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Biochemistry

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/55835

Summary

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Abstract

In questo studio, descriviamo un protocollo abbreviato passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem. Il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) solubilizza efficacemente nativamente piegati proteine nel tessuto cerebrale permettendo l'arricchimento degli aggregati della proteina detersivo-insolubili da una vasta gamma di proteinopathies neurodegenerative, come Morbo di Alzheimer (annuncio), morbo di Parkinson e sclerosi laterale amiotrofica e malattie da prioni. Controllo umano e tessuti di cervello post mortem AD sono stati omogeneizzati e sedimentato di ultracentrifugazione in presenza di sarkosyl per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili tra cui tau fosforilata patologica, il componente principale di neurofibrillary grovigli in annuncio. Macchiarsi occidentale ha dimostrato la solubilità differenziale aggregati fosforilato-tau e la proteina detergente solubile, presto 1 antigene Endosome (EEA1) in controllo e cervello dell'annuncio. Analisi proteomica ha rivelato anche arricchimento di β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e l'apolipoproteina E (APOE) nelle frazioni sarkosyl-insolubile del cervello dell'annuncio rispetto a quelli di controllo, coerenza con le precedenti strategie di frazionamento del tessuto . Così, questo protocollo semplice arricchimento è ideale per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e funzionale della proteina saggi co-aggregazione a basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Introduction

Malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e le malattie da prioni strettamente correlati sono proteinopathies caratterizzata dall'accumulo graduale di aggregati di detersivo-insolubili della proteina nel cervello con l'accompagnamento conoscitivo declino. 1 , 2 questa caratteristica patologica comune è pensata per svolgere un ruolo centrale nell'eziologia e patofisiologia di queste malattie neurodegenerative. 2 questi aggregati consistono tipicamente di fibre amiloidi polimeriche, che sono composti da unità di proteine misfolded espositrici Croce βripetute-struttura. 1 , 2 , 3 , 4 biochimicamente, aggregati amiloidi sono altamente resistenti alla denaturazione termica o chimica e solubilizzazione,3 che presenta sfide uniche per la loro purificazione, analisi e studiano tramite tecniche biochimiche tradizionali. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 non sorprende, la frazione di detersivo-insolubili della proteina è stato al centro di molte ricerche nella patofisiologia delle malattie neurodegenerative che coinvolgono l'accumulo di proteine misfolded. 6 , 12 , 13 , 14

Tecniche di frazionamento biochimici sono stati utilizzati spesso per arricchire la frazione di detersivo-insolubili da omogenati di cervello post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno dei metodi più comuni comporta l'estrazione sequenza degli omogeneati del tessuto con buffer e detergenti di crescente rigore, seguita da ultracentrifugazione di partizionare le frazioni solubili e insolubili. Un frazionamento sequenziale comunemente usato protocollo6,14 comporta l'omogeneizzazione di campioni di tessuto congelato in un buffer senza detersivo basso contenuto di sale (LS) e i pellet insolubili risultanti quindi vengono estratte in sequenza con buffer contenente sale alto, detergenti non ionici, alta saccarosio, detergenti ionici e infine chaotropes come urea. 6 , 14 un evidente svantaggio di tali protocolli di un frazionamento sequenziale è la notevole di tempo e l'impegno di lavoro necessario per completarle. Omogeneizzazione e ultracentrifugazione, un protocollo tipico cinque fasi frazionamento può richiedere diverse ore o anche giorni per completare. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 inoltre, aggregati di proteine patologiche come molti rimangono insolubili in tutti, ma le più dure condizioni19,20 la maggior parte delle frazioni generate sono di scarso valore. Così, i passaggi di meno-rigorosi frazionamento che utilizzano alte concentrazioni saline e detergenti non ionici sono in gran parte ridondanti.

