Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in Published: June 3, 2017 doi: 10.3791/55836

Summary

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Abstract

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA interacties is van cruciaal belang voor het begrijpen van genregulatie, chromatin remodeling en andere chromatin-residente processen. Formaldehyde verknoping gevolgd door chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) is gebruikt om veel waardevolle inzicht in genoombiologie te verkrijgen. X-ChIP-seq heeft echter opvallende beperkingen verbonden aan crosslinking en sonication. Inheemse ChIP vermijdt deze nadelen door crosslinking weg te nemen, maar resulteert vaak in slecht herstel van chromatine gebonden eiwitten. Bovendien zijn alle ChIP-gebaseerde methoden onderworpen aan antilichaamkwaliteit overwegingen. Enzymatische methoden voor het mappen van eiwit-DNA-interacties, waarbij fusie van een eiwit van belang is voor een DNA-modificerend enzym, is ook gebruikt om eiwit-DNA-interacties te coderen. We hebben onlangs een dergelijke methode gecombineerd, chromatine endogene cleavage (ChEC), met high-throughput sequencing als ChEC-seq. ChEC-seq berust op fusie van een chromatine-assocGeïncentreerd eiwit van belang voor micrococculaire nuclease (MNase) om gerichte DNA-splitsing te genereren in aanwezigheid van calcium in levende cellen. ChEC-seq is niet gebaseerd op immunoprecipitatie en vermijdt zo mogelijke problemen met crosslinking, sonicatie, chromatinoplossing en antilichaamkwaliteit, terwijl het een hoge resolutie mapping biedt met minimaal achtergrondsignaal. We zijn van mening dat ChEC-seq een krachtige tegenpartij bij ChIP zal zijn, waardoor een onafhankelijke methode wordt verkregen om beide bevindingen van ChIP-seq te valideren en nieuwe inzichten te ontdekken in genomische regulering.

Introduction

Mapping van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren (TF's), chromatine remodelers en andere chromatin-geassocieerde regulerende factoren is de sleutel tot het begrijpen van alle chromatin gebaseerde processen. Terwijl chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (ChIP-seq) benaderingen zijn gebruikt om veel belangrijke inzichten in genoombiologie te krijgen, hebben ze opmerkelijke beperkingen. Wij hebben onlangs een alternatieve methode geïntroduceerd, genaamd chromatin endogene splitsing en high-throughput sequencing (ChEC-seq) 1 , om deze nadelen te omzeilen.

ChIP-seq wordt meestal uitgevoerd met een initiële formaldehyde verknopingstap (X-ChIP-seq) om eiwit-DNA-interacties te behouden. Een aantal recente studies hebben echter aangetoond dat X-ChIP-seq transiënte of niet-specifieke eiwit-DNA-interacties vastlegt 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , die aanleiding geven tot valse positieve bindingsplaatsen. Bovendien, sonicatie, die gewoonlijk wordt gebruikt om fragmentin te fragmenteren in X-ChIP-seq experimenten, bij voorkeur schaarstreken van open chromatine, wat resulteert in voorspannen herstel van fragmenten uit deze gebieden 9 , 10 . Sonicatie levert ook een heterogeen mengsel van fragmentlengtes op, waardoor de bindingsplaatsresolutie uiteindelijk wordt beperkt, hoewel de toevoeging van een exonuclease-verteringstap de resolutie 11 , 12 aanzienlijk kan verbeteren. Inheemse ChIP-methoden zoals bezette gebieden van genen uit affiniteitszuiverde natuurlijk geïsoleerde chromatine (ORGANISCHE) 13 gebruiken geen verknoping en fragmentchromatine met micrococculaire nuclease (MNase), waardoor potentiële vooroordelen worden geassocieerd met formaldehydeverknoping en sonicatie. Echter,De oplosbaarheid van veel chromatine gebonden eiwitten onder de relatief milde omstandigheden die nodig zijn voor natieve chromatine extractie is slecht, wat mogelijk leidt tot verminderde dynamische bereik en / of valse negatieven 14 .

