Summary
Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.
Abstract
En este estudio, se describe un protocolo abreviado fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. El detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) efectivamente solubiliza proteínas forma nativa plegadas en el tejido cerebral que permite el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de una amplia gama de proteinopatías neurodegenerativas, tales como Enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades priónicas. Control humano y los tejidos del cerebro post mortem AD fueron homogeneizadas y sedimentados por ultracentrifugación en presencia sarkosyl enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente incluyendo patológica tau fosforilada, el componente principal de ovillos enredos en AD. Western Blot demostró la solubilidad diferencial de agregados tau fosforilado y la proteína soluble en detergente, temprano Endosome antígeno 1 (EEA1) en control y el cerebro de AD. Análisis proteómico también revelaron enriquecimiento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) y apolipoproteína E (APOE) en las fracciones insolubles en sarkosyl de AD cerebral comparados con los de control, consistente con anteriores estrategias de fraccionamiento de tejido . Así, este Protocolo simple enriquecimiento es ideal para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde borrar occidental y funcional de la proteína ensayos de agregación Co proteómica basada en espectrometría de masa.
Introduction
Enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de prión estrechamente relacionados son proteinopatías caracterizada por la acumulación gradual de agregados de proteína insoluble en detergente en el cerebro con el acompañamiento cognitivo disminución. 1 , 2 esta característica patológica común se cree que desempeñan un papel central en la etiología y la patofisiología de estas enfermedades neurodegenerativas. 2 estos agregados consisten en típicamente poliméricas fibras amiloides, que se componen de unidades de proteínas mal plegadas que Cruz β-estructura. 1 , 2 , 3 , 4 bioquímico, agregados amiloides son altamente resistentes a la desnaturalización térmica o química y solubilización,3 que presenta retos únicos para su purificación, análisis y estudian por medio de técnicas bioquímicas tradicionales. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , la fracción de proteína insoluble en detergente ha sido el foco de mucha investigación en la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas que implica la acumulación de proteínas mal plegadas. 6 , 12 , 13 , 14
Técnicas de fraccionamiento bioquímico a menudo han sido utilizadas para enriquecer la fracción insoluble en detergente de homogenados de cerebro post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno de los métodos más comunes consiste en la extracción secuencial de homogenados de tejido con tampones y detergentes de aumentar rigor, seguido por ultracentrifugación para dividir las fracciones solubles e insolubles. Un protocolo comúnmente usado fraccionamiento secuencial6,14 implica la homogeneización de las muestras de tejido congelado en un tampón libre de detergente bajo en sal (LS) y los pellets insolubles resultantes entonces son extraídos secuencialmente con buffers que contengan alta sal, detergentes no iónicos, alta sacarosa, detergentes iónicos y finalmente chaotropes como urea. 6 , 14 un inconveniente obvio de tales protocolos de fraccionamiento secuencial es el substancial del tiempo y el compromiso de la mano de obra necesaria para completarlos. Homogeneización y ultracentrifugación, un protocolo típico fraccionamiento de cinco pasos puede tomar varias horas o incluso días. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 además, tantos agregados de proteína patológica permanecen insolubles en casi todos las más duras condiciones19,20 la mayoría de las fracciones generadas son de valor limitado. Así, los pasos de fraccionamiento menos-rigurosos utilizando altas concentraciones de sal y detergentes no iónicos son en gran medida redundantes.
