Summary
ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。
Abstract
タンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピングは、遺伝子調節、クロマチンリモデリング、および他のクロマチン常駐プロセスを理解するために重要です。ホルムアルデヒド架橋、その後のクロマチン免疫沈降およびハイスループット配列決定（X-ChIP-seq）は、ゲノム生物学に対する多くの貴重な洞察を得るために使用されてきた。しかしながら、X-ChIP-seqは、架橋および超音波処理に関連する注目すべき制限を有する。ネイティブChIPは、架橋を省略することによってこれらの欠点を回避するが、多くの場合、クロマチン結合タンパク質の回収率が低い。さらに、すべてのChIPベースの方法は、抗体の品質を考慮する必要があります。目的のタンパク質のDNA修飾酵素への融合を含むタンパク質-DNA相互作用をマッピングするための酵素的方法もまた、タンパク質-DNA相互作用をマッピングするために使用されている。我々は最近、ChEC-seqとして高スループット配列決定法を用いて、このような方法の一つであるクロマチン内在性切断（ChEC）を組み合わせた。 ChEC-seqは、クロマチンアソーク生存細胞中のカルシウムの存在下で標的とされたDNA切断を生成するために、ミクロコッカルヌクレアーゼ（MNase）に対する関心対象のタンパク質を同定する。 ChEC-seqは免疫沈降に基づいていないため、架橋、超音波処理、クロマチン可溶化、抗体品質に関する潜在的な懸念を回避し、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えた高分解能マッピングを回避します。 ChEC-seqは、ChIP-seqの知見を検証し、ゲノム規制への新たな洞察を発見するための独立した手段を提供し、ChIPに強力に対応するものと考えています。
Introduction
転写因子（TF）、クロマチンリモデーダー、および他のクロマチン関連調節因子の結合部位のマッピングは、すべてのクロマチンベースのプロセスを理解する上で重要です。ゲノム生物学への多くの重要な洞察を得るために、クロマチン免疫沈降法およびハイスループットシーケンシング（ChIP-seq）アプローチが用いられてきたが、それらには顕著な限界がある。我々は最近、これらの欠点を回避するために、クロマチン内在性切断および高スループット配列決定（ChEC-seq） 1と呼ばれる別の方法を導入した。
ChIP-seqは、タンパク質-DNA相互作用を保存するために、初期ホルムアルデヒド架橋工程（X-ChIP-seq）で行われることが最も多い。しかしながら、最近の多くの研究により、X-ChIP-seqは、一過性または非特異的なタンパク質-DNA相互作用を2,3,4,5 、偽陽性結合部位を生じさせる。さらに、X-ChIP-seq実験においてクロマチンを断片化するために一般的に使用される超音波処理は、オープンクロマチンの領域を優先的に切断し、これらの領域9,10からの断片の偏った回収をもたらす。超音波処理はまた、エキソヌクレアーゼ消化工程の追加が分解能11,12を大幅に改善することができるが、最終的に結合部位分解を制限する、断片長の異種混合物を生じる。親和性精製された天然に単離されたクロマチン（ORGANIC） 13由来のゲノムの占有領域などのネイティブChIP法は、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理に関連する潜在的な偏りを緩和する、ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）しかしながら、天然のクロマチン抽出に必要とされる比較的穏やかな条件下での多くのクロマチン結合タンパク質の溶解度が低く、潜在的にダイナミックレンジおよび/または偽陰性の減少を招く可能性がある14 。
