Summary
Vi beskriver chromatin endogen spaltning kombineret med høj gennemstrømningssekvensering (ChEC-seq), en chromatinimmunpræcipitation (ChIP) -orthogonal metode til kortlægning af proteinbindingssteder, som er genomsamlede med mikrokocelle nuklease (MNase) fusionsproteiner.
Abstract
Genomfattende kortlægning af protein-DNA-interaktioner er kritisk for forståelse af genregulering, chromatin-remodeling og andre chromatin-residente processer. Formaldehyd-tværbinding efterfulgt af chromatinimmunpræcipitation og høj-gennemstrømningssekvensering (X-ChIP-seq) er blevet anvendt til at opnå mange værdifulde indsigter i genombiologi. Imidlertid har X-ChIP-seq bemærkelsesværdige begrænsninger forbundet med tværbinding og sonikering. Native ChIP undgår disse ulemper ved at udelade tværbinding, men resulterer ofte i dårlig genopretning af kromatinbundne proteiner. Derudover er alle ChIP-baserede metoder underlagt antistofkvalitets overvejelser. Enzymatiske metoder til kortlægning af protein-DNA-interaktioner, der involverer fusion af et protein af interesse for et DNA-modificerende enzym, er også blevet anvendt til kortlægning af protein-DNA-interaktioner. Vi har for nylig kombineret en sådan metode, chromatin endogen spaltning (ChEC), med høj gennemstrømningssekvensering som ChEC-seq. ChEC-seq er afhængig af fusion af en chromatin-assocIeret protein af interesse for mikrokokernuklease (MNase) til dannelse af målrettet DNA-spaltning i nærværelse af calcium i levende celler. ChEC-seq er ikke baseret på immunpræcipitation og omgår således potentielle problemer med tværbinding, sonikering, chromatinopløseliggørelse og antistofkvalitet, samtidig med at der tilvejebringes højopløsningsmapping med minimalt baggrundssignal. Vi forestiller os, at ChEC-seq vil være en stærk modstykke til ChIP, hvilket giver et selvstændigt middel til at både validere ChIP-seq-fund og opdage nye indblik i genomisk regulering.
Introduction
Kortlægning af bindingsstederne for transkriptionsfaktorer (TF'er), chromatin-remodelerer og andre kromatinassocierede regulatoriske faktorer er nøglen til forståelsen af alle kromatinbaserede processer. Mens chromatinimmunpræcipitation og høj gennemstrømningssekvensering (ChIP-seq) fremgangsmåder er blevet brugt til at opnå mange vigtige indsigter i genombiologi, har de bemærkelsesværdige begrænsninger. Vi introducerede for nylig en alternativ metode, kaldet chromatin endogen spaltning og high-throughput sekventering (ChEC-seq) 1 , for at omgå disse ulemper.
ChIP-seq udføres oftest med et indledende formaldehydtværbindelsestrin (X-ChIP-seq) for at bevare protein-DNA-interaktioner. Imidlertid har en række nyere undersøgelser vist, at X-ChIP-seq fanger transient eller ikke-specifikke protein-DNA-interaktioner 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , hvilket giver anledning til falske positive bindingssteder. Hertil kommer, at sonikering, der almindeligvis anvendes til fragmentering af chromatin i X-ChIP-seq-eksperimenter, fortrinsvis saksregioner af åben chromatin, hvilket fører til forspændt opsving af fragmenter fra disse regioner 9 , 10 . Sonikering giver også en heterogen blanding af fragmentlængder, der i sidste ende begrænser bindingsstedets opløsning, selvom tilsætningen af et exonukleasefordøjelsestrin i høj grad kan forbedre opløsningen 11 , 12 . Native ChIP-metoder såsom besatte regioner af genomer fra affinitetsrenset naturligt isoleret kromatin (ORGANISK) 13 bruger ikke tværbinding og fragmentkromatin med mikrokokernuklease (MNase), lindrende potentielle biaser forbundet med formaldehyd-tværbinding og sonikering. Imidlertid,Opløseligheden af mange kromatinbundne proteiner under de forholdsvis milde betingelser, der kræves til nativ kromatinekstraktion er dårlig, hvilket potentielt fører til reduceret dynamisk område og / eller falske negativer 14 .