Estudios previos han demostrado que el detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) es un excelente candidato para un protocolo simplificado solo paso detergente fraccionamiento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 como un desnaturalización detergente sarkosyl es lo suficientemente estricta como para solubilizar la gran mayoría de proteínas de forma nativa plegadas en cerebro sin solubilización agregados de proteínas mal plegadas compuestos de beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilada (pTau),6 proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43),14 alfa-sinucleína,12,13 tembladera,23 o U1 ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs U1) como U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Como sarkosyl es menos estricto que el dodecil sulfato de sodio detergente aniónico ubicua (SDS), conserva formas oligoméricas menos robustas de agregados de proteínas mal plegadas que no pueden soportar el tratamiento de la SDS. 9
Anteriormente, hemos descrito un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento que logra resultados comparables a la metodología de fraccionamiento secuencial más laboriosa. 5 por omitir las medidas menos estrictas de fraccionamiento, hemos sido capaces de desarrollar un protocolo de fácil fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. 5 este protocolo detallado descrito en este documento es adecuado para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde el Western Blot y análisis de proteómica basada en espectrometría de masa mal plegamiento de proteínas funcionales y siembra de agregación. 5 , 6 , 21
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Protocol
declaración de ética: todos los tejidos del cerebro fueron obtenidos de la Emory de Alzheimer ' s enfermedad investigación centro (ADRC) Banco de cerebros. Tejidos humanos post mortem fueron adquiridos bajo adecuados protocolos de la Junta de revisión institucional (IRB).
1. homogeneización y fraccionamiento
- selección de tejido
Nota: congelados de tejido post mortem corteza frontal de control sano (Ctl) y patológico casos confirmados de AD fueron seleccionados de la Emory Banco de cerebros ADRC (n = 2). Evaluación neuropathological post mortem de la distribución de la placa amiloide fue realizada según el consorcio establecer un registro de Alzheimer ' s enfermedad semicuantitativo de puntuación criterios 24, aunque patología neurofibrilares fue evaluado de acuerdo con el sistema de estadiaje de Braak. 16- obtener congelados de tejido cerebral post mortem de control sano (Ctl) y patológico confirmó casos de AD. Utilizando contenedores de hielo seco, pinzas y una navaja, suprimir ~ porciones de 250 mg de materia gris de cada muestra de tejido en desechables previamente tarado pesan barcos, teniendo cuidado de evitar que el tejido descongelado. Registrar el peso de cada pieza a ser homogeneizado.
- Impuesto especial ~ 250 mg de materia gris usando pinzas y navajas por inspeccionar visualmente para localizar la interfaz entre el exterior materia gris y materia blanca interior. Evitar que la materia blanca y lo más importante, cualquier vasos sanguíneos o regiones sangrientas, meninges o aracnoides. Mantener el tejido congelado durante el proceso de corte trabajando rápidamente y con frecuencia colocando peso barco con tejido cerebral en contenedores de poliestireno con hielo seco
- Registrar el peso exacto de la materia gris de cada pieza congelada utilizando una balanza analítica. Calcular el volumen de tampón bajo en sal (LS) (ver tabla 1) necesarios para la homogeneización de dounce (5 mL/g o 20% w/v).
- Preparar 10 mL LS de tampón 1 x inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel y frialdad de hielo.
- Eliminar el tejido pesado y pesaje del barco de hielo seco y dados en trozos de aproximadamente 2 x 2 mm como deshiela. Transfiéralo a un tubo de homogeneizador de 2 mL dounce previamente enfriado en hielo.
- Añadir 5 mL/g (20% w/v) de tampón de helado bajo en sal (LS) con 1 X inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel.
- Homogeneizar el tejido de cerebro en hielo, mediante aproximadamente 10 movimientos de separación alta Maja A y 15 golpes de mortero de baja holgura B.
- Transferencia de homogeneizado de todos a un tubo de polipropileno de 2 mL con un pipeta Pasteur de vidrio. Etiquetar el tubo con “ TH ” (homogenado Total), el tejido del caso número y volumen de homogenado. alícuota 0,8 mL en un tubo de 1,5 mL etiquetado. Cualquier exceso homogeneizado puede ser semejantemente alícuotas y almacenados a -80 ° C.
- a cada 0,8 mL de alícuota, añada 100 μl de 5 M NaCl y sarkosyl 10% (p/v) a concentraciones de 0,5 y 1% w/v, respectivamente. Tubos de mezclar bien por inversión e incubar en hielo por 15 minutos los tubos etiqueta con " TH-S " (homogeneizado Total-Sarkosyl) para indicar que los homogenados en sarkosyl-buffer (tabla 1).
- Someter a ultrasonidos cada tubo de impulsos tres 5 s en amplitud de 30% en el hielo (intensidad máxima = 40%) utilizando una sonda de microtip.
