Summary
Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine di fusione microscopica nuclease (MNase).
Abstract
La mappatura genomica delle interazioni proteine-DNA è fondamentale per comprendere la regolazione del gene, il rimodellamento della cromatina e altri processi residenti in cromatina. La reticolazione di formaldeide seguita da immunoprecipitazione di cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (X-ChIP-seq) è stata utilizzata per ottenere molti approfondimenti nella biologia del genoma. Tuttavia, X-ChIP-seq ha limitazioni notevoli legate alla reticolazione e alla sonicazione. Il ChIP nativo evita questi inconvenienti evitando il collegamento incrociato, ma spesso provoca una scarsa ripresa delle proteine legate alla cromatina. Inoltre, tutti i metodi basati su ChIP sono soggetti a considerazioni sulla qualità degli anticorpi. I metodi enzimatici per la mappatura delle interazioni proteine-DNA, che coinvolgono la fusione di una proteina di interesse per un enzima modificante del DNA, sono stati utilizzati anche per mappare interazioni proteine-DNA. Recentemente abbiamo combinato un metodo di questo tipo, scissione endogena cromatina (ChEC), con sequenziamento ad alto rendimento come ChEC-seq. ChEC-seq si basa sulla fusione di una cromatin-assoc(MNase) per generare frammenti di DNA mirati in presenza di calcio nelle cellule viventi. La ChEC-seq non è basata sull'immunoprecipitazione e pertanto evita le potenziali preoccupazioni con il collegamento a reticolazione, la sonicazione, la solubilizzazione di cromatina e la qualità degli anticorpi, fornendo al tempo stesso una mappatura ad alta risoluzione con un minimo di segnale di fondo. Prevediamo che ChEC-seq sarà una potente controparte di ChIP, fornendo un mezzo indipendente per convalidare i risultati ChIP-seq e scoprire nuove conoscenze sulla regolazione genomica.
Introduction
La mappatura dei siti di legame dei fattori di trascrizione (TFs), dei rimodellanti di cromatina e di altri fattori regolatori associati alla cromatina è fondamentale per comprendere tutti i processi basati sulla cromatina. Mentre sono stati utilizzati approcci di immunoprecipitazione cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChIP-seq) per ottenere molte importanti conoscenze sulla biologia genoma, esse presentano limitazioni notevoli. Recentemente abbiamo introdotto un metodo alternativo, definito scissione endogena cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChEC-seq) 1 , per eludere questi inconvenienti.
Il ChIP-seq viene spesso eseguito con un passo iniziale di reticolazione di formaldeide (X-ChIP-seq) per preservare interazioni proteine-DNA. Tuttavia, un certo numero di recenti studi hanno indicato che X-ChIP-seq cattura interazioni transienti o non specifiche di proteine-DNA 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , dando origine a falsi positivi siti di legame. Inoltre, la sonicazione, comunemente usata per frammentare la cromatina in esperimenti X-ChIP-seq, preferisce scavare regioni di cromatina aperta, portando a un recupero biasimo di frammenti da queste regioni 9,10. La sonicazione produce anche una miscela eterogenea di lunghezze di frammento, limitando in ultima analisi la risoluzione del sito di legame, anche se l'aggiunta di una fase di digestione di esonucleasi può notevolmente migliorare la risoluzione 11 , 12 . I metodi naturali di ChIP come le regioni occupate di genomi da cromatina (ORGANIC) 13 naturalmente isolati dall'affinità (ORGANIC) non usano la reticolazione e la frammentazione di cromatin con la nuclace micrococcica (MNase), alleviando potenziali pregiudizi associati a crosslinking e sonicazione di formaldeide. Però,La solubilità di molte proteine legate alla cromatina sotto le condizioni relativamente lievi richieste per l'estrazione natu- rale di cromatina è scarsa, potenzialmente in grado di ridurre la dinamica e / o falsi negativi 14 .
