Summary
Ett förkortat fraktionering protokoll för anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat från människahjärnan efter döden beskrivs.
Abstract
I denna studie beskriver vi ett förkortat steg fraktionering protokoll för anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat från efter döden människohjärnan. Det Joniska tvättmedlet N-lauryl-Sarkosin (sarkosyl) solubilizes effektivt inföding vikta proteiner i hjärnvävnad tillåta berikning av tvättmedel-olösligt protein aggregat från en rad olika neurodegenerativa proteinopathies, såsom Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom och ALS och prionsjukdomar. Mänsklig kontroll och AD efter döden hjärnans vävnader var homogeniserad och sedimenterade vid ultracentrifugering i närvaro av sarkosyl att berika tvättmedel-olösligt protein aggregat inklusive patologisk fosforyleras tau, kärnan i neurofibrillära tovor i AD. Western blotting visat differentiell lösligheten av aggregerade fosforyleras-tau och rengöringsmedel-lösliga proteinet, tidig Endosome Antigen 1 (EEA1) i kontroll och AD hjärna. Proteomiska analys visade också anrikning av β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), och apolipoprotein E (APOE) i sarkosyl olösliga fraktioner av AD hjärnan jämfört med de av kontroll, överensstämmer med tidigare vävnad fraktionering strategier . Sålunda, detta enkla anrikning protokoll är idealisk för ett brett spektrum av experimentella applikationer alltifrån Western blotting och funktionellt protein samtidig aggregering analyser till mass spectrometry-baserad proteomik.
Introduction
Neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD), amyotrofisk lateralskleros (ALS) och de närbesläktade prionsjukdomar är proteinopathies kännetecknas av gradvis ackumulering av tvättmedel-olösligt protein aggregat i hjärnan med tillhörande kognitiv nedgång. 1 , 2 delad patologiska funktionen tros spela en central roll i etiologi och patofysiologi av dessa neurodegenerativa sjukdomar. 2 dessa aggregat består typiskt av Polymera amyloid fibrer, vilka består av upprepade enheter av felveckning protein uppvisar kors β-struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biokemiskt, amyloid aggregat är mycket motståndskraftiga mot kemisk eller termisk denaturering och lösbarhet,3 som presenterar unika utmaningar att deras rening, analys och studera via traditionella biokemiska tekniker. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 föga förvånande den tvättmedel-olöslig protein fraktionen har varit i fokus för mycket forskning patofysiologin bakom neurodegenerativa sjukdomar som inbegriper ackumulering av felveckning proteiner. 6 , 12 , 13 , 14
Biokemiska fraktionering tekniker har ofta använts för att berika den olösliga i tvättmedel fraktionen från efter döden hjärnan homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 en av de vanligaste metoderna innebär sekventiella extraktionen av vävnad homogenates med buffertar och rengöringsmedel öka stringens, följt av ultracentrifugering att partitionera de lösliga och olösliga fraktionerna. En vanligt förekommande sekventiell fraktionering protokoll6,14 innebär homogenisering av djupfrysta vävnadsprover i en buffert för tvättmedel-fri låg salthalt (LS) och de resulterande olösliga pelletarna extraheras sedan sekventiellt med buffertar som innehåller hög salthalt, icke-joniskt rengöringsmedel, hög sackaros, som joniskt rengöringsmedel och slutligen chaotropes urea. 6 , 14 en uppenbar nackdel med sådana en sekventiell fraktionering protokoll är avsevärd tid och arbetskraft engagemang krävs för att slutföra dem. Inklusive homogenisering och ultracentrifugering, ett typiskt fem steg fraktionering protokoll kan ta flera timmar eller dagar att slutföra. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 dessutom så många patologiska protein aggregat förblir olösliga i alla utom de mest krävande förhållande19,20 de flesta av de genererade fraktionerna är av begränsat värde. Således är mindre-stränga fraktionering stegen använder salt kickkoncentrationer och icke-joniskt rengöringsmedel i stort sett överflödig.