Gli studi precedenti hanno dimostrato che il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) è un candidato eccellente per un protocollo semplificato passo singolo detergente frazionamento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 come un detergente denaturante, sarkosyl è sufficientemente rigorosi per solubilizzare la stragrande maggioranza delle proteine in modo nativo piegati nel cervello senza solubilizzanti aggregati di proteine misfolded composti di beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilata (pTau),6 TAR DNA-proteina 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 scrapie,23 o U1 piccole ribonucleoproteine nucleari (U1 snRNPs) come U1 - 70K. 5 , 21 , 22 Come sarkosyl è meno rigorose rispetto l'onnipresente anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS), conserva meno robuste forme oligomeriche di aggregati di proteine misfolded che non possono sopportare un trattamento di SDS. 9

In precedenza, abbiamo descritto un protocollo di detersivo-frazionamento abbreviato che ha raggiunto risultati paragonabili alle metodologie di frazionamento sequenziale più laboriose. 5 omettendo i passaggi meno rigorosi di frazionamento, siamo stati in grado di sviluppare un protocollo facile passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello umano. 5 questo protocollo dettagliato qui descritto è adatto per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e saggi basati sulla spettrometria di massa proteomica a funzionale misfolding e aggregazione semina. 5 , 6 , 21

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Protocol

etica istruzione: tutti i tessuti del cervello sono stati ottenuti da Emory Alzheimer ' s malattia Research Center (ADRC) Brain Bank. Tessuti umani post mortem sono stati acquisiti sotto protocolli appropriati Institutional Review Board (IRB).

1. omogeneizzazione e frazionamento

  1. selezione del tessuto
    Nota: Frozen tessuto corteccia frontale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico casi confermati di annuncio sono stati selezionati dalla Emory Banca di cervello ADRC (n = 2). Post mortem neuropathological valutazione della distribuzione della placca dell'amiloide è stato eseguito secondo il Consorzio di istituire un registro per Alzheimer ' s malattia semi-quantitativa segnando criteri 24, anche se patologia neurofibrillary di groviglio è stata valutata in conformità con il sistema di stadiazione di Braak. 16
    1. ottenere congelato tessuto cerebrale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico confermato casi di AD. Utilizzando contenitori di ghiaccio secco, pinze e una lama di rasoio, asportare ~ porzioni di 250 mg di materia grigia da ogni campione di tessuto su monouso tarato pesano barche, avendo cura di evitare che il tessuto dallo scongelamento. Registrare il peso di ciascun pezzo di omogeneizzati.
    2. Accise ~ 250 mg di sostanza grigia utilizzando forcipe e rasoio controllando visivamente per individuare l'interfaccia tra la materia grigia esterna e interna della materia bianca. Evitare di materia bianca e ancora più importante, qualsiasi grandi vasi sanguigni o regioni sanguinose, meningi o mater aracnoide. Mantenere il tessuto congelato durante il processo di taglio lavorando rapidamente e frequentemente posizionando barca pesatura con tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco
    3. Registra il peso esatto di materia grigia asportato da ogni pezzo congelato utilizzando una bilancia analitica. Calcolare il volume di tampone di basso contenuto di sale (LS) (Vedi tabella 1) necessaria per omogeneizzazione lisata (5 mL/g o 20% w/v).
    4. Preparare 10 mL LS tampone con 1x dell'inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail e chill sul ghiaccio.
    5. Rimuovere tessuto pesato e pesatura barca da ghiaccio secco e dadi pezzetti di circa 2 x 2 mm come si scioglie. Trasferimento a una provetta da 2 mL pre-refrigerati lisata omogeneizzatore su Ice.
    6. Aggiungere 5 mL/g (20% w/v) del buffer ghiacciata basso contenuto di sale (LS) con 1 X cocktail di inibitore della proteasi e fosfatasi.
    7. Omogenizzazione del tessuto di cervello sul ghiaccio con circa 10 colpi di clearance elevata pestello A e 15 colpi di pestello bassa clearance B.
    8. Trasferire tutti omogeneato ad un tubo in polipropilene da 2 mL utilizzando un pipetta Pasteur di vetro. Etichettare la provetta con “ TH ” (Totale omogeneato), il tessuto caso numero e volume omogeneato. aliquota 0,8 mL in una provetta con etichetta 1,5 mL. Qualsiasi omogeneato in eccesso può essere similmente aliquotati e conservati a -80 ° C.
    9. Per ogni aliquota di mL 0,8, aggiungere 100 µ l di 5 M di NaCl e sarkosyl 10% (p/v) a concentrazioni di 0,5 M e 1% w/v, rispettivamente. Tubi di mescolare bene capovolgendo e incubare in ghiaccio per 15 min. Etichettare provette con " TH-S " (Totale omogeneato-Sarkosyl) per indicare che gli omogeneati sono nel sarkosyl-buffer (tabella 1).
    10. Sonicare ogni tubo per gli impulsi di tre 5 s a 30% ampiezza sul ghiaccio (intensità massima = 40%) utilizzando una sonda microtip.
    11. determinare le concentrazioni di proteina degli omogeneati usando l'acido bicinconinico (BCA) dosaggio 25 Metodo.
      Nota: La concentrazione media di proteine degli omogeneati TH-S preparati alle LS da 5 mL per grammo di tessuto è 15-20 mg/mL. Gli omogeneati possono essere frazionati immediatamente o conservati a-80 ° C fino all'utilizzo.
    12. Omogeneati diluire TH-S a 10 mg/mL utilizzando ghiacciata sark buffer (tabella 1) con inibitori di proteasi e fosfatasi: 1x.
    13. Trasferire 5 mg proteina (0,5 mL) di ogni omogeneato TH-S in 500 µ l in policarbonato ultracentrifuga provette e coppia-equilibrio con buffer di sark. Caricare i tubi in un rotore pre-refrigerato e ultracentrifuga a 180.000 x g per 30 min a 4 surnatanti di trasferimento sarkosyl-solubile ° C. (S1) per provette da 1,5 mL e conservare a -80 ° C.
      Nota: (Lavaggio facoltativo) aggiungere 200 µ l di sark-tampone per l'ultracentrifuga tubi contenenti le frazioni di detersivo-insolubili (P1) e sloggiare i pellet (P1) dalla parte inferiore dei tubi ultracentrifuga utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.
    14. Tubi di
    15. brevemente impulso-spin invertito per 2-3 s (≤ 2.500 x g) in una microcentrifuga per trasferire il pellet (P1) e il buffer nelle provette da 1,5 mL qui sotto. Risospendere il pellet insolubile (P1) nel buffer di sark pipettando su e giù per assicurare il pellet è perturbato.
    16. Coppia-equilibrio e centrifugare a 180.000 x g per altri 30 min a 4 ° C.
    17. Scartare il surnatante di lavaggio opzionale (S2) e incubare i pellet sarkosyl-insolubile (P2) in 50-75 µ l di tampone di urea (tabella 1) con 1 x PIC (inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail) per 30 min a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet.
      Nota: Buffer di urea calda a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare la precipitazione di SDS. Per le applicazioni sensibili al detersivo, omettere SDS dal buffer di urea e considerare lavare il precipitato insolubile (P2) in basso tampone salino prima ematico nel buffer di urea.
    18. Trasferire il sedimento pellet (P2) in 0,5 mL provette e utilizzare breve (1 s) microtip sonicazione a 20% ampiezza (intensità massima = 40%) per solubilizzare completamente il pellet.
    19. Determinare le concentrazioni di proteina di sarkosyl-solubile (S1) e - metodo di analisi insolubile (P2) frazioni utilizzando la BCA. Utilizzare queste frazioni immediatamente o conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.