Mens forskellige iterationer af ChIP-seq mest anvendes til genomfattende kortlægning af protein-DNA-interaktioner, er der også implementeret adskillige kortlægningsteknikker baseret på fusion af proteiner af interesse for forskellige DNA-modificerende enzymer. En sådan fremgangsmåde er DNA-adeninmethyltransferaseidentifikation (DamID) 15 , hvor et chromatinbindende protein af interesse er genetisk fusioneret til Dam, og denne fusion udtrykkes i celler eller dyr, hvilket resulterer i methylering af GATC-sekvenser, der er proximale til bindingssteder for proteinet. DamID er fordelagtig, fordi den ikke er afhængig af immunpræcipitation og således undgår tværbinding, antistoffer eller chromatinopløseliggørelse. Det udføres også in vivo . Imidlertid, Er opløsningen af DamID begrænset til kilobaseskalaen og den methylerende aktivitet af Dam-fusionsproteinet er konstitutiv. En anden metode baseret på enzymatisk fusion er Calling Card-seq 16 , der anvender fusion af en faktor af interesse for en transposase, der dirigerer stedsspecifik integration af transposoner. Som DamID er Calling Card-seq ikke baseret på immunpræcipitation og har dermed tilsvarende fordele, med den ekstra fordel ved forøget opløsning. Calling Card-seq kan imidlertid begrænses af sekvensforspændinger af transposaser og er også afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder tæt på transposon-insertionssteder.
En tredje enzymatisk fusionsmetode, der er udviklet i Laemmli lab, er chromatin endogen spaltning (ChEC) 17 . I ChEC udtrykkes en fusion mellem et chromatinassocieret protein og MNase i celler, og efter calciumtilsætning til aktivering af MNase spaltes DNA proximalt til bindingssteder for den mærketFaktor ( figur 1 ). I forbindelse med Southern blotting er ChEC blevet anvendt til at karakterisere chromatinstruktur og proteinbinding på et antal individuelle loci i gær 17 , 18 og er blevet kombineret med lavopløsnings-mikroarrayanalyse for at undersøge interaktionen mellem nukleare pore-komponenter med gæren Genom 19 . ChEC tilbyder fordele svarende til DamID og Calling Card-seq, og dens opløsning er næsten single-base pair, når den analyseres ved primer forlængelse 19 . ChEC er også kontrollerbar: Robust DNA spaltning ved MNase afhænger af tilsætning af millimolar calcium, hvilket sikrer, at MNase er inaktiv ved de lave frie calciumkoncentrationer observeret i levende gærceller 20 .
Tidligere postulerede vi at kombinere ChEC med high-throughput-sekventering (ChEC-seq) ville tilvejebringe kort med høj opløsning af TF-bindingssteder. Faktisk, ChEC-seq genererede kort med høj opløsning af de spirende gær generelle regulatoriske faktorer (GRF'er) Abf1, Rap1 og Reb1 på tværs af genomet 1 . Vi har også med succes anvendt ChEC-seq til det modulære Mediator-kompleks, en bevaret, essentiel global transkriptionel coaktivator 21 , der udvider anvendeligheden af ChEC-seq til megadalton-størrelse komplekser, der ikke direkte kontakter DNA og kan være vanskelige at kortlægge ved ChIP- Baserede metoder. ChEC-seq er en stærk metode både til uafhængig validering af ChIP-seq-resultater og generering af nye indsigter i reguleringen af chromatin-residente processer. Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol til implementering af denne metode i spirende gær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Frembringelse af gærstammer
- Generer en gærstamme, der bærer den faktor af interesse, der er mærket med MNase.