Mentre varie iterazioni di ChIP-seq sono più comunemente utilizzate per la mappatura genoma di interazioni proteine-DNA, sono state implementate anche diverse tecniche di mappatura basate sulla fusione di proteine di interesse per vari enzimi che modificano il DNA. Un tale approccio è l'identificazione di DNA adenina metiltransferasi (DamID) 15 , in cui una proteina di interesse di cromatina di interesse è geneticamente fusa alla diga e questa fusione è espressa in cellule o animali, con conseguente metilazione di sequenze GATC prossimali ai siti di legame della proteina. DamID è vantaggioso in quanto non si basa sull'immunoprecipitazione e quindi evita il collegamento a reticolazione, gli anticorpi o la solubilizzazione di cromatina. Viene anche eseguito in vivo . però, La risoluzione di DamID è limitata alla scala di kilobase e l'attività di metilazione della proteina di fusione della diga è costitutiva. Un secondo metodo basato sulla fusione enzimatica è Calling Card-seq 16 , che impiega fusione di un fattore di interesse per una transposa, orientando l'integrazione specifica del sito di transposoni. Come DamID, Calling Card-seq non è basato su immunoprecipitazione e quindi ha vantaggi simili, con il vantaggio aggiunto di una maggiore risoluzione. Tuttavia, Calling Card-seq può essere limitato da biases di sequenza di transposasi ed è anche dipendente dalla presenza di siti di restrizione vicini ai siti di inserimento di transposone.
Un terzo metodo di fusione enzimatica, sviluppato nel laboratorio Laemmli, è la scissione endogena cromatina (ChEC) 17 . In ChEC, una fusione tra una proteina associata alla cromatina e il MNase viene espressa in cellule, e dopo l'aggiunta di calcio per attivare MNase, il DNA viene ceduto prossimale ai siti di legame per il taggedFattore ( figura 1 ). In combinazione con il blotting del sud, la ChEC è stata usata per caratterizzare la struttura della cromatina e la legatura di proteine in un certo numero di singoli loci nel lievito 17 , 18 ed è stata combinata con analisi microarray a bassa risoluzione per sondare l'interazione dei componenti dei pori nucleari con il lievito Genoma 19 . ChEC offre vantaggi simili a DamID e Calling Card-seq, e la sua risoluzione è quasi una coppia di base quando viene analizzata dall'estensione primer 19 . ChEC è inoltre controllabile: la robusta sequenza del DNA da parte di MNase dipende dall'aggiunta di calcio millimolare, assicurando che MNase sia inattivo alle basse concentrazioni di calcio libere osservate nelle cellule di lievito vivo 20 .
In precedenza, abbiamo affermato che la combinazione di ChEC con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq) fornirà mappe ad alta risoluzione di siti di legame TF. Anzi, ChEC-seq ha generato mappe ad alta risoluzione dei fattori di regolazione generale del lievito (GRF) Abf1, Rap1 e Reb1 attraverso il genoma 1 . Abbiamo anche applicato con successo ChEC-seq al complesso modulare Mediator, un coattivatore globale trascrizionale 21 essenzialmente conservato, espandendo l'applicabilità di ChEC-seq a complessi di dimensione megadalton che non contattano direttamente il DNA e possono essere difficili da mappare con ChIP- Basati su metodi. ChEC-seq è un metodo potente sia per la convalida indipendente dei risultati ChIP-seq che per la generazione di nuove conoscenze nella regolazione dei processi residenti in cromatina. Qui esempiamo un protocollo passo per passo per l'attuazione di questo metodo nel lievito in erba.
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Protocol
1. Generazione di ceppi di lievito
- Genera un ceppo di lievito che porta il fattore di interesse tagliato con MNase.
- PCR amplifica la cassetta di contrassegno MNase dal vettore desiderato ( Tabella 1 ) usando la miscela di reazione specificata ( Tabella 2 ) e le condizioni di ciclo ( Tabella 3 ). Mescolare 5 μL della reazione PCR e 1 μL di colorante carica DNA 6X. Eseguire ogni aliquota di PCR su un gel agarosio 0,8% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 2,3 kb.
- Trasformare la cassetta di etichettatura amplificata nel ceppo di scelta usando la trasformazione standard di acetato di litio 22 e eseguire la selezione.
- Verificare l'integrazione corretta del cassetto di codifica con colonia PCR.
- Preparare la miscela di reazione specificata ( Tabella 4 ) per il numero di colonie da sottoporre a screening. Continuare a girare fino a quando non sia necessario.
- Scegli una porzione di ciascuna colonia per essere provataNella parte inferiore di un tubo PCR utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta pipetta.
- Microonde le colonie selezionate ad alta potenza per 1 min.
- Aggiungere 50 μL di miscela PCR ( Tabella 4 ) a ciascuna colonia microelastica e pipetta su e giù per mescolare. Eseguire il PCR utilizzando le condizioni di ciclo specificate ( Tabella 5 ).