2. Immunoblotting

  1. Western blotting
    Nota: macchiare occidentale è stato eseguito secondo le procedure precedentemente segnalate con lievi modifiche. 5 , 10
    1. preparare 40 µ g campioni di totali omogeneati (TH-S), sark-solubile (S1) e le frazioni (P2) di sark insolubile nel buffer del campione di 1 X Laemmli SDS-page con pH compreso tra 5 mM TCEP 7. Incubare i campioni a 95 ° C per 5 min.
    2. Carico campione su una Bis-Tris 10 pozzetti prefabbricati 4-12% SDS-PAGE gel. Elettroforesi a 80 V per il primo centimetro (10 min) e 120 V per il resto (60 min) o fino a quando la tintura di rilevamento raggiunge il fondo del gel.
    3. Utilizzare una lama di rasoio fresco e gel coltello per Spalato-Apri il vassoio del gel prefabbricato. Tagliare delicatamente i pettini e il fondo del gel con una lama di rasoio fresco.
    4. Risospendere il pellet insolubile (P1) in 200 µ l di sark-tampone con 1 x PIC pipettando su e giù.
    5. Trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm utilizzando un metodo di trasferimento asciutto su una macchina macchiante (Vedi materiali tavolo).
    6. Bloccare la membrana in tampone bloccante (BB) senza Tween 20 per 30 min, seguita con BB con 0.05% Tween 20 (BB/T) per 30 min. Dopo il blocco, risciacquare la membrana in TBS/T (0.1% Tween 20) per 5 min rimuovere l'eccesso tampone bloccante.
    7. Preparare diluizioni di 1:1,000 della pT231 di anticorpi primari, Tau-2 (pan tau), AT8 ed EEA1 in BB/T (0.05% Tween 20).
    8. Incubare le membrane in soluzione di anticorpo primario durante la notte a 4 ° C con agitazione circolare. Lavare la membrana in TBS/T per un minimo di 3 x 15
    9. Sonda la membrana con una diluizione di 1: 20,000 di fluorescente-identificato vicino-IR anticorpo secondario in BB/T per 60 min a temperatura ambiente al buio su agitatore. Risciacquare la membrana per 3 x 10 min in TBS/T e 2 x 5 min in TBS.
    10. Scan la membrana utilizzando una porta a infrarossi imaging sistema alla lunghezza d'onda di eccitazione appropriato (ad es. 700 nm (canale rosso) per tintura infrarosso 680 capra anti-topo IgG (H + L) secondaria e 800 nm (canale verde) per tintura infrarosso 790 asino anti-rabbit IgG (H + L secondaria)).
    11. Utilizzare il software di imaging per quantificare l'intensità del segnale ed eseguire misurazioni densitometria secondo il produttore ' s istruzioni, assicurando auto-sfondo impostazione è impostata su media l'intero sfondo.