- PCR amplificerer MNase-mærkningskassetten fra den ønskede vektor ( tabel 1 ) under anvendelse af den specificerede reaktionsblanding ( tabel 2 ) og cykliske betingelser ( tabel 3 ). Bland 5 μL af PCR-reaktionen og 1 μl 6X DNA-fyldstof. Kør hver PCR-alikvot på en 0,8% agarosegel ved 120 V i 40 minutter. Den forventede produktstørrelse er ~ 2,3 kb.
- Transformér den amplificerede mærkningskassette i valgfrihed ved brug af standard lithiumacetat-transformation 22 og udfør valg.
- Bekræft korrekt integration af mærkningskassetten med koloni-PCR.
- Forbered den specificerede reaktionsblanding ( tabel 4 ) for antallet af kolonier, der skal screenes. Opbevares på is til brug.
- Vælg en del af hver koloni for at være tesTed ind i bunden af et PCR-rør ved anvendelse af en steril tandstikker eller pipetip.
- Mikrobølgeovn de udvalgte kolonier ved høj effekt i 1 min.
- Tilsæt 50 μl PCR-blanding ( tabel 4 ) til hver mikrobølget koloni og pipetter op og ned for at blande. Udfør PCR ved hjælp af de angivne cykliske forhold ( tabel 5 ).
- Bland 50 μL PCR-reaktionen og 10 μl 6X DNA-fyldstof direkte i hvert PCR-rør. Kør 10 μl af hver prøve på en 1% agarosegel ved 120 V i 40 minutter. Den forventede produktstørrelse er ~ 700 bp.
BEMÆRK: Kontroller, om ønsket, passende ekspression af MNase-fusionsproteinet via western blotting. A ~ 20,6 kilodalton skift i molekylvægten af det mærkede protein forventes.
- Generer en fri MNase-stamme ved homologi-baseret kloning af promotoren af genet af interesse i pGZ136 (tabel 1) og transformation og selektion som i trin 1.1.2.
- AlternatiMontere promotoren af genet af interesse og 3xFLAG-MNase-SV40 NLS i en plasmidvektor, transformere og selekter som i trin 1.1.2 og dyrke stammen i den passende selektive tilstand til vedligeholdelse af plasmidet.
2. ChEC
- På eftermiddagen / aftenen dagen før ChEC-eksperimentet inokulerer 3 ml gærpepton-dextrose (YPD) eller passende selektivt medium med en enkelt koloni af stammen, der bærer den MNase-mærket faktor. Inkubér denne kultur natten over (180 rpm rystning, 30 ° C).
- Om morgenen på dagen for ChEC-eksperimentet fortyndes natten overkulturen i 50 ml medium til en optisk densitet ved 600 nm (OD 600 ) på 0,2-0,3. Inkuber denne kultur (180 omdrejningstal rystning, 30 ° C), indtil den når en OD 600 på 0,5-0,7. Når kulturen nærmer sig den passende OD 600 , sættes varmeblokken eller vandbadet til 30 ° C og starter optøning af buffer A tilsætningsstoffer ( TaBle 6).
- Forbered 5 ml Buffer A plus additiver ( tabel 6 ) pr. Kultur. Opbevar buffer A ved RT under proceduren.
- Forbered mikrofuge rør indeholdende 90 μL stopopløsning ( Tabel 7 ) og 10 μl 10% SDS for hvert tidspunkt, der skal opsamles. For hver analyseret ny faktor tages prøver på 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min og 10 min.
- Dekanter kulturen i et 50 ml konisk rør og centrifuger ved 1500 xg og stuetemperatur (RT) i 1 min.
- Resuspender cellerne grundigt i 1 ml buffer A og overfør de resuspenderede celler til et microfuge-rør. Pellet resuspenderede celler i en mikrofuge ved 1.500 xg og RT i 30 s.