- Mescolare 50 μL di reazione PCR e 10 μL di colorante di caricamento del DNA da 6X direttamente in ciascun tubo PCR. Eseguire 10 μl di ogni campione su un gel agarosico al 1% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 700 bp.
NOTA: Se si desidera, verificare l'espressione appropriata della proteina di fusione MNase mediante blotting occidentale. Si prevede un cambiamento di ~ 20,6 kilodalton nel peso molecolare della proteina taggata.
- Generare un ceppo di MNase libero mediante clonazione a base omologica del promotore del gene di interesse in pGZ136 (Tabella 1) e trasformazione e selezione come nel punto 1.1.2.
- alternati, Assemblare il promotore del gene di interesse e NLS di 3xFLAG-MNase-SV40 in un vettore plasmide, trasformare e selezionare come nel punto 1.1.2 e sviluppare il ceppo nella condizione appropriata selettiva per mantenere il plasmide.
2. ChEC
- Nel pomeriggio / sera del giorno prima dell'esperimento ChEC, inoculare 3 mL di lievito-peptone-dextrose (YPD) o di un mezzo selettivo appropriato con una singola colonia del ceppo che porta il fattore tagliato a MNase. Incubare questa coltura durante la notte (180 giri / min di scuotimento, 30 ° C).
- Nella mattina del giorno dell'esperimento ChEC, diluire la coltura durante la notte in 50 ml di media a una densità ottica a 600 nm (OD 600 ) di 0,2-0,3. Incubare questa coltura (180 rpm agitando, 30 ° C) fino a raggiungere un OD 600 di 0,5-0,7. Poiché la cultura si avvicina all'appropriato OD 600 , impostare il blocco termico o il bagno d'acqua a 30 ° C e avviare il disgelo del tampone A additivi ( TaBle 6).
- Preparare 5 mL di Tampone A e gli additivi ( Tabella 6 ) per coltura. Tenere il buffer A a RT durante la procedura.
- Preparare i tubi microfuge contenenti 90 μL di soluzione di arresto ( tabella 7 ) e 10 μL di SDS 10% per ogni punto temporale da raccogliere. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendete campioni a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min.
- Coltura la decantazione in un tubo conico da 50 mL e centrifuga a 1.500 xg e la temperatura ambiente (RT) per 1 minuto.
- Riposizionare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A e trasferire le cellule risospese in un tubo microfugo. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s.
- Aspirare il surnatante e riposare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A pipettando verso l'alto e verso il basso. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s. Ripetere questa fase una sola volta.
- Riposizionare completamente le cellule in 570 μl di Tampone A. Aggiungere 30 μl di 2% di digitonina(0,1% di concentrazione finale) per facilitare la permeabilizzazione delle cellule e invertire la miscela.
- Permeabilizzare le cellule in blocco termico o in bagno d'acqua a 30 ° C per 5 min.
- Pipettare la reazione verso l'alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme di celle. Rimuovere una aliquota da 100 μl di cellule permeabilizzate come un controllo negativo a un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS (fase 2.4) e vortex brevemente per mescolare.
- Aggiungere 1,1 μL di 1 M CaCl2 (concentrazione finale 2 mM) alle cellule permeabilizzate per attivare MNase e invertire più volte rapidamente o vorticarsi brevemente per mescolare. Immediatamente restituire la reazione mista a 30 ° C e avviare un timer.
- Ad ogni punto temporale da raccogliere, pipettare la reazione verso l'alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule, quindi rimuovere una aliquota di cellule permeabilizzate da 100 μl in un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS e vorticare brevemente per mescolare. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendere 0 s (nessun CaCl2 aggiunto), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 minuti di tempo.
NOTA: Esperimenti di ChEC con fattori che rapidamente fendono il DNA a 30 ° C possono essere eseguiti a temperature più basse per rallentare la cinetica di scissione di MNase. - Una volta raccolti tutti i punti di tempo, aggiungere a ciascun campione 4 μL di 20 mg / mL proteinasi K, vorticare brevemente per mescolare e incubare a 55 ° C per 30 minuti.
- Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticare vigorosamente per mescolare e centrifugare a velocità massima e RT in microfuga per 5 min.
- Rimuovere ogni fase acquosa (~ 150 μL) in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Vortex vigorosamente per mescolare e precipitare su ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa.
- Il pellet ha precipitato il DNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min.