Tidigare studier har visat att det Joniska tvättmedlet N-lauryl-Sarkosin (sarkosyl) är en utmärkt kandidat för ett förenklat steg tvättmedel fraktionering protokoll. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 som ett denatureringen rengöringsmedel, sarkosyl är tillräckligt stränga för att solubilize den stora majoriteten av inföding vikta proteiner i hjärnan utan solubilizing felveckning protein aggregat består av beta-amyloid (Aβ),6,11 fosforyleras tau (pTau),6 tjära DNA-bindande protein 43 (TDP-43),14 alfa-synuklein,12,13 skrapie,23 eller U1 små nukleära ribonucleoproteins (U1 snRNP) såsom U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl är mindre stränga än allestädes närvarande anjoniska tvättmedel dodecyl natriumsulfat (SDS), bevarar det mindre robust Oligomera former av felveckning protein aggregat som inte tål SDS behandling. 9
Tidigare har beskrivit vi ett förkortat tvättmedel-fraktionering protokoll som uppnått resultat jämförbara med de mer arbetskrävande metoderna som sekventiella fraktionering. 5 genom att utelämna de mindre stränga fraktionering steg, vi kunde utveckla ett lättköpt steg fraktionering protokoll för anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat från efter döden mänskliga hjärnan. 5 detta detaljerade protokoll som beskrivs häri är väl lämpad för en rad olika experimentella tillämpningar som sträcker sig från Western blotting och mass spectrometry-baserad proteomik för att funktionellt protein Skellefteåsjukan och aggregering seedning analyser. 5 , 6 , 21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etik uttalande: alla hjärnans vävnader erhölls från Emory Alzheimer ' s sjukdom Research Center (ADRC) Brain Bank. Efter döden vävnader förvärvades under lämpliga institutionella granskning Board (IRB) protokoll.
1. homogenisering och fraktionering
- vävnad urval
Obs: frysta efter döden frontala cortex vävnad från frisk kontroll (Ctl) och patologiskt bekräftade AD fall valdes från Emory ADRC Hjärnbanken (n = 2). Postmortala neuropatologiska utvärderingen av amyloida plack distribution utfördes enligt konsortiet att inrätta ett register för Alzheimers ' s sjukdom semikvantitativt scoring kriterier 24, även om neurofibrillära trassel patologi bedömdes enligt Braak mellanlagringsplatsen. 16- Erhåll frysas efter döden hjärnvävnad från frisk kontroll (Ctl) och patologiskt bekräftade AD fall. Utnyttja behållare av torris, pincett och ett rakblad, punktskatter ~ 250 mg delar av grå hjärnsubstans från varje vävnadsprov på tarerad disponibel väga båtar, noga med för att förhindra upptining av vävnaden. Vikten för varje bit till homogeniseras.
- Punktskatter ~ 250 mg grå substans med pincett och razor genom att visuellt inspektera för att hitta gränssnittet mellan den yttre grå substans och inre vit substans. Undvik vit substans och viktigare, någon stora blodkärl eller blodiga regioner, meningerna eller spindelvävshinnan mater. Hålla vävnaden frysas under styckningen av arbetar snabbt och ofta placera väger båten med hjärnvävnad i polystyren behållare med torr ice.
- Registrera exakt vikt av grå hjärnsubstans censurerade från varje fryst bit med en Analysvåg. Beräkna volymen av låg salthalt (LS) buffert (se tabell 1) behövs för dounce homogenisering (5 mL/g eller 20% w/v).
- Förbereda 10 mL LS buffert med 1 x proteas och fosfatas hämmare cocktail och chill på ice.
- Ta bort vägde vävnad och väger båten från torris och tärningarna i ungefär 2 x 2 mm bitar som det tinar. Överföring till en 2 mL före kylda dounce Homogenisatorer tub på ice.
- Tillsätt 5 mL/g (20% w/v) iskall låg salthalt (LS) buffert med 1 X proteas och fosfatas hämmare cocktail.
- Homogenize hjärnvävnad på is med ca 10 slag av hög clearance mortelstöt A och 15 linjer av lågt clearance mortelstöten B.
