Summary
Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).
Abstract
La cartographie à l'échelle du génome des interactions protéine-ADN est essentielle pour la compréhension de la régulation des gènes, du remodelage de la chromatine et d'autres processus résistant aux chromatines. La réticulation par formaldehyde suivie de l'immunoprécipitation de la chromatine et du séquençage à haut débit (X-ChIP-seq) a été utilisée pour obtenir de nombreuses informations précieuses sur la biologie du génome. Cependant, X-ChIP-seq a des limitations remarquables liées à la réticulation et à la sonication. Le ChIP indigène évite ces inconvénients en omettant la réticulation, mais entraîne souvent une mauvaise récupération des protéines liées à la chromatine. En outre, toutes les méthodes basées sur le ChIP sont soumises à des considérations de qualité d'anticorps. Les méthodes enzymatiques pour cartographier les interactions protéine-ADN, qui impliquent la fusion d'une protéine d'intérêt pour une enzyme modifiant l'ADN, ont également été utilisées pour cartographier les interactions protéine-ADN. Nous avons récemment combiné une telle méthode, le clivage endogène de la chromatine (ChEC), avec un séquençage à haut débit comme ChEC-seq. ChEC-seq repose sur la fusion d'une chromatine-assocUne protéine d'intérêt intéressant pour la nuclease micrococcique (MNase) génère un clivage d'ADN ciblé en présence de calcium dans les cellules vivantes. Le ChEC-seq n'est pas basé sur l'immunoprécipitation et contourne ainsi les préoccupations potentielles liées à la réticulation, à la sonication, à la solubilisation de la chromatine et à la qualité des anticorps tout en fournissant une cartographie haute résolution avec un signal de fond minimal. Nous envisageons que ChEC-seq sera une contrepartie puissante de ChIP, fournissant un moyen indépendant permettant de valider les résultats de ChIP-seq et de découvrir de nouvelles idées sur la régulation génomique.
Introduction
La cartographie des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), des remodelateurs de la chromatine et d'autres facteurs réglementaires associés à la chromatine est essentielle pour comprendre tous les processus basés sur la chromatine. Bien que les approches d'immunoprécipitation à la chromatine et de séquençage à haut débit (ChIP-seq) aient été utilisées pour obtenir de nombreuses connaissances importantes sur la biologie du génome, elles ont des limitations notables. Nous avons récemment introduit une méthode alternative, appelée clivage endogène de la chromatine et séquençage à haut débit (ChEC-seq) 1 , pour contourner ces inconvénients.
ChIP-seq est le plus souvent réalisé avec une étape initiale de réticulation de formaldéhyde (X-ChIP-seq) pour préserver les interactions protéine-ADN. Cependant, un certain nombre d'études récentes ont indiqué que X-ChIP-seq capture des interactions protéines-ADN transitoires ou non spécifiques 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , donnant lieu à des sites de liaison faussement positifs. En outre, la sonication, couramment utilisée pour fragmenter la chromatine dans les expériences X-ChIP-seq, cisaille préférentiellement les régions de la chromatine ouverte, ce qui conduit à une récupération partielle des fragments de ces régions 9 , 10 . La sonication produit également un mélange hétérogène de longueurs de fragments, limitant finalement la résolution du site de liaison, bien que l'ajout d'une étape de digestion par une exonucléase puisse grandement améliorer la résolution 11 , 12 . Les méthodes ChIP indigènes telles que les régions occupées des génomes provenant de la chromatine naturellement isolée purifiée par affinité (ORGANIQUE) 13 n'utilisent pas de réticulation et de fragmentation de la chromatine avec la nucléase micrococcie (MNase), en atténuant les biais potentiels associés à la réticulation au formaldéhyde et à la sonication. cependant,La solubilité de nombreuses protéines liées à la chromatine dans les conditions relativement douces requises pour l'extraction de la chromatine native est médiocre, entraînant potentiellement une réduction de la dynamique et / ou des faux négatifs 14 .