- Diluenti supernatanti e lavare pellet con 1 ml di etanolo RT 70%.
- Decantare l'etanolo, rimuovendo il resto invertendo unD toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all'aria per RT per 5 min.
- Mentre i pellets stanno asciugando, fanno un master mix per riposizionare pellet essiccati in 29 μl di Tris, pH 8.0 + 1 μL di 10 mg / mL RNasi A ciascuno. Digest RNA a 37 ° C per 20 minuti.
- Mescolare 1 μl di colorante di carica del DNA 6X con 5 μl di ciascun campione e eseguire su un gel agarosio al 1,5% a 120 V per 40 min.
3. Selezione delle dimensioni
NOTA: L'obiettivo della selezione delle dimensioni è quello di rimuovere frammenti multi-kilobase di DNA genomico dal campione da sequenziare ed arricchire frammenti di ~ 150 bp (circa la dimensione del DNA nucleosomale) o più piccoli. Nei dati di sequenziamento, i frammenti <400 bp sono arricchiti, con un picco notevole intorno alla dimensione del DNA nucleosomale (~ 150 bp) e una distribuzione di picco o ampia di frammenti subnucleosomiali.
<ol>NOTA: L'analisi dei dati di ChEC-seq è una procedura complessa e oltre l'ambito di questo articolo. Informazioni dettagliate sull'analisi dei dati possono essere trovate nelle pubblicazioni precedenti 1 , 21 e gli script personalizzati utilizzati per l'analisi sono disponibili su GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) può anche essere utilizzato per l'analisi della riga di comando dei dati ChEC-seq.
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Representative Results
Nel caso di un esperimento di successo di ChEC, l'analisi del DNA mediante elettroforesi con agarosio gel rivelerà un aumento calcio-dipendente della frammentazione del DNA in tempo, come indicato dalla macerazione e eventuale completa digestione del DNA genomico. In alcuni casi, una scala di bande simili a quella osservata con una digestione tradizionale di MNase viene osservata dopo una digestione estesa. Questo è il caso per l'analisi ChEC di Reb1, un fattore di regolazione generale che lega le regioni esaurite nucleosomi (NDR) ( Figura 2 ). Abbiamo trovato, nel caso di GRF, una digestione estesa che porta alla perdita di segnali in siti di rilascio rapido 1 . Idealmente, verrà utilizzato un campione con una riduzione della dimensione della banda del DNA genomico che presenta la macerazione di peso ad alto peso molecolare, ad esempio i 30 s e 1 min di tempo per Reb1 ChEC, per sequenziare per evitare perdite temporanee di segnale .
Figura 3 ). Allo stesso modo, osserviamo una decisiva scissione del DNA mediante una fusione della subunità mediterranea Med8 con MNase, ma non MNase libero guidato dal promotore MED8 , 1 min dopo l'aggiunta di calcio ( Figura 3 ).
Per confrontare i dati di Reb1 ChEC-seq a ChIP-seq, abbiamo ottenuto un elenco di 1.991 picchi Reb1 determinati da ORGANIC 13 . Questi picchi sono stati centrati sul motivo con il conteggio finale di frammento medio in ciascuna posizione di base in una finestra da 100 bp intorno al punto medio del motivo. Abbiamo osservato una stretta asimmetria nella scissione, con la maggior parte delle estremità del frammento che si avvicinano al lato a monte del motivo (Figura 4 ).