Hoewel verschillende iteraties van ChIP-seq meestal worden gebruikt voor genoom-brede mapping van eiwit-DNA-interacties, zijn ook verschillende mappingstechnieken gebaseerd op fusie van eiwitten van belang voor diverse DNA-modificerende enzymen geïmplementeerd. Een dergelijke benadering is DNA-adenine-methyltransferase-identificatie (DamID) 15 , waarbij een chromatine-bindend eiwit van belang genetisch gesmolten is met Dam en deze fusie wordt uitgedrukt in cellen of dieren, resulterend in methylering van GATC sequenties proximaal voor bindingsplaatsen voor het eiwit. DamID is voordelig doordat het niet staat op immunoprecipitatie en vermijdt dus verknoping, antilichamen of chromatinoplosbaarheid. Het wordt ook in vivo uitgevoerd. Echter, De resolutie van DamID is beperkt tot de kilobase-schaal en de methyleringsactiviteit van het Dam-fusie-eiwit is constitutief. Een tweede methode op basis van enzymatische fusie is Calling Card-seq 16 , waarbij fusie van een factor van belang is voor een transposase, waarbij site-specifieke integratie van transposons wordt aangestuurd. Net als DamID is Calling Card-seq niet gebaseerd op immunoprecipitatie en heeft derhalve dezelfde voordelen, met als extra voordeel van een verhoogde resolutie. Calling Card-seq kan echter worden beperkt door sequentieverzettingen van transposases en is ook afhankelijk van de aanwezigheid van restrictieplaatsen nabij transposon-insertieplaatsen.

Een derde enzymatische fusie methode, ontwikkeld in het Laemmli lab, is chromatine endogene splitsing (ChEC) 17 . In ChEC wordt een fusie tussen een chromatine geassocieerd eiwit en MNase uitgedrukt in cellen, en na calciumtoevoeging om MNase te activeren, wordt DNA proximaal gesplitst aan bindingsplaatsen voor de getagdeFactor ( figuur 1 ). In combinatie met Southern Blotting is ChEC gebruikt om chromatinstructuur en eiwitbinding op een aantal individuele loci in gist 17 , 18 te karakteriseren en is gecombineerd met microarrayanalyse met lage resolutie om de interactie van kernpompcomponenten met de gist te onderzoeken Genoom 19 . ChEC biedt voordelen die vergelijkbaar zijn met DamID en Calling Card-seq, en de resolutie is bijna enkelbasispaar wanneer geanalyseerd door primeruitbreiding 19 . ChEC is ook controleerbaar: robuuste DNA-splitsing door MNase hangt af van de toevoeging van millimolair calcium, zodat MNase inactief is bij de lage vrije calciumconcentraties waargenomen in levende gistcellen 20 .

Voorheen hebben we gepostuleerd dat het combineren van ChEC met high-throughput sequencing (ChEC-seq) high-resolution kaarten van TF bindingsplaatsen zou verschaffen. Inderdaad, ChEC-seq gegenereerde kaarten met hoge resolutie van de ontluikende gistregulatieve factoren (GRF's) Abf1, Rap1 en Reb1 over het genoom 1 . We hebben ook succesvol ChEC-seq toegepast op het modulaire Mediator-complex, een geconserveerde, essentiële, globale transcriptiecoactivator 21 , die de toepasbaarheid van ChEC-seq uitbreidt naar megadalton-complexen die niet direct contact met DNA hebben en moeilijk kunnen zijn om te plotten door ChIP- Gebaseerde methoden. ChEC-seq is een krachtige methode, zowel voor de onafhankelijke validatie van ChIP-seq-resultaten en het genereren van nieuwe inzichten in de regeling van chromatin-residente processen. Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol voor de implementatie van deze methode in ontluikende gist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generatie van giststammen

  1. Genereer een giststam die de factor van interesse met MNase draagt.
    1. PCR amplificeer de MNase-merkcassette van de gewenste vector ( Tabel 1 ) onder gebruikmaking van het gespecificeerde reactiemengsel ( Tabel 2 ) en cyclische condities ( Tabel 3 ). Meng 5 μl van de PCR-reactie en 1 μl 6X DNA-laadkleuring. Run elke PCR-aliquot op een 0,8% agarosegel bij 120 V gedurende 40 minuten. De verwachte productgrootte is ~ 2,3 kb.
    2. Transformeer de geamplificeerde tagcassette naar keuze door gebruik te maken van standaard lithium acetaat transformatie 22 en selectie uit te voeren.
    3. Controleer de juiste integratie van de tagcassette met kolonie-PCR.
      1. Bereid het gespecificeerde reactiemengsel voor ( Tabel 4 ) voor het aantal te screenen kolonies. Blijf ijs totdat het nodig is.
      2. Kies een deel van elke kolonie als tesTed in de bodem van een PCR buis met behulp van een steriele tandenstoker of pipet tip.
      3. Magnetron de geplukte kolonies bij een hoge stroom gedurende 1 minuut.
      4. Voeg 50 μl PCR mengsel ( Tabel 4 ) toe aan elke microwaved kolonie en pipet omhoog en omlaag om te mengen. Voer PCR uit met de opgegeven fietsomstandigheden ( tabel 5 ).
      5. Meng de 50 μl PCR-reactie en 10 μl 6X DNA laadkleuren direct in elke PCR-buis. Run 10 μl van elk monster op een 1% agarosegel bij 120 V gedurende 40 minuten. De verwachte productgrootte is ~ 700 bp.
        OPMERKING: Controleer desgewenst de juiste expressie van het MNase-fusie-eiwit via western blotting. A ~ 20,6 kilodalton verschuiving in het molecuulgewicht van het getekende eiwit wordt verwacht.
  2. Genereer een vrije MNase stam door homologie gebaseerde kloning van de promoter van het gen van belang in pGZ136 (Tabel 1) en transformatie en selectie zoals in stap 1.1.2.
    1. AlternatiVoeg de promotor van het gen van belang en 3xFLAG-MNase-SV40 NLS in een plasmide vector samen, transformeer en selecteer zoals in stap 1.1.2 en groei de stam in de geschikte selectieve conditie voor het behoud van het plasmide.