Alors que diverses itérations de ChIP-seq sont le plus couramment utilisées pour la cartographie génomique des interactions protéine-ADN, plusieurs techniques de cartographie basées sur la fusion de protéines d'intérêt pour diverses enzymes modifiant l'ADN ont également été mises en œuvre. Une telle approche est l'identification par l'ADN adénine méthyltransférase (DamID) 15 , dans laquelle une protéine de liaison à la chromatine est génétiquement fusionnée à Barrage et cette fusion est exprimée dans des cellules ou des animaux, entraînant une méthylation de séquences de GATC proches des sites de liaison de la protéine. DamID est avantageux en ce qu'il ne repose pas sur l'immunoprécipitation et évite ainsi la réticulation, les anticorps ou la solubilisation de la chromatine. Il est également réalisé in vivo . toutefois, La résolution de DamID est limitée à l'échelle de kilobase et l'activité de méthylation de la protéine de fusion du barrage est constitutive. Une deuxième méthode basée sur la fusion enzymatique est Calling Card-seq 16 , qui utilise une fusion d'un facteur d'intérêt pour une transposase, en dirigeant l'intégration spécifique au site des transposons. Comme DamID, Calling Card-seq n'est pas basé sur l'immunoprécipitation et a donc des avantages similaires, avec l'avantage supplémentaire d'une résolution accrue. Toutefois, Calling Card-seq peut être limité par des biais de séquences de transposases et dépend également de la présence de sites de restriction proches des sites d'insertion de transposon.
Une troisième méthode de fusion enzymatique, développée dans le laboratoire de Laemmli, est le clivage endogène de la chromatine (ChEC) 17 . Dans ChEC, une fusion entre une protéine associée à la chromatine et la MNase est exprimée dans les cellules et, après l'addition de calcium pour activer la MNase, l'ADN est clivé proximal aux sites de liaison pour les étiquetésFacteur ( figure 1 ). En conjonction avec Southern Blot, ChEC a été utilisé pour caractériser la structure de la chromatine et la liaison des protéines à un certain nombre de loci individuels dans la levure 17 , 18 et a été combiné avec une analyse de microarrays à basse résolution pour sonder l'interaction des composants des pores nucléaires avec la levure Génome 19 . ChEC offre des avantages similaires à DamID et Calling Card-seq, et sa résolution est presque une paire de base unique lorsqu'elle est analysée par l'extension d'amorçage 19 . ChEC est également contrôlable: le clivage d'ADN robuste par MNase dépend de l'ajout de calcium millimolaire, ce qui garantit que la MNase est inactive aux faibles concentrations de calcium libres observées dans les cellules vivantes 20 .
Auparavant, nous avons postulé que la combinaison de ChEC avec le séquençage à haut débit (ChEC-seq) fournirait des cartes haute résolution des sites de liaison TF. En effet, ChEC-seq a généré des cartes haute résolution des facteurs de régulation généraux de la levure bourgeonnaire (GRF) Abf1, Rap1 et Reb1 à travers le génome 1 . Nous avons également appliqué avec succès ChEC-seq au complexe Mediator modulaire, un conservateur, un coactivateur de transcription global essentiel 21 , élargissant l'applicabilité de ChEC-seq aux complexes de taille megadalton qui ne contactent pas directement l'ADN et peuvent être difficiles à cartographier par ChIP- Méthodes basées. ChEC-seq est une méthode puissante à la fois pour la validation indépendante des résultats de ChIP-seq et la génération de nouvelles connaissances sur la régulation des processus résistant aux chromatines. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour la mise en œuvre de cette méthode dans la levure bourgeonnante.
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Protocol
1. Génération de souches de levure
- Générer une souche de levure portant le facteur d'intérêt marqué avec MNase.
- La PCR amplifie la cassette de marquage MNase du vecteur souhaité ( Tableau 1 ) en utilisant le mélange réactionnel spécifié ( Tableau 2 ) et les conditions cycliques ( Tableau 3 ). Mélanger 5 μL de la réaction de PCR et 1 μL de colorant de chargement d'ADN 6X. Exécutez chaque portion aliquote de PCR sur un gel d'agarose à 0,8% à 120 V pendant 40 minutes. La taille de produit attendue est de ~ 2,3 kb.