Figura 1 : Schema del metodo ChEC-seq. Una fusione di proteina associata alla cromatina (CAP) -MNasi viene espressa nelle cellule del lievito. La proteina si lega al DNA, ma non genera scissione sopra i livelli di fondo a causa del basso contenuto di calcio libero nel nucleo. Dopo la permeabilizzazione delle cellule con digitonina e l'aggiunta di calcio millimolare, le fusioni di CAP-MNase legate al genoma fendono il DNA, rilasciando piccoli frammenti. Questi frammenti vengono quindi purificati, sequenziati e mappati al genoma, fornendo picchi di frammenti finali prossimali ai siti di legame per la fusione CAP-MNase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Elettroforesi del gel di agarosio del DNA da un esperimento di Reb1 ChEC. Una aliquota di DNA da 5 μl da ogni punto temporale di ChEC è stata analizzata su un gel da TA-agarosio di 1,5% prima della selezione delle dimensioni. Ciò mostra la progressiva digestione del DNA genomico dalla fusione di Reb1-MNase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Snapshot del browser genomico di Reb1-MNase e Free MNase ChEC-seq Experiments. IGV vista del segnale finale di frammento per Reb1 e libero MNase ChEC-seq 30 s dopo l'aggiunta di calcio e Med8 e libero MNase ChEC-seq 1 min af Ter aggiunta di calcio lungo un segmento rappresentativo del genoma del lievito. I set di dati sono stati normalizzati dividendo il numero di estremità di frammento mappato a ciascuna posizione base dal numero totale di estremità di frammento mappate e moltiplicandosi per il numero totale di mappe basate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Arricchimento dei frammenti rilasciati da Reb1-MNase intorno ai siti ORGANIC Reb1. Grafico medio di 30 s Reb1 e libero MNase ChEC-seq frammento segnale finale circa 1,991 Reb1 motivi determinati da ORGANIC 13 . I dati sono stati normalizzati come nella Figura 3 .Lank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| plasmide | Indicatore selettivo del lievito | Gli appunti | Aggiungere il numero del plasmide |
| pGZ108 | kanMX6 | Codifica 3xFLAG-MNase, 33 linker aa | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | Codifica 3xFLAG-MNase, 33 linker aa | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | Codifica 3xFLAG-MNase, 33 linker aa | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | Esprime 3xFLAG-MNase-SV40 NLS sotto il controllo del promotore REB1 | 72273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNase tagging, 8 aa linker | 70234 |
Tabella 1: Dettagli dei Plasmidi ChEC. Tutti i vettori di tagging sono basati su vettori pFA6a e quindi sono compatibili con le coppie di primer di etichettatura F2 / R1 comunemente usate. La cassetta di contrassegno è costituita da un linker della lunghezza indicata, un epitopo 3xFLAG per facilitare la rilevazione da blotting occidentale (tranne nel caso di pGZ173, dove il linker è stato abbreviato per rimuovere il tag 3xFLAG), la catena matura di MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231) e il marcatore selezionabile selezionabile.
| Reagente | Volume | [Finale] |
| 5x buffer PCR | 10 mL | 1x (2 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP mix (2,5 mM ogni dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM ogni dNTP) |
| 10 mM F2 primer | 2,5 mL | 0,5 mM |
| 10 mM R1 primatore | 2,5 mL | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) | 1 ml | |
| 2 U / μL iniezione a caldo ad alta fedeltà polimerasi | 0,5 mL | 1 U |
| DdH 2 O | 32,5 ml |
Tabella 2: Miscela di reazione per amplificazione PCR di cassette di tagging a 3xFLAG-MNase. Le sequenze di primer F2 / R1 possono essere trovate all'indirizzo http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatura (° C) | Tempo | cicli |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 min | 1 |
| 10 | Per sempre | tenere |
Tabella 3: Condizioni di ciclo termico per amplificazione PCR di cassette di tagging a 3xFLAG-MNase. Potrebbe essere necessario regolare la temperatura di incubazione e il tempo di prolungamento in base alla DNA polimerasi utilizzata.
| Reagente | Volume | [Finale] |
| Tampone Taq 10x | 5 mL | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP mix (2,5 mM ogni dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM ogni dNTP) |
| 10 mM Primer di controllo | 1 ml | 0,2 mM |
| 10 mM MNase-R o primer di controllo negativo | 1 ml | 0,2 mM |
| 5 U / mL Taq polimerasi | 0,5 mL | 2,5 U |
| DdH 2 O | 41,5 ml |
Tabella 4: Miscela di reazione per la colonia PCR Conferma di MNase Tagging. Controllare le sequenze di primer possono essere trovate all'indirizzo http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. Il primer di controllo è usato come primer in avanti con un primer inverso all'interno di MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') e un primer inverso ~ 500 paia di base (bp) a valle del rispettivo gene come un controllo negativo.
| Temperatura (° C) | Tempo | cicli |
| 95 | 5 minuti | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 minuto | 35 |
| 68 | 5 minuti | 1 |
| 10 | Per sempre | tenere |
Tabella 5: Condizioni di ciclo termico per la colonia PCR Conferma di tagging MNase. Potrebbe essere necessario regolare la temperatura di incubazione e il tempo di prolungamento in base alla DNA polimerasi utilizzata.