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Representative Results

Il protocollo abbreviato passo singolo sarkosyl-frazionamento è stato utilizzato per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili da controllo e cervello post mortem dell'annuncio (Figura 1). Proteine da frazioni TH-S, S1, S2 e P2 sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250. Il passo di risospensione è facoltativo in quanto c'erano livelli inosservabili della proteina nella frazione di S2 (Vedi 1.1.14). L'analisi Western blot (Figura 2A e B) dimostra chiaramente che nel cervello dell'annuncio, gli aggregati di patologico alto peso molecolare tau fosforilata erano sarkosyl-insolubile e molto poco pTau rimase nella frazioni di Sarkosyl-solubili. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 al contrario, la maggior parte dei pTau nel cervello di controllo partizionato in frazione sarkosyl-solubile. 5 , 6 , 10 al contrario, EEA1 tramezzi principalmente nella frazione del S1 in sia il controllo che il cervello dell'annuncio (Figura 2). Qui, EEA1 agisce come un indicatore generale per proteine più native, non patologici che sono intrinsecamente sarkosyl-solubile5. In particolare, c'è un po' meno segnale per EEA1 nella frazione solubile (S1) rispetto alla frazione TH-S, che indica che un pool minori di EEA1 è probabile sarkosyl-insolubile, ancora sotto il limite di rilevazione mediante western blot con questo anticorpo particolare. È altrettanto possibile che la leggera diminuzione nell'intensità del segnale di EEA1 nella frazione solubile (S1) è a causa del legame non specifico di EEA1 ai tubi ultracentrifuga potrebbe anche spiegare la leggera deviazione dai risultati attesi.

Per valutare l'efficacia del protocollo abbreviato passo singolo frazionamento (Figura 3A) contro la più tradizionale metodologia di frazionamento sequenziale multi-step (Figura 3B), i livelli relativi di sarkosyl-insolubile proteina precursore dell'amiloide (APP), tau (MAPT), piccola ribonucleoproteina nucleare U1 - 70K (snRNP70) e l'apolipoproteina E (APOE) sono stati confrontati da privo di etichetta spettrometria totale (MS) basata proteomica attraverso controllo Pool (Ctl), cognitivo lieve (MCI) e AD casi da precedenti studi7,18 (Figura 3). Misurazioni di detersivo-insolubili APP rappresenta efficacemente il peptide Aβ, come tutti i peptidi APP completamente triptico quantificato mappato sulla regione Aβ del residuo APP proteina integrale 6957. Con entrambi i metodi, i livelli di sarkosyl-insolubile di tutte le quattro proteine patologiche registrato una tendenza verso l'alto in MCI e AD casi rispetto ai controlli, coerenti con la forte correlazione del declino conoscitivo e onere patologico. Nel complesso, arricchimento di queste proteine nelle frazioni detersivo-insolubili (P2) erano notevolmente coerenti utilizzando sia il singolo-passaggio18 e di protocolli di frazionamento di multi-step7.