- Överföra alla Homogenatet till en 2 mL polypropylen rör med ett glas Pasteur-pipett. Märk röret med “ TH ” (totala Homogenatet), vävnaden mål nummer och Homogenatet volym. alikvot 0,8 mL till en märkt 1,5 mL tub. Eventuella överskott Homogenatet kan vara likaså aliquoted och lagras vid -80 ° C.
- Till varje 0,8 mL alikvotens, tillsätt 100 µL varje 5 M NaCl och 10% (w/v) sarkosyl för koncentrationer av 0,5 M och 1% w/v, respektive. Blanda rören väl genom inversion och inkubera på is för 15 min. etikett rör med " TH-S " (totala Homogenatet-Sarkosyl) att indikera att homogenates är i sarkosyl-buffert (tabell 1).
- Sonikera varje rör för tre 5 s pulser på 30% amplitud på is (maximal intensitet = 40%) använder en microtip sond.
- bestämma protein koncentrationerna av de homogenates som använder den bicinchoninic syran (BCA) assay 25 metod.
Obs: Den genomsnittliga proteinkoncentration av TH-S homogenates beredd på 5 mL LS per gram vävnad är 15-20 mg/mL. Homogenates kan fractionated omedelbart eller förvaras vid-80 ° C fram till användning. - Späda TH-S homogenates 10 mg/ml med 1 x proteas och fosfatas-hämmare iskall sark buffert (tabell 1).
- Överföra 5 mg protein (0,5 mL) i varje TH-S Homogenatet in 500 µL polykarbonat ultracentrifugen rör och par-balans med sark-buffert. Fyll rören i en pre kylda rotor och ultracentrifugen vid 180 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. överföring den sarkosyl-lösliga supernatanterna (S1) 1,5 mL rör och förvaras vid -80 ° C.
Obs: (Valfritt tvätt) tillsätt 200 µL sark-buffert till ultracentrifugen rör som innehåller tvättmedel-olöslig fraktioner (P1) och rubba pellets (P1) från botten av ultracentrifugen rören med en 200 µL pipettspetsen. - Kort puls-spin den inverterade rör för 2-3 s (≤ 2500 x g) på en mikrocentrifug att överföra pellets (P1) och buffert till 1,5 mL tuberna nedan. Återsuspendera olösliga pellets (P1) i sark-bufferten av pipettering upp och ner för att säkerställa pelleten störs.
- Par-balans och centrifugera vid 180 000 x g för en ytterligare 30 min vid 4 ° C.
- Avlägsna valfria tvätta supernatanten (S2) och inkubera sarkosyl olösliga pellets (P2) i 50-75 µL av urea buffert (tabell 1) med 1 x PIC (proteas och fosfatas hämmare cocktail) i 30 min i rumstemperatur att solubilize den pellet.
Obs: Varm urea buffert till rumstemperatur innan användning för att undvika SDS utfällning. För tvättmedel-känsliga tillämpningar, utelämna SDS från urea buffert och överväga tvättning olösliga pelleten (P2) i låg salt buffert innan omblandning i urea buffert. - Överföra de återsuspenderade pelletarna (P2) 0,5 mL rör och använda kort (1 s) microtip ultraljudsbehandling på 20% amplitud (maximal intensitet = 40%) till fullo solubilize pellets.
- Bestämma protein koncentrationerna av sarkosyl lösliga (S1) och - olösliga (P2) fraktioner med hjälp av BCA analys metod. Använd dessa fraktioner omedelbart eller förvaras vid-80 ° C fram till användning.
2. Immunoblotting
- Western blotting
Obs: Western blotting utfördes enligt tidigare rapporterade förfaranden med smärre ändringar. 5 , 10- förbereda 40 µg prover av totala homogenates (TH-S), sark-lösliga (S1) och sark olösliga (P2) fraktioner i 1 X Laemmli SDS-page prov buffert med 5 mM TCEP pH 7. Inkubera prover vid 95 ° C i 5 min.
- Belastning prover på en prefabricerad 10-väl 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel. Electrophorese på 80 V för de första centimeter (10 min) och 120 V för återstoden (60 min) eller tills spårning färgämnet når botten av gelen.
