Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/55835

Summary

Описан сокращенное фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг.

Abstract

В этом исследовании мы описываем сокращенное одноступенчатых фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг. Ионных моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) эффективно solubilizes изначально сложенном белков в ткани мозга, позволяя обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от широкий спектр нейродегенеративных proteinopathies, такие как Болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз и прионы заболеваний. Человеческого контроля и AD посмертных мозга тканей были гомогенизированные и осевших ultracentrifugation присутствии sarkosyl обогатить моющего средства нерастворимого белка агрегаты, включая патологическое фосфорилированных Тау, основной компонент нейрофибриллярных связок в AD. Западный blotting продемонстрировал дифференциального растворимость агрегированных фосфорилированных Тау и моющих средств растворимого белка, раннего Endosome Antigen 1 (ЕЕА1) управления и AD мозга. Протеомного анализа также выявлено обогащение β-амилоида (значения), Тау, snRNP70 (U1 - 70 K) и аполипопротеина Е (АРОЕ) в sarkosyl нерастворимые фракций AD мозга по сравнению с теми из элемента управления, в соответствии с предыдущей стратегии фракционирование ткани . Таким образом этот протокол простого обогащения идеально подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и функциональных белков Сопредседатель агрегации анализов массы на основе спектрометрии протеомики.

Introduction

Нейродегенеративные заболевания, как болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезни Гентингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и тесно связанных прионных заболеваний являются proteinopathies, характеризуется постепенным накоплением агрегатов моющего средства нерастворимого белка в головном мозге с сопутствующими когнитивных снижаться. 1 , 2 считается, что эта общая патологическая функция играть центральную роль в этиологии и патофизиологии этих нейродегенеративных заболеваний. 2 эти агрегаты обычно состоят из полимерных волокон амилоида, которые состоят из повторяющихся звеньев смятых протеинов экспонирования крест β-структуры. 1 , 2 , 3 , 4 биохимически, амилоида агрегаты обладают высокой устойчивостью к химическим или тепловой денатурации и солюбилизация,3 , который представляет уникальные проблемы для их очистки, анализ и исследование через традиционные биохимические методы. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 неудивительно, что моющее средство нерастворимые белковые фракции был в центре внимания многочисленных исследований в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, связанных с накоплением смятых протеинов. 6 , 12 , 13 , 14

Фракционирование биохимические методы часто были использованы для обогатить моющих средств нерастворимые фракция от гомогенатах мозга посмертных. 6 , 12 , 13 , 14 один из наиболее распространенных методов предполагает последовательное извлечение гомогенатах ткани с буферами и моющих средств увеличения жесткости, а затем ultracentrifugation для разделения фракций растворимых и нерастворимых. Часто используемых последовательных фракционирование протокола6,14 включает гомогенизацию образцов замороженные ткани в буфере моющее средство бесплатно низкой концентрацией соли (LS) и затем результирующая нерастворимых гранулы последовательно извлекаются с буферы содержащие высокий соль, неионогенные моющих средств, высоким сахарозы, ионные моющих средств и, наконец, chaotropes как мочевины. 6 , 14 очевидный недостаток такого последовательного фракционирование протоколов является значительное количество времени и труда обязательства, необходимые для их завершения. Включая гомогенизации и ultracentrifugation, типичный пятиступенчатый фракционирование протокол может занять несколько часов или даже дней для завершения. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 , Кроме того, как много патологического белка агрегатов остаются нерастворимых в всех исклучая суровых условий19,20 большинство созданных фракций имеют ограниченную ценность. Таким образом менее строгие фракционирование шаги, используя высокие концентрации соли и неионных моющих средств являются значительной степени излишним.