- Transformer la cassette de marquage amplifiée en la souche de choix en utilisant une transformation standard en acétate de lithium 22 et effectuer une sélection.
- Vérifiez l'intégration correcte de la cassette de marquage avec la PCR des colonies.
- Préparer le mélange réactionnel spécifié ( Tableau 4 ) pour le nombre de colonies à tester. Continuez à glisser jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
- Choisissez une partie de chaque colonie pour être tesAu bout d'un tube PCR en utilisant un cure-dent stérile ou une pipette.
- Micro-ondes aux colonies sélectionnées à haute puissance pendant 1 minute.
- Ajouter 50 μL de mélange PCR ( Tableau 4 ) à chaque colonie à micro-ondes et faire pipeter vers le haut et vers le bas pour mélanger. Effectuer la PCR en utilisant les conditions de cyclage spécifiées ( Tableau 5 ).
- Mélanger les 50 μL de réaction de PCR et 10 μL de colorant de chargement d'ADN 6X directement dans chaque tube de PCR. Exécuter 10 μL de chaque échantillon sur un gel d'agarose à 1% à 120 V pendant 40 min. La taille prévue du produit est de ~ 700 pb.
NOTE: Si vous le souhaitez, vérifiez l'expression appropriée de la protéine de fusion MNase par Western Blot. On s'attend à un changement de ~ 20,6 kilodalton dans le poids moléculaire de la protéine marquée.
- Générer une souche MNase gratuite par clonage homologique du promoteur du gène d'intérêt dans pGZ136 (Tableau 1) et transformation et sélection comme dans l'étape 1.1.2.
- AlternatiEn particulier, assembler le promoteur du gène d'intérêt et 3xFLAG-MNase-SV40 NLS dans un vecteur plasmidique, transformer et sélectionner comme dans l'étape 1.1.2 et faire pousser la souche dans l'état sélectif approprié pour la maintenance du plasmide.
2. ChEC
- Dans l'après-midi / soir du jour précédant l'expérience ChEC, inoculer 3 mL de levure-peptone-dextrose (YPD) ou milieu sélectif approprié avec une seule colonie de la souche portant le facteur marqué MNase. Incuber cette culture tout au long de la nuit (180 tr / min de secousse, 30 ° C).
- Dans la matinée du jour de l'expérience ChEC, diluer la culture de nuit dans 50 ml de densité moyenne à 600 nm (OD 600 ) de 0,2 à 0,3. Incuber cette culture (180 tr / min secouillant, 30 ° C) jusqu'à ce qu'elle atteigne une DO 600 de 0.5-0.7. Au fur et à mesure que la culture s'approche de la DO 600 appropriée, régler le bloc de chaleur ou le bain d'eau à 30 ° C et commencer à décongeler les additifs Buffer A ( TaBle 6).
- Préparer 5 mL d'additifs Buffer A plus ( Tableau 6 ) par culture. Conserver le tampon A à la RT pendant la procédure.
- Préparez des tubes à microcentrifuges contenant 90 μl de solution d'arrêt ( Tableau 7 ) et 10 μL de SDS à 10% pour chaque point horaire à collecter. Pour chaque nouveau facteur analysé, prenez des échantillons à 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min et 10 min.
- Décanter la culture dans un tube conique de 50 ml et centrifuger à 1 500 xg et la température ambiante (RT) pendant 1 min.
- Remplacer complètement les cellules dans 1 mL de tampon A et transférer les cellules remises en suspension dans un tube à microcentrifugation. Pellets remis en suspension dans une microcentrifugeuse à 1 500 xg et RT pendant 30 s.
- Aspirer le surnageant et ré-endiguer complètement les cellules dans 1 mL de tampon A en pipetant vers le haut et vers le bas. Pellets remis en suspension dans une microcentrifugeuse à 1 500 xg et RT pendant 30 s. Répétez cette étape une fois.
- Remplacer complètement les cellules dans 570 μl de tampon A. Ajouter 30 μL de 2% de digitonine(0,1% de concentration finale) pour faciliter la perméabilisation des cellules, et inverser à mélanger.