| Reagente | Volume | [Finale] |
| 1 M Tris, pH 7,5 | 1,5 mL | 15 mM |
| 1 M KCl | 8 ml | 80 mM |
| 0,2 M EGTA | 50 mL | 0,1 mM |
| DdH 2 O | Riempire a 100mL |
Tabella 6: Ricetta per Tampone A. Prima dell'uso, aggiungere metà di una compressa inibitore della proteasi, 50 μL di 100 mM PMSF (finale 1 mM), 5 μL di sperma di 200 mM (0,2 mM finale) e 2,5 μL di 1 M Spermidina (0,5 mM finale) per 5 ml di soluzione.
| Reagente | Volume | [Finale] |
| 5 M NaCl | 8 ml | 400 mM |
| 0.5 M EDTA | 4 mL | 20 mM |
| 0,2 M EGTA | 2 ml | 4 mM |
| DdH 2 O | Riempire a 100 ml |
Tabella 7: Ricetta per la soluzione di arresto 2x. Combinare 90 μl di stoP con 10 μL di SDS del 10% in un tubo microfugo per ogni punto temporale da prendere (vedere la fase 2.4).
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Discussion
Abbiamo dimostrato che la ChEC può mappare diverse classi di proteine di lievito sulla cromatina e anticipare che sarà generalmente applicabile a diverse famiglie di TF e altri fattori leganti di cromatina nel lievito. ChEC-seq è vantaggioso in quanto non richiede un collegamento reticolato, solubilizzazione di cromatina o anticorpi. Così, ChEC evita gli artefatti potenzialmente presenti in X-ChIP-seq, come gli artefatti hyper-ChIPable 3 , 4 e ChIP nativi, come falsi negativi dovuti a solubilizzazione proteica incompleta 14 . Lo svantaggio principale di ChEC-seq, come per tutti i metodi enzimatici di fusione, è il requisito di una proteina di fusione. Questo può essere raggiunto rapidamente in lievito in erba, ma è più laborioso nei metazo. Un'altra limitazione di ChEC-seq è che non può essere implementata come-è per la profilazione delle modifiche dell'istone. Tuttavia, un dominio di modifica-binding potrebbe essere fuso a MNase ed espresso, consentendo hMapping di modifica istone con ChEC-seq. In questa vena, ChIP-seq usando domini di legame di modificazione dell'istone con etichettatura epitopica è stato utilizzato per mappare schemi genomici di modifica dell'istone 26 .
L'uso di un controllo libero di MNase è importante per stabilire la specificità dei risultati di ChEC-seq. Il ceppo libero di MNase porta MNase taggato con 3xFLAG e un virus di simian 40 localizzazione nucleare (SV40 NLS) sotto il controllo del promotore endogeno per il gene di interesse. È concettualmente simile al controllo della diga non utilizzata utilizzato negli studi di DamID 27 e ai controlli per la scissione non specificata dovuta all'accessibilità della cromatina. Come controllo libero di MNase per TF ChEC-seq, abbiamo integrato il NLS 3xFLAG-MNase-SV40 guidato dal promotore REB1 al locus 1 di ura3 . Per Mediatore ChEC-seq, abbiamo espresso NLS di 3xFLAG-MNase-SV40 sotto il controllo del promotore MED8 in plasmi non integrantiD vettore mantenuto in mezzo selettivo 21 . In entrambi i casi, è stata osservata pochissimo scissione del MNase libero. Così, un singolo ceppo di controllo in cui 3xLFL-MNase-SV40 NLS è guidato da un promotore relativamente robusto dovrebbe essere appropriato per la maggior parte degli esperimenti.
Quando si pianifica un esperimento di ChEC, può essere importante considerare strutturale la proteina di interesse. Per esempio, abbiamo trovato che aggiungere MNase al C-terminale di Reb1 ha dato un pattern di scissione asimmetrica nei motivi Reb1, mentre l'espressione di Reb1 con MNase N-terminale ha dato un modello di scissione simmetrica 1 . Attribuiamo questi diversi modelli di scissione alla struttura di Reb1. Il dominio di legame del DNA di Reb1 si trova al suo C-terminus; Quindi il C-terminus è strutturato e vicino al DNA, limitando l'intervallo di movimento di MNase e solo consentendo la scissione C-terminale. Al contrario, il C-terminale di Abf1 è relativamente non strutturato e può quindi agire per aumentareRaggiungere il MNase, consentendo la scissione su entrambi i lati dei siti di legame di Abf1. Nel caso di Rap1, un altro lievito GRF, abbiamo scoperto che abbreviare il linker tra C-terminus e MNase da 33 a 8 aa era sufficiente a ridurre notevolmente la fenditura, forse dovuto alla distanza proposta della porzione C terminale di Rap1 DNA 28 . Tale considerazione strutturale è probabilmente importante anche nel tentativo di mappare il legame delle proteine presenti in grandi complessi. Per la nostra analisi ChEC-seq del mediatore legato al genoma del lievito 21 , abbiamo scelto le subunità i cui C-termini erano strutturalmente previsti per essere esposti piuttosto che sepolti all'interno del complesso. Delle tre sottounità unite a MNase, non si è staccato il DNA in modo robusto, suggerendo che vincoli sterici o interazioni con altri fattori di legame del DNA abbassassero la decadenza del DNA.
Abbiamo scoperto che il ChEC-seq rileva 4-12 volte più picchi per i grassi GRF Abf1, Rap1 e Reb1 rispetto a vari approcci CHIP quando tutti i punti di tempo sono stati considerati insieme 1 . Questi siti potrebbero essere suddivisi in due classi basate sulla cinetica di scissione di MNase. L'analisi dei dati ChEC-seq per i GRF di lieviti ha rivelato due classi temporaneamente distinte di siti di legame 1 . La prima, denominata "veloce", ha evidenziato una scissione massima <1 min dopo l'aggiunta di calcio e generalmente contiene corrispondenze robuste a motivi di consenso noti. Il secondo, chiamato "lento", ha impiegato diversi minuti per raggiungere notevoli livelli di scissione e sono stati esauriti di partite di motivi. Entrambe le classi di siti sono stati, in media, arricchiti per il legame in set di dati ChIP, anche se non sono stati necessariamente chiamati picchi in quegli studi ChIP. La maggior parte dei siti per un determinato fattore erano siti lenti. Pensiamo che siti veloci rappresentino siti di legame di fattore di trascrizione ad alta affinità, mentre i siti lenti rappresentano loci campionati temporaneamente durante la scansione del sito di rilegatura. L'obL'utilizzo di due classi di siti di legame separati dalla cinetica della scissione di MNase può spiegare l'osservazione in molti set di dati ChIP-seq che un gran numero di picchi per un determinato fattore con una specifica legame di DNA ben consolidata non contengono un motivo di consenso 29 : La reticolazione di formaldeide, eseguita per 10-15 min nella maggior parte dei protocolli ChIP, può ripetutamente acquisire interazioni transitorie o opportunistiche di un fattore con il genoma, portando all'inflazione del segnale. Infatti, il confronto tra ChIP-exo e immagini a cellule vive suggerisce che questo sia il caso 2 . In particolare, non abbiamo osservato una tale drammatica diminuzione del tempo dei segnali Mediator ChEC-seq 21 , con il segnale Mediatore ChEC-seq relativamente costante da 30 s a 20 minuti. Tenendo conto di queste osservazioni, si consiglia di eseguire brevi periodi di scansione ChEC-seq per recuperare siti di legame ad alta fiducia.
Prevediamo che il ChEC-seq possa essere adattato al non lievitosistemi. La concentrazione di calcio libero nelle cellule non mammarie non stimolate è 50-300 nM 30 , 32 , molto al di sotto della soglia per l'attivazione efficiente di MNase. Il passo di limitazione per la creazione di ChEC-seq nei sistemi metazoan è quindi la generazione di proteine di fusione, che rimane molto più laboriosa nelle metazoane rispetto alle cellule del lievito. Tuttavia, la codifica endogena dei geni metazoane è stata notevolmente facilitata dall'avvento dell'ingegneria genomica a base di CRISPR 33 e quindi questa limitazione dovrebbe essere facilmente sormontata. In alternativa, le proteine di fusione di MNase potrebbero essere espresse a bassi livelli dai plasmidi. Questo approccio è stato di grande successo per DamID in Drosophila 34 , 35 e cellule umane 36 e quindi potrebbe anche facilitare ChEC-seq nelle cellule metazoane.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Moustafa Saleh e Jay Tourigny per una lettura critica del manoscritto e Steven Hahn e Steven Henikoff per la tutorship e il supporto durante lo sviluppo del ChEC-seq e la sua applicazione al complesso Mediator. SG è supportato da NIH concede R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ è supportato dai fondi di avvio di Indiana University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
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