Предыдущие исследования показали, что ионные моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) является отличным кандидатом для упрощенной одноступенчатых стиральный порошок фракционирование протокола. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 как денатурируя моющего средства sarkosyl является достаточно строгим, чтобы солюбилизировать последнего подавляющее большинство изначально сложенном белков в мозге без растворяющие смятых протеинов агрегатов состоит из бета амилоида (значения),6,11 фосфорилированных Тау (pTau),6 TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43),14 альфа synuclein,12,13 почесуха,23 или U1 малых ядерных ribonucleoproteins (U1 snRNPs) например U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Как sarkosyl является менее строгим, чем вездесущие анионные стиральный порошок натрия лаурилсульфат (SDS), она сохраняет менее надежные олигомерных формы агрегатов смятых протеинов, которые не могут выдержать SDS лечения. 9

Ранее мы описали сокращенное моющих средств фракционирование протокол, который достигнутые результаты, сопоставимые с более трудоемкий последовательных фракционирование методологий. 5 , опустив менее жесткие шаги фракционирования, мы смогли разработать протокол снисходительный одноступенчатых фракционирование для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от посмертных человеческого мозга. 5 этот подробный протокол, описанные здесь хорошо подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и массы на основе спектрометрии протеомики к сворачиванию функциональных белков и агрегации посева assays. 5 , 6 , 21

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

этика заявление: все ткани мозга были получены от Emory Alzheimer ' s болезни исследовательский центр (АЦСБ) мозга банк. Посмертный тканях человека были приобретены по протоколам надлежащего институционального обзора Совет (IRB).

1. гомогенизации и фракционирование

  1. ткани выбор
    Примечание: замороженные ткани посмертных лобной коры от здорового управления (Ctl) и патологически подтвержденных случаев AD были отобраны из Эмори АЦСБ мозга банк (n = 2). Посмертные патологического оценки распределения амилоида доска была выполнена согласно консорциуму по созданию реестра для болезни Альцгеймера ' s болезни полуколичественного забил 24 критерии, хотя в соответствии с промежуточной системы Браак оценивали нейрофибриллярных клубок патологии. 16
    1. получить замороженные посмертных мозговой ткани от здорового управления (Ctl) и патологически подтвержденных случаях AD. Использование контейнеров сухого льда, щипцы и лезвие бритвы, акцизный ~ 250 мг части серого вещества от каждого образца ткани на тарированного одноразовые весят лодки, заботясь, чтобы предотвратить ткани от таяния. Запишите вес каждый кусок, чтобы быть гомогенизированный.
    2. Акцизных ~ 250 мг серого вещества, с помощью щипцов и бритвы проверив визуально найти взаимосвязь между внешней серого вещества и внутренний белого вещества. Избегайте белого вещества и что более важно, любой крупных кровеносных сосудов или кровавый регионов, мозговые оболочки или паутинной. Держите ткани, заморожен во время процесса резки, работает быстро и часто поместив весом лодка с ткани мозга в полистирола контейнеров с сухим ice.
    3. Запись точный вес иссечена от каждого замороженный кусок, используя аналитический баланс серого вещества. Рассчитать объем буфера (LS) с низкой концентрацией соли (см. таблицу 1) необходимые для гомогенизации dounce (5 мл/г или 20% w/v).
    4. Подготовка 10 мл LS буфер с 1 x ингибитор протеазы и фосфатазы коктейль и холод на ДВС.