ChIP-seqの種々の反復は、タンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピングに最も一般的に使用されるが、目的のタンパク質と様々なDNA修飾酵素との融合に基づくいくつかのマッピング技術も実施されている。そのようなアプローチの1つは、目的のクロマチン結合タンパク質がダムに遺伝的に融合され、この融合が細胞または動物において発現され、タンパク質の結合部位に近接したGATC配列のメチル化をもたらす、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ同定（DamID） 15である。 DamIDは、免疫沈降に頼らず、架橋、抗体またはクロマチンの可溶化を回避するという点で有利である。それはインビボでも行われる 。しかしながらDamIDの分解能はキロベーススケールに限定され、Dam融合タンパク質のメチル化活性は構成的である。酵素的融合に基づく第2の方法は、興味のある因子のトランスポザーゼへの融合を用いて、トランスポゾンの部位特異的組込みを指示するCalling Card-seq 16である。 DamIDと同様に、Calling Card-seqは免疫沈降に基づいていないため、同様の利点があり、分解能が向上するという利点があります。しかし、Calling Card-seqは、トランスポゼースの配列バイアスによって制限され、トランスポゾン挿入部位に近い制限部位の存在にも依存する。
Laemmli研究室で開発された第3の酵素的融合法は、クロマチン内在性切断（ChEC） 17である。 ChECでは、クロマチン関連タンパク質とMNaseとの融合物が細胞内で発現され、MNaseを活性化するためにカルシウムが添加されると、DNAはタグ付き結合部位の近位で切断される因子（ 図1 ）。サザンブロッティングと併せて、ChECは、酵母17,18中の多数の個々の遺伝子座でのクロマチン構造およびタンパク質結合を特徴付けるために使用され、低解像度マイクロアレイ分析と組み合わせて、核細孔成分と酵母との相互作用を調べたゲノム19 。 ChECは、DamIDおよびCalling Card-seqと同様の利点を提供し、プライマー伸長19によって分析された場合、その分解能はほぼ1塩基対である。 ChECはまた制御可能である：MNaseによる頑強なDNA切断はミリモルのカルシウムの添加に依存し、MNaseは生酵母細胞で観察される低遊離カルシウム濃度で不活性である20 。
これまで、我々は、ChECを高スループット配列決定（ChEC-seq）と組み合わせることにより、TF結合部位の高分解能マップを提供すると仮定した。確かに、ChEC-seqは、出芽酵母一般制御因子（GRF）Abf1、Rap1、およびReb1のゲノム1にわたる高分解能マップを生成した。我々はまた、ChEC-seqを、直接的にDNAと接触しないChEC-seqの適用可能性を拡大し、ChIP-seqによってマッピングすることが困難な、モジュラーメディエーター複合体、保存された必須の全体的転写共活性化剤21に首尾よく適用したベースの方法。 ChEC-seqは、ChIP-seq結果の独立した検証と、クロマチン常駐プロセスの新しい洞察の生成の両方の強力な方法です。ここでは、出芽酵母におけるこの方法の実施のための段階的プロトコールを提示する。
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Protocol
1.酵母菌株の生成
- MNaseでタグ付けされた目的の因子を有する酵母株を作製する。
- 指定された反応混合物（ 表2 ）およびサイクル条件（ 表3 ）を用いて、所望のベクター（ 表1 ）からMNase標識カセットをPCR増幅する。 5μLのPCR反応物と1μLの6X DNAローディング色素を混合する。各PCRアリコートを0.8％アガロースゲル上で120Vで40分間実行する。予想される製品サイズは〜2.3kbです。
- 増幅されたタグ付カセットを、標準的な酢酸リチウムトランスフォーメーション22を使用して選択した株に形質転換し、選択を行う。
- コロニーPCRによるタグカセットの正確な組み込みを確認する。
- スクリーニングするコロニーの数について、指定の反応液（ 表4 ）を調製する。必要になるまで氷上に置いてください。
- 各コロニーの一部を選んでテス滅菌した爪楊枝またはピペットチップを用いてPCRチューブの底に移した。
- 拾ったコロニーを1分間高出力でマイクロ波処理する。
- 各マイクロ波コロニーに50μLのPCRミックス（ 表4 ）を加え、ピペットで上下にミックスします。指定されたサイクリング条件（ 表5 ）を使用してPCRを行います。
- 各PCRチューブに50μLのPCR反応液と10μLの6X DNAローディング色素を直接混合する。各サンプル10μLを1％アガロースゲル上で120Vで40分間泳動する。予想される製品サイズは約700bpである。
注：必要に応じて、ウェスタンブロッティングによるMNase融合タンパク質の適切な発現を確認します。タグ付きタンパク質の分子量が約20.6キロダルトンシフトすることが予想される。