2. Chec

  1. In de middag / avond van de dag voorafgaand aan het ChEC experiment, inoculeer 3 ml gist-pepton-dextrose (YPD) of geschikt selectief medium met een enkele kolonie van de stam die de MNase-getagde factor draagt. Incubeer deze cultuur 's nachts (180 rpm schudden, 30 ° C).
  2. In de ochtend van de dag van het ChEC-experiment verdun de nachtcultuur in 50 ml medium tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600 ) van 0,2-0,3. Incubeer deze cultuur (180 rpm schudden, 30 ° C) totdat het een OD 600 bereikt van 0,5-0,7. Naarmate de cultuur de geschikte OD 600 nadert, zet het warmteblok of het waterbad op tot 30 ° C en start het ontdooien van Buffer A-additieven ( TaBle 6).
  3. Bereid 5 ml Buffer A plus additieven ( Tabel 6 ) per cultuur op. Hou buffer A bij RT tijdens de procedure.
  4. Maak microfugebuizen met 90 μL stopoplossing ( Tabel 7 ) en 10 μl 10% SDS voor elk tijdstip dat moet worden verzameld. Voor elke nieuwe factor geanalyseerd, neem monsters op 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min en 10 min.
  5. Decant cultuur in een 50 ml conische buis en centrifuge bij 1.500 xg en kamertemperatuur (RT) gedurende 1 min.
  6. Resusteer cellen grondig in 1 ml Buffer A en verplaats de geresuspendeerde cellen naar een microfuge buis. Pellet geresuspendeerde cellen in een microfuge bij 1.500 xg en RT gedurende 30 s.
  7. Aspirateer supernatant en doe de cellen grondig opnieuw in 1 ml Buffer A door pipettering omhoog en omlaag. Pellet geresuspendeerde cellen in een microfuge bij 1.500 xg en RT gedurende 30 s. Herhaal deze stap een keer.
  8. Resusteer cellen grondig in 570 μl buffer A. Voeg 30 μL 2% digitonine toe(0,1% uiteindelijke concentratie) om de permeabilisatie van de cellen te vergemakkelijken en om te mengen.
  9. Permeabiliseer cellen in warmteblok of waterbad bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
  10. Pipet de reactie omhoog en omlaag om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen te waarborgen. Verwijder een 100 μL aliquot van doorlaatbare cellen als een negatieve controle op een microfusie buis bevattende stopoplossing en SDS (stap 2.4) en vortex kort om te mengen.
  11. Voeg 1,1 μl 1 M CaCl2 (2 mM uiteindelijke concentratie) toe aan permeabiliseerde cellen om MNase te activeren en versnelde een paar keer snel of vortex om te mengen. Retourneer de gemengde reactie onmiddellijk bij 30 ° C en start een timer.
  12. Op elke tijdstip die moet worden verzameld, pipet de reactie omhoog en omlaag om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen te waarborgen, verwijder vervolgens een 100 μL aliquot door permeabiliseerde cellen naar een microfusiebuis met stopoplossing en SDS en vortex kort om te mengen. Voor elke nieuwe factor geanalyseerd, neem 0 s (geen CaCl 2 toegevoegd), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min en 10 min tijdspunten.
    OPMERKING: ChEC-experimenten met factoren die DNA snel bij 30 ° C splitsen kunnen bij lagere temperaturen worden uitgevoerd om de MNase-splitsingskinetica te vertragen.
  13. Zodra alle tijdspunten zijn verzameld, voeg 4 μL 20 mg / ml protease K toe aan elk monster, vortex kort om te mengen en incubeer bij 55 ° C gedurende 30 minuten.
  14. Voeg 200 μL 25: 24: 1 fenol: chloroform: isoamylalcohol toe aan elk monster, vortex krachtig te mengen en centrifugeer bij maximale snelheid en RT in een microfuge gedurende 5 minuten.
  15. Verwijder elke waterfase (~ 150 μL) naar een nieuwe buis. Voeg 30 μg glycogeen en 500 μl 100% ethanol toe. Vortex krachtig te mengen en neerslaan op droog ijs gedurende 10 minuten of tot oplossing is viskeus.
  16. Pellet neergeslagen DNA bij maximale snelheid en 4 ° C in een microfuge gedurende 10 minuten.
  17. Decant supernatanten en waspellets met 1 ml RT 70% ethanol.
  18. Decant ethanol, verwijder de rest door een omkeren van eenD tik de buizen voorzichtig op een papierdoek aan. Spoel de monsters kort in een centrifuge en gebruik een pipet om resterende ethanol te verwijderen, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Luchtdroge pellets voor 5 minuten bij RT.
  19. Terwijl de pellets drogen, maak een master mix om gedroogde pellets opnieuw te suspenderen in 29 μl Tris, pH 8,0 + 1 μL van 10 mg / mL RNase A elk. Digest RNA bij 37 ° C gedurende 20 min.
  20. Meng 1 μl 6X DNA laadkleuring met 5 μl van elk monster en laat deze gedurende 40 minuten op een 1,5% agarosegel lopen bij 120 V.