    5. Удалить весил ткани и весом лодка из сухого льда и кости на примерно 2 x 2 мм куски, как он тает. Передача в 2-мл пробирку гомогенизатор предварительно охлажденные dounce на льду
    6. Добавить 5 мл/г (20% w/v) буфера ледяной с низкой концентрацией соли (LS) с 1 X коктейль АБС битор протеазы и фосфатазы.
    7. Homogenize ткани мозга на льду, используя примерно 10 ударов высокой Распродажа пестик и 15 ударов низкой Распродажа пестика б.
    8. Передачи всех огневки до 2 мл полипропиленовые трубы, с помощью стеклянной пипетки Пастера. Этикетке трубки с “ й ” (общая огневки), ткани дело номер и огневки тома. Алиготе 0,8 мл в меткой 1,5 мл трубку. Любой избыток огневки может быть аналогично aliquoted и хранятся в -80 ° C.
    9. Для каждого 0,8 мл аликвота, добавьте 100 мкл 5 М NaCl и 10% (w/v) sarkosyl в концентрации 0,5 М и 1% w/v, соответственно. Mix трубы хорошо инверсии и инкубировать на льду 15 мин метки трубы с " TH-S " (общая огневки-Sarkosyl) для обозначения, что гомогенатах находятся в sarkosyl буфера (Таблица 1).
    10. Sonicate каждая трубка для трех 5 s импульсов на 30% амплитуды на льду (максимальная интенсивность = 40%) с помощью зонда microtip.
    11. определить концентрацию белка гомогенатах, используя bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного 25 метод.
      Примечание: Средняя белка концентрацию гомогенатах TH-S, подготовленных в 5 мл LS в грамм ткани — 15-20 мг/мл. Может быть фракционированный немедленно или температуре-80 ° C до использования гомогенатах.
    12. Развести TH-S гомогенатах до 10 мг/мл, с 1 x ингибиторы протеазы и фосфатазы ледяной Сарк буфера (Таблица 1).
    13. Передачи 5 мг белка (0,5 мл) каждого TH-S огневки в 500 мкл поликарбоната ультрацентрифуга трубы и пара баланс с Сарк буфера. Загрузить трубы в предварительно охлажденные ротора и ультрацентрифугирования на 180 000 x г за 30 мин при 4 ° C. передачи sarkosyl растворимые supernatants (S1) для 1.5 мл пробирок и хранить на -80 ° C.
      Примечание: (Необязательно мыть) добавить 200 мкл Сарк-буфера ультрацентрифуга трубок, содержащих моющих средств нерастворимые дроби (P1) и выбить окатышей (P1) от нижней части ультрацентрифуга трубок с помощью кончика пипетки 200 мкл.
    14. Кратко пульс спин перевернутое трубы для 2-3 s (≤ 2500 x g) на microcentrifuge передать окатышей (P1) и буфер для 1.5 мл пробирок ниже. Ресуспензируйте нерастворимых окатышей (P1) в буфере Сарк, закупорить вверх и вниз, чтобы гранулы нарушается.
    15. Пара баланс и центрифуги на 180 000 x g для дополнительных 30 мин при 4 ° C.
    16. Отменить необязательные мыть супернатант (S2) и проинкубируйте sarkosyl нерастворимые окатышей (P2) в 50-75 мкл буфера мочевины (Таблица 1) с 1 x ПОС (протеазы и фосфатазы ингибитор коктейль) за 30 мин при комнатной температуре чтобы солюбилизировать последнего Пелле.
      Примечание: Теплый мочевины буфер к комнатной температуре перед использованием, чтобы избежать осадки SDS. Для приложений, чувствительных моющего средства, опустить SDS из буфера мочевины и рассмотреть мытье нерастворимых Пелле (P2) в низкой соли буфера перед resuspending в буфере мочевины.
    17. Передачи ресуспензированы гранулы (P2) до 0,5 мл пробирок и использовать краткий (1 s) microtip sonication на 20% амплитуды (максимальная интенсивность = 40%) чтобы полностью солюбилизировать последнего гранулы.
    18. Определяют концентрацию белка sarkosyl растворимые (S1) и - нерастворимые фракций (P2), с использованием BCA пробирного метод. Использовать эти фракции сразу или хранить при температуре-80 ° C до использования.

