Summary
Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).
Abstract
O mapeamento genômico de interações proteína-DNA é crítico para a compreensão da regulação de genes, remodelação de cromatina e outros processos residente em cromatina. A reticulação de formaldeído seguida de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (X-ChIP-seq) tem sido usada para obter muitas informações valiosas sobre a biologia do genoma. No entanto, X-ChIP-seq tem limitações notáveis ligadas à reticulação e sonicação. O ChIP nativo evita essas desvantagens ao omitir reticulação, mas muitas vezes resulta em uma recuperação fraca de proteínas ligadas à cromatina. Além disso, todos os métodos baseados em ChIP estão sujeitos a considerações de qualidade de anticorpos. Métodos enzimáticos para mapear interações proteína-DNA, que envolvem a fusão de uma proteína de interesse para uma enzima modificadora de DNA, também foram utilizados para mapear interações proteína-DNA. Recentemente, combinamos um desses métodos, clivagem endógena de cromatina (ChEC), com sequenciação de alto rendimento como ChEC-seq. ChEC-seq depende da fusão de uma cromatina-assocProteína de interesse para a nuclease microcócica (MNase) para gerar clivagem de DNA direcionada na presença de cálcio nas células vivas. O ChEC-seq não se baseia na imunoprecipitação e evita possíveis preocupações com reticulação, sonicação, solubilização da cromatina e qualidade de anticorpos, ao mesmo tempo que fornece mapeamento de alta resolução com sinal mínimo de fundo. Nós imaginamos que o ChEC-seq será uma contrapartida poderosa para o ChIP, proporcionando um meio independente para validar as descobertas do ChIP-seq e descobrir novas idéias sobre a regulação genômica.
Introduction
O mapeamento dos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs), remodeladores de cromatina e outros fatores reguladores associados à cromatina é fundamental para entender todos os processos baseados em cromatina. Embora as abordagens de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (ChIP-seq) tenham sido usadas para obter muitos pontos de vista importantes sobre a biologia do genoma, eles apresentam limitações notáveis. Introduzimos recentemente um método alternativo, denominado clivagem endógena de cromatina e seqüenciamento de alto rendimento (ChEC-seq) 1 , para contornar essas desvantagens.
O ChIP-seq é mais frequentemente realizado com um passo inicial de reticulação de formaldeído (X-ChIP-seq) para preservar as interações proteína-DNA. No entanto, uma série de estudos recentes indicaram que X-ChIP-seq captura interações transiente ou inespecífica proteína-DNA 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , dando origem a falsos locais de ligação positiva. Além disso, a sonicação, comumente usada para fragmentar a cromatina em experimentos X-ChIP-seq, preferencialmente cisa regiões de cromatina aberta, levando a recuperação tendenciosa de fragmentos dessas regiões 9 , 10 . A sonicação também produz uma mistura heterogênea de comprimentos de fragmentos, limitando, em última instância, a resolução do local de ligação, embora a adição de um passo de digestão com exonuclease possa melhorar muito a resolução 11 , 12 . Os métodos ChIP nativos, tais como regiões ocupadas de genomas, de cromatina naturalmente isolada purificada por afinidade (ORGÂNICO) 13 não utilizam reticulação e fragmentação de cromatina com nuclease microcócica (MNase), aliviando vieses de potencial associadas à reticulação de formaldeído e sonicação. Contudo,A solubilidade de muitas proteínas ligadas à cromatina sob as condições relativamente suaves requeridas para a extração nativa da cromatina é fraca, potencialmente levando a uma redução do alcance dinâmico e / ou falsos negativos 14 .