- Aspirer supernatant og grundigt resuspender cellerne i 1 ml Buffer A ved pipettering op og ned. Pellet resuspenderede celler i en mikrofuge ved 1.500 xg og RT i 30 s. Gentag dette trin en gang.
- Resuspender cellerne grundigt i 570 μl buffer A. Tilsæt 30 μl 2% digitonin(0,1% slutkoncentration) for at lette permeabilisering af cellerne og invertere til blanding.
- Permeabiliser celler i varmeblok eller vandbad ved 30 ° C i 5 minutter.
- Pipet reaktionen op og ned for at sikre en jævn fordeling af cellerne. Fjern en 100 μl alikvot af permeabiliserede celler som en negativ kontrol til en mikrofugerør indeholdende stopopløsning og SDS (trin 2.4) og hvirvel kortvarigt at blande.
- Tilsæt 1,1 μL 1 M CaCl2 (2 mM slutkoncentration) til permeabiliserede celler for at aktivere MNase og inverter flere gange hurtigt eller hvirvel kort for at blande. Returner straks den blandede reaktion ved 30 ° C og start en timer.
- På hvert tidspunkt, der skal indsamles, pipetteres reaktionen op og ned for at sikre en jævn fordeling af cellerne, så fjern en 100 μl alikvot af permeabiliserede celler til en mikrofugerør indeholdende stopopløsning, og SDS og hvirvel kortvarigt blandes. For hver ny faktor analyseret, tag 0 s (ingen CaCl 2 tilsat), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min og 10 min tidspunkter.
BEMÆRK: ChEC-eksperimenter med faktorer, der hurtigt spalter DNA ved 30 ° C, kan udføres ved lavere temperaturer til langsom MNase spaltningskinetik. - Når alle tidspunkter er blevet opsamlet, tilsættes 4 μL 20 mg / ml proteinase K til hver prøve, hvirveler kortvarigt at blande og inkuberer ved 55 ° C i 30 minutter.
- Tilsæt 200 μL 25: 24: 1 phenol: chloroform: isoamylalkohol til hver prøve, hvirvel kraftigt at blande, og centrifuger ved maksimal hastighed og RT i en mikrofuge i 5 minutter.
- Fjern hver vandfase (~ 150 μL) til et nyt rør. Tilsæt 30 μg glykogen og 500 μl 100% ethanol. Vortex kraftigt at blande og bundfælde på tøris i 10 minutter eller indtil opløsningen er viskøs.
- Pelletfældet DNA ved maksimal hastighed og 4 ° C i en mikrofuge i 10 minutter.
- Dekanter supernatanter og vask pellets med 1 ml RT 70% ethanol.
- Dekanter ethanol, fjerne resten ved at vende enD tapper forsigtigt rørene på et papirhåndklæde. Snur omdrejningsprøver ved hjælp af en benchtopcentrifuge og brug en pipette for at fjerne resterende ethanol, og pas på at ikke forstyrre pelleten. Luft-tørre piller til RT i 5 min.
- Mens pellets tørrer, laves en master blanding til resuspendering af tørrede pellets i 29 μl Tris, pH 8,0 + 1 μL 10 mg / ml RNase A hver. Fordøj RNA ved 37 ° C i 20 minutter.
- Bland 1 μl 6X DNA-fyldstof med 5 μl af hver prøve og kør på en 1,5% agarosegel ved 120 V i 40 minutter.
3. Størrelsesvalg
BEMÆRK: Målet med størrelsesvalg er at fjerne multi-kilobase fragmenter af genomisk DNA fra prøven, som skal sekventeres og berige fragmenter på ~ 150 bp (ca. størrelsen af nukleosomalt DNA) eller mindre. I sekventeringsdata beriges fragmenter <400 bp, med en bemærkelsesværdig top omkring størrelsen af nukleosomalt DNA (~ 150 bp) og en top eller bred fordeling af subnucleosomale fragmenter.