2. Immunoblotting

  1. , Западный blotting
    Примечание: Западный blotting была выполнена согласно сообщалось ранее процедуры с незначительными изменениями. 5 , 10
    1. подготовить 40 мкг образцы всего гомогенатах (TH-S), Сарк растворимые (S1) и Сарк нерастворимые (P2) фракций в 1 X Лэмли SDS-page буфере выборки с 5 мм TCEP pH 7. Проинкубируйте образцы на 95 ° C за 5 мин
    2. Образцы
    3. нагрузки на сборный 4-12% 10-Ну бис-трис SDS-PAGE гель. Electrophorese 80 V первый сантиметр (10 мин) и 120 V на оставшуюся (60 мин) или до тех пор, пока краска отслеживания достигает нижней части геля.
    4. Использовать свежий лезвие бритвы и гель нож Сплит-открыть кассетный сборного гель. Аккуратно отрезать Расчески и самой нижней части гель с лезвием бритвы свежий.
    5. Ресуспензируйте нерастворимых окатышей (P1) в 200 мкл Сарк буфер с 1 x ПОС, закупорить вверх и вниз.
    6. Передачи на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм, с помощью метода сухой передачи на blotting машине (см. таблицу материалы).
    7. Блокирует мембраны в блокирующем буфере (BB) без анимации 20 30 мин, затем с BB с 0,05% Tween-20 (BB/T) за 30 мин. После блокирования, Промойте мембрану в TBS/T (0,1% анимации 20) на 5 минут, чтобы удалить избыток блокирующий буфер.
    8. Подготовка 1:1,000 разведений первичных антител pT231, Тау-2 (Пан Тау), AT8 и ЕЕА1 в BB/T (анимации 20 0,05%).
    9. Инкубации мембран в раствор первичных антител на ночь при 4 ° C с круговой агитации. Промойте мембрану в TBS/T для 3 x 15 мин
    10. Зонд мембраны с топографической разрежения дневно меченых вблизи IR вторичные антитела в BB/T 60 мин при комнатной температуре в темноте на шейкер. Промойте мембрану 3 x 10 мин в TBS/T и 2 x 5 мин в TBS.
    11. Проверять мембрану с помощью инфракрасной системы на длине волны возбуждения соответствующую (например 700 Нм (красный канал) для инфракрасного краситель 680 коза анти мыши IgG (H + L) среднего и 800 Нм (зеленый канал) для инфракрасного краситель 790 осла анти кролик IgG (H + L вторичные)).
    12. Использование изображений программное обеспечение для количественного определения интенсивности сигнала и выполнять замеры денситометрия согласно производителя ' s инструкции, обеспечение auto фоновый параметр равным средний весь фон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сокращенная сингл шаг sarkosyl фракционирование протокол был использован для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от контроля и AD посмертных мозга (рис. 1). Белки из й-S, S1, S2 и P2 фракций были решены путем SDS-PAGE, фиксированный за 15 мин в Кумасси синий фиксирующие буфера следуют нежный Окрашивание Кумасси синим G-250 окрашивание буфера. Ресуспендирования шаг является необязательным, так как там были неопределяемого уровня белка в S2 фракции (см. 1.1.14). Западный анализ помаркой (рисунок 2A и B) ясно показывает, что в мозге AD, агрегаты патологического высоким молекулярным весом фосфорилированных Тау были sarkosyl нерастворимые, и осталось очень мало pTau sarkosyl растворимых фракций. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 и наоборот, большинство pTau в мозге управления разделены на sarkosyl растворимая фракция. 5 , 6 , 10 в отличие от ЕЕА1 главным образом перегородки в S1 дроби как управления, так и AD мозга (рис. 2 c). Здесь ЕЕА1 выступает в качестве общего маркера для наиболее родной, не патологических белков, которые являются по своей сути sarkosyl растворимые5. В частности есть немного меньше сигнал для ЕЕА1 в растворимая фракция (S1) по сравнению с TH-S дроби, о том, что незначительные пул ЕЕА1 вероятно sarkosyl нерастворимые, еще ниже предела обнаружения по Вестерн-блот с этой конкретной антитела. Это также возможно, что небольшое снижение в силу сигнала ЕЕА1 в растворимая фракция (S1) обусловлено неспецифической привязки ЕЕА1 ультрацентрифуга труб может также объяснить незначительное отклонение от ожидаемых результатов.

Для сравнения эффективности протокола сокращенное одноступенчатых фракционирование (Рисунок 3А) против более традиционной многоступенчатой последовательных фракционирование методологии (рисунок 3B), относительные уровни sarkosyl нерастворимые амилоидоподобные прекурсоров протеина (APP), Тау (МКВ), малые ядерные рибонуклеопротеида U1 - 70K (snRNP70) и аполипопротеина Е (АРОЕ) были сопоставлены на лейбл бесплатные масс-спектрометрия (МС) на основе протеомики через объединенного контроля (Ctl), легкого когнитивного расстройства (MCI) и AD случаи от предыдущих исследований7,18 (рис. 3). Измерения моющих средств нерастворимые APP эффективно представляет значения пептида, как все полностью tryptic APP пептиды количественно сопоставляются значения региона белка полная длина 695 остатков приложения7. С помощью обоих методов sarkosyl нерастворимые уровни всех четырех патологических белков отклонялись вверх в MCI и AD случаях относительно элементов управления, в соответствии с сильной корреляции когнитивными и патологических бремя. В целом обогащения этих белков в моющих средств нерастворимые дроби (P2) удивительно согласуются, используя единый этапа18 и многоэтапного фракционирование протоколы7.