3. Grootte selectie

OPMERKING: Het doel van de grootte selectie is het verwijderen van multi-kilobase fragmenten van genomisch DNA uit het monster dat wordt gehersequentieerd en verrijkt fragmenten van ~ 150 bp (ongeveer de grootte van nucleosomale DNA) of kleiner. Bij sequentiegegevens worden fragmenten <400 bp verrijkt, met een opmerkelijke piek rond de grootte van nucleosomaal DNA (~ 150 bp) en een piek of brede verdeling van subnucleosomale fragmenten.

<ol>
  • Aan elk monster toevoegen 75 μL vaste-fase reversibele immobilisatie (SPRI) kralen in een polyethyleenglycol (PEG) oplossing 23 en pipet 10 keer omhoog en omlaag om te mengen. Incubeer de kraal: DNA-mengsel bij RT gedurende 5 minuten.
  • Tijdens de incubatie van SPRI-kraal, bereiden microfugebuizen die 96 μl van 10 mM Tris, pH 8,0 en 4 μl van 5 M NaCl voor elk monster bevatten.
  • Plaats buizen in een magnetisch rek om kralen aan de zijkant van de buis te verzamelen. Laat de kralen gedurende 2 minuten aan de zijkant van de buis verzamelen.
  • Breng elke supernatant over naar een nieuwe buis die Tris en NaCl bevat (stap 3.2).
  • Voeg 200 μL 25: 24: 1 fenol: chloroform: isoamylalcohol toe aan elk monster, vortex om te mengen en centrifugeer bij maximale snelheid en RT in een microfuge gedurende 5 minuten.
  • Verwijder elke waterfase naar een nieuwe buis. Voeg 30 μg glycogeen en 500 μl 100% ethanol toe. Neerslaan DNA op droog ijs gedurende 10 minuten of tot oplossing is visceus.
  • Pellet preciPitated DNA bij maximale snelheid en 4 ° C in een microfuge gedurende 10 minuten.
  • Decant supernatanten en waspellets met 1 ml 70% ethanol.
  • Decant ethanol, verwijder de rest door het omkeren en voorzichtig aan de buizen op een papieren handdoek te tikken. Spoel de monsters kort in een centrifuge en gebruik een pipet om resterende ethanol te verwijderen, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Luchtdroge pellets voor 5 minuten bij RT.
  • Resuspendeer gedroogde pellets in 25 μl Tris, pH 8,0. Bepaal de monsterconcentratie met behulp van een analyse met een hoge gevoeligheid. Voor TF ChEC experimenten wordt 10-100 ng DNA routinematig hersteld na grootte selectie.
  • Bereid sequencing bibliotheken op. Bibliotheekbereidingsprotocollen die niet afhankelijk zijn van grootteselectie, zoals eerder beschreven 24 , zijn gewenst om sequentiebepaling van een groot bereik van fragmentgroottes (25-500 bp) toe te staan.
  • Sequentiebibliotheken in de gekoppelde modus. Een minimum van 25 bases sequentie aan elk uiteinde is nodig voor het lezen van hoge kwaliteitin kaart brengen. Tussen 1 en 2 miljoen lezingen biedt voldoende dekking voor een ChEC-monster.
    OPMERKING: Analyse van ChEC-seq data is een complexe procedure en buiten het bereik van dit artikel. Gedetailleerde informatie over data analyse is te vinden in eerdere publicaties 1 , 21 en de aangepaste scripts die worden gebruikt voor analyse zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kan ook worden gebruikt voor command-line analyse van ChEC-seq data.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    In het geval van een succesvol ChEC-experiment, zal analyse van DNA door agarosegel-elektroforese een calciumafhankelijke toename in DNA-fragmentatie over de tijd onthullen, zoals aangegeven door het uitknippen en eventueel volledige vertering van genomisch DNA. In sommige gevallen wordt een ladder van banden vergelijkbaar met die gezien met een traditionele MNase-spijsvertering waargenomen na uitgebreide spijsvertering. Dit is het geval voor ChEC analyse van Reb1, een algemene regulerende factor die nucleosoomuitputtende gebieden bindt (NDR's) ( Figuur 2 ). We hebben gevonden, in het geval van GRF's, verlengde vertering leidt tot verlies van signaal in snel gesplitste bindingsplaatsen 1 . Idealiter zal een monster met een afname van de grootte van de genomische DNA-band die een hoge moleculaire massa uitstrijk, zoals de 30 s en 1 min tijdspunten voor Reb1 ChEC, worden gebruikt voor sequencing om tijdsafhankelijk signaalverlies te vermijden .