Enquanto várias iterações de ChIP-seq são mais comumente usadas para mapeamento genômico de interações proteína-DNA, várias técnicas de mapeamento baseadas na fusão de proteínas de interesse para várias enzimas modificadoras de DNA também foram implementadas. Uma dessas abordagens é a identificação de DNA adenina metiltransferase (DamID) 15 , em que uma proteína de ligação à cromatina de interesse é geneticamente fundida em Dam e esta fusão é expressa em células ou animais, resultando em metilação de sequências de GATC proximais a locais de ligação para a proteína. DamID é vantajoso porque não depende da imunoprecipitação e evita a reticulação, os anticorpos ou a solubilização da cromatina. Também é realizado in vivo . Contudo, A resolução de DamID é limitada à escala de kilobase e a atividade de metilação da proteína de fusão de Dam é constitutiva. Um segundo método baseado na fusão enzimática é Calling Card-seq 16 , que emprega a fusão de um fator de interesse para uma transposase, direcionando a integração específica do site para os transposões. Como DamID, o Calling Card-seq não é baseado na imunoprecipitação e, portanto, tem vantagens semelhantes, com o benefício adicional de uma maior resolução. No entanto, Calling Card-seq pode ser limitado por viés de sequência das transposases e também depende da presença de locais de restrição próximos aos locais de inserção do transposão.
Um terceiro método de fusão enzimática, desenvolvido no laboratório de Laemmli, é clivagem endógena da cromatina (ChEC) 17 . No ChEC, uma fusão entre uma proteína associada à cromatina e MNase é expressa nas células, e após a adição de cálcio para ativar a MNase, o DNA é cortado proximal aos locais de ligação para os marcadosFator ( Figura 1 ). Em conjunto com Southern Blot, o ChEC tem sido usado para caracterizar a estrutura da cromatina e a ligação de proteínas em vários loci individuais em leveduras 17 , 18 e foi combinado com análise de microarrays de baixa resolução para investigar a interação de componentes de poros nucleares com o fermento Genoma 19 . O ChEC oferece benefícios semelhantes a DamID e Calling Card-seq, e sua resolução é quase um par de bases únicas quando analisado pela extensão primária 19 . O ChEC também é controlável: a clivagem de DNA robusta por MNase depende da adição de cálcio milimolar, garantindo que o MNase seja inativo nas baixas concentrações de cálcio livres observadas em células de fermento vivas 20 .
Anteriormente, postulamos que a combinação de ChEC com sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq) proporcionaria mapas de alta resolução de sites de ligação TF. Na verdade, ChEC-seq gerou mapas de alta resolução dos fatores reguladores gerais de fermento em broto (GRFs) Abf1, Rap1 e Reb1 em todo o genoma 1 . Também aplicamos o ChEC-seq com sucesso ao complexo Mediador modular, um coativador transcriptional global conservado e conservado 21 , expandindo a aplicabilidade dos complexos ChEC-seq para megadalton-size que não contatam diretamente o DNA e podem ser difíceis de serem mapeados pelo ChIP- Métodos baseados. O ChEC-seq é um método poderoso tanto para validação independente de resultados de ChIP-seq quanto para geração de novas idéias sobre a regulação de processos de residência de cromatina. Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a implementação deste método em fermento em brotamento.
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Protocol
1. Geração de cepas de fermento
- Gerar uma cepa de fermento com o fator de interesse etiquetado com MNase.
- O PCR amplifica a cassete de marcação MNase do vetor desejado ( Tabela 1 ) usando a mistura de reação especificada ( Tabela 2 ) e condições de ciclagem ( Tabela 3 ). Misture 5 μL da reação de PCR e 1 μL de corante de carga de DNA 6X. Execute cada alíquota de PCR em um gel de agarose a 0,8% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de ~ 2,3 kb.
- Transforme a cassete de marcação amplificada para a tensão de escolha usando a transformação padrão de acetato de lítio 22 e execute a seleção.
- Verifique a integração correta da cassete de marcação com PCR de colônia.
- Prepare a mistura de reação especificada ( Tabela 4 ) para o número de colônias a serem selecionadas. Mantenha-se gelado até ser necessário.
- Escolha uma porção de cada colônia para ser tesDeslizou-se no fundo de um tubo de PCR usando um palito de palito esterilizado ou uma pipeta.
- Microondas as colônias colhidas com alta potência durante 1 min.
- Adicione 50 μL de mistura de PCR ( Tabela 4 ) a cada colônia de microondas e pipetar para cima e para baixo para misturar. Execute PCR usando as condições de ciclagem especificadas ( Tabela 5 ).
- Misture os 50 μL de reação de PCR e 10 μL de corante de carga de DNA 6X diretamente em cada tubo de PCR. Executar 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 1% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de 700 pb.
NOTA: Se desejado, verifique a expressão apropriada da proteína de fusão MNase por Western Blot. É esperada uma mudança de ~ 20,6 kilodalton no peso molecular da proteína marcada.
- Gerar uma linhagem de MNase livre por clonagem baseada em homologia do promotor do gene de interesse em pGZ136 (Tabela 1) e transformação e seleção como no passo 1.1.2.
- AlternatiPor exemplo, montar o promotor do gene de interesse e 3xFLAG-MNase-SV40 NLS em um vetor plasmídico, transformar e selecionar como no passo 1.1.2 e cultivar a deformação na condição seletiva apropriada para a manutenção do plasmídeo.
2. ChEC
- À tarde / noite do dia anterior ao experimento ChEC, inocule 3 mL de levedura-peptona-dextrose (YPD) ou meio seletivo apropriado com uma única colônia da cepa que contém o fator marcado com MNase. Incubar esta cultura durante a noite (agitação de 180 RPM, 30 ° C).
- Na manhã do dia do experimento ChEC, diluir a cultura durante a noite em 50 mL de meio para uma densidade óptica a 600 nm (OD 600 ) de 0,2 a 0,3. Incubar esta cultura (180 RPM agitando, 30 ° C) até atingir uma DO 600 de 0,5-0,7. À medida que a cultura se aproxima do OD 600 apropriado, coloque o bloco de calor ou o banho de água a 30 ° C e comece a descongelar os aditivos Buffer A ( TaBle 6).
- Prepare 5 mL de aditivos Buffer A plus ( Tabela 6 ) por cultura. Mantenha o buffer A na RT durante o procedimento.
- Prepare tubos de microcentrífuga contendo 90 μL de solução de parada ( Tabela 7 ) e 10 μL de SDS a 10% para cada ponto de tempo a ser coletado. Para cada novo fator analisado, faça amostras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min.
- Decantar a cultura em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar a 1.500 xg e a temperatura ambiente (RT) durante 1 min.
- Ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A e transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A por pipetagem para cima e para baixo. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s. Repita este passo uma vez.
- Ressuspender completamente as células em 570 μL de tampão A. Adicionar 30 μL de 2% de digitonina(0,1% de concentração final) para facilitar a permeabilização das células e inverter para misturar.
- Permeabilize células em bloco de calor ou banho-maria a 30 ° C durante 5 min.
- Pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células. Remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas como um controle negativo para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS (passo 2.4) e vortex brevemente para misturar.
- Adicione 1,1 μL de CaCl2 1 M (concentração final 2 mM) a células permeabilizadas para ativar MNase e inverter várias vezes rapidamente ou vortex brevemente para misturar. Volte imediatamente a reação mista a 30 ° C e comece um temporizador.
- Em cada ponto de tempo a ser coletado, pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme de células, então remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS e vortex brevemente para misturar. Para cada novo fator analisado, tome 0 s (não adicionou CaCl 2 ), 30 s1 minuto, 2,5 min, 5 min e 10 minutos.
NOTA: Experimentos de ChEC com fatores que rapidamente escinham DNA a 30 ° C podem ser realizados a temperaturas mais baixas para diminuir a cinética de clivagem de MNase. - Uma vez que todos os pontos de tempo foram coletados, adicione 4 μL de 20 mg / mL de proteinase K a cada amostra, vortex brevemente para misturar e incuba a 55 ° C durante 30 min.
- Adicionar 200 μL de fenol: cloroformo: álcool isoamílico a cada amostra, vortex vigorosamente para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min.
- Remova cada fase aquosa (~ 150 μL) para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Vortex vigorosamente para misturar e precipitar em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa.
- O precipitado precipitou DNA à velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min.
- Decantar sobrenadantes e granulados de lavagem com 1 mL de RT 70% de etanol.