- determinar las concentraciones de proteína de los homogenados del ácido bicinchoninic (BCA) ensayo 25 método.
Nota: La concentración promedio de proteína de TH S homogenados preparados en LS de 5 mL por gramo de tejido es 15-20 mg/mL. Los homogenados pueden ser fraccionada inmediatamente o almacenadas a-80 ° C hasta su uso. - TH-S diluir homogenados a 10 mg/mL con buffer de sark helada (tabla 1) 1 x inhibidores de la proteasa y fosfatasa. Proteína de
- transferencia 5 mg (0,5 mL) de cada homogenado TH S en 500 μl policarbonato ultracentrífuga tubos y par-equilibrio con tampón de sark. Cargar tubos en un rotor previamente enfriada y ultracentrífuga a 180.000 x g durante 30 min en sobrenadantes de transferencia sarkosyl-soluble 4 ° C. (S1) para tubos de 1,5 mL y guardar a -80 ° C.
Nota: (Lavado opcional) Añadir 200 μL de tampón de sark en la ultracentrífuga tubos que contienen las fracciones insolubles en detergente (P1) y desalojar los pellets (P1) de la parte inferior de los tubos de la ultracentrífuga utilizando una pipeta de 200 μl.
Tubos de - brevemente pulso spin la invertida para 2-3 s (≤ 2.500 x g) en una microcentrífuga para transferir el pellets (P1) y buffer a los tubos de 1,5 mL a continuación. Resuspender los gránulos insolubles (P1) en el búfer de sark transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de la pelotilla se interrumpe.
- El equilibrio de par y centrifugar a 180.000 x g durante un adicional 30 min a 4 ° C.
- Descarte el sobrenadante del lavado opcional (S2) e incubar los pellets sarkosyl insoluble (P2) en 50-75 μl de tampón de urea (cuadro 1) con 1 x PIC (inhibidor de proteasa y fosfatasa cóctel) durante 30 min a temperatura ambiente para solubilizar el pellets de.
Nota: Urea caliente la memoria intermedia a la temperatura ambiente antes de su uso para evitar la precipitación de la SDS. Para aplicaciones sensibles al detergente, omitir SDS desde el búfer de urea y considerar lavado el precipitado insoluble (P2) en tampón salino bajo antes de resuspender en tampón urea. - Transferir las pelotillas resuspendidas (P2) a tubos de 0.5 mL y uso breve (1 s) microtip sonicación en 20% de amplitud (intensidad máxima = 40%) para solubilizar completamente las pelotillas.
- Determinar las concentraciones de proteína del sarkosyl-soluble (S1) y - insolubles fracciones (P2) con el BCA método de ensayo. Utilice estas fracciones inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta su uso.
2. Immunoblotting
- Western blotting
Nota: borrar occidental fue realizado según los procedimientos previamente divulgados con leves modificaciones. 5 , 10- preparar 40 μg muestras de homogenados total (TH-S), soluble en sark (S1) y fracciones de sark-insoluble (P2) en el tampón de muestra Laemmli SDS-page de X 1 con pH de 5 mM TCEP 7. Incubar las muestras a 95 ° C por 5 min
- Carga de muestras en un prefabricado 10-pozo 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel. Electrophorese 80 V para el primer centímetro (10 min) y 120 V para el resto (60 min) o hasta que el tinte de seguimiento alcance la parte inferior del gel.
- Utilizar una nueva hoja de afeitar y un cuchillo de gel para split-abrir el cartucho de gel prefabricado. Con cuidado corte el peines y parte inferior del gel con una cuchilla de afeitar nueva.
- Volver a suspender los pellets insolubles (P1) en 200 μL de tampón de sark con 1 x PIC mediante pipeteo arriba y abajo.
- Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0.2 μm utilizando un método de transferencia en seco en una máquina de Blot (ver la tabla de materiales).