    Figuur 3 ). Op dezelfde manier zien we aanzienlijke DNA-splitsing door een fusie van de Mediator subunit Med8 met MNase, maar niet gratis MNase aangedreven door de MED8 promotor, 1 minuut na calciumtoevoeging ( Figuur 3 ).

    Om de gegevens van Reb1 ChEC-seq te vergelijken met ChIP-seq, behaalden we een lijst van 1.991 Reb1 pieken bepaald door ORGANIC 13 . Deze pieken waren gemotiveerd met de gemiddelde fragment eindtelling bij elke basispositie in een 100 bp venster rond het motief middenpunt. We hebben een opvallende asymmetrie in splitsing waargenomen, waarbij de meerderheid van het fragment eindigt in kaart brengen naar de stroomopwaartse kant van het motief (Figuur 4 ).

    Figuur 1
    Figuur 1 : Schematisch van de ChEC-Seq Methode. Een chromatine-geassocieerde eiwit (CAP) -MNase fusie wordt uitgedrukt in gistcellen. Het eiwit bindt aan DNA, maar veroorzaakt geen splitsing boven achtergrondniveaus door het zeer lage vrije calcium in de kern. Bij permeabilisatie van cellen met digitonine en toevoeging van millimolair calcium, binden CAP-MNase fusies aan het genoom kloof DNA, waardoor kleine fragmenten vrijkomen. Deze fragmenten worden vervolgens gezuiverd, sequentieerd en teruggekeken naar het genoom, waardoor pieken van fragmenten eindigend zijn aan bindingsplaatsen voor de CAP-MNase fusie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.


    Figuur 2 : Agarosegel-elektroforese van DNA uit een Reb1 ChEC-experiment. Een 5 μl aliquot van DNA uit elk ChEC tijdspunt werd geanalyseerd op een 1,5% TAE-agarosegel voorafgaand aan de grootte selectie. Dit toont progressieve vertering van genomisch DNA door de Reb1-MNase fusie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 3
    Figuur 3 : Genome Browser Snapshots van Reb1-MNase en Free MNase ChEC-Seq Experimenten. IGV-weergaven van fragment eindignaal voor Reb1 en vrije MNase ChEC-seq 30 s na calciumtoevoeging en Med8 en gratis MNase ChEC-seq 1 min af Ter calcium toevoeging langs een representatief segment van het gistgenoom. Datasets werden genormaliseerd door het aantal fragmenteinden te verdelen die zijn toegewezen aan elke basispositie door het totale aantal fragmenteinden die in kaart zijn gebracht en vermenigvuldigen met het totale aantal genummerde bases. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 4
    Figuur 4 : Verrijking van Reb1-MNase-vrijgegeven fragment eindigt rond Reb1 ORGANISCHE sites. Gemiddelde grafiek van 30 s Reb1 en gratis MNase ChEC-seq fragment eindignaal rond 1.991 Reb1 motieven bepaald door ORGANIC 13 . Gegevens werden genormaliseerd zoals in Figuur 3 .Lank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Plasmid Gist selecteerbare marker Notes Addgen plasmide nummer
    pGZ108 kanMX6 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker 70231
    pGZ109 HIS3MX6 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker 70232
    pGZ110 TRP1 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker 70233
    pGZ136 URA3 Expresseert 3xFLAG-MNase-SV40 NLS onder de controle van de REB1 promotor 72273
    pGZ173 kanMX6 MNase tagging, 8 aa linker 70234