Есть, однако, небольшие различия между двумя методологиями, которые могут оказаться выгодным или вредного в зависимости от характера и целей отдельных эксперимента. Сравнительные протеомических данных, обобщены в рисунке 3 может сообщить какой протокол использовать в зависимости от конкретных экспериментальных параметры и приложения. Как можно было ожидать, существует общий компромисс между образца обогащения и чистоты, с упрощенной фракционирование протоколом, обеспечивающим более обогащается образцы с меньше потери белка, чем метод многоступенчатой.

Например управления нерастворимых фракций, подготовлен с использованием упрощенного протокола (рис. 3A) демонстрируют несколько выше фоновых уровней заболевания соответствующих белков чем те, которые подготовлены через многоэтапный подход. И наоборот фракционирование одношаговый метод может быть выгодным для низкого изобилие белки как общего образца, который значительно снижаются потери. Например относительная обогащения sarkosyl нерастворимые АРОЕ в MCI случаях значительно выше в нерастворимые фракций, подготовлен сокращенный протоколу (рисA).

Хотя оба подхода являются более чем достаточным для наблюдения за любое существенное увеличение болезнь отношение или патологического белка смятых агрегатов, более многочисленные и обширные фракционирования и мыть шаги многоступенчатого подхода может генерировать пылесос и более конкретные proteomic подпись. Тем не менее наши данные убедитесь, что метод фракционирования сингл шаг согласуется с опубликованных выводах, что патологический агрегатов как Тау нейрофибриллярных клубков (NFTs), значения бляшек и скрепи прионы (ScPr) нерастворим в sarkosyl, Хотя их изначально сложенном партнерами остаются растворимые. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26

Путем расчета относительного количества белков, которые разделения на фракции нерастворимого моющего средства управления (n = 3) и AD (n = 3) мозга (Таблица 2), только ~ 10% от общего белка пула sarkosyl нерастворимые. Когда фракционированный 5 мг общего белка мозг огневки (TH-S), 10,4% и 11,3% протеома перегородки в моющих средств нерастворимые фракция в области контроля и случаев AD, соответственно. Хотя общее количество sarkosyl нерастворимого белка обогащенного в AD мозг немного выше, чем контроль, никаких существенных различий были замечены в двух группах (p = 0,703). Это означает, что сворачиванию белков и агрегирование не является распространенной в AD мозга, но довольно ограничены подмножеством белков, таких как Тау, значения и U1, узкие и конкретные snRNPs. 7 , 21 , 22

Figure 1
Рисунок 1: схема фракционирование Sarkosyl. (A) A посмертных человеческий мозг был гомогенизированные низкой соли буфере, после чего sarkosyl и NaCl были добавлены к окончательной концентрации 1% w/v и 0,5 М, соответственно и инкубировали в течение 15 минут на льду. После sonication гомогенатах были фракционированный, ultracentrifugation на 180 000 x g 30 мин sarkosyl растворимые супернатант (S1) и sarkosyl нерастворимые Пелле (P1). Пелле P1 была (опционально) омывается с Сарк буфера и ре отложившейся ultracentrifugation позволить себе окончательное Пелле sarkosyl нерастворимые (P2). Эта часть P2 была солюбилизирован в буфере мочевины для 30 мин при комнатной температуре, следуют 3 x 5 s sonication с чистой microtip зонд. (B) белки (20 мкг) от TH-S, S1, S2 (10 мкл) и P2 фракций были урегулированы SDS-PAGE, фиксированный за 15 мин в Кумасси синий фиксирующие буфера следуют нежный Окрашивание Кумасси синим G-250 окрашивание буфера на ночь при комнатной температуре.Figure 2
Рисунок 2: обогащение фосфорилированных-Тау стиральный порошок нерастворимых доли мозга AD. (A и B) Белка (40 мкг) от общего числа (TH-S), растворимый (S1) и нерастворимых (P2) фракции были смыты с антитело против Тау фосфорилированных на треонин 231 (pT231) или AT8 (pSer202, pThr205) для демонстрации в обогащение видов патологической фосфо Тау в нерастворимые дроби (P2) AD мозга. В мозге AD, высокой молекулярной массой агрегированы Тау исключительно разделов в моющих средств нерастворимые дроби (P2). (C) ЕЕА1 служил растворимого белка маркера и относительной загрузки для всего (TH-S) и растворимых фракций (S1) управления и AD мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Proteomic анализ патологических AD белков, с помощью протокола пошагово или многоэтапный фракционирования. Относительные уровни представитель sarkosyl нерастворимые белки APP (значения), Тау, snRNP70 (U1 - 70K) и АРОЕ через различных заболеваний среди управления, MCI и объявление дела, используя один шаг (A) или многоэтапный (B) sarkosyl фракционирование подход. Для обоих наборов данных уровень белка оценивалась пептид спектральных матчи (PSMs) этих определенных белков и нормализуется установить максимум до 100. PSMs от случаев контроля, MCI и AD (n = 5 каждый) были использованы для одного набора dataset. Многоэтапный подход, PSMs из двух репликации пулов контроля, MCI и объявление дела (n = 5 каждый) были проанализированы. Планки погрешностей указывают значения среднее ± S.E.M. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