- Bloquear la membrana en solución amortiguadora de bloqueo (BB) sin Tween 20 durante 30 min, seguida con BB con 0,05% Tween 20 (BB/T) para 30 minutos. Después de bloquear, enjuagar la membrana en TBS/T (0,1% Tween 20) por 5 min eliminar el exceso de tampón bloqueo. 1:1,000 de
- preparar diluciones de los anticuerpos primarios pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 y EEA1 en BB/T (0,05% Tween 20).
- Incubar las membranas en solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C con agitación circular. Enjuagar la membrana en TBS/T 3 x 15 min Anticuerpo secundario cercano-IR de
- punta de prueba de la membrana con una dilución de 1: 20.000 de la marcada con fluorescencia, en BB/T durante 60 min a temperatura ambiente en oscuridad en coctelera. Enjuagar la membrana para 3 x 10 min en TBS/T y 2 x 5 minutos en TBS.
- Analizar la membrana usando un infrarrojo sistema de la longitud de onda de excitación apropiada (por ejemplo 700 nm (canal rojo) para tinte infrarrojo 680 cabra anti-mouse IgG (H+L) secundaria y 800 nm (canal verde) para tinte infrarrojo 790 burro anti-rabbit IgG (H+L de imagen secundaria)).
- Uso del software de proyección de imagen para cuantificar la intensidades de la señal y realizar mediciones de densitometría según el fabricante ' instrucciones, asegurando el ajuste de auto-fondo se establece en promedio el fondo entero.
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Representative Results
El protocolo abreviado solo paso sarkosyl-fraccionamiento fue utilizado para enriquecer a agregados de proteína insoluble en detergente de control y cerebro post mortem AD (figura 1). Proteínas de fracciones TH S, S1, S2 y P2 fueron resueltas por SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie. El paso de resuspensión es opcional puesto que había niveles indetectables de proteína en la fracción S2 (véase 1.1.14). Análisis de Western blot (figura 2A y B) demuestra claramente que en cerebro de AD, los agregados patológicos tau fosforilada de alto peso molecular son insolubles en sarkosyl, y muy poco pTau permaneció en el fracciones solubles en Sarkosyl. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 por el contrario, la mayoría de pTau en cerebro de control repartido en la fracción soluble en sarkosyl. 5 , 6 , 10 en cambio, EEA1 principalmente las particiones en la fracción S1 en control y cerebro de AD (figura 2). Aquí, EEA1 actúa como un marcador general para proteínas más nativos, no patológicas que son inherentemente sarkosyl-soluble5. En particular, es un poco menos señal para EEA1 en la fracción soluble (S1) en comparación con la fracción de TH-S, que indica que un grupo menor de EEA1 es probable sarkosyl-insoluble, sin embargo por debajo del límite de detección por western blot con este anticuerpo particular. Es igualmente posible que la leve disminución en la intensidad de la señal de EEA1 en la fracción soluble (S1) es debido a la Unión inespecífica de EEA1 a los tubos de la ultracentrífuga también podría explicar la leve desviación de los resultados esperados.
Para comparar la eficacia del protocolo abreviado fraccionamiento solo paso (Figura 3A) contra la tradicional metodología de fraccionamiento secuencial de pasos múltiples (figura 3B), los niveles relativos de sarkosyl-insoluble proteína precursora de amiloide (APP), tau (MAPT), ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 - 70K (snRNP70) y la apolipoproteína E (APOE) se compararon por etiqueta-libre espectrometría de masas (MS) basado en proteómica a través de los control (Ctl), deterioro cognitivo leve (DCL) y AD casos de anteriores estudios7,18 (figura 3). Medidas de aplicación detergente-insolubles efectivamente representa el péptido Aβ, como los péptidos APP completamente trípticos cuantificado trazado a la región de Aß de la longitud total 695 residuos APP proteína7. Con ambos métodos, los niveles de sarkosyl insoluble de las cuatro proteínas patológicas marcado una tendencia hacia arriba en casos de MCI y anuncios en relación con los controles, consistentes con la fuerte correlación del deterioro cognitivo y la carga patológica. En general, enriquecimiento de estas proteínas en las fracciones insolubles en detergente (P2) fueron notablemente coherentes solo paso18 y el de fraccionamiento de pasos múltiples protocolos7.