- 目的の遺伝子のプロモーターの相同性に基づくクローニングをpGZ136（表1）に加え、ステップ1.1.2のように形質転換および選択することにより、遊離のMNase株を作製する。
- オルタナティ目的の遺伝子のプロモーターおよび3xFLAG-MNase-SV40 NLSをプラスミドベクターに組み込み、ステップ1.1.2のように形質転換および選択し、プラスミドの維持のための適切な選択条件で株を増殖させる。
2. ChEC
- ChEC実験前日の午後/夕方に、MNaseタグ付き因子を有する菌株の単一コロニーを有する酵母 - ペプトン - デキストロース（YPD）または適切な選択培地3mLを接種する。この培養物を一晩インキュベートする（180RPM振とう、30℃）。
- ChEC実験の当日の朝、終夜培養物を50mLの培地に希釈して、600nmでの光学密度（OD 600 ）が0.2〜0.3になるようにする。 OD 600が0.5〜0.7に達するまで、この培養物（180 RPM振盪、30℃）をインキュベートする。培養液が適切なOD 600に近づくにつれて、ヒートブロックまたはウォーターバスを30℃に設定し、Buffer A添加物（ Ta6）。
- 培養液あたり5 mLのBuffer A +添加物（ 表6 ）を調製する。手順中にバッファーAを室温に保つ。
- 90μLの停止液（ 表7 ）および10μLの10％SDSを含む微量遠心管を収集する各時点で調製する。分析した各新しい因子について、0秒、30秒、1分、2.5分、5分、および10分でサンプルを採取する。
- 培養液を50 mLコニカルチューブに移し、1,500 xgで室温（RT）で1分間遠心します。
- 細胞を緩衝液Aの1mLに徹底的に再懸濁し、再懸濁した細胞をマイクロチューブに移す。ペレットは、微小遠心分離機に1,500 xg、RTで30秒間再懸濁した。
- 上清を吸引し、上下にピペッティングすることにより、緩衝液Aの1 mL中に細胞を完全に再懸濁する。ペレットは、微小遠心分離機に1,500 xg、RTで30秒間再懸濁した。このステップを1回繰り返します。
- 緩衝液Aの570μL中に細胞を徹底的に再懸濁する.30μLの2％ジギトニン（0.1％最終濃度）、細胞の透過性を促進し、混合を逆転させる。
- 30℃で5分間加熱ブロックまたは水浴中で細胞を浸透させる。
- 細胞の均一な分布を確実にするために反応を上下にピペッティングします。停止溶液およびSDS（ステップ2.4）を含有する微量遠心管へのネガティブコントロールとして透過性細胞の100μLアリコートを除去し、短時間ボルテックスして混合する。
- 1.1mMの1M CaCl 2 （2mM最終濃度）を透過性細胞に添加してMNaseを活性化し、迅速に数回反転させるか、短時間ボルテックスして混合します。直ちに混合反応を30℃に戻し、タイマーを開始する。
- 収集する各時点で、細胞を均一に分布させるために反応を上下にピペッティングしてから、100μLの透過細胞のアリコートを停止溶液とSDSを入れたマイクロチューブに加え、ボルテックスして混合します。分析された各新しい因子について、0秒（CaCl 2添加なし）、30秒、1分、2.5分、5分、および10分の時点で測定した。
注：30℃でDNAを迅速に切断する因子を用いたChEC実験は、MNase切断速度を遅くするために低温で行うことができる。 - すべての時点を集めたら、各サンプルに20μg/ mLプロテイナーゼK4μLを添加し、ボルテックスして短時間混合し、55℃で30分間インキュベートする。
- 各サンプルに200μLの25：24：1フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、激しく撹拌して混合し、最大速度および室温で微量遠心機で5分間遠心する。
- 各水相（〜150μL）を新しいチューブに移す。 30μgのグリコーゲンおよび500μLの100％エタノールを添加する。 10分間または溶液が粘性になるまでドライアイス上で混合および沈殿させるために激しく攪拌する。
- ペレットはDNAを最大速度で微量遠心分離で4℃で10分間沈殿させた。
- 上清をデカントし、1mLのRT 70％エタノールでペレットを洗浄する。
- エタノールを傾瀉し、残りを紙タオルでチューブを静かに軽くたたきます。ベンチトップ遠心分離機を使用して試料を簡単に回転させ、ペレットを乱さないように注意して残留エタノールを除去するためにピペットを使用する。室温で5分間空気乾燥したペレット。
- ペレットが乾燥している間、それぞれ10mg / mL RNase AのpH 8.0 +1μLのトリス29μL中に乾燥ペレットを再懸濁するためのマスターミックスを作製する。 37℃で20分間RNAを消化する。