- Perméabiliser les cellules dans un bloc de chaleur ou un bain d'eau à 30 ° C pendant 5 min.
- Pipeter la réaction vers le haut et vers le bas pour assurer une répartition uniforme des cellules. Enlevez une aliquote de 100 μL de cellules perméabilisées en tant que témoin négatif sur un tube à microcentre contenant une solution d'arrêt et un SDS (étape 2.4) et vortex brièvement pour mélanger.
- Ajouter 1,1 μl de CaCl 2 1 (concentration finale 2 mM) aux cellules perméabilisées pour activer MNase et inverser plusieurs fois rapidement ou vortex brièvement pour mélanger. Réintroduire immédiatement la réaction mixte à 30 ° C et démarrer une minuterie.
- À chaque fois que l'on doit recueillir, faire pipeter la réaction vers le haut et vers le bas pour assurer une répartition uniforme des cellules, puis enlever une aliquote de 100 μL de cellules perméabilisées à un tube de microcentrure contenant une solution d'arrêt et un SDS et un vortex brièvement pour mélanger. Pour chaque nouveau facteur analysé, prendre 0 s (pas de CaCl 2 ajouté), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min et 10 min points de temps.
NOTE: Les expériences de ChEC avec des facteurs qui coupent rapidement l'ADN à 30 ° C peuvent être effectuées à des températures plus basses pour ralentir la cinétique de clivage de MNase. - Une fois que tous les points de temps ont été recueillis, ajouter 4 μL de 20 mg / mL de protéinase K à chaque échantillon, vortex brièvement pour mélanger et incuber à 55 ° C pendant 30 minutes.
- Ajouter 200 μL de 25: 24: 1 phénol: chloroforme: alcool isoamylique à chaque échantillon, vortex vigoureusement à mélanger et centrifuger à vitesse maximale et RT dans une microcentrifugeuse pendant 5 min.
- Retirez chaque phase aqueuse (~ 150 μL) d'un nouveau tube. Ajouter 30 μg de glycogène et 500 μL d'éthanol à 100%. Vortex vigoureusement pour mélanger et précipiter sur de la glace sèche pendant 10 minutes ou jusqu'à ce que la solution soit visqueuse.
- Pellet a précipité l'ADN à la vitesse maximale et 4 ° C dans une microcentrifugeuse pendant 10 min.
- Décanter les surnageants et les pastilles de lavage avec 1 ml de RT à 70% d'éthanol.
- Décanter l'éthanol, retirer le reste en inversant unD en tapant doucement les tubes sur une serviette en papier. Essuyez brièvement les échantillons à l'aide d'une centrifugeuse de table et utilisez une pipette pour éliminer l'éthanol résiduel, en prenant soin de ne pas gêner la pastille. Granulés secs à l'air à la RT pendant 5 min.
- Alors que les granulés sont en train de sécher, faire un mélange maître pour ré-endommager les pastilles séchées dans 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μL de RNase A 10 mg / mL chacun. Digest ARN à 37 ° C pendant 20 min.
- Mélanger 1 μL de colorant de chargement d'ADN 6X avec 5 μL de chaque échantillon et exécuter sur un gel d'agarose à 1,5% à 120 V pendant 40 min.
3. Sélection des tailles
NOTE: L'objectif de la sélection de taille est d'éliminer les fragments multi-kilobase d'ADN génomique de l'échantillon à séquencer et d'enrichir des fragments de ~ 150 pb (approximativement la taille de l'ADN nucléosomique) ou plus petits. Dans les données séquentielles, des fragments <400 pb sont enrichis, avec un pic notable autour de la taille de l'ADN nucléosomique (~ 150 pb) et une répartition maximale ou large des fragments subnucléosomaux.
<Ol>NOTE: L'analyse des données ChEC-seq est une procédure complexe et dépasse la portée de cet article. Des informations détaillées sur l'analyse des données se trouvent dans les publications précédentes 1 , 21 , et les scripts personnalisés utilisés pour l'analyse sont disponibles sur GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) peut également être utilisé pour l'analyse de ligne de commande des données ChEC-seq.
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Representative Results
Dans le cas d'une expérience réussie de ChEC, l'analyse de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose révélera une augmentation de la fragmentation de l'ADN par rapport au calcium, comme l'indiquent les frottis et la digestion éventuelle complète de l'ADN génomique. Dans certains cas, une échelle de bandes similaire à celle observée avec une digestion MNase traditionnelle est observée après une digestion prolongée. C'est le cas pour l'analyse ChEC de Reb1, un facteur de régulation général qui lie les régions appauvries en nucléosomes (NDR) ( Figure 2 ). Nous avons trouvé, dans le cas des GRF, une digestion prolongée entraînant une perte de signal sur les sites de liaison rapidement clivés 1 . Idéalement, un échantillon avec une réduction de la taille de la bande d'ADN génomique qui affiche des frottis de poids moléculaire élevé, tels que les points de temps de 30 s et 1 minute pour ReC1 ChEC, sera utilisé pour le séquençage afin d'éviter une perte de signal dépendant du temps .
figure 3 ). De même, nous observons un important clivage de l'ADN par une fusion de la sous-unité Mediator Med8 avec MNase, mais pas MNase libre pilotée par le promoteur MED8 , 1 min après l'addition de calcium ( Figure 3 ).
Pour comparer les données Reb1 ChEC-seq à ChIP-seq, nous avons obtenu une liste de 1 991 pics Reb1 déterminés par ORGANIC 13 . Ces pics ont été centrés sur le motif avec le nombre moyen de fin de fragment à chaque position de base dans une fenêtre de 100 pb autour du point médian du motif. Nous avons observé une asymétrie frappante dans le clivage, la majorité des extrémités des fragments étant cartographiées dans le côté amont du motif (Figure 4 ).
Figure 1 : schéma de la méthode ChEC-seq. Une fusion de la protéine associée à la chromatine (CAP) -MNase est exprimée dans les cellules de levure. La protéine se lie à l'ADN mais ne génère pas de clivage au-dessus des niveaux d'arrière-plan en raison du très faible calcium libre dans le noyau. Après la perméabilisation des cellules avec la digitonine et l'addition de calcium millimolaire, les fusions CAP-MNase liées à l'ADN du clivage du génome, en libérant de petits fragments. Ces fragments sont ensuite purifiés, séquencés et mappés au génome, donnant des pics de extrémités de fragments proximaux aux sites de liaison pour la fusion CAP-MNase. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Électrophorèse en gel d'agarose d'ADN d'une expérience ReC1 ChEC. Une aliquote de 5 μL d'ADN de chaque point de temps de ChEC a été analysée sur un gel de TAE-agarose à 1,5% avant la sélection de la taille. Ceci montre une digestion progressive de l'ADN génomique par la fusion Reb1-MNase. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Snapshots du navigateur génome de Reb1-MNase et expériences gratuites de MNCE ChEC-seq. Les vues IGV du signal de fin de fragment pour Reb1 et MNase libre ChEC-seq 30 s après addition de calcium et Med8 et MNase libre ChEC-seq 1 min af Ter calcium additionnel le long d'un segment représentatif du génome de levure. Les jeux de données ont été normalisés en divisant le nombre de extrémités de fragment mappées à chaque position de base par le nombre total de extrémités de fragment mappées et multipliées par le nombre total de bases mappées. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Enrichissement du fragment de fragment Reb1-MNase terminé autour des sites ORGANISMES Reb1. Graphique moyen de 30 s Reb1 et signal de fin de fragment MNCE Chec-seq gratuit autour de 1 991 motifs Reb1 déterminés par ORGANIC 13 . Les données ont été normalisées comme dans la figure 3 .Lank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Plasmide | Marqueur sélectionnable à la levure | Remarques | Numéro de plasmide Addgene |
| PGZ108 | KanMX6 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70231 |
| PGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70232 |
| PGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70233 |
| PGZ136 | URA3 | Exprime 3xFLAG-MNase-SV40 NLS sous le contrôle du promoteur REB1 | 72273 |
| PGZ173 | KanMX6 | Marquage MNase, 8 aa linker | 70234 |
Tableau 1: Détails des plasmides ChEC. Tous les vecteurs de marquage sont basés sur les vecteurs pFA6a et sont donc compatibles avec les paires d'amorçage F2 / R1 couramment utilisées. La cassette de marquage se compose d'un lieurur de la longueur indiquée, un epitope 3xFLAG pour faciliter la détection par western blot (sauf dans le cas de pGZ173, où le lieur a été raccourci pour supprimer la balise 3xFLAG), la chaîne mature de MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), et le marqueur sélectionnable indiqué.
| Réactif | Le volume | [Final] |
| 5x tampon de PCR | 10 mL | 1x (MgCl2 2 mM) |
| 10 mM de mélange de dNTP (2,5 mM chaque dNTP) | 1 mL | 200 mM (50 mM chaque dNTP) |
| Primaire F2 10 mM | 2,5 mL | 0,5 mM |
| 10 mM R1 pRimer | 2,5 mL | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) | 1 mL | |
| 2 U / μL de polymérase haute fidélité à démarrage à chaud | 0,5 mL | 1 U |
| DdH 2 O | 32,5 ml |
Tableau 2: Mélange de réaction pour l'amplification par PCR de cassettes de marquage 3xFLAG-MNase. Les séquences d'amorces F2 / R1 peuvent être trouvées à http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Température (° C) | Temps | Cycles |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 minute 15 s | 25 | |
| 72 | 2 min | 1 |
| dix | Pour toujours | Tenir |
Tableau 3: Conditions de cyclisme thermique pour l'amplification par PCR des cassettes de marquage 3xFLAG-MNase. La température d'incubation et le temps d'extension peuvent devoir être ajustés en fonction de l'ADN polymerase utilisée.
| Réactif | Le volume | [Final] |
| 10 x tampon Taq | 5 mL | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| 10 mM de mélange de dNTP (2,5 mM chaque dNTP) | 1 mL | 200 mM (50 mM chaque dNTP) |
| 10 mM Vérifier amorce | 1 mL | 0,2 mM |
| 10 mM MNase-R ou amortisseur de contrôle négatif | 1 mL | 0,2 mM |
| 5 U / mL Taq polymerase | 0,5 mL | 2,5 U |
| DdH 2 O | 41,5 mL |
Tableau 4: Mélange de réaction pour la confirmation de la colonie PCR du marquage MNase. Vérifiez les séquences d'amorçage peuvent être trouvées à http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. L'amorce de contrôle est utilisé comme amorce avant avec une amorce inverse dans MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') et une amorce inverse ~ 500 paires de bases (bp) en aval du gène respectif en tant que témoin négatif.
| Température (° C) | Temps | Cycles |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 minute | 35 |
| 68 | 5 min | 1 |
| dix | Pour toujours | Tenir |
Tableau 5: Conditions thermiques de cyclage pour la confirmation de la colonie en PCR du marquage MNase. La température d'incubation et le temps d'extension peuvent devoir être ajustés en fonction de l'ADN polymerase utilisée.
| Réactif | Le volume | [Final] |
| Tris 1 M, pH 7,5 | 1,5 mL | 15 mM |
| KCl 1 M | 8 mL | 80 mM |
| 0,2 M EGTA | 50 mL | 0,1 mM |
| DdH 2 O | Remplir à 100Ml |
Tableau 6: Recette pour le tampon A. Avant l'utilisation, ajouter la moitié d'un comprimé inhibiteur de la protéase, 50 μL de PMSF 100 mM (finale 1 mM), 5 μL de spermine 200 mM (0,2 mM finale) et 2,5 μL de 1 M La spermidine (0,5 mM finale) pour 5 ml de solution.
| Réactif | Le volume | [Final] |
| NaCl 5 M | 8 mL | 400 mM |
| EDTA 0,5 M | 4 mL | 20 mM |
| 0,2 M EGTA | 2 mL | 4 mM |
| DdH 2 O | Remplir à 100 mL |
Tableau 7: Recette pour solution d'arrêt 2x. Combiner 90 μL de stoP avec 10 μL de SDS à 10% dans un tube de microcentrifugeuse pour chaque point de temps à prendre (voir étape 2.4).
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Discussion
Nous avons montré que ChEC peut cartographier diverses classes de protéines de levure sur la chromatine et anticiper qu'il sera largement applicable à différentes familles de TF et d'autres facteurs de liaison à la chromatine dans la levure. ChEC-seq est avantageux en ce qu'il ne nécessite pas de réticulation, de solubilisation de la chromatine ou d'anticorps. Ainsi, ChEC évite les artefacts potentiellement présents dans X-ChIP-seq, tels que l'artefact hyper-ChIPable 3 , 4 et le ChIP natif, tels que les faux négatifs en raison de la solubilisation protéinique incomplète 14 . L'inconvénient majeur de ChEC-seq, comme pour toutes les méthodes de fusion enzymatique, est l'exigence d'une protéine de fusion. Cela peut être réalisé rapidement dans la levure en herbe, mais est plus laborieux dans les métazoaires. Une autre limitation de ChEC-seq est qu'il ne peut pas être implémenté tel quel pour le profilage des modifications des histones. Cependant, un domaine de liaison de modification pourrait être fusionné à MNase et exprimé, permettant hMappage de modification d'istone avec ChEC-seq. Dans cette veine, ChIP-seq utilisant des domaines de liaison de modification d'histone marqués par un epitope a été utilisé pour cartographier les modèles génomaux de modification des histones 26 .
L'utilisation d'un contrôle MNase gratuit est importante pour établir la spécificité des résultats ChEC-seq. La souche MNase gratuite porte MNase marquée avec 3xFLAG et un signal de localisation nucléaire de virus simien (SV40 NLS) sous le contrôle du promoteur endogène pour le gène d'intérêt. Il est conceptuellement similaire au contrôle du barrage non utilisé utilisé dans les études de DamID 27 et aux contrôles du clivage non spécifique en raison de l'accessibilité à la chromatine. En tant que contrôle MNase gratuit pour TF ChEC-seq, nous avons intégré 3xFLAG-MNase-SV40 NLS piloté par le promoteur REB1 au niveau ura3 1 . Pour Mediator ChEC-seq, nous avons exprimé 3xFLAG-MNase-SV40 NLS sous le contrôle du promoteur MED8 dans un plasmide non-intégrantD vecteur maintenu dans le milieu sélectif 21 . Dans les deux cas, on a observé très peu de clivage par MNase libre. Ainsi, une souche de contrôle unique dans laquelle 3xFLAG-MNase-SV40 NLS est pilotée par un promoteur relativement robuste devrait convenir à la plupart des expériences.
Lors de la planification d'une expérience ChEC, la considération structurelle de la protéine d'intérêt peut être importante. Par exemple, nous avons constaté que l'ajout de MNase au C-terminus de Reb1 donnait un schéma de clivage asymétrique autour des motifs Reb1, tandis que l'expression de Reb1 avec MNase N-terminale donnait un schéma symétrique de clivage 1 . Nous attribuons ces différents motifs de clivage à la structure de Reb1. Le domaine de liaison à l'ADN de Reb1 est situé à son extrémité C-terminale; Ainsi, le C-terminus est structuré et proche de l'ADN, limitant la plage de mouvement de la MNase et ne permettant que le clivage C-terminal. En revanche, le C-terminus d'Abf1 est relativement peu structuré et peut donc augmenter jusqu'àLa portée de MNase, permettant le clivage des deux côtés des sites de liaison Abf1. Dans le cas de Rap1, une autre levure GRF, nous avons constaté que le raccourcissement entre le C-terminal et le MNase de 33 à 8 aa était suffisant pour réduire fortement le clivage, peut-être en raison de la distance proposée de la partie C-terminale de Rap1 de ADN 28 . Une telle considération structurelle est également susceptible d'être importante lorsqu'on tente de cartographier la liaison des protéines présentes dans les grands complexes. Pour notre analyse ChEC-seq de la liaison du Médiateur au génome de levure 21 , nous avons sélectionné des sous-unités dont les C-termini ont été prédisposés à être exposés, plutôt que enterrés dans le complexe. Parmi les trois sous-unités fusionnées à MNase, on n'a pas clivé solidement l'ADN, ce qui suggère que les contraintes stériques ou les interactions avec d'autres facteurs de liaison de l'ADN atténuent le clivage de l'ADN.
Nous avons constaté que ChEC-seq détecte 4-12 fois plus de pics pour la levure GRF Abf1, Rap1 et Reb1 que diverses approches ChIP lorsque tous les points de temps étaient considérés ensemble 1 . Ces sites pourraient être divisés en deux classes basées sur la cinétique de clivage de MNase. L'analyse des données ChEC-seq pour les GRF de levure a révélé deux classes temporellement distinctes de sites de liaison 1 . Le premier, appelé «rapide», a affiché un clivage maximal <1 min après l'addition de calcium et contenant généralement des correspondances robustes à des motifs de consensus connus. Le second, appelé «lent», a pris plusieurs minutes pour atteindre des niveaux appréciables de clivage et ont été épuisés de matchs de motifs. Les deux classes de sites étaient, en moyenne, enrichies pour la liaison dans les ensembles de données ChIP, bien qu'elles n'étaient pas nécessairement appelées comme pics dans ces études de ChIP. La majorité des sites pour un facteur donné étaient des sites lents. Nous supposons que les sites rapides sont représentatifs des sites de liaison du facteur de transcription à haute affinité, tandis que les sites lents représentent des loci échantillonnés de manière transitoire pendant la numérisation du site de liaison. L'obLa servitude de deux classes de sites de liaison séparés par la cinétique du clivage de MNase peut expliquer l'observation dans de nombreux ensembles de données de ChIP-seq qu'un grand nombre de pics pour un facteur donné avec une spécificité de liaison d'ADN bien établie ne contiennent pas de motif de consensus 29 : La réticulation au formaldéhyde, effectuée pendant 10 à 15 minutes dans la plupart des protocoles ChIP, peut saisir à plusieurs reprises des interactions transitoires ou opportunistes d'un facteur avec le génome, entraînant un gonflement du signal. En effet, la comparaison de ChIP-exo et l'imagerie des cellules vivantes suggère que c'est le cas 2 . Notamment, nous n'avons pas observé une diminution aussi spectaculaire dépendant du temps dans les signaux 21 de Mediator ChEC-seq, avec le signal Mediator ChEC-seq relativement constant de 30 s à 20 min. Compte tenu de ces observations, nous recommandons d'effectuer des ChEC-seq de courte durée pour récupérer des sites de liaison à haute confiance.
Nous prévoyons que ChEC-seq peut être adapté à la non-levureSystèmes. La concentration de calcium libre dans les cellules de mammifères non stimulées est de 50 à 300 nM 30 , 32 , bien en dessous du seuil pour une activation efficace de MNase. L'étape limitante pour l'établissement de ChEC-seq dans les systèmes métazoaires est donc la génération de protéines de fusion, qui reste beaucoup plus laborieuse dans les métazoaires que dans les cellules de levure. Cependant, le marquage endogène des gènes métazoaires a été grandement facilité par l'avènement de l'ingénierie du génome à base de CRISPR 33 , et cette limitation devrait donc être facilement surmontée. Alternativement, les protéines de fusion MNase pourraient être exprimées à des niveaux faibles à partir des plasmides. Cette approche a été assez réussie pour DamID dans les cellules Drosophila 34 , 35 et humaines 36 , ce qui pourrait également faciliter le ChEC-seq dans les cellules métazoaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Moustafa Saleh et Jay Tourigny pour la lecture critique du manuscrit et Steven Hahn et Steven Henikoff pour le mentorat et le soutien lors du développement de ChEC-seq et son application au complexe Mediator. SG est soutenu par les subventions du NIH R01GM053451 et R01GM075114 et GEZ est soutenu par les fonds de démarrage de l'Université d'Indiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
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