Sin embargo, hay ligeras diferencias entre las dos metodologías que pueden resultar ventajosas o perjudiciales dependiendo de la naturaleza exacta y los objetivos de un experimento individual. La información proteómica comparativa resumida en la figura 3 puede informar a que el protocolo a utilizar dependiendo de los parámetros experimentales específicos y aplicaciones. Como es de esperar, hay un equilibrio general entre el enriquecimiento de la muestra y la pureza, con el protocolo de fraccionamiento simplificado con más enriquecida las muestras con menos pérdida de proteína que el método de paso múltiples.
Por ejemplo, fracciones insolubles de control preparados usando el protocolo simplificado (Figura 3A) exhiben niveles de fondo ligeramente superiores de proteínas relevantes a la enfermedad que los preparados vía el acercamiento multi-step. Por el contrario, la técnica de fraccionamiento de solo paso puede ser ventajosa para las proteínas de baja abundancia como la muestra global, las pérdidas se reducen considerablemente. Por ejemplo, el enriquecimiento relativo de APOE sarkosyl-insoluble en los casos MCI es significativamente mayor en las fracciones insolubles preparadas mediante el protocolo abreviado (figura 3A).
Aunque ambos enfoques son más que suficiente para observar cualquier incremento significativo en agregados de proteínas mal plegadas enfermedad relevante o patológica, la más numerosa y amplia fraccionamiento y pasos de lavado del enfoque multi-step pueden generar un limpiador y firma de proteómica más específica. Sin embargo, nuestros datos verificar que el método de fraccionamiento de solo paso es consistente con los resultados publicados que agregados patológicos como los enredos de neurofibrillary tau (NFTs), placas de Aß y priones de scrapie (PrSc) son insolubles en sarkosyl, mientras que sus homólogos de forma nativa plegadas permanecen solubles. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Mediante el cálculo de las cantidades relativas de proteína que en las fracciones insolubles en detergente de control (n = 3) y AD (n = 3) cerebro (tabla 2), solamente ~ 10% de la piscina de la proteína total es insoluble en sarkosyl. Cuando 5 mg de proteína total de homogeneizado de cerebro (TH-S) es fraccionado, 10.4% y 11,3% del proteoma particiona en la fracción insoluble en detergente en control y AD, respectivamente. Aunque la cantidad total de proteína insoluble en sarkosyl enriquecida en el cerebro de AD es ligeramente superior de control, diferencias significativas no se observaron entre los dos grupos (p = 0.703). Esto indica que mal plegamiento de proteínas y la agregación no es generalizadas en el cerebro de AD, pero más bien se limita a un subconjunto estrecho y específico de proteínas como el tau, Aβ y U1 snRNPs. 7 , 21 , 22
Figura 1: esquema de fraccionamiento Sarkosyl. (A) A cerebro humano postmortem se homogeneizó en tampón salino bajo, después de lo cual sarkosyl y NaCl se agregó a concentraciones finales de 1% w/v y 0.5 M, respectivamente y se incubaron durante 15 min en hielo. Después de la sonicación, los homogenados fueron fraccionados por ultracentrifugación a 180.000 x g durante 30 min con el sobrenadante sarkosyl-soluble (S1) y el sedimento insoluble en sarkosyl (P1). La pelotilla de P1 (opcionalmente) se lavó con tampón de sark y re-sedimentados por ultracentrifugación a permitirse el final precipitado insoluble en sarkosyl (P2). Esta fracción de la P2 fue solubilizada en tampón de urea durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de sonicación de s de 3 x 5 con una sonda limpia micropunta. (B) proteínas (20 μg) de TH-S, S1, S2 (10 μl) y fracciones de P2 se resolvieron mediante SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción azul brillante de Coomassie G-250 durante la noche a temperatura ambiente.