10% w/v sarkosyl решение: 10 g N-лаурил sarcosine натриевой соли на 100 мл ddH2O (перемешать в РТ на ночь)
Низкая соль (LS) буфера: 50 мм HEPES рН 7,0, сахароза 250 мм, 1 мм ЭДТА
Sarkosyl (Сарк) буфера: Буфер LS + 1% (w/v) sarkosyl + 0.5 М NaCl
Мочевина буфера (магазин при -20 ° C): 50 мм трис-HCl рН 8,5, мочевина 8 М, 2% SDS
4 X SDS загрузки буфера: 200 мм трис-HCl pH 6.8, 40% глицерина, 8% натрия Додециловый suflate (SDS), 0,4% бромфеноловый синий (BPB) и 20 мм TCEP pH 7.0 ddH2O
Кумасси фиксирующие буфера: 40% метанола, 10% уксусной кислоты в ddH2O
Окрашивание Кумасси синим G-250 буфер: 25% метанола, 5% уксусной кислоты, 0.1% Кумасси синий G-250 в ddH2O
Кумасси Отмойте буфера: 25% метанола, 5% уксусной кислоты в ddH2O
1 X Tris буфер солевой раствор (TBS): 50 мм трис-HCl рН 7.45, 150 мм NaCl в ddH2O
1 X Tris буфер солевой раствор с Tween-20 (TBS/T): 50 мм трис-HCl рН 7.45, 150 мм NaCl, 0.1% анимации 20 в ddH2O
1 X блокирует буфер (BB): 50 мм трис-HCl рН 7.45, 150 мм NaCl, 1% собственных белков (см. перечень материалов), 750 мм, метилхлоризотиазолинон ddH2O
1 X блокирует буфер с 0,05% Tween-20 (BB/T): 50 мм трис-HCl рН 7.45, 150 мм NaCl, 1% собственных белков (см. перечень материалов), 0,05% Tween-20, 750 мм метилхлоризотиазолинон в ddH2O

Таблица 1: Список буферов.

Пример Объем образца (мкл) Концентрация (мкг/мкл) Общий белок (мкг) Средний общий белок (мкг) и S.E.M. % TH-S (5 мг)
CTL 1 70 9.89 692.3
CTL 2 70 7.38 516.6 518.7 (±99.63) 10,4%
CTL 3 70 4.96 347,2
ОБЪЯВЛЕНИЕ 1 70 9.77 683.9
ОБЪЯВЛЕНИЕ 2 70 6.67 466.9 567.0 (±63.20) 11,3%
ОБЪЯВЛЕНИЯ 3 70 7,86 550.2

Таблица 2: Количество белка в sarkosyl нерастворимые дроби (P2). В среднем доля белка, перегородки в sarkosyl нерастворимая часть управления (n= 3) и AD (n= 3) мозг был 10,4% и 11,3%, соответственно. Там было статистически значимой разницы суммы sarkosyl нерастворимые белки от контроля и AD мозга, что подтверждается от студента t-тест (p = 0,703) и стандартная ошибка (S.E.M.) значений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем и обсудить сокращенное одноступенчатых моющих средств фракционирование протокол, который применяется для широкого ряда экспериментальных приложений, начиная от массы на основе спектрометрии протеомики анализа функциональных белков сворачиванию анализов и Западный blotting. 5 , 6 , 7 , 10 данная методология, пожалуй, наиболее эффективным при использовании для изучения нейродегенеративных proteinopathies таких как болезнь Альцгеймера, ALS, Хантингтон болезни, прионы заболеваний и различных tauopathies. По сравнению с оригинального протокола пятиступенчатый последовательных фракционирования, эта процедура один шаг может быть завершена в течение одного дня и дает очень близкие результаты. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22