- Decantar o etanol, remover o restante invando umD suavemente tocando os tubos em uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min.
- Enquanto os grânulos estão secando, faça uma mistura principal para ressuspender os grânulos secos em 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μL de RNase A 10 mg / mL cada. Digerir ARN a 37 ° C durante 20 min.
- Misture 1 μL de corante de carga de DNA 6X com 5 μL de cada amostra e execute um gel de agarose a 1,5% a 120 V durante 40 min.
3. Seleção de tamanho
NOTA: O objetivo da seleção de tamanho é remover fragmentos multi-kilobase de DNA genômico da amostra para ser sequenciado e enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente o tamanho do DNA nucleossômico) ou menor. Na sequenciação de dados, fragmentos <400 pb são enriquecidos, com um pico notável em torno do tamanho do DNA nucleossômico (~ 150 pb) e uma distribuição máxima ou ampla de fragmentos subnucleosômicos.
<Ol>NOTA: A análise dos dados do ChEC-seq é um procedimento complexo e além do alcance deste artigo. Informações detalhadas sobre análise de dados podem ser encontradas nas publicações anteriores 1 , 21 e os scripts personalizados usados para análise estão disponíveis no GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) também pode ser usado para análise de linha de comando de dados ChEC-seq.
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Representative Results
No caso de um experimento de ChEC bem sucedido, a análise do DNA por eletroforese em gel de agarose revelará um aumento dependente do cálcio na fragmentação do DNA ao longo do tempo, conforme indicado por manchas e eventual digestão completa do DNA genômico. Em alguns casos, observa-se uma escala de bandas semelhante à observada com uma digestão MNase tradicional após a digestão prolongada. Este é o caso da análise ChEC do Reb1, um fator regulatório geral que liga as regiões com insuficiência de núcleos nucleares (NDRs) ( Figura 2 ). Descobrimos que, no caso dos GRF, a digestão prolongada leva à perda de sinal em locais de ligação rapidamente escavados 1 . Idealmente, uma amostra com uma redução no tamanho da banda de DNA genômico que exibe manchas de alto peso molecular, como os pontos de tempo de 30 s e 1 min para ReC1 ChEC, será usada para seqüenciamento para evitar perda de sinal dependente do tempo .
Figura 3 ). Da mesma forma, observamos uma clivagem substancial de DNA por uma fusão da subunidade Mediator Med8 com MNase, mas não MNase livre conduzida pelo promotor MED8 , 1 min após a adição de cálcio ( Figura 3 ).
Para comparar os dados ReC1 ChEC-seq para ChIP-seq, obtivemos uma lista de 1.991 picos Reb1 determinados pelo ORGANIC 13 . Esses picos foram centrados no motivo com a contagem média final do fragmento em cada posição da base em uma janela de 100 pb em torno do ponto médio do motivo. Observamos uma assimetria impressionante na divisão, com a maioria dos mapeamentos das extremidades dos fragmentos para o lado a montante do motivo (Figura 4 ).
Figura 1 : Esquema do método ChEC-seq. Uma proteína de proteína associada à cromatina (CAP) - fusão de mãe é expressa em células de levedura. A proteína se liga ao DNA, mas não gera clivagem acima dos níveis de fundo devido ao muito baixo cálcio livre no núcleo. Após a permeabilização de células com digitonina e adição de cálcio milimolar, as fusões CAP-MNase ligadas ao genoma entram DNA, liberando pequenos fragmentos. Estes fragmentos são então purificados, sequenciados e mapeados de volta ao genoma, dando picos de extremidades do fragmento proximais aos locais de ligação para a fusão CAP-MNase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Electroforese em gel de agarose do DNA de uma experiência ReC1 CHEC. Uma alíquota de 5 μL de DNA de cada ponto de tempo de ChEC foi analisada num gel de TAE-agarose a 1,5% antes da seleção do tamanho. Isso mostra a digestão progressiva do DNA genômico pela fusão Reb1-MNase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Snapshots do navegador Genome de Reb1-MNase e Experiências gratuitas de MNCE ChEC-seq. Visões IGV do sinal final do fragmento para Reb1 e MNase livre ChEC-seq 30 s após a adição de cálcio e Med8 e MNase grátis ChEC-seq 1 min af Ter adição de cálcio ao longo de um segmento representativo do genoma de levedura. Os conjuntos de dados foram normalizados dividindo o número de extremidades de fragmento mapeadas para cada posição de base pelo número total de extremidades de fragmentos mapeadas e multiplicando pelo número total de bases mapeadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Enriquecimento dos Fragmentos de Fragmento liberados pelo Reb1-MNase em torno dos Sites Orgânicos Reb1. Lote médio de 30 s Reb1 e sinal de fim de fragmento MNCE Chec-seq livre em torno de 1.991 motivos Reb1 determinados por ORGANIC 13 . Os dados foram normalizados como na Figura 3 .Lank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Plasmídeo | Marcador seletivo de fermento | Notas | Número do plasmídeo Addgene |
| PGZ108 | KanMX6 | Marcação 3xFLAG-MNase, 33 aa linker | 70231 |
| PGZ109 | HIS3MX6 | Marcação 3xFLAG-MNase, 33 aa linker | 70232 |
| PGZ110 | TRP1 | Marcação 3xFLAG-MNase, 33 aa linker | 70233 |
| PGZ136 | URA3 | Expressa 3xFLAG-MNase-SV40 NLS sob o controle do promotor REB1 | 72273 |
| PGZ173 | KanMX6 | Marcação de MNase, 8 aa linker | 70234 |
Tabela 1: Detalhes dos plasmídeos ChEC. Todos os vetores de marcação são baseados em vetores pFA6a e, portanto, são compatíveis com os pares de iniciadores de marcação F2 / R1 comumente usados. A cassete de marcação consiste de um linker do comprimento indicado, um epítopo 3xFLAG para facilitar a detecção por western blot (exceto no caso de pGZ173, onde o linker foi encurtado para remover a etiqueta 3xFLAG), a cadeia madura de MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), e o marcador selecionável indicado.
| Reagente | Volume | [Final] |
| 5x buffer de PCR | 10 mL | 1x (MgCl2 2 mM) |
| Mistura de dNTP 10 mM (2,5 mM cada dNTP) | 1 mL | 200 mM (50 mM cada dNTP) |
| Iniciador F2 10 mM | 2,5 mL | 0,5 mM |
| 10 mM R1 pRimer | 2,5 mL | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) | 1 mL | |
| Polimerase de alta fidelidade de 2 U / μL de início quente | 0,5 mL | 1 U |
| DdH 2 O | 32,5 mL |
Tabela 2: Mistura de Reação para Amplificação por PCR de Cassetes de Marcação 3xFLAG-MNase. As sequências de iniciadores F2 / R1 podem ser encontradas em http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatura (° C) | Tempo | Ciclos |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 minutos | 1 |
| 10 | Para sempre | Aguarde |
Tabela 3: Condições térmicas de ciclagem para amplificação por PCR de cassete de marcação 3xFLAG-MNase. A temperatura de incubação e o tempo de extensão podem ser ajustados com base na DNA polimerase utilizada.
| Reagente | Volume | [Final] |
| Tampão Taq 10x | 5 mL | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| Mistura de dNTP 10 mM (2,5 mM cada dNTP) | 1 mL | 200 mM (50 mM cada dNTP) |
| 10 mM Verifique o iniciador | 1 mL | 0,2 mM |
| 10 mM de MNase-R ou iniciador de controle negativo | 1 mL | 0,2 mM |
| 5 U / mL Taq polimerase | 0,5 mL | 2,5 U |
| DdH 2 O | 41,5 mL |
Tabela 4: Mistura de Reação para Colônia PCR Confirmação de Marcação MNase. Verifique se as sequências do primer podem ser encontradas em http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. O iniciador de verificação é usado como iniciador direto junto com um iniciador reverso dentro de MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') e um iniciador reverso ~ 500 pares de bases (bp) a jusante do respectivo gene