Figura 2: enriquecimiento de tau fosforilada en la fracción insoluble detergente del cerebro AD. (A y B) Proteína (40 μg) del total (TH-S), (S1) solubles y las insolubles (P2) fracciones fueron borrados con un anticuerpo contra tau fosforilada en la treonina 231 (pT231) o AT8 (pSer202, pThr205) para demostrar el enriquecimiento de especies de fosfo-tau patológica en la fracción insoluble (P2) del cerebro de AD. En cerebro de AD, alto peso molecular agregado tau exclusivamente particiones en la fracción de (P2) insoluble en el detergente. (C) EEA1 sirve como un marcador de proteína soluble y control de la carga relativa para el total (TH-S) y soluble (S1) fracciones de cerebro AD y control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: análisis proteómico de patológicas proteínas AD utilizando un protocolo de fraccionamiento single-step o multipasos. Niveles relativos de las representativas sarkosyl insoluble proteínas APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) y APOE en diversas enfermedades entre control, casos de MCI y AD con el solo paso (A) o sarkosyl multi-step (B) método de fraccionamiento. Para ambos conjuntos de datos, nivel de la proteína se estima por péptido espectral partidos (PSMs) de estos identificaron proteínas y normalizaron para establecer el máximo a 100. PSMs de casos Control, MCI y AD (n = 5 cada) fueron utilizados para el conjunto de datos de grupo. Para el abordaje de múltiples paso, PSMs de piscinas replicadas dos de control, casos de MCI y AD (n = 5 cada) fueron analizados. Barras de error indican los valores de media ± SEM haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 10% w/v sarkosyl solución: sal de sodio 10 g N-lauril sarcosina por 100 ml de ddH2O (agitación a temperatura ambiente durante la noche) |
| Baja sal (LS) de tampón: 50 mM HEPES, pH 7.0, sacarosa 250 mM, 1 mM EDTA |
| Buffer Sarkosyl (sark): Buffer de LS + 1% (p/v) sarkosyl 0,5 M NaCl |
| Urea de tampón (conservar a -20 ° C): 50 mM Tris-HCl, pH 8.5, urea de 8 M, SDS 2% |
| 4 carga X SDS de tampón: 200 mM Tris-HCl pH 6.8, glicerol al 40%, 8% suflate de dodecyl de sodio (SDS), 0.4% azul de bromofenol (BPB) y 20 mM TCEP pH 7.0 ddH2O |
| Solución fijadora de Coomassie: 40% metanol, ácido acético al 10% en ddH2O |
| Tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie: 25% metanol, ácido acético al 5%, 0.1% coomassie blue G-250 en Dec2O |
| Coomassie desmanchar tampón: 25% metanol, ácido acético al 5% en ddH2O |
| 50 mM Tris-HCl de 1 X Tris tamponada salino (TBS): pH 7,45, 150 mM NaCl en ddH2O |
| 50 mM Tris-HCl de 1 X Tris tamponada con solución salina con Tween 20 (TBS/T): pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 ddH en2O |
| 1 X bloqueo de tampón (BB): 50 mM Tris-HCl, pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% proteína patentada (véase lista de materiales), 750 mM Methylchloroisothiazolinone en ddH2O |
| 1 Tampón X bloqueo con 0,05% Tween 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl de pH 7.45, 150 mM NaCl, 1% proteína patentada (véase lista de materiales), 0,05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone en ddH2O |
Tabla 1: Lista de Buffers.
| Muestra | Volumen de muestra (μL) | Concentración (μg/μl) | Proteína total (μg) | Promedio de proteína Total (μg) y SEM | % TH-S (5 mg) |
| 1 CTL | 70 | 9.89 | 692.3 | ||
| 2 CTL | 70 | 7.38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10.4% |
| 3 CTL | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| AD 1 | 70 | 9.77 | 683.9 | ||
| AD 2 | 70 | 6.67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11.3% |
| ANUNCIO 3 | 70 | 7.86 | 550.2 |
Tabla 2: Cantidad de proteína en las fracciones insolubles en sarkosyl (P2). En promedio, el porcentaje de proteína que particiona en la fracción insoluble en sarkosyl de control (n= 3) y AD (n= 3) cerebral fue de 10,4% y 11.3%, respectivamente. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa de la cantidad de proteínas insolubles en sarkosyl de control y cerebro del anuncio, según lo evidenciado por el por de student t-test (p = 0.703) y error estándar de los valores de la media (SEM).
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Discussion
En este documento presentamos y discutir un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento de solo paso que es aplicable a una amplia variedad de aplicaciones experimentales que van desde análisis de proteómica basada en espectrometría de masa al mal plegamiento de análisis funcional de la proteína y western blot. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodología es más eficaz cuando se utiliza para el estudio de proteinopatías neurodegenerativas como el Alzheimer, ALS, la enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y los diferentes tauopatías. Comparado con el protocolo original de fraccionamiento secuencial de cinco fases, este procedimiento solo paso puede completarse en un solo día y ofrece resultados muy similares. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Un aspecto importante de este protocolo es el uso de sarkosyl como el detergente de fraccionamiento. En contraste con otros detergentes como Tritón X-100 o sodio dodecil sulfato (SDS), sarkosyl parece ser muy adecuado para esta tarea; en cuanto a rigor y fuerza de solubilización, es suficiente para solubilizar la mayoría de las proteínas de forma nativa plegadas preservando la insolubilidad del detergente, la estructura y la función de agregados de proteínas relevantes a la enfermedad que son inherentemente sensible a la SDS. 5 , 9 además, a diferencia de la SDS, sarkosyl permanece soluble a bajas temperaturas y en condiciones de alta sal.
Otra característica clave de este protocolo es la resuspensión de los gránulos de (P1) insoluble en sarkosyl primera tras la primera de ultracentrifugación. Este paso de lavado permite la granza inicial (P1) para extraer y lavar completamente de cualquier residual contaminante de Cruz homogeneizado total o soluble proteínas, con una fracción de proteína insoluble en detergente puro y bien definido. Sin el paso de resuspensión y lavado del pellet opcional (P1), proteínas solubles residuales pueden ser llevado a más en la fracción insoluble en detergente, confundiendo posiblemente los resultados posteriores y experimentos (es decir, análisis de inmunotransferencia o proteómica).
El carácter insoluble y de alto peso molecular de proteínas mal plegadas patológicos agregados (es decir, tau, fosfo-tau y especies Aβ) presente desafíos hacia su aislamiento y análisis a través de las técnicas bioquímicas tradicionales. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 a diferencia de las proteínas solubles, insolubles en agregados como amiloides (Aβ) e hiperfosforilada tau los enredos neurofibrillary (NFTs) no pueden ser fácilmente purificada de tejido post mortem por métodos tradicionales tales como inmunoprecipitación o rápido cromatografía líquida de la proteína (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 por lo tanto, el protocolo abreviado sarkosyl-fraccionamiento es una de las técnicas únicas que permite el fácil enriquecimiento y aislamiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro post mortem en un relativamente corto plazo. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Mientras que pasos adicionales pueden ser empleados para aislar una muestra pura, homogénea de proteínas agregadas, el protocolo de fraccionamiento sarkosyl permite el fácil enriquecimiento de agregados de proteína insoluble en detergente con comparativamente poco compromiso de tiempo. 5 , 6 en apoyo de esta hipótesis, estudios proteómicos del proteoma sarkosyl-insoluble confirman que la gran mayoría de las proteínas conocidas de propensas a la agregación patológicas de la partición en el sarkosyl insoluble en fracción ambos tradicionales multi-step 6 , 11 , 21 así como nuestro enfoque novedoso fraccionamiento solo paso. 5 , 7 , 9 , 10
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los Drs. Jim Lah y Allan Levey, Departamento de Neurología de Emory, para sugerencias y comentarios. Este trabajo fue financiado en parte por la Asociación de medicina acelerar concesión (U01AG046161-02), el Emory Alzheimer centro de investigación de la enfermedad (P50AG025688) y un Instituto Nacional del envejecimiento conceden (R01AG053960-01) a N.T.S. Esta investigación también fue apoyada en parte por el núcleo de la neuropatología de la donacion de Emory Neurociencia NINDS base instalaciones, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