Важным аспектом этого протокола является использование sarkosyl в качестве фракционирования моющего средства. В отличие от других моющих средств как Тритон X-100 или натрия Додециловый сульфат (SDS) sarkosyl, как представляется, хорошо подходит для выполнения этой задачи; с точки зрения строгости и растворяющие прочность это достаточно сильны, чтобы солюбилизировать последнего большинство изначально сложенном белков при сохранении моющих средств нерастворимость, структура и функции агрегатов болезни соответствующих белков, которые являются неотъемлемыми чувствителен к SDS. 5 , 9 Кроме того, в отличие от SDS, sarkosyl остается растворим при низких температурах и в условиях высокого соли.

Еще одной ключевой особенностью настоящего Протокола является ресуспендирования первые окатыши (P1) sarkosyl нерастворимые после первого раунда ultracentrifugation. Этот шаг мыть позволяет первоначальный окатышей (P1) должны быть тщательно извлечены и промывают любого остаточного загрязнения крест растворимые или всего огневки белков, обеспечивающим чистый и четкий моющих средств нерастворимые белковых фракций. Без ресуспендирования и мыть шаг необязательный Пелле (P1) остаточная растворимые белки могут быть осуществляется над в моющих средств нерастворимые дроби, возможно смешение последующие результаты и эксперименты (т.е. immunoblotting или протеомики анализ).

Нерастворимый и высокой молекулярной массой характер патологического смятых протеинов агрегатов (т.е. Тау, фосфо Тау и Aβ видов) настоящему уникальных задач к их изоляции и анализа через традиционные биохимические методы. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 в отличие от растворимые белки, нерастворимые агрегатов например Амилоиды (значения) и hyperphosphorylated Тау нейрофибриллярных клубков (NFTs) не может быть легко очищенного от посмертных ткани традиционными методами, такими как иммунопреципитации или быстро белка жидкостной хроматографии (ПСОК). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 таким образом, сокращенно sarkosyl фракционирование протокол является одним из только методы, которые позволяет легким обогащением и изоляции агрегатов моющего средства нерастворимого белка от посмертных мозга в сравнительно короткие сроки. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27

В то время как дополнительные шаги могут быть использованы для изоляции образец чистой, однородных агрегированных белка, sarkosyl фракционирование протокол позволяет легким обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов с сравнительно мало времени обязательства. 5 , 6 в поддержку этой гипотезы, протеомических исследований sarkosyl нерастворимые протеома подтверждают, что подавляющее большинство известных патологических подверженных агрегации белков разделить на sarkosyl нерастворимые фракция в обоих традиционным многоэтапного 6 , 11 , 21 , а также наш Роман одноступенчатых фракционирование подход. 5 , 7 , 9 , 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Drs. Джим Lah и Аллан Levey, Эмори Кафедра неврологии, за полезные замечания и предложения. Эта работа частично финансируется путем ускорения медицины партнерство гранта (U01AG046161-02), Emory Альцгеймера болезнь научно-исследовательский центр (P50AG025688) и Национальный институт по проблемам старения предоставить (R01AG053960-01) N.T.S. Это исследование было также поддержано в невропатологии ядро Эмори неврологии NINDS основной зал Грант, P30NS055077.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) Thermo Fisher 78441 protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) Fisher Scientific FB505110 microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361545 refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor Beckman Coulter 362224 ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall Beckman Coulter 343776 ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer Home-made N/A SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH Thermo Fisher 77720 reducing agent
(TBS) blocking buffer Thermo Fisher 37542 blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 Thermo Fisher 37543 blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well Thermo Fisher NW04120BOX precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher B0002 SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma Aldrich L5777-50G detergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody Chemicon MAB375 antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody Millipore MAB5450 antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) Thermo Fisher MN1020 antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody abcam ab2900 antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A21058 antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A11374 antibodies
iBlot2 Dry Blotting System Thermo Fisher IB21001 Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini Thermo Fisher IB23002 Gel transfer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
  23. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 128 нейродегенеративные агрегации невропатология proteostasis proteinopathy амилоида Тау sarkosyl фракционирование
Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N.More

Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N. T. Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (128), e55835, doi:10.3791/55835 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter