Summary
Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.
Abstract
In dieser Studie beschreiben wir eine abgekürzte Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn. Das Ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) solubilisiert effektiv nativ gefaltete Proteine im Gehirngewebe, so dass die Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus einer breiten Palette von neurodegenerativen Proteinopathies, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose und Prion-Krankheiten. Menschlichen Kontrolle und Post-mortem Hirngewebe AD wurden homogenisiert und sedimentierte durch Ultrazentrifugation in Anwesenheit von Sarkosyl Waschmittel-unlösliche Aggregate einschließlich pathologischer phosphorylierten Tau, das Herzstück der neurofibrillären bereichern Verwicklungen in AD. Westliche Beflecken, demonstriert die differenzielle Löslichkeit der aggregierten phosphoryliert-Tau und die Waschmittel-lösliche Protein, frühen Endosom Antigen 1 (EEA1) in Steuerung und AD Gehirn. Proteomic Analysen ergaben auch Bereicherung der β-Amyloid (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 - 70 K), und Apolipoprotein E (APOE) in die Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen von AD Gehirn im Vergleich zu denen der Kontrolle, konsistent mit früheren Gewebe Fraktionierung Strategien . Somit eignet sich dieses einfache Bereicherung-Protokoll für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und funktionsfähiges Protein Co Aggregation Assays, Massenspektrometrie-basierte Proteomics.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die eng verwandten Prion-Krankheiten sind gekennzeichnet durch die allmähliche Anhäufung von proteinopathies Waschmittel-unlösliche Aggregate im Gehirn mit begleitenden kognitiven ablehnen. 1 , 2 diese gemeinsame pathologische Funktion wird gedacht, um eine zentrale Rolle in der Ätiologie und Pathophysiologie dieser neurodegenerativen Krankheiten. 2 diese Aggregate bestehen typischerweise aus Polymeren Amyloid Fasern, die zusammengesetzt sind, sich wiederholender Einheiten der fehlgefaltete Protein ausstellenden Kreuz β-Struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemisch, Amyloid Aggregate sind sehr widerstandsfähig gegen chemische oder thermische Denaturierung und Solubilisierung,3 stellt besondere Herausforderungen an ihre Reinigung, Analyse und über traditionelle biochemischen Techniken zu studieren. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 es überrascht nicht, wurde die Waschmittel-unlösliche Proteinfraktion viel Forschungsschwerpunkt in der Pathophysiologie der neurodegenerativen Erkrankungen mit der Anhäufung von fehlgefaltete Proteine. 6 , 12 , 13 , 14
Biochemische Fraktionierung Techniken wurden oft genutzt, um die Reinigungsmittel-unlösliche Fraktion aus Post-mortem Gehirn Homogenates bereichern. 6 , 12 , 13 , 14 eine der am häufigsten verwendeten Methoden beinhaltet die sequentielle Extraktion von Gewebe Homogenates mit Puffern und Reinigungsmittel erhöhen Stringenz, gefolgt von Ultrazentrifugation, die löslichen und unlöslichen Anteile zu partitionieren. Eine häufig verwendete sequentielle Fraktionierung Protokoll6,14 beinhaltet die Homogenisierung der gefrorene Gewebeproben in einem Waschmittel-freie wenig Salz (LS)-Puffer und die daraus resultierende unlösliche Pellets werden dann nacheinander mit extrahiert Puffer mit hohen Salz, nichtionischen Detergentien, hohen Saccharose, wie Ionischen Detergentien und schließlich Chaotropes Harnstoff. 6 , 14 eine offensichtliche Nachteil solch eine sequentielle Fraktionierung Protokolle ist die beträchtliche Zeit und Arbeit Engagement erforderlich, um sie abzuschließen. Einschließlich der Homogenisierung und Ultrazentrifugation, eine typische 5-stufige Fraktionierung Protokoll dauert mehrere Stunden oder sogar Tage dauern. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 darüber hinaus möglichst viele pathologische Proteinaggregaten unlöslich in allen außer den härtesten Bedingungen19,20 bleiben die meisten der erzeugten Brüche sind nur von begrenztem Wert. Somit sind die weniger strengen Fraktionierung Schritte nutzen hohe Salzkonzentrationen und nichtionische Detergentien weitgehend überflüssig.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) ein ausgezeichneter Kandidat für einen vereinfachten einstufigen Waschmittel Fraktionierung Protokoll ist. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als denaturierenden Waschmittel, Sarkosyl ist streng genug, um die überwiegende Mehrheit der nativ gefaltete Proteine im Gehirn anderweitig ohne Gefäss-fehlgefaltete Protein-Aggregate bestehend aus Beta-Amyloid (Aβ),6,11 phosphorylierten Tau (pTau),6 TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43),14 Alpha-Synuclein,12,13 Scrapie,23 oder U1 small nuclear Ribonucleoproteins (U1 SnRNPs) wie U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Da Sarkosyl weniger streng als die allgegenwärtigen anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) ist, bewahrt es weniger robuste Oligomere Formen von fehlgefaltete Protein-Aggregate, die SDS-Behandlung nicht standhalten können. 9
Zuvor beschrieben wir eine abgekürzte Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, das vergleichbar mit aufwendiger sequentielle Fraktionierung Methoden Ergebnisse erzielt. 5 durch die weniger strenge Fraktionierung Schritte auslassen, konnten wir ein facile Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn zu entwickeln. 5 dieses ausführliche Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und Massenspektrometrie-basierte Proteomics, funktionsfähiges Protein misfolding und Aggregation seeding assays. 5 , 6 , 21
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Protocol
Ethik-Erklärung: alle Hirngewebe stammen aus der Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) Brain Bank. Post-mortem Gewebe unter richtigen institutionellen Review Board (IRB) Protokolle erworben wurden.
1. Homogenisierung und Fraktionierung
- Gewebe Auswahl
Hinweis: Frozen Post-mortem frontalen Kortex Gewebe aus gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch bestätigten AD-Fälle wurden ausgewählt von der Emory ADRC Gehirn Bank (n = 2). Post-Mortem neuropathologische Auswertung der Amyloid-Plaques Verteilung wurde entsprechend des Konsortiums, eine Registrierung für Alzheimer zu etablieren durchgeführt ' s Krankheit semi-quantitativen Kriterien 24, scoring, obwohl neurofibrillären Gewirr Pathologie wurde gemäß der Braak-staging-System bewertet. 16- erhalten Post-mortem Hirngewebe von gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch eingefroren bestätigt AD-Fälle. Verwendung von Containern von Trockeneis, Zange und einer Rasierklinge, Verbrauchsteuern ~ 250 mg Teile der grauen Substanz aus jede Gewebeprobe auf tarierten Einweg wiegen Boote, kümmert sich um Auftauen des Gewebes zu verhindern. Nehmen Sie das Gewicht jedes Stückes, homogenisiert werden.
- Verbrauchsteuern ~ 250 mg der grauen Zellen mit Zange und gestochen von visuell inspizieren, um die Schnittstelle zwischen der äußeren graue Substanz und inneren weißen Substanz zu finden. Vermeiden Sie weiße Substanz und was noch wichtiger ist, alle großen Blutgefäße oder blutigen Regionen, Hirnhäute oder Arachnoidea Mater. Halten Sie das Gewebe eingefroren während des Schneidprozesses indem arbeiten schnell und häufig mit einem Gewicht von Boot mit Hirngewebe in Polystyrol-Behälter mit trocken Ice
- Datensatz das exakte Gewicht der grauen Substanz, die aus jedem gefrorenen Stück mit Hilfe einer Analysenwaage herausgeschnitten. Berechnen Sie das Volumen des wenig Salz (LS) Puffer für Dounce Homogenisierung (5 mL/g oder 20 % w/V) benötigt (siehe Tabelle 1).
- Vorbereitung 10 mL LS Puffer mit 1 x Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail und chill auf Eis.
- Entfernen Sie wog Gewebe und mit einem Gewicht von Boot aus Trockeneis und Würfel in etwa 2 x 2 mm Stücke wie es taut. Transfer zu einem 2 mL vorgekühlt Dounce Homogenisator Schlauch auf Ice
- 5 mL/g (20 % w/V) der eiskalten wenig Salz (LS) Puffer mit 1 X Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail hinzufügen.
- Homogenize das Hirngewebe auf Eis mit etwa 10 Schläge von hoher Bodenfreiheit Stößel A und 15 Hübe der niedrige Clearance Stößel B.
- Alle Homogenat auf ein 2 mL Polypropylen-Rohr mit einem Glas Pasteurpipette übertragen. Beschriften der Röhrchen mit “ TH ” (insgesamt Homogenat), das Gewebe Fall Nummer und homogenisierte Volumen. aliquoten 0,8 mL in einem beschrifteten 1,5 mL-Tube. Jede überschüssige Homogenat kann ähnlich sein, regelmÄÑig und gespeicherte bei-80 ° c
- Zu je 0,8 mL Aliquoten, bzw. 100 µL 5 M NaCl und 10 % (w/V) Sarkosyl zu Konzentrationen von 0,5 M und 1 % w/V, hinzufügen. Mischen Sie Rohre gut durch Umkehrung und inkubieren Sie auf Eis für 15 min. Label Rohre mit " TH-S " (insgesamt Homogenat-Sarkosyl) darauf hin, dass die Homogenates in Sarkosyl-Puffer (Tabelle 1).
- Beschallen jedes Rohr für drei 5 s-Pulse bei 30 % Amplitude auf Eis (maximale Intensität = 40 %) mit einer Sonde Microtip.
- bestimmen die Proteinkonzentrationen von der Homogenates mit der Bicinchoninic Säure (BCA) assay 25 Methode.
Hinweis: Die durchschnittliche Proteinkonzentration von TH-S Homogenates in 5 mL LS pro Gramm Gewebe vorbereitet ist 15-20 mg/mL. Die Homogenates fraktioniert sofort oder bis zur Verwendung bei-80 ° C gelagert werden kann. - Verdünnen TH-S Homogenates bis 10 mg/mL mit eiskalten Sark Puffer (Tabelle 1) mit 1 x Phosphatase, Protease-Inhibitoren.
- Transfer 5 mg Protein (0,5 mL) von jeder TH-S Homogenat in 500 µL Polycarbonat Ultrazentrifugen Tuben und paar-Balance mit Sark-Puffer. Laden Sie Rohre in einem vorgekühlt Rotor und Ultrazentrifugen 180.000 x g für 30 min bei 4 ° c Übertragung Sarkosyl lösliche Überstände (S1) auf 1,5 mL Röhrchen und Lagern bei-80 ° c
Hinweis: (Optional-Waschanlagen) fügen Sie 200 µL Sark-Puffer, der Ultrazentrifuge Rohre mit Waschmittel-unlösliche Fraktionen (P1) und verdrängen die Pellets (P1) von der Unterseite der Ultrazentrifuge Rohre mit einer Pipettenspitze 200 µL. - Kurz Puls-Spin die invertierten Rohre für 2-3 s (≤ 2.500 X g) auf einem Microcentrifuge der Pellets (P1) und Puffer auf die 1,5 mL Röhrchen unten übertragen. Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) im Sark-Puffer durch Pipettieren rauf und runter um sicherzustellen das Pellet wird gestört,.
- Paar-Balance und Zentrifuge bei 180.000 x g für eine zusätzliche 30 min bei 4 ° c
- Verwerfen den optionalen waschen überstand (S2) und inkubieren Sie die Sarkosyl-unlösliche Pellets (P2) in 50-75 µL Harnstoff Puffer (Tabelle 1) mit 1 x PIC (Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail) für 30 min bei Raumtemperatur zu solubilisieren die Pellet.
Hinweis: Warme Harnstoff Puffer auf Raumtemperatur vor Gebrauch SDS Niederschlag zu vermeiden. Für Waschmittel-Sensitive Anwendungen weglassen SDS aus Harnstoff Puffer und in niedrigen Salz Puffer betrachten waschen das unlösliche Pellet (P2), bevor in Harnstoff Puffer resuspending. - Übertragen die resuspendierte Pellets (P2) auf 0,5 mL Röhrchen und verwenden Sie kurze (1 s) Microtip Beschallung bei 20 % Amplitude (maximale Intensität = 40 %), voll die Pellets solubilisieren.
- Bestimmen die Proteinkonzentrationen von Sarkosyl löslich (S1) und unlösliche (P2) Brüche mit der BCA assay Methode. Diese Fraktionen sofort verwenden oder bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
2. Immunoblotting
- Western Blot
Hinweis: Western blotting nach zuvor gemeldeten Verfahren mit leichten Modifikationen durchgeführt wurde. 5 , 10- bereiten 40 µg Proben von insgesamt Homogenates (TH-S), Sark-löslich (S1) und Sark-unlösliche (P2) Brüche in 1 X Laemmli SDS-Page-Probenpuffer mit 5 mM DÄMMUND pH 7. Inkubieren Sie Proben bei 95 ° C für 5 min.
- Last Proben auf ein Fertigteil 10-Brunnen 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE gel. Bei 80 V für die ersten Zentimeter (10 min) und 120 V für den Rest (60 min) oder bis die Tracking-Farbstoff den Boden des Gels erreicht electrophorese.
- Verwenden Sie frischen Rasierklinge und Gel Messer auf Split-die vorgegossenen Gel-Kassette offen. Sanft die Kämme und ganz unten das Gel mit einer frischen Rasierklinge wegschneiden.
- Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) in 200 µl Sark-Puffer mit 1 X PIC durch Pipettieren rauf und runter.
- Übertragung an eine 0,2 µm Nitrozellulose-Membran mit einer trockenen Übertragungsmethode auf ein Blot Maschine (siehe der Materialtabelle).
- Blockieren die Membran in blockierende Puffer (BB) ohne Tween 20 für 30 min, gefolgt mit BB mit 0,05 % Tween 20 (BB/T) für 30 min. Nach der Blockierung, spülen Sie die Membran in TBS/T (0,1 % Tween 20) für 5 min um überschüssige blockierende Puffer entfernen.
- Bereiten 1:1,000 Verdünnungen der primären Antikörper pT231, Tau-2 (Pan Tau), AT8 und EEA1 in BB/T (0,05 % Tween 20).
- Brüten die Membranen in Primärantikörper Lösung über Nacht bei 4 ° C mit kreisförmigen Bewegung. Spülen Sie die Membran in TBS/T für 3 x 15 min.
- Sonde die Membran mit einer Verdünnung 1: 20.000 Eindringmittel beschriftet in der Nähe von IR Sekundärantikörper in BB/T für 60 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit auf Shaker. Spülen Sie die Membran für 3 x 10 min in TBS/T und 2 x 5 min in El
- Scannen die Membran, die über eine Infrarot imaging-System bei der entsprechenden Erregung Wellenlänge (z.B. 700 nm (Rot-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 680 Ziege Anti-Maus IgG (H + L) sekundär- und 800 nm (Grün-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 790 Esel Anti-Kaninchen IgG (H + L (sekundäre)).
- Verwenden die Software zur Abbilderstellung Signalintensitäten zu quantifizieren und Densitometrie Messungen gemäß den Hersteller ' Anweisungen, Auto-Hintergrund zu gewährleisten wird voraussichtlich den gesamten Hintergrund durchschnittliche.
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Representative Results
Das abgekürzte einstufigen Sarkosyl-Fraktionierung-Protokoll wurde verwendet, um Waschmittel-unlösliche Aggregate aus Kontrolle und AD Post-mortem Gehirn (Abbildung 1) zu bereichern. Proteine aus TH-S, S1, S2 und P2 Fraktionen wurden gelöst durch SDS-PAGE, für 15 min in Coomassie Blau Fixativ Puffer gefolgt von schonende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer fest. Die Wiederfreisetzung Schritt ist optional, da gab es nicht nachweisbare Niveaus des Proteins in der S2-Fraktion (siehe 1.1.14). Western-Blot Analyse (Abbildung 2A und B) zeigt deutlich, dass in AD Gehirn, die pathologische hohes Molekulargewicht phosphorylierten Tau-Aggregate Sarkosyl unlöslich waren, und sehr wenig pTau in blieb der Sarkosyl-löslichen Brüche. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 partitioniert dagegen die Mehrheit der pTau im Gehirn Kontrolle in der Sarkosyl-löslichen Fraktion. 5 , 6 , 10 Partitionen im Gegensatz dazu EEA1 in erster Linie in der S1-Bruch in Kontrolle und AD Gehirn (Abbildung 2). Hier fungiert EEA1 als allgemeine Marker für die meisten Einheimischen, nicht-pathologische Proteine, die von Natur aus Sarkosyl lösliche5sind. Bemerkenswert ist, ist etwas weniger Signal für EEA1 in der löslichen Fraktion (S1) im Vergleich zu den TH-S-Bruch, darauf hinweist, dass ein kleine Pool von EEA1 wahrscheinlich Sarkosyl unlösliche, noch unterhalb der Nachweisgrenze von western-Blot mit diesem bestimmten Antikörper. Ebenso ist es möglich, dass der leichte Rückgang der Signalstärke des EEA1 in der löslichen Fraktion (S1) aufgrund der unspezifischen Bindung der EEA1 an den Rohren Ultrazentrifugen könnte auch erklären, die geringfügige Abweichung von der erwarteten Ergebnisse.
Um die Wirksamkeit des abgekürzten Einzelschritt Fraktionierung Protokolls (Abbildung 3A) gegen die eher traditionellen mehrstufigen sequentielle Fraktionierung Methodik (Abb. 3 b), die relativen Pegel der Sarkosyl-unlösliche benchmark Amyloid-Precursor-Protein (APP), Tau (MAPT), kleine nuclear Ribonucleoprotein U1 - 70K (snRNP70) und Apolipoprotein E (APOE) waren im Vergleich von markierungsfreie Massenspektrometrie (MS) basierte Proteomics gepoolten Kontrolle (Ctl), leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI) und AD Fälle von früheren Studien7,18 (Abbildung 3). Messungen der Waschmittel-unlösliche APP effektiv repräsentiert das Aβ-Peptid, als alle voll tryptic APP Peptide quantifiziert Aβ und Umgebung voller Länge 695 Rückstände APP Protein7zugeordnet. Bei beiden Methoden tendierte die Sarkosyl-unlösliche Ebenen aller vier pathologischer Proteine nach oben in MCI und AD Fällen im Vergleich zu Kontrollen, Einklang mit der starken Korrelation der kognitiven Fähigkeiten und pathologische Belastung. Insgesamt waren Bereicherung dieser Proteine in der Waschmittel-unlösliche Bruchteilen (P2) bemerkenswert konsistent mit dem einstufigen18 und mehrstufigen Fraktionierung Protokolle7.
Allerdings gibt es leichte Unterschiede zwischen den zwei Methoden, die vorteilhaft oder schädlich abhängig von der genauen Art erweisen und Ziele eines einzelnen Experiments. Die vergleichende Proteomic Daten in Abbildung 3 zusammengefasst informieren welches Protokoll abhängig von spezifischen experimentellen Parameter und Anwendungen verwendet. Wie man erwarten könnte, gibt es ein allgemeine Kompromiss zwischen Probe Bereicherung und Reinheit mit dem vereinfachten Fraktionierung Protokoll bieten mehr angereicherte Proben mit weniger Proteinverlust als Multi-Schritt-Methode.
Beispielsweise weisen Kontrolle unlösliche Fraktionen bereit, über das vereinfachte Protokoll (Abbildung 3A) etwas höhere Hintergrundkonzentrationen von krankheitsrelevanten Proteinen als jene, die über den mehrstufigen Ansatz. Umgekehrt kann die einstufigen Fraktionierung Technik vorteilhaft für Low-Fülle Proteine als die Gesamtprobe, die Verluste deutlich reduziert werden. Beispielsweise ist die relative Anreicherung von Sarkosyl-unlösliche APOE in MCI Fällen deutlich höher in den unlöslichen Fraktionen vorbereitet über das abgekürzte Protokoll(Abbildung 3).
Obwohl beide Ansätze mehr als ausreichend sind zu signifikanten Anstieg krankheitsrelevante oder pathologische fehlgefaltete Protein-Aggregate, desto zahlreicher beobachten und umfangreiche Fraktionierung und waschen Schritte der mehrstufigen Ansatz können ein sauberer erzeugen und spezifischere Proteomic Unterschrift. Dennoch, unsere Daten überprüfen, ob die einstufigen Fraktionierung Methode veröffentlichten Erkenntnisse entspricht, dass pathologische Aggregate wie Tau neurofibrillären Verschlingungen (NFTs), Aβ Plaques und Scrapie-Prionen (PR-Sc) in Sarkosyl unlöslich sind, während ihre nativ gefalteten Gegenstücke wasserlöslich bleiben. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Durch die Berechnung der relativen Mengen des Proteins, die in der Waschmittel-unlösliche Fraktionen des Steuerelements zu partitionieren (n = 3) und AD (n = 3) Gehirn (Tabelle 2), nur ~ 10 % der Gesamt-Protein Pool ist Sarkosyl unlöslich. Wenn 5 mg Gesamtprotein des Gehirns Homogenat (TH-S) fraktioniert ist, 10,4 % und 11,3 % des Proteoms Partitionen in der Waschmittel-unlösliche Fraktion in Kontrolle und AD-Fälle, beziehungsweise. Obwohl die Gesamtmenge des Sarkosyl unlöslichen Protein angereichert in AD Gehirn etwas höher als Kontrolle, keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen beobachtet wurden (p = 0.703). Dies bedeutet, dass Protein misfolding und Aggregation ist nicht im AD Gehirn weit verbreitet, aber eher beschränkt auf eine schmale und spezifische Teilmenge der Proteine wie Tau, Aβ und U1 SnRNPs. 7 , 21 , 22
Abbildung 1: Sarkosyl Fraktionierung Schema. (A) A Post-mortem Gehirn wurde homogenisiert, in niedrigen Salz Puffer, woraufhin Sarkosyl und NaCl Endkonzentrationen von 1 % w/V und 0,5 M bzw. hinzugefügt und für 15 min auf Eis inkubiert. Nach Beschallung wurden die Homogenates durch Ultrazentrifugation 180.000 X g für 30 min mit der Sarkosyl-lösliche überstand (S1) und Sarkosyl-unlösliche Pellet (P1) fraktioniert. Das P1-Pellet wurde (optional) mit Sark-Puffer und Re-sedimentierte durch Ultrazentrifugation leisten die endgültige Sarkosyl unlösliche Pellet (P2) gewaschen. Diese P2-Fraktion war in Harnstoff Puffer für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 x 5 s Beschallung mit einer sauberen Microtip Sonde solubilisiert. (B) Proteine (20 µg) von TH-S, S1, S2 (10 µL) und P2 Fraktionen wurden gelöst durch SDS-PAGE, für 15 min in Coomassie Blau Fixativ Puffer gefolgt von schonende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer über Nacht bei Raumtemperatur fest. klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Anreicherung von phosphoryliert-Tau in der Waschmittel unlösliche Fraktion der AD Gehirn. (A und (B) Protein (40 μg) des gesamten (TH-S), löslich (S1) und unlösliche (P2) Brüche wurden mit einem Antikörper gegen Tau an Threonin 231 (pT231) phosphoryliert ausgelöscht oder AT8 (pSer202, pThr205) zu zeigen, die Anreicherung von pathologischen Phospho-Tau-Arten in der unlöslichen Anteil (P2) der AD Gehirn. In AD Gehirn, hochmolekularen aggregiert Tau ausschließlich Partitionen in der Waschmittel-unlösliche (P2) Bruch. (C) EEA1 diente als lösliche Protein-Marker und relatives Laden Steuerung für die Summe (TH-S) und lösliche (S1) Bruchteile von Kontrolle und AD Gehirn. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Proteomik Analyse der pathologischen AD Proteine mit einem einstufigen oder mehrstufigen Fraktionierung Protokoll. Relativen Pegel der repräsentativen Sarkosyl unlösliche Proteine APP (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 - 70K) und APOE über verschiedene Krankheiten unter Kontrolle, gebündelt MCI und AD-Fälle mit den einzigen Schritt (A) oder Multi-Schritt (B) Sarkosyl Fraktionierung Ansatz. Für beide Datensätze schätzte Protein-Ebene durch Peptid spektrale Übereinstimmungen (PVSM) dieser Proteine identifiziert und normalisiert, um das Maximum auf 100 festgelegt. PVSM von Kontrolle, MCI und AD-Fälle (n = 5 jedes) wurden für das Single-Set-Dataset verwendet. Für den mehrstufigen Ansatz, PVSM aus zwei replizieren Pools des Steuerelements, MCI und AD-Fälle (n = 5 jedes) wurden analysiert. Fehlerbalken zeigen die Werte der Mittelwert ± S.E.M Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| 10 % w/V Sarkosyl Lösung: 10 g N Natriumlaurylsulfat Sarkosin Natrium Kochsalz pro 100 ml DdH2O (rühren über Nacht bei RT) |
| Niedrigem Salz (LS)-Puffer: 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA |
| Sarkosyl (Sark) Puffer: LS-Puffer + 1 % (w/V) Sarkosyl + 0,5 M NaCl |
| Harnstoff-Puffer (Shop bei-20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8 M Harnstoff, 2 % SDS |
| 4 X SDS laden Puffer: 200 mM Tris-HCl pH 6,8, 40 % Glycerin, 8 % Sodium Dodecyl Suflate (SDS), 0,4 % Bromophenol blue (BPB) und 20 mM DÄMMUND pH 7,0 in DdH2O |
| Coomassie Fixativ Puffer: 40 % Methanol, 10 % Essigsäure in DdH2O |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer: 25 % Methanol, 5 % Essigsäure, 0,1 % Coomassie blau G-250 DdH2O |
| Coomassie destain Puffer: 25 % Methanol, 5 % Essigsäure in DdH2O |
| 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl in DdH2O |
| 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBS/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20 in DdH2O |
| 1 X Blocking-Puffer (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1 % proprietären Protein (siehe Materialliste), 750 mM Methylchloroisothiazolinone in DdH2O |
| 1 X Blocking-Puffer mit 0,05 % Tween 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1 % proprietären Protein (siehe Materialliste), 0,05 % Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone ddH2O |
Tabelle 1: Puffer Liste.
| Probe | Volumen-Probe (µL) | Konzentration (µg/µL) | Gesamt-Protein (µg) | Durchschnittliche Gesamt-Protein (µg) und S.E.M | % TH-S (5 mg) |
| CTL-1 | 70 | 9,89 | 692.3 | ||
| CTL-2 | 70 | 7,38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10,4 % |
| CTL 3 | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| AD 1 | 70 | 9,77 | 683.9 | ||
| AD 2 | 70 | 6.67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11,3 % |
| AD 3 | 70 | 7,86 | 550.2 |
Tabelle 2: Protein-Menge in Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen (P2). Im Durchschnitt der Anteil an Protein, die Partitionen in der Sarkosyl unlöslichen Anteil der Kontrolle (n= 3) und AD (n= 3) Gehirn betrug 10,4 % bzw. 11,3 %. Gab es keinen statistisch signifikanter Unterschied der Höhe der Sarkosyl-unlösliche Proteine aus Kontrolle und AD Gehirn, ausweislich der Schülers t-test (p = 0.703) und Standardfehler der Mittelwerte (SEM).
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Discussion
Hier wir vorstellen und diskutieren eine abgekürzte Einzelschritt Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, die für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen von Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen bis hin zu funktionellen Protein misfolding assays und westliche Beflecken. 5 , 6 , 7 , 10 dieser Methodik ist vielleicht die meisten wirksam, wenn Sie zur Untersuchung neurodegenerativer Proteinopathies wie Alzheimer, ALS, Chorea Huntington, Prion-Krankheiten und die verschiedenen Tauopathies. Im Vergleich zum ursprünglichen fünfstufigen sequentielle Fraktionierung Protokoll, das einstufige Verfahren kann an einem einzigen Tag abgeschlossen werden und bietet sehr ähnliche Ergebnisse. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Verwendung von Sarkosyl als Fraktionierung Waschmittel. Im Gegensatz zu anderen Detergentien wie Triton x-100 oder Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) scheint Sarkosyl gut für diese Aufgabe geeignet sein; in Bezug auf die Stringenz und Palladiumhaltige Stärke ist es stark genug, um anderweitig die Mehrheit der nativ gefaltete Proteine unter Beibehaltung der Waschmittel-Unlöslichkeit, Struktur und Funktion von krankheitsrelevanten Protein-Aggregate, die von Natur aus sind empfindlich gegen SDS. 5 , 9 darüber hinaus bleibt im Gegensatz zu SDS, Sarkosyl löslich bei niedrigen Temperaturen und hohen Salz Bedingungen.
Ein weiteres wesentliches Merkmal dieses Protokolls ist die Wiederfreisetzung der ersten Sarkosyl-unlösliche (P1) Pellets nach dem ersten Wahlgang der Ultrazentrifugation. Diese Waschschritt ermöglicht die erste Pellets (P1), extrahiert und gründlich gewaschen werden alle verbleibenden kontaminierend Kreuz löslich oder total Homogenat Proteine, mit einer rein und klar definierte Waschmittel-unlösliche Proteinfraktion. Ohne die optionale Pellet (P1) Wiederfreisetzung und waschen Schritt residual lösliche Proteine können durchgeführt in der Waschmittel-unlösliche Fraktion, verwirrende möglicherweise daraus resultierenden Ergebnisse und Experimente (d. h. Immunoblotting oder Proteomics-Analyse) über sein.
Die unlöslichen und hohen Molekulargewicht Art der pathologische fehlgefaltete Protein Aggregate (d. h. Tau, Phospho-Tau und Aβ-Arten) einzigartige Herausforderungen in Richtung ihrer Isolierung und Analyse über die traditionellen biochemischen Techniken. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 anders als lösliche Proteine unlösliche Aggregate wie Amyloide (Aβ) und hyperphosphoryliertem Tau neurofibrillären Verschlingungen (NFTs) dürfen nicht ohne weiteres von Post-mortem Gewebe durch traditionelle Methoden wie Immunopräzipitation gereinigten oder schnell Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 so gehört das abgekürzte Sarkosyl-Fraktionierung-Protokoll nur Techniken, die für die einfache Anreicherung und Isolierung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus Post-mortem Gehirn innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeitrahmen ermöglicht. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Während zusätzliche Schritte eingesetzt werden können, um eine reine, homogene Stichprobe von aggregierten Protein zu isolieren, ermöglicht das Sarkosyl Fraktionierung Protokoll facile Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate mit vergleichsweise wenig Zeitaufwand. 5 , 6 zur Unterstützung dieser Hypothese bestätigen Proteomik-Studien des Proteoms Sarkosyl unlöslich, dass die überwiegende Mehrheit der bekannten pathologischen Aggregation neigen Proteine in der Sarkosyl-unlösliche Fraktion-in beiden traditionellen mehrstufigen partitionieren 6 , 11 , 21 sowie unsere neuartige Einzelschritt Fraktionierung Ansatz. 5 , 7 , 9 , 10
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Jim Lah und Allan Levey, Emory Universitätsklinik für Neurologie, für die hilfreichen Kommentare und Anregungen. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch die Beschleunigung der Medizin Partnerschaft Grant (U01AG046161-02), die Emory Alzheimer Disease Research Center (P50AG025688) und eine National Institute on Aging gewähren (R01AG053960-01) N.T.S. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die Neuropathologie Kern von Emory Neurowissenschaften NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
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