<ol>BEMÆRK: Analyse af ChEC-seq-data er en kompleks procedure og ud over anvendelsesområdet for denne artikel. Detaljerede oplysninger om dataanalyse findes i tidligere publikationer 1 , 21 , og de brugerdefinerede scripts anvendt til analyse er tilgængelige på GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kan også bruges til kommandolinjeanalyse af ChEC-seq data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I tilfælde af et vellykket ChEC-forsøg vil analyse af DNA ved agarosegelelektroforese afsløre en calciumafhængig forøgelse i DNA-fragmentering over tid som angivet ved udtværing og eventuel fuldstændig fordøjelse af genomisk DNA. I nogle tilfælde observeres en stige af bånd, der ligner den, der ses med en traditionel MNase-fordøjelse efter udvidet fordøjelse. Dette er tilfældet for ChEC analyse af Reb1, en generel regulatorisk faktor, der binder nukleosomudtømte regioner (NDR'er) ( Figur 2 ). Vi har fundet, i tilfælde af GRF'er, udvidet fordøjelse fører til tab af signal på hurtigt spaltede bindingssteder 1 . Ideelt set vil en prøve med en reduktion i størrelsen af det genomiske DNA-bånd, der udviser højmolekylær smearing, såsom 30 s og 1 min-tidspunkter for Reb1 ChEC, blive anvendt til sekventering for at undgå tidsafhængig tab af signal .
figur 3 ). På samme måde observerer vi væsentlig DNA-spaltning ved en fusion af mediatorunderenheden Med8 med MNase, men ikke fri MNase drevet af MED8-promotoren , 1 minut efter calciumtilsætning ( Figur 3 ).
For at sammenligne Reb1 ChEC-seq data til ChIP-seq opnåede vi en liste over 1,991 Reb1 toppe bestemt af ORGANIC 13 . Disse toppe var motiv-centreret med det gennemsnitlige fragment endtælling ved hver basisposition i et 100 bp vindue omkring motiv midtpunktet. Vi observerede en slående asymmetri i spaltning, med størstedelen af fragmentet slutter kortlægning til opstrøms siden af motivet (Figur 4 ).
Figur 1 : Skematisk af ChEC-seq Metoden. En chromatinassocieret protein (CAP) -MNase-fusion udtrykkes i gærceller. Proteinet binder til DNA, men genererer ikke spaltning over baggrundsniveauer på grund af det meget lave frie calcium i kernen. Ved permeabilisering af celler med digitonin og tilsætning af millimolær calcium bundet CAP-MNase-fusioner til genom-spaltnings-DNA'et, der frigiver små fragmenter. Disse fragmenter renses derefter, sekventeres og kortlægges tilbage til genomet, hvilket giver toppe af fragmenter ender proximalt med bindingssteder for CAP-MNase-fusionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Agarosegelektroforese af DNA fra et Reb1 ChEC-eksperiment. En 5 μl alikvot af DNA fra hvert ChEC-tidspunkt blev analyseret på en 1,5% TAE-agarosegel forud for størrelsesvalg. Dette viser progressiv fordøjelse af genomisk DNA ved Reb1-MNase fusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Genoms Browser Snapshots af Reb1-MNase og Free MNase ChEC-Seq Experiments. IGV-synspunkter af fragment-endesignal for Reb1 og fri MNase ChEC-seq 30 s efter calciumtilsætning og Med8 og fri MNase ChEC-seq 1 min af Ter calcium tilsætning langs et repræsentativt segment af gærgenomet. Datasæt blev normaliseret ved at dividere antallet af fragment-ender kortlagt til hver basisposition med det totale antal fragment-ender kortlagt og multiplicere med det samlede antal baser kortlagt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Berigelse af Reb1-MNase-frigivet fragmenter slutter omkring Reb1 ORGANISKE websteder. Gennemsnitlig plot på 30 s Reb1 og fri MNase ChEC-seq fragment slut signal omkring 1.991 Reb1 motiver bestemt af ORGANIC 13 . Data blev normaliseret som i figur 3 .Lank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
| Plasmid | Gær selekterbar markør | Noter | Addgen plasmid nummer |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70.231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70.232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70.233 |
| pGZ136 | URA3 | Udtrykker 3xFLAG-MNase-SV40 NLS under kontrol af REB1-promotoren | 72.273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNase tagging, 8 aa linker | 70.234 |
Tabel 1: Detaljer om ChEC Plasmider. Alle mærkningvektorer er baseret på pFA6a-vektorer og er således kompatible med de almindeligt anvendte F2 / R1-mærkningsprimerpar. Tagningskassetten består af en linker med den angivne længde, en 3xFLAG-epitop for at lette detektering ved western blotting (undtagen i tilfælde af pGZ173, hvor linkeren er blevet forkortet for at fjerne 3xFLAG-mærket), den modne kæde af MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), og den angivne selekterbare markør.
| Reagens | Bind | [Final] |
| 5x PCR buffer | 10 ml | 1 x (2 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP-blanding (2,5 mM hver dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM hver dNTP) |
| 10 mM F2 primer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| 10 mM R1 pRimer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / ml) | 1 ml | |
| 2 U / μL hot start high-fidelity polymerase | 0,5 ml | 1 U |
| DdH20 | 32,5 ml |
Tabel 2: Reaktionsblanding til PCR-amplifikation af 3xFLAG-MNase-mærkningskassetter. F2 / R1-primer-sekvenser kan findes på http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatur (° C) | Tid | Cykler |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 min | 1 |
| 10 | For evigt | Holde |
Tabel 3: Termiske cykliske betingelser for PCR-amplifikation af 3xFLAG-MNase-mærkningskassetter. Inkubationstemperatur og forlængelsestid kan muligvis justeres baseret på den anvendte DNA-polymerase.
| Reagens | Bind | [Final] |
| 10x Taq buffer | 5 ml | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP-blanding (2,5 mM hver dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM hver dNTP) |
| 10 mM Check primer | 1 ml | 0,2 mM |
| 10 mM MNase-R eller negativ kontrol primer | 1 ml | 0,2 mM |
| 5 U / ml Taq-polymerase | 0,5 ml | 2,5 U |
| DdH20 | 41,5 ml |
Tabel 4: Reaktionsblanding til koloni-PCR-bekræftelse af MNase-tagging. Check primer sekvenser kan findes på http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. Kontrolprimeren anvendes som den fremadrettede primer sammen med en omvendt primer inden for MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') og en revers primer ~ 500 basepar (bp) nedstrøms for det respektive gen som en negativ kontrol.
| Temperatur (° C) | Tid | Cykler |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 min | 35 |
| 68 | 5 min | 1 |
| 10 | For evigt | Holde |
Tabel 5: Termiske cykliske betingelser for koloni-PCR-bekræftelse af MNase-tagging. Inkubationstemperatur og forlængelsestid kan muligvis justeres baseret på den anvendte DNA-polymerase.
| Reagens | Bind | [Final] |
| 1 M Tris, pH 7,5 | 1,5 ml | 15 mM |
| 1 M KCl | 8 ml | 80 mM |
| 0,2 M EGTA | 50 ml | 0,1 mM |
| DdH20 | Fyld til 100ml |
Tabel 6: Opskrift på buffer A. Før brug skal der tilsættes halvdelen af en proteasehæmmende tablet, 50 μl 100 mM PMSF (1 mM endelig), 5 μl 200 mM spermin (0,2 mM endelig) og 2,5 μl 1 M Spermidin (0,5 mM endelig) pr. 5 ml opløsning.
| Reagens | Bind | [Final] |
| 5 M NaCl | 8 ml | 400 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 mL | 20 mM |
| 0,2 M EGTA | 2 ml | 4 mM |
| DdH20 | Fyld til 100 ml |
Tabel 7: Opskrift på 2x Stop Solution. Kombiner 90 μL stoP opløsning med 10 μl 10% SDS i et mikrofugerør for hvert tidspunkt, der skal tages (se trin 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist, at ChEC kan kortlægge forskellige klasser af gærproteiner på kromatin og forudse, at det vil være bredt anvendeligt for forskellige familier af TF'er og andre kromatinbindende faktorer i gær. ChEC-seq er fordelagtig, idet den ikke kræver tværbinding, chromatinopløseliggørelse eller antistoffer. Således undgår ChEC artefakter, der potentielt er til stede i X-ChIP-seq, såsom hyper-ChIPable artefact 3 , 4 og native ChIP, såsom falske negativer på grund af ufuldstændig proteinsolubilisering 14 . Den største ulempe ved ChEC-seq, som med alle enzymatiske fusionsmetoder, er kravet om et fusionsprotein. Dette kan opnås hurtigt i spirende gær, men er mere besværlig i metazoans. En anden begrænsning af ChEC-seq er, at den ikke kan implementeres som-er til profilering af histon-modifikationer. Et modifikationsbindende domæne kunne dog fusioneres til MNase og udtrykkes, hvilket muliggør hIstone modifikation kortlægning med ChEC-seq. I denne vene er ChIP-seq, der anvender epitop-mærket histon-modifikationsbindende domæner, blevet anvendt til at kortlægge genom-brede mønstre af histon-modifikation 26 .
Anvendelsen af en fri MNase-kontrol er vigtig for at fastslå specificiteten af ChEC-seq-resultater. Den frie MNase-stamme bærer MNase mærket med 3xFLAG og et simianvirus 40 nukleært lokaliseringssignal (SV40 NLS) under kontrol af den endogene promotor for genet af interesse. Det er begrebsmæssigt ligner den ufuldstændige dæmningskontrol, der anvendes i DamID-undersøgelser 27 og kontrollerer for uspecifik spaltning på grund af chromatin tilgængelighed. Som en gratis MNase-kontrol for TF ChEC-seq integrerede vi 3xFLAG-MNase-SV40 NLS drevet af REB1-promotoren på ura3- locus 1 . For Mediator ChEC-seq udtrykte vi 3xFLAG-MNase-SV40 NLS under kontrol af MED8-promotoren i en ikke-integrerende plasmakoncentrationD vektor bibeholdt i selektivt medium 21 . I begge tilfælde blev meget lille spaltning ved fri MNase observeret. Således skal en enkelt kontrolstamme, hvor 3xFLAG-MNase-SV40 NLS drives af en relativt robust promotor være passende for de fleste eksperimenter.
Ved planlægning af et ChEC-eksperiment kan strukturelle overvejelser af protein af interesse være vigtige. For eksempel fandt vi, at tilføjelse af MNase til C-terminalen af Reb1 gav et asymmetrisk spaltningsmønster omkring Reb1-motiver, mens ekspression af Reb1 med N-terminal MNase gav et symmetrisk spaltningsmønster 1 . Vi tilskriver disse forskellige spaltningsmønstre til strukturen af Reb1. Det DNA-bindende domæne af Reb1 er placeret ved dets C-terminus; C-terminalen er således struktureret og tæt på DNA, der begrænser bevægelsesområdet for MNase og tillader kun C-terminal spaltning. I modsætning hertil er Cf-terminalen af Abf1 relativt ustruktureret og kan således virke til at stige tilRækkevidde af MNase, hvilket tillader spaltning på begge sider af Abf1 bindingssteder. I tilfælde af Rap1, en anden gær GRF, fandt vi, at afkortning af linkeren mellem C-terminalen og MNase fra 33 til 8 aa var tilstrækkelig til alvorligt at reducere spaltning, måske på grund af den foreslåede afstand af den C-terminale del af Rap1 fra DNA 28 . En sådan strukturel overvejelse vil også være vigtig, når man forsøger at kortlægge bindingen af proteiner, der er til stede i store komplekser. Til vores ChEC-seq-analyse af mediatorbinding til gærgenomet 21 valgte vi subunits, hvis C-termini strukturelt var forudsagt at blive eksponeret, snarere end begravet inden for komplekset. Af de tre underenheder fusioneret til MNase spaltede man ikke kraftigt DNA, hvilket tyder på, at enten steriske begrænsninger eller interaktioner med andre DNA-bindingsfaktorer svækkede DNA-spaltning.
Vi fandt ud af, at ChEC-seq detekterer 4-12 gange flere toppe for gær-GRF'erne Abf1, Rap1 og Reb1 end forskellige ChIP-tilgange, da alle tidspunkter blev betragtet sammen 1 . Disse steder kan opdeles i to klasser baseret på MNase spaltningskinetik. Analyse af ChEC-seq-data for gær-GRF'er afslørede to midlertidigt forskellige klasser af bindingssteder 1 . Den første, kaldet "hurtig" vises maksimal spaltning <1 min efter calciumtilsætning og indeholder generelt robuste kampe til kendte konsensusmotiver. Den anden, betegnet 'langsom', tog flere minutter for at nå mærkbare niveauer af spaltning og var udtømt af motivkampe. Begge klasser af websteder blev i gennemsnit beriget for binding i ChIP datasæt, selvom de ikke nødvendigvis blev kaldt toppe i disse ChIP-undersøgelser. De fleste steder for en given faktor var langsomme steder. Vi spekulerer på, at hurtige steder er repræsentative for højaffinitetstransskriptionsfaktorbindingssteder, mens langsomme steder repræsenterer loci transientt udtaget under bindingsstedscanning. ObBetjening af to klasser bindingssteder adskilt af kinetikken af MNase spaltning kan forklare observationen i mange ChIP-seq datasæt, at et stort antal toppe for en given faktor med en veletableret DNA-bindingsspecificitet ikke indeholder et konsensusmotiv 29 : Formaldehyd-tværbinding, udført i 10-15 minutter i de fleste ChIP-protokoller, kan gentagne gange opfange forbigående eller opportunistiske interaktioner af en faktor med genomet, hvilket fører til signalinflation. Faktisk antyder sammenligning af ChIP-exo og levende cellebilleddannelse, at dette er tilfældet 2 . I særdeleshed observerede vi ikke et så dramatisk tidsafhængigt fald i mediator-ChEC-seq-signaler 21 , med Mediator ChEC-seq-signal relativt konstant fra 30 s til 20 min. I betragtning af disse observationer anbefaler vi at udføre ChEC-seq med kort varighed for at genoprette bindingssteder med høj tillid.
Vi forventer, at ChEC-seq kan tilpasses til ikke-gærsystemer. Koncentrationen af frit calcium i ustimulerede pattedyrceller er 50-300 nM 30 , 32 , langt under tærsklen for effektiv MNase-aktivering. Det begrænsende trin for etablering af ChEC-seq i metazoan-systemer er således dannelsen af fusionsproteiner, som forbliver langt mere besværlige i metazoan end gærceller. Imidlertid er endogent mærkning af metazoan-gener blevet letteret lettet ved tilkomsten af CRISPR-baseret genomteknik 33 , og denne begrænsning bør derfor let overføres. Alternativt kan MNase-fusionsproteiner udtrykkes ved lave niveauer fra plasmider. Denne fremgangsmåde har været ret succesfuld for DamID i Drosophila 34 , 35 og humane 36 celler og kan således også lette ChEC-seq i metazoanceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Moustafa Saleh og Jay Tourigny for kritisk læsning af manuskriptet og Steven Hahn og Steven Henikoff til mentorskab og support under udviklingen af ChEC-seq og dens anvendelse til Mediator-komplekset. SG understøttes af NIH tilskud R01GM053451 og R01GM075114 og GEZ understøttes af Indiana University startup funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