- Använda en färsk rakblad och gel kniv till split-öppna förtillverkade gel kassett. Försiktigt skära bort kammar och botten av gelen med ett färskt rakblad.
- Återsuspendera olösliga pellets (P1) i 200 µl sark-buffert med 1 x PIC av pipettering upp och ner.
- Överföring till ett 0,2 µm nitrocellulosa membran med en torr överföringsmetod på en blotting maskin (se tabellen material).
- Blockera membranet i blockerande buffert (BB) utan Tween 20 för 30 min, följt med BB med 0,05% Tween-20 (BB/T) i 30 min. Efter blockering, skölj membranet i TBS/T (0,1% Tween-20) för 5 min att ta bort överflödig blockerande buffert.
- Förbered 1:1,000 spädningar av den primära antikroppar pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 och EEA1 i BB/T (0,05% Tween 20).
- Inkubera membranen i primär antikropp lösning över natten vid 4 ° C med cirkulär agitation. Skölj membranet i TBS/T för 3 x 15 min.
- Sond membranet med en 1:20,000 utspädning av fluorescently-märkta nära-IR sekundär antikropp i BB/T i 60 min i rumstemperatur i mörker på shaker. Skölj membranet för 3 x 10 min i TBS/T och 2 x 5 min i TBS.
- Skanna membranet via IR imaging system av lämpliga excitation våglängden (t.ex. 700 nm (röd kanal) för infraröd dye 680 get antimus IgG (H + L) sekundära och 800 nm (grön kanal) för infraröd dye 790 åsna anti-kanin IgG (H + L ) sekundära).
- Använd avbildningsprogrammet att kvantifiera signal stödnivåer och utföra densitometry mätningar enligt tillverkaren ' anvisningar, att säkerställa auto-bakgrund inställning är inställd på genomsnitt hela bakgrunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förkortat steg sarkosyl-fraktionering protokollet användes för att berika tvättmedel-olösligt protein aggregat från kontroll och AD efter döden hjärnan (figur 1). Proteiner från TH-S, S1, S2 och P2 fraktioner löstes av SDS-PAGE, fast i 15 min i Coomassie blå fixativ buffert följt av mild färgning med Coomassie Brilliant Blue G-250 färgning buffert. Resuspension steget är valfritt eftersom det fanns omätbara nivåer av protein i S2 fraktionen (se 1.1.14). Western blot analys (figur 2A och B) visar tydligt att i AD-hjärna, patologisk hög molekylvikt fosforyleras tau aggregaten var sarkosyl olösliga, och mycket lite pTau kvar i den Sarkosyl lösliga fraktioner. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 däremot majoriteten av pTau i kontroll hjärna uppdelad i sarkosyl lösliga fraktionen. 5 , 6 , 10 däremot EEA1 primärt partitioner i den S1 fraktionen i både kontroll och AD hjärna (figur 2 c). Här, fungerar EEA1 som en allmän markör för mest infödda, icke-patologiska proteiner som är inneboende sarkosyl lösliga5. Framför allt, finns det något mindre signal för EEA1 i lösliga fraktionen (S1) jämfört med den TH-S fraktionen, som anger att en mindre pool av EEA1 är sannolikt sarkosyl olösliga, ännu nedanför detektionsgränsen genom western blot med denna särskilt antikropp. Det är lika möjligt att den svaga minskningen i signalstyrka för EEA1 i lösliga fraktionen (S1) beror på icke-specifik bindning av EEA1 till ultracentrifugen rören kan också förklara den smärre avvikelsen från förväntat resultat.
Att mäta effekten av förkortat steg fraktionering protokollet (figur 3A) mot den mer traditionella flerstegs sekventiell fraktionering metoden (figur 3B), de relativa nivåerna av sarkosyl olösliga amyloid prekursor protein (APP), tau (MAPT), små nukleära ribonukleoprotein U1 - 70K (snRNP70) och apolipoprotein E (APOE) jämfördes av etikett-fri masspektrometri (MS) baserad proteomik över poolade kontroll (Ctl), kognitiv svikt (MCI) och AD fall från tidigare studier7,18 (figur 3). Mätningar av tvättmedel-olöslig APP representerar effektivt Aβ peptiden, som alla fullt tryptic APP peptider kvantifieras mappas till regionen Aβ av full längd 695 rester APP protein7. Med båda metoderna uppåtriktade olösliga i sarkosyl nivåerna av alla fyra patologiska proteiner inflationstrenden MCI och AD fall i förhållande till kontroller, konsekvent med det starka sambandet av kognitiv nedgång och patologiska börda. Anrikning av dessa proteiner i tvättmedel-olöslig fraktioner (P2) var generellt anmärkningsvärt konsekvent använda både singel-steg18 och flera steg fraktionering protokoll7.