- 1μLの6X DNAローディング色素と5μLの各サンプルを混合し、120Vで1.5％アガロースゲル上で40分間泳動する。
3.サイズ選択
注：サイズ選択の目的は、配列決定されるサンプルからゲノムDNAのマルチキロベース断片を除去し、約150bp（およそヌクレオソームDNAのサイズ）以下の断片を濃縮することです。配列データでは、<400bpの断片が濃縮され、ヌクレオソームDNAのサイズ（約150bp）の周りに顕著なピークがあり、サブヌクレオソーム断片のピークまたは広域分布がある。
<ol>注：ChEC-seqデータの分析は複雑な手順であり、この記事の範囲を超えています。データ分析に関する詳細な情報は、以前の刊行物1,21にあり、分析に使用されたカスタムスクリプトはGitHub（https://github.com/zentnerlab/chec-seq）で入手できます。 HOMER 25 （http://homer.salk.edu）は、ChEC-seqデータのコマンドライン解析にも使用できます。
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Representative Results
成功したChEC実験の場合、アガロースゲル電気泳動によるDNA分析は、ゲノムDNAの塗抹および最終的な完全消化によって示されるように、DNA断片化の時間依存的な増加を明らかにする。場合によっては、従来のMNase消化で見られるのと同様のバンドのはしごが、消化の延長の後に観察される。これは、ヌクレオソーム枯渇領域（NDR）に結合する一般的な調節因子であるReb1（ 図2 ）のChEC分析の場合である。本発明者らは、GRFの場合、伸長消化が急速に切断された結合部位でのシグナル消失をもたらすことを見出した1 。理想的には、Reb1 ChECの30秒および1分の時点など、高分子量スメアを示すゲノムDNAバンドのサイズが減少したサンプルは、シグナルの時間依存的損失を避けるための配列決定に使用されます。
図3 ）。同様に、メディエーターサブユニットMed8とMNaseとの融合によって、しかしカルシウム添加の1分後にMED8プロモーターによって駆動される遊離のMNaseでは実質的なDNA切断は観察されない（ 図3 ）。
Reb1 ChEC-seqデータとChIP-seqを比較するために、我々はORGANIC 13によって決定された1,991のReb1ピークのリストを得た。これらのピークはモチーフ中心であり、モチーフ中点の周りの100bpのウインドウ内の各塩基位置における平均フラグメント末端カウントを有する。本発明者らは、開裂における顕著な非対称性を観察したが、断片末端の大部分はモチーフの上流側にマッピングした（図4 ）。
図1 ：ChEC-seq法の模式 図クロマチン関連タンパク質（CAP）-MNase融合体は、酵母細胞で発現される。このタンパク質はDNAに結合するが、核内の非常に低い遊離カルシウムのためにバックグラウンドレベル以上の切断を生じない。細胞をジギトニンで透過処理し、ミリモルのカルシウムを添加すると、ゲノムに結合したCAP-MNアーゼ融合体がDNAを切断し、小さな断片を放出する。次いで、これらの断片を精製し、配列決定し、そしてゲノムにマップして戻し、CAP-MNase融合のための結合部位に近接した断片末端のピークを与える。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：Reb1 ChEC実験からのDNAのアガロースゲル電気泳動。サイズ選択の前に、各ChEC時点からのDNAの5μLアリコートを1.5％TAE-アガロースゲルで分析した。これは、Reb1-MNase融合によるゲノムDNAの進行的消化を示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3 ：Reb1-MNaseおよびMNase ChEC-seq実験のゲノムブラウザスナップショット。カルシウム添加後のReb1および遊離MNase ChEC-seq 30秒およびMed8および遊離MNaseに対するフラグメント終結シグナルのIGVビューChEC-seq 1分af酵母ゲノムの代表的なセグメントに沿ったカルシウムの添加。データセットは、各塩基位置にマッピングされたフラグメント末端の数を、マッピングされたフラグメント末端の総数で割って、マッピングされた塩基の総数を掛けて正規化した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ：Reb1-MNase放出フラグメントのReb1 ORGANICサイトの濃縮。 ORGANIC 13によって決定された1,950のReb1モチーフの周りの30秒のReb1および遊離のMNase ChEC-seq断片エンドシグナルの平均プロット。データは図3のように正規化した。lank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| プラスミド | 酵母選択マーカー | ノート | 付加遺伝子番号 |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNaseタグ付け、33aaリンカー | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNaseタグ付け、33aaリンカー | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNaseタグ付け、33aaリンカー | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | REB1プロモーターの制御下で3xFLAG-MNase-SV40 NLSを発現する | 72273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNaseタグ付け、8aaリンカー | 70234 |
表1：ChECプラスミドの詳細。すべてのタグ化ベクターはpFA6aベクターに基づいており、一般的に使用されるF2 / R1タグ化プライマー対と互換性がある。タグ付けカセットは、示された長さのリンカー、ウエスタンブロッティング（3xFLAGタグを除去するためにリンカーが短縮されたpGZ173の場合を除く）、MNaseの成熟鎖（GenBank P00644 、aa83-231）、および指示された選択マーカー。
| 試薬 | ボリューム | [最後の] |
| 5×PCRバッファー | 10 mL | 1×（2mM MgCl 2 ） |
| 10mM dNTP混合物（各dNTP 2.5mM） | 1 mL | 200mM（各dNTP 50mM） |
| 10mM F2プライマー | 2.5mL | 0.5mM |
| 10mM R1pリマー | 2.5mL | 0.5mM |
| pGZ108 / 109/110/172（1~5ng / mL） | 1 mL | |
| 2U /μLホットスタート高性能ポリメラーゼ | 0.5mL | 1U |
| ddH 2 O | 32.5mL |
表2：3xFLAG-MNaseタギングカセットのPCR増幅のための反応混合物。 F2 / R1プライマー配列はhttp://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txtにあります。
| 温度（℃） | 時間 | サイクル |
| 98 | 30秒 | 1 |
| 98 | 10秒 | 25 |
| 55 | 30秒 | 25 |
| 72 1分15秒 | 25 | |
| 72 | 2分 | 1 |
| 10 | 永遠に | ホールド |
表3：3xFLAG-MNaseタギングカセットのPCR増幅のための熱サイクル条件。インキュベーション温度および伸長時間は、使用したDNAポリメラーゼに基づいて調整する必要があります。
| 試薬 | ボリューム | [最後の] |
| 10×Taq緩衝液 | 5 mL | 1×（1.5mM MgCl 2 ） |
| 10mM dNTP混合物（各dNTP 2.5mM） | 1 mL | 200mM（各dNTP 50mM） |
| 10mMチェックプライマー | 1 mL | 0.2mM |
| 10mMのMNase-Rまたは陰性対照プライマー | 1 mL | 0.2mM |
| 5U / mL Taqポリメラーゼ | 0.5mL | 2.5ユーロ |
| ddH 2 O | 41.5mL |
表4：コロニーPCRのための反応混合物MNaseタギングの確認。チェックプライマー配列はhttp://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txtにあります。チェックプライマーは、ネガティブコントロールとしてのMNase（5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 '）内のリバースプライマーおよびそれぞれの遺伝子の下流のリバースプライマー約500塩基対（bp）と共にフォワードプライマーとして使用される。
| 温度（℃） | 時間 | サイクル |
| 95 | 5分 | 1 |
| 95 | 30秒 | 35 |
| 55 | 30秒 | 35 |
| 68 | 1分 | 35 |
| 68 | 5分 | 1 |
| 10 | 永遠に | ホールド |
表5：コロニーPCRのための熱サイクリング条件MNaseタギングの確認。インキュベーション温度および伸長時間は、使用したDNAポリメラーゼに基づいて調整する必要があります。
| 試薬 | ボリューム | [最後の] |
| 1Mトリス、pH7.5 | 1.5mL | 15mM |
| 1M KCl | 8 mL | 80mM |
| 0.2M EGTA | 50mL | 0.1mM |
| ddH 2 O | 100にするmL |
表6：緩衝液Aのためのレシピ使用する前に、50μLの100mM PMSF（1mM最終）、5μLの200mMスペルミン（0.2mM最終）、および2.5μLの1M 5mLの溶液につきスペルミジン（最終濃度0.5mM）。
| 試薬 | ボリューム | [最後の] |
| 5M NaCl | 8 mL | 400mM |
| 0.5M EDTA | 4 mL | 20mM |
| 0.2M EGTA | 2 mL | 4mM |
| ddH 2 O | 100 mLまで充填する |
表7：2倍ストップ溶液のレシピ。 stoの90μLを組み合わせる10μLの10％SDSを微量遠心管に入れ、各時点で採取します（ステップ2.4参照）。
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Discussion
我々は、ChECが酵母タンパク質の多様なクラスを染色体上にマッピングすることができ、それが酵母の異なるファミリーのTFおよび他のクロマチン結合因子に広く適用可能であることを予期していることを示した。 ChEC-seqは、架橋、クロマチン可溶化、または抗体を必要としないという点で有利である。したがって、ChECは、不完全なタンパク質可溶化14による偽陰性など、ハイパーチップ可能なアーチファクト3,4およびネイティブChIPなど、X-ChIP-seqに潜在的に存在するアーチファクトを回避する14 。 ChEC-seqの主要な欠点は、すべての酵素的融合法と同様に、融合タンパク質の必要条件である。これは出芽酵母で迅速に達成することができるが、後生動物ではより困難である。 ChEC-seqのもう1つの制限は、ヒストン修飾のプロファイリングのためにそのまま実施することができないことである。しかし、修飾結合ドメインをMNaseに融合させて発現させると、hChEC-seqを用いたアイソトーン変更マッピング。このように、エピトープタグ付きヒストン修飾結合ドメインを用いたChIP-seqは、ヒストン修飾26のゲノムワイドパターンをマッピングするために使用されています。
遊離MNaseコントロールの使用は、ChEC-seq結果の特異性を確立する上で重要である。遊離MNase株は、関心のある遺伝子の内因性プロモーターの制御下で、3xFLAGおよびサルウイルス40核局在化シグナル（SV40 NLS）でタグ付けされたMNaseを有する。これは、概念的にDamID研究27で使用されている非融合ダムコントロール、およびクロマチン接近可能性に起因する非特異的切断のコントロールに似ています。 TF ChEC-seqのための遊離MNaseコントロールとして、我々はREB1プロモーターにより駆動される3xFLAG-MNase-SV40 NLSをura3座1に 組み込んだ 。メディエーターChEC-seqについては、我々は非組み込みプラスミド中のMED8プロモーターの制御下で3xFLAG-MNase-SV40 NLSを発現したdベクターを選択培地21に保持する 。両方の場合において、遊離のMNaseによる切断はほとんど観察されなかった。したがって、3xFLAG-MNase-SV40 NLSが比較的強力なプロモーターによって駆動される単一の対照株は、ほとんどの実験に適切であるはずである。
ChEC実験を計画する場合、目的のタンパク質の構造的考察が重要であるかもしれない。例えば、MNaseをReb1のC末端に付加すると、Reb1モチーフの周りに非対称切断パターンが与えられ、一方、N末端MNaseを有するReb1の発現は対称切断パターン1を与えた。我々は、これらの異なる切断パターンがReb1の構造に帰すると考えている。 Reb1のDNA結合ドメインは、そのC末端に位置する。したがって、C末端はDNAに構造化されており、MNaseの運動範囲を制限し、C末端切断のみを可能にする。対照的に、Abf1のC末端は比較的構造化されておらず、したがって、MNaseの到達量を増加させ、Abf1結合部位の両側で切断を可能にする。別の酵母GRF1のRap1の場合、我々はC末端とMNaseとの間のリンカーを33から8aaに短縮することが切断を大幅に減少させるのに十分であることを見出した。おそらく、Rap1のC末端部分のDNA28 。このような構造的考察は、大きな複合体に存在するタンパク質の結合をマッピングしようと試みる場合にも重要であると思われる。酵母ゲノム21へのメディエーター結合のChEC-seq分析のために、複合体内に埋め込まれるのではなく、C末端が構造的に露出していると予測されたサブユニットを選択した。 MNaseに融合した3つのサブユニットのうち、立体的な制約、または他のDNA結合因子との相互作用がDNA切断を弱めることを示唆して、DNAを強く切断しなかった。
我々は、ChEC-seqが、酵母GRF Abf1、Rap1、およびRebについて4〜12倍のピークを検出することを見出したすべてのタイムポイントを一緒に考慮した場合、さまざまなChIPアプローチよりも1 。これらの部位は、MNase切断の動力学に基づいて2つのクラスに分けられ得る。酵母GRFのChEC-seqデータの分析は、2つの時間的に異なるクラスの結合部位を明らかにした1 。第1のものは、「高速」と呼ばれ、カルシウム添加後1分未満の最大切断を示し、一般的には既知のコンセンサスモチーフとの強固な一致を含む。 「遅い」と呼ばれる第2のものは、かなりのレベルの切断に達するまでに数分かかり、モチーフのマッチが枯渇した。両方のクラスのクラスは平均してChIPデータセットの結合に富んだが、これらのChIP研究では必ずしもピークと呼ばれるわけではなかった。特定の要因のサイトの大半はサイトの低速でした。高速サイトは高親和性転写因子結合部位の代表であり、低速部位は結合部位走査中に一時的にサンプリングされた遺伝子座を表すと考えられる。オブMNase切断の動力学によって分離された2つのクラスの結合部位の播種は、十分に確立されたDNA結合特異性を有する所与の因子の多数のピークがコンセンサスモチーフ29を含まないという多くのChIP-seqデータセットにおける観察を説明することができる29 。ほとんどのChIPプロトコールで10〜15分間実施されるホルムアルデヒド架橋は、因子の一時的または日和見的な相互作用をゲノムと繰り返し捕らえ、シグナルの膨張をもたらすことができる。実際、ChIP-exoと生存細胞イメージングの比較は、これが事例2であることを示唆している。特に、Mediator ChEC-seqシグナルが30秒〜20分で比較的一定であることを考慮すると、このような劇的な時間依存的なMediation ChEC-seqシグナルの減少は観察されなかった（ 21） 。これらの所見を考慮すると、信頼性の高い結合部位を回復するために短時間のChEC-seqを行うことを推奨します。
我々はChEC-seqが非酵母に適応できることを期待しているシステム。非刺激哺乳動物細胞中の遊離カルシウムの濃度は、効率的なMNase活性化の閾値よりはるかに低い50〜300nM 30,32である。メタゾーン系におけるChEC-seqの確立のための制限段階は、従って、酵母細胞よりも後生動物においてはるかに面倒なままである融合タンパク質の生成である。しかし、メタアザン遺伝子の内在性タグ付けは、CRISPRに基づくゲノム工学33の出現によって大きく促進されており、この制限は容易に克服されるべきである。あるいは、MNase融合タンパク質は、プラスミドから低レベルで発現され得る。このアプローチは、 ショウジョウバエ 34,35およびヒト36細胞におけるDamIDにとって非常に成功しており、したがって、後生動物細胞においてChEC-seqも促進する可能性がある。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
ChEC-seqの開発とMediator複合体への応用の際に、Moustafa SalehとJay Tourignyに原稿の批評とSteven HahnとSteven Henikoffの指導と支援を感謝します。 SGはNIHグラントR01GM053451とR01GM075114でサポートされ、GEZはインディアナ大学のスタートアップファンドによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
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