    Tabel 1: Details van ChEC Plasmides. Alle markeringsvectoren zijn gebaseerd op pFA6a-vectoren en zijn dus compatibel met de veelgebruikte F2 / R1-markeringsprimerparen. De taggingcassette bestaat uit een linker met de aangegeven lengte, een 3xFLAG epitoop om de detectie door western blotting te vergemakkelijken (behalve in het geval van pGZ173, waar de linker is verkort om de 3xFLAG tag te verwijderen), de volwassen keten van MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), en de aangegeven selecteerbare marker.

    Reagens Volume [Laatste]
    5x PCR buffer 10 ml 1x (2 mM MgCl2)
    10 mM dNTP-mix (2,5 mM elk dNTP) 1 ml 200 mM (50 mM elke dNTP)
    10 mM F2 primer 2,5 ml 0,5 mM
    10 mM R1 primer 2,5 ml 0,5 mM
    PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / ml) 1 ml
    2 U / μL hot start high-fidelity polymerase 0,5 ml 1 U
    DdH20 32,5 ml

    Tabel 2: Reactie Mengsel voor PCR Amplificatie van 3xFLAG-MNase Tagging Cassettes. F2 / R1 primer sequenties zijn te vinden op http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.

    Temperatuur (° C) Tijd Cycles
    98 30 s 1
    98 10 s 25
    55 30 s 25
    72 1 min 15 s 25
    72 2 minuten 1
    10 Voor altijd Houden

    Tabel 3: Thermische fietsvoorwaarden voor PCR amplificatie van 3xFLAG-MNase Tagging Cassettes. Incubatietemperatuur en verlengingstijd kan wellicht aangepast worden op basis van het gebruikte DNA-polymerase.

    Reagens Volume [Laatste]
    10x Taq buffer 5 ml 1x (1,5 mM MgCl2)
    10 mM dNTP-mix (2,5 mM elk dNTP) 1 ml 200 mM (50 mM elke dNTP)
    10 mM Controleer de primer 1 ml 0,2 mM
    10 mM MNase-R of negatieve controle primer 1 ml 0,2 mM
    5 U / ml Taq polymerase 0,5 ml 2,5 U
    DdH20 41,5 ml

    Tabel 4: Reactie Mengsel voor Colony PCR Bevestiging van MNase Tagging. Controleer de primer sequenties kunt u vinden op http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. De controleprimer wordt gebruikt als de voorwaartse primer samen met een omgekeerde primer binnen MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') en een omgekeerde primer ~500 basisparen (bp) stroomafwaarts van het respectieve gen als een negatieve controle.

    Temperatuur (° C) Tijd Cycles
    95 5 minuten 1
    95 30 s 35
    55 30 s 35
    68 1 minuut 35
    68 5 minuten 1
    10 Voor altijd Houden

    Tabel 5: Thermische fietsvoorwaarden voor kolonie-PCR-bevestiging van MNase-markering. Incubatietemperatuur en verlengingstijd kan wellicht aangepast worden op basis van het gebruikte DNA-polymerase.

    Reagens Volume [Laatste]
    1 M Tris, pH 7,5 1,5 ml 15 mM
    1 M KCl 8 ml 80 mM
    0,2 M EGTA 50 ml 0,1 mM
    DdH20 Vul tot 100mL

    Tabel 6: Recept voor buffer A. Voeg voor het gebruik de helft van een proteaseremmerschema, 50 μl 100 mM PMSF (1 mM finale), 5 μl 200 mM spermine (0,2 mM finale) en 2,5 μl 1 M Spermidine (0,5 mM definitief) per 5 ml oplossing.

    Reagens Volume [Laatste]
    5 M NaCl 8 ml 400 mM
    0,5 M EDTA 4 ml 20 mM
    0,2 M EGTA 2 ml 4 mM
    DdH20 Vul tot 100 ml

    Tabel 7: Recept voor 2x stopoplossing. Combineer 90 μL stoP oplossing met 10 μl 10% SDS in een microfuge buis voor elk tijdstip dat moet worden genomen (zie stap 2.4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    We hebben aangetoond dat ChEC diverse klassen gistproteïnen op chromatine kan plassen en anticiperen dat het in grote mate van toepassing zal zijn op verschillende families van TF's en andere chromatine-bindende factoren in gist. ChEC-seq is voordelig doordat het geen crosslinking, chromatinoplosbaarheid of antilichamen vereist. Zo vermijdt ChEC artefacten die mogelijk aanwezig zijn in X-ChIP-seq, zoals het hyper-ChIPable artefact 3 , 4 en native ChIP, zoals valse negatieven door onvolledige eiwitsolubilisatie 14 . Het grote nadeel van ChEC-seq, zoals bij alle enzymatische fusiemethoden, is de eis voor een fusie-eiwit. Dit kan snel worden bereikt in ontluikende gist, maar is meer moeizaam in metazoanen. Een andere beperking van ChEC-seq is dat het niet kan worden geïmplementeerd als-is voor het profileren van histon-modificaties. Een modificatie-bindend domein kan echter gefuseerd worden aan MNase en uitgedrukt, waardoor h mogelijk isIstone modificatie mapping met ChEC-seq. In deze ader is ChIP-seq met behulp van epitoop-getagde histon-modificatie-bindende domeinen gebruikt om genoom-brede patronen van histon-modificatie 26 te plassen.

    Het gebruik van een gratis MNase controle is belangrijk bij het vaststellen van de specificiteit van ChEC-seq resultaten. De vrije MNase stam draagt ​​MNase gemarkeerd met 3xFLAG en een simian virus 40 nucleaire lokalisatie signaal (SV40 NLS) onder de controle van de endogene promotor voor het gen van belang. Het is conceptueel vergelijkbaar met de onvolledige Dam control die wordt gebruikt in DamID studies 27 en controleert voor nonspecifieke splitsing door chromatin toegankelijkheid. Als een gratis MNase controle voor TF ChEC-seq, integreren we 3xFLAG-MNase-SV40 NLS gedreven door de REB1 promotor op de ura3 locus 1 . Voor mediator ChEC-seq hebben we 3xFLAG-MNase-SV40 NLS uitgedrukt onder de controle van de MED8 promotor in een niet-integrerende plasmaD-vector gehandhaafd in selectief medium 21 . In beide gevallen werd zeer weinig splitsing door vrije MNase waargenomen. Zo moet een enkele controlevast waarbij 3xFLAG-MNase-SV40 NLS wordt aangedreven door een relatief robuuste promotor geschikt zijn voor de meeste experimenten.

    Bij het plannen van een ChEC-experiment kan structurele overweging van het geïnde eiwit belangrijk zijn. Bijvoorbeeld, we vonden dat bijvoeging van MNase aan de C-terminus van Reb1 een asymmetrisch splitsingspatroon gaf rond Reb1 motieven, terwijl expressie van Reb1 met N-terminale MNase een symmetrisch splitsingspatroon 1 gaf. Wij onderscheiden deze verschillende splitsingspatronen aan de structuur van Reb1. Het DNA-bindende domein van Reb1 bevindt zich bij zijn C-terminus; Dus is de C-terminus gestructureerd en dicht bij DNA, waardoor het bewegingsbereik van MNase wordt beperkt en alleen C-terminale splitsing mogelijk. In tegenstelling hiermee is de C-terminus van Abf1 relatief ongestructureerd en kan dit dus toenemen totBereik van MNase, waardoor splitsing aan beide zijden van Abf1 bindingsplaatsen mogelijk is. In het geval van Rap1, een andere gist GRF, vonden we dat het verkorten van de linker tussen de C-terminus en MNase van 33 tot 8 aa voldoende was om splitsing ernstig te verminderen, misschien door de voorgestelde afstand van het C-terminale gedeelte van Rap1 van DNA 28 . Dergelijke structurele overwegingen zullen ook belangrijk zijn bij het proberen de binding van eiwitten die aanwezig zijn in grote complexen te plannen. Voor onze ChEC-seq analyse van mediator binding aan het gistgenoom 21 , selecteerden we subeenheden waarvan de C-termini structureel werden voorgesteld bloot te stellen, in plaats van begraven in het complex. Van de drie subeenheden die gefuseerd werden met MNase, klonk er niet DNA gemakkelijk aan, waardoor sterische beperkingen, of interacties met andere DNA-bindingsfactoren, DNA-splitsing gedaald werden.