Det finns, dock små skillnader mellan de två metoder som kan visa sig fördelaktig eller fördärvliga beroende på karaktären och målen för individuella experiment. Jämförande proteomiska data sammanfattas i figur 3 kan informera vilka protokoll som ska användas beroende på specifika experimentella parametrar och applikationer. Som man kan förvänta sig, finns det en allmän avvägning mellan prov anrikning och renhet, med förenklad fraktionering protokollet ger mer berikade prover med mindre protein förlust än metoden flera steg.
Till exempel uppvisar kontroll olösliga fraktioner beredd med förenklade protokollet (figur 3A) något högre bakgrundsnivåer av sjukdom-relevanta proteiner än de förberedda via flera steg strategi. Omvänt, singel-steg fraktionering tekniken kan vara fördelaktigt för låg-överflöd proteiner som övergripande provet förluster minskas avsevärt. Den relativa anrikningen av sarkosyl olösliga APOE i MCI fall är exempelvis betydligt högre i de olösliga fraktioner beredd via protokollet förkortad (figur 3A).
Även om båda metoderna är mer än tillräcklig att observera någon betydande ökning av sjukdom-relevanta eller patologisk felveckning protein aggregat, de mer talrika och omfattande fraktionering och tvätta stegen i metoden flera steg kan generera en renare och mer specifika proteomiska signatur. Dock verifierar våra data att metoden steg fraktionering är förenlig med avgöranden som offentliggörs att patologisk aggregat såsom tau neurofibrillära trassel (NTFS), Aβ plack och skrapie prioner (PrSc) är olösliga i sarkosyl, medan deras inföding vikta motsvarigheter är lösliga. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Genom att beräkna de relativa mängder protein som partition till de olösliga i tvättmedel fraktionerna av kontroll (n = 3) och AD (n = 3) hjärnan (tabell 2), endast ~ 10% av den totala protein poolen är sarkosyl olösliga. När 5 mg totalprotein av hjärnan Homogenatet (TH-S) är fractionated, 10,4% och 11,3% av proteomet partitioner till den olösliga i tvättmedel bråk i kontroll och AD fall, respektive. Även om den totala mängden sarkosyl-olösligt protein berikad i AD hjärna är något högre än kontroll, inga signifikanta skillnader observerades mellan de två grupperna (p = 0.703). Detta indikerar att protein Skellefteåsjukan och aggregering är inte utbredd i AD-hjärna, men ganska begränsad till en smal och specifika delmängd av proteiner som tau, Aβ och U1 snRNP. 7 , 21 , 22
Figur 1: Sarkosyl fraktionering scheme. (A) A efter döden mänskliga hjärnan var homogeniserad i låg salt buffert, varefter sarkosyl och NaCl var till på slutliga koncentrationer av 1% w/v och 0,5 M, respektive och inkuberas i 15 min på is. Efter ultraljudsbehandling, var homogenates fraktionerade oljor av ultracentrifugering vid 180 000 x g i 30 min ger sarkosyl lösliga supernatanten (S1) och sarkosyl olösliga pelleten (P1). P1 pelleten spolades (valfritt) med sark-buffert och re-sedimenterade av ultracentrifugering råd med den slutliga sarkosyl olösliga pelleten (P2). Detta P2 bråkdel var solubilized i urea buffert för 30 min i rumstemperatur, följt av 3 x 5 s ultraljudsbehandling med en ren microtip sond. (B) proteiner (20 µg) från TH-S, S1, S2 (10 µL) och P2 fraktioner löstes av SDS-PAGE, fast i 15 min i Coomassie blå fixativ buffert följt av mild färgning med Coomassie Brilliant Blue G-250 färgning buffert över natten i rumstemperatur.
Figur 2: anrikning av fosforyleras-tau i tvättmedel olösliga fraktionen av AD hjärna. (A och (B) Protein (40 μg) av totalen (TH-S), lösliga (S1) och olösliga (P2) bråk var utplånas med en antikropp mot tau fosforyleras på treonin 231 (pT231) eller AT8 (pSer202, pThr205) att demonstrera anrikningen av patologiska phospho-tau arter i den olösliga bråkdel (P2) av AD hjärna. I AD-hjärna, hög molekylvikt aggregerade tau uteslutande partitioner till det olösliga i tvättmedel (P2) bråket. (C) EEA1 tjänade som lösligt protein markör och relativa lastning kontroll för totalt (TH-S) och lösliga (S1) fraktioner av kontroll och AD hjärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: proteomiska analys av patologiska AD proteiner med ett enda steg eller flera steg fraktionering protokoll. Relativa nivåer av representativa sarkosyl olösliga proteiner APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) och APOE över olika sjukdomar bland poolade kontroll, MCI och AD fall med enda steg (A) eller flera steg (B) sarkosyl fraktionering strategi. För både datamängder uppskattades proteinnivå av peptid spektrala matcher (PSMs) av dessa identifierade proteiner och normaliserade för att ställa in maximal till 100. PSMs från kontroll, MCI och AD fall (n = 5 varje) användes för singel-set datamängden. För metoden med flera steg, PSMs från två replikera pooler av kontroll, MCI och AD fall (n = 5 varje) analyserades. Felstaplar visar värdena för medelvärde ± S.E.M. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| 10% w/v sarkosyl lösning: 10 g N-lauryl-Sarkosin natriumsalt per 100 ml ddH2O (uppståndelse på RT över natten) |
| Låg Salt (LS) buffert: 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM sackaros, 1 mM EDTA |
| Sarkosyl (sark) buffert: LS buffert + 1% (w/v) sarkosyl + 0,5 M NaCl |
| Urea buffert (förvaras vid -20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8.5, 8 M urea, 2% SDS |
| 4 X SDS lastning buffert: 200 mM Tris-HCl pH 6.8, 40% glycerol, 8% sodium dodecyl suflate (SDS), 0,4% bromofenolblått (BPB) och 20 mM TCEP pH 7.0 i ddH2O |
| Coomassie fixativ buffert: 40% metanol, 10% ättiksyra i ddH2O |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 färgning buffert: 25% metanol, 5% ättiksyra, 0,1% coomassie blå G-250 i ddH2O |
| Coomassie Avfärga buffert: 25% metanol, 5% ättiksyra i ddH2O |
| 1 X Tris buffrad koksaltlösning (TBS): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl i ddH2O |
| 1 X Tris buffrad koksaltlösning med Tween-20 (TBS/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 i ddH2O |
| 1 X blockerande buffert (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% egenutvecklade protein (se lista över material), 750 mM Methylchloroisothiazolinone i ddH2O |
| 1 X blockerande buffert med 0,05% Tween-20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% egenutvecklade protein (se lista över material), 0,05% Tween-20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone i ddH2O |
Tabell 1: Buffertar lista.
| Prov | Volym prov (µL) | Koncentration (µg/µL) | Totalt Protein (µg) | Genomsnittliga totala Protein (µg) och S.E.M. | % TH-S (5 mg) |
| CTL 1 | 70 | 9,89 | 692,3 | ||
| CTL 2 | 70 | 7.38 | 516.6 | 518,7 (±99.63) | 10,4% |
| CTL 3 | 70 | 4,96 | 347,2 | ||
| AD 1 | 70 | 9,77 | 683.9 | ||
| AD 2 | 70 | 6,67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11,3% |
| AD 3 | 70 | 7.86 | 550.2 |
Tabell 2: Protein mängden olösliga i sarkosyl fraktioner (P2). I genomsnitt andelen protein som mellanväggar till den olösliga i sarkosyl fraktionen av kontroll (n= 3) och AD (n= 3) hjärnan var 10,4% och 11,3%, respektive. Det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad av mängden sarkosyl olösliga proteiner från kontroll och AD hjärna, vilket framgår av den av Students t-test (p = 0.703) och standardavvikelsen för medelvärdet (S.E.M.) värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri vi introducera och diskutera ett förkortat steg tvättmedel-fraktionering protokoll som gäller för en mängd olika experimentella tillämpningar som sträcker sig från mass spectrometry-baserad proteomik analys till funktionella protein Skellefteåsjukan analyser och western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 denna metod är kanske mest effektiv när den används att studera neurodegenerativa proteinopathies såsom Alzheimers och ALS, Huntingtons sjukdom, prionsjukdomar och de olika tauopathies. Jämfört med ursprungliga fem steg sekventiell fraktionering protokoll, proceduren steg kan utföras på en enda dag och ger mycket liknande resultat. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
En viktig aspekt av detta protokoll är användningen av sarkosyl som fraktionering tvättmedel. I motsats till andra tvättmedel som Triton x-100 eller sodium dodecyl sulfate (SDS) förefaller sarkosyl vara väl lämpade för denna uppgift; i fråga om stringens och solubilizing styrka, är det stark nog att solubilize majoriteten av inföding vikta proteiner samtidigt som tvättmedel-olöslighet, struktur och funktion av sjukdom-relevanta protein aggregat som till sin natur känsliga för SDS. 5 , 9 dessutom, till skillnad från SDS, sarkosyl förblir lösligt vid låga temperaturer och hög salt förhållanden.
En annan viktig funktion i detta protokoll är resuspension av första sarkosyl olösliga (P1) pellets efter först omgången av ultracentrifugering. Detta TVÄTTNINGSSTEGET tillåter inledande pellets (P1) för noggrant utvinnas och tvättade av eventuella kvarvarande korset-kontaminerande lösliga eller totala Homogenatet proteiner, ger en ren och väl definierade tvättmedel-olöslig proteinfraktion. Utan det valfria pellet (P1) återsuspension och tvätta steget, kvarstående lösliga proteiner kan vara överförda till den olösliga i tvättmedel bråk, möjligen confounding efterföljande resultat och experiment (dvs immunoblotting eller proteomik analys).
Olösliga och hög molekylvikt naturen av patologiska felveckning protein aggregat (dvs tau, phospho-tau och Aβ arter) innebär unika utmaningar mot deras isolering och analys via traditionella biokemiska tekniker. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 till skillnad från lösliga proteiner, olösliga aggregat såsom amyloid (Aβ) och hyperphosphorylated tau neurofibrillära trassel (NTFS) kan inte vara lätt renat från efter döden vävnad av traditionella metoder såsom immunoprecipitation eller snabb protein vätskekromatografi (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 således förkortat sarkosyl-fraktionering protokollet är en av de enda metoder som möjliggör det lättköpt anrikning och isolering av tvättmedel-olösligt protein aggregat från efter döden hjärnan inom en relativt kort tid. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Medan ytterligare steg kan användas för att isolera en ren, homogen urval av aggregerade protein, tillåter sarkosyl fraktionering protokollet för facile anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat med jämförelsevis lite tid engagemang. 5 , 6 stöd för denna hypotes, proteomiska studier av det olösliga i sarkosyl proteomet bekräftar att de allra flesta kända patologisk aggregation-benägen proteiner partitionera i det sarkosyl olösligt i bråkdel-i både traditionella flera steg 6 , 11 , 21 samt vår nya singel-steg fraktionering strategi. 5 , 7 , 9 , 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Drs. Jim Lah och Allan Levey, Emory Institutionen för neurologi, för hjälpsamma kommentarer och förslag. Detta arbete finansierades delvis av den accelererande medicin partnerskap grant (U01AG046161-02), Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) och en National Institute on Aging bevilja (R01AG053960-01) N.T.S. Denna forskning var också stöds delvis av neuropatologi kärnan av Emory neurovetenskap NINDS corefaciliteter bidraget, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