Tuttavia, ci sono lievi differenze tra le due metodologie che possono risultare vantaggiosa o deleteri secondo la natura esatta e obiettivi di un singolo esperimento. I dati di proteomica comparativa riassunti nella Figura 3 possono informare il protocollo da utilizzare a seconda delle applicazioni e parametri sperimentali specifici. Come ci si potrebbe aspettare, c'è un bilanciamento generale tra arricchimento del campione e purezza, con il protocollo di frazionamento semplificata offrendo più i campioni arricchiti con meno perdita di proteine rispetto al metodo multi-step.

Ad esempio, le frazioni insolubili di controllo preparate utilizzando il protocollo semplificato (Figura 3A) presentano leggermente più alti livelli di fondo di malattia-relative proteine rispetto a quelli preparati tramite l'approccio multi-step. Al contrario, la tecnica di frazionamento del passo singolo può essere vantaggiosa per basso-abbondanza proteine come il campione globale le perdite sono notevolmente ridotti. Ad esempio, il relativo arricchimento di APOE sarkosyl-insolubile in casi MCI è significativamente più alta nelle frazioni insolubili preparate tramite il protocollo abbreviato (Figura 3A).

Sebbene entrambi gli approcci sono più che adeguati osservare un aumento significativo in aggregati di proteine misfolded rilevanti per la malattia o patologica, il più numeroso e vasto frazionamento e fasi di lavaggio dell'approccio multi-step possono generare un pulitore e firma di proteomica più specifica. Tuttavia, i nostri dati verificare che il metodo di frazionamento del passo singolo è coerenza con i risultati pubblicati che gli aggregati patologici quali tau grovigli neurofibrillary (NFTs), placche Aβ e prioni scrapie (PrSc) sono insolubili in sarkosyl, mentre loro controparti nativamente piegati rimangono solubili. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26

Calcolando la quantità relativa di proteina quella partizione nelle frazioni detersivo-insolubili di controllo (n = 3) e AD (n = 3) cervello (tabella 2), solo ~ 10% del pool proteico totale è sarkosyl-insolubile. Quando 5 mg di proteina totale di omogeneato del cervello (TH-S) è frazionato, 10,4% e all'11,3% del proteoma partizioni nella frazione del detersivo-insolubili in controllo e casi di AD, rispettivamente. Anche se la quantità totale di proteina sarkosyl-insolubile arricchita nel cervello dell'annuncio è leggermente superiore di controllo, sono state osservate differenze significative tra i due gruppi (p = 0,703). Questo indica che misfolding e aggregazione non è molto diffuse nel cervello dell'annuncio, ma piuttosto limitata a un sottoinsieme stretto e specifico di proteine quali tau, Aβ e U1 snRNPs. 7 , 21 , 22

Figure 1
Figura 1: schema di frazionamento Sarkosyl. (A) A post mortem del cervello umano è stato omogeneizzato in basso tampone salino, dopo il quale sarkosyl e NaCl erano aggiunti a concentrazioni finali di 1% p/v e 0,5 M, rispettivamente e incubate per 15 min sul ghiaccio. Dopo sonicazione, gli omogeneati sono stati frazionati mediante ultracentrifugazione a 180.000 x g per 30 min che offrano il surnatante sarkosyl-solubile (S1) e il pellet sarkosyl-insolubile (P1). Il pellet di P1 (facoltativamente) è stato lavato con sark-buffer e re-sedimentato dall'ultracentrifugazione di permettersi il finale pellet sarkosyl-insolubile (P2). Questa frazione di P2 è stata solubilizzata in buffer di urea per 30 min a temperatura ambiente, seguita da 3 x 5 sonicazione di s con una sonda microtip pulito. (B) proteine (20 µ g) da TH-S, S1, S2 (10 µ l) e P2 frazioni sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con il buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 durante la notte a temperatura ambiente.

Figure 2
Figura 2: arricchimento della tau fosforilata nella frazione insolubile detergente del cervello dell'annuncio. (A e B) Proteina (40 μg) del totale (TH-S), solubile (S1) e insolubili (P2) frazioni furono cancellate con un anticorpo contro tau fosforilata a treonina 231 (pT231) o AT8 (pSer202, pThr205) per dimostrare l'arricchimento della specie patologica phospho-tau nella frazione insolubile (P2) del cervello dell'annuncio. Nel cervello dell'annuncio, ad alto peso molecolare aggregati tau esclusivamente partizioni nella frazione (P2) del detersivo-insolubili. (C) EEA1 servito come un marcatore di proteina solubile e relativo caricamento controllo per il totale (TH-S) e frazioni solubili (S1) di controllo e di cervello dell'annuncio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: analisi di proteomica di patologiche proteine AD utilizza un protocollo di frazionamento passo singolo o multi-step. Livelli relativi delle proteine sarkosyl-insolubile rappresentante APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e APOE attraverso diverse malattie tra pool controllo, casi MCI e annuncio utilizzando il singolo passaggio (A) o multi-step (B) sarkosyl approccio di frazionamento. Per entrambi i set di dati, livello della proteina è stato valutato dal peptide spettrale partite (PSMs) di questi identificate proteine e normalizzati per impostare il numero massimo di 100. PSMs da casi di controllo, MCI e annuncio (n = 5 ogni) sono stati usati per l'insieme di singolo oggetto dataset. Per l'approccio multi-step, PSMs da replicare due piscine del controllo, casi MCI e annuncio (n = 5 ogni) sono stati analizzati. Barre di errore indicano i valori di media ± s.e.m. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

soluzione al 10% w/v sarkosyl: sale di sodio 10 g N-lauril-sarcosina per 100 ml di ddH2O (mescolare a RT durante la notte)
Low Salt (LS) tampone: 50 mM HEPES pH 7.0, saccarosio 250 mM, 1 mM EDTA
Tampone Sarkosyl (sark): Buffer di LS + 1% (p/v) sarkosyl + 0.5 M NaCl
Urea tampone (conservare a -20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8.5, urea 8 M, 2% SDS
4 tampone di caricamento X SDS: 200 millimetri Tris-HCl pH 6.8, 40% glicerolo, 8% sodio dodecil suflate (SDS), 0,4% bromofenolo (BPB) e 20mm TCEP pH 7.0 in ddH2O
Coomassie fissativo buffer: 40% metanolo, acido acetico 10% in ddH2O
Buffer di colorante Coomassie Brilliant Blue G-250: 25% metanolo, acido acetico al 5%, 0,1% coomassie blue G-250 a ddH2O
Coomassie decolorare buffer: 25% metanolo, acido acetico al 5% in ddH2O
1 X Tris buffered saline (TBS): 50 mM Tris-HCl a pH 7,45, 150 mM NaCl di ddH2O
1 X Tris buffered saline con Tween 20 (TBS/T): 50 mM Tris-HCl a pH 7,45, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 ddH in2O
1 X blocco tampone (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% di proteine proprietarie (Vedi elenco dei materiali), 750 mM Methylchloroisothiazolinone in ddH2O
1 X blocco buffer con 0.05% Tween 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl a pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% di proteine proprietarie (Vedi elenco materiali), 0.05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone in ddH2O

Tabella 1: Elenco di buffer.

Campione Campione di volume (µ l) Concentrazione (µ g / µ l) Proteina totale (µ g) Proteina totale media (µ g) e s.e.m. % TH-S (5 mg)
CTL 1 70 9.89 692.3
CTL 2 70 7,38 516.6 518,7 (±99.63) 10,4%
CTL 3 70 4,96 347.2
ANNUNCIO 1 70 9.77 683,9
AD 2 70 6,67 466.9 567,0 (±63.20) 11,3%
AD 3 70 7.86 550,2

Tabella 2: Quantità di proteina in frazioni sarkosyl-insolubile (P2). In media, la percentuale di proteine che suddivide in frazione sarkosyl-insolubile di controllo (n= 3) e AD (n= 3) cervello era 10,4% e 11,3%, rispettivamente. Non c'era differenza statisticamente significativa della quantità di proteine sarkosyl-insolubile da controllo e cervello dell'annuncio, come testimoniano i da dello studente t-test (p = 0,703) e l'errore standard dei valori di media (s.e.m.).

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Discussion

Qui introduciamo e discutere un protocollo di detersivo-frazionamento passo singolo abbreviato che è applicabile a una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno dall'analisi basati sulla spettrometria di massa proteomica funzionale proteina misfolding saggi e western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 questa metodologia è forse più efficace quando usato per studiare proteinopathies neurodegenerative come l'Alzheimer, ALS, la malattia di Huntington, malattie da prioni e le taupatie vari. Rispetto al protocollo originale di frazionamento sequenziale di cinque fasi, questa procedura a passo singolo può essere completato in un solo giorno e offre risultati molto simili. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22

Un aspetto importante di questo protocollo è l'utilizzo di sarkosyl come il detersivo di frazionamento. In contrasto con altri detergenti come Triton X-100 o sodio dodecil solfato (SDS), sarkosyl sembra essere adatto a questo compito; in termini di rigore e solubilizzanti forza, è abbastanza forte per solubilizzare la maggior parte delle proteine in modo nativo piegati, preservando il detersivo-insolubilità, la struttura e la funzione degli aggregati proteici rilevanti per la malattia che sono intrinsecamente sensibili alla SDS. 5 , 9 inoltre, a differenza di SDS, sarkosyl rimane solubile a basse temperature e in condizioni di elevata sale.

Un'altra caratteristica fondamentale di questo protocollo è la risospensione del primo pellet sarkosyl-insolubile (P1) dopo il primo di ultracentrifugazione. Questo passaggio di lavaggio permette il pellet iniziale (P1) essere accuratamente estratte e lavato di qualsiasi cross-contaminazione residua proteine solubili o totale omogeneato, che offrano una frazione della proteina pura e ben definito di detersivo-insolubili. Senza il passaggio di risospensione e lavaggio pellet opzionale (P1), proteine solubili residue possono protrarsi nella frazione del detersivo-insolubili, possibilmente confondendo i risultati successivi ed esperimenti (ossia analisi immunoblotting o proteomica).

La natura insolubile e alto peso molecolare di sfide uniche presenti di proteine misfolded patologica aggregati (cioè tau phospho-tau e specie Aβ) verso il loro isolamento e analisi mediante tecniche biochimiche tradizionali. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 a differenza di proteine solubili, insolubili aggrega come amiloidi (Aβ) e i grovigli neurofibrillary tau iperfosforilata (NFTs) non possono essere facilmente purificato dal tessuto post mortem da metodi tradizionali quali immunoprecipitazione o veloce cromatografia liquida di proteine (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 in tal senso, il protocollo abbreviato sarkosyl-frazionamento è una delle tecniche uniche che permette il facile arricchimento e l'isolamento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello entro un lasso relativamente breve periodo di tempo. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27

Mentre ulteriori passaggi possono essere impiegati per isolare un campione omogeneo, puro di aggregati della proteina, il protocollo di frazionamento sarkosyl consente il facile arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili con relativamente poco impegno di tempo. 5 , 6 a sostegno di questa ipotesi, studi di proteomica del proteoma sarkosyl-insolubile confermano che la stragrande maggioranza delle proteine note di aggregazione-incline patologiche partizione sarkosyl-insolubile frazione-in entrambi tradizionali multi-step 6 , 11 , 21 così come il nostro approccio di romanzo singolo passaggio frazionamento. 5 , 7 , 9 , 10

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano la d. ssa Jim Lah e Allan Levey, Emory dipartimento di neurologia, per suggerimenti e commenti utili. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Partnership di medicina accelerando concessione (U01AG046161-02), la Emory Alzheimer malattia Research Center (P50AG025688) e un Istituto nazionale su invecchiamento concedere (R01AG053960-01) di N.T.S Questa ricerca è stata anche sostenuta in parte dal nucleo della neuropatologia della sovvenzione Emory neuroscienze NINDS Core strutture, P30NS055077.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) Thermo Fisher 78441 protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) Fisher Scientific FB505110 microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361545 refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor Beckman Coulter 362224 ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall Beckman Coulter 343776 ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer Home-made N/A SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH Thermo Fisher 77720 reducing agent
(TBS) blocking buffer Thermo Fisher 37542 blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 Thermo Fisher 37543 blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well Thermo Fisher NW04120BOX precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher B0002 SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma Aldrich L5777-50G detergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody Chemicon MAB375 antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody Millipore MAB5450 antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) Thermo Fisher MN1020 antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody abcam ab2900 antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A21058 antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A11374 antibodies
iBlot2 Dry Blotting System Thermo Fisher IB21001 Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini Thermo Fisher IB23002 Gel transfer

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References

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Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N.More

Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N. T. Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (128), e55835, doi:10.3791/55835 (2017).

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