    We vonden dat ChEC-seq 4-12 keer meer pieken detecteert voor de gist GRF's Abf1, Rap1 en Reb1 dan verschillende ChIP-benaderingen wanneer alle tijdspunten samen werden beschouwd 1 . Deze sites kunnen worden verdeeld in twee klassen op basis van MNase splitsing kinetiek. Analyse van ChEC-seq data voor gist GRF's onthulde twee tijdelijk verschillende klassen bindingsplaatsen 1 . De eerste, aangeduide 'snelle' weergegeven maximale splitsing <1 min na calciumtoevoeging en over het algemeen robuuste overeenkomsten met bekende consensusmotieven. De tweede, genaamd 'langzaam', duurde enkele minuten om opmerkelijke niveaus van splitsing te bereiken en waren uitermate geschikt voor motieven. Beide klassen sites werden gemiddeld verrijkt voor binding in ChIP datasets, hoewel ze niet noodzakelijkerwijs worden genoemd als pieken in die ChIP studies. De meeste sites voor een gegeven factor waren langzame plaatsen. We speculeren dat snelle sites representatief zijn voor high-affinity transcriptiefactor bindingsplaatsen, terwijl trage sites loci voorlopig laten proeven tijdens het scannen van bindingsplaatsen. De obServatie van twee klassen bindingsplaatsen gescheiden door de kinetiek van MNase-splitsing kan de waarneming in veel ChIP-seq datasets verklaren dat een groot aantal pieken voor een bepaalde factor met een gevestigde DNA-bindingsspecificiteit geen consensusmotief 29 bevat : Formaldehyde verknoping, uitgevoerd gedurende 10-15 minuten in de meeste ChIP-protocollen, kan herhaaldelijk transiënte of opportunistische interacties van een factor met het genoom vastleggen, wat tot inflatie van het signaal leidt. Inderdaad, vergelijking van ChIP-exo en live-celbeelden suggereert dat dit het geval is 2 . In het bijzonder hebben we niet zo'n dramatische tijdafhankelijke afname in Mediator ChEC-seq-signalen 21 waargenomen, waarbij mediator ChEC-seq-signaal relatief constant is van 30 s tot 20 min. Gezien deze waarnemingen, raden we aan om ChEC-seq met korte duur te voltooien om vertrouwde sites te realiseren.

    We anticiperen dat ChEC-seq kan worden aangepast aan niet-gistsystemen. De concentratie van vrij calcium in ongestimuleerde zoogdiercellen is 50-300 nM 30 , 32 , ver onder de drempel voor efficiënte MNase-activering. De beperkende stap voor de oprichting van ChEC-seq in metazoan systemen is dus de opwekking van fusie-eiwitten, die veel meer moeizaam blijft in metazoan dan gistcellen. Echter, de endogene tagging van metazoan genen is sterk vergemakkelijkt door de komst van CRISPR-gebaseerde genoom engineering 33 , en daarom moet deze beperking gemakkelijk worden overschreden. Als alternatief kunnen MNase-fusie-eiwitten op lage niveaus uit plasmiden worden uitgedrukt. Deze aanpak is behoorlijk succesvol geweest voor DamID in Drosophila 34 , 35 en human 36 cellen en kan dus ook ChEC-seq in metazoancellen vergemakkelijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Acknowledgments

    We danken Moustafa Saleh en Jay Tourigny voor kritische lezing van het manuscript en Steven Hahn en Steven Henikoff voor mentor en ondersteuning tijdens de ontwikkeling van ChEC-seq en de toepassing ervan op het Mediatorcomplex. SG wordt ondersteund door NIH subsidies R01GM053451 en R01GM075114 en GEZ wordt ondersteund door Indiana University startup funds.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    dNTPs NEB N0447
    Q5 high-fidelity DNA polymerase NEB M0491L Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
    TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder ThermoFisher Scientific 10488085
    Taq DNA polymerase NEB M0273L
    cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001 It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
    PMSF ACROS Organics AC215740010
    Digitonin, High Purity EMD Millipore 300410-250MG Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
    Proteinase K, 20 mg/mL Invitrogen 25530049
    RNase A, 10 mg/mL ThermoFisher Scientific EN0531
    Ampure XP beads Beckman Coulter A63880 Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
    MagneSphere magnetic rack Promega Z5342

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
    2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
    3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
    4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
    5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
    6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
    7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
    8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
    9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
    10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
    11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
    12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
    13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
    14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
    15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
    16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
    17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
    18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
    19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
    20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
    21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
    22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
    23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
    24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
    25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
    26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
    27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
    28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
    29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
    30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
    31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
    32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
    33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
    34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
    35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
    36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

    Tags

    Genetica ChEC-seq ChIP-seq transcriptie genoom-breed mediator,
    Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Grünberg, S., Zentner, G. E.More

    Grünberg, S., Zentner, G. E. Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (124), e55836, doi:10.3791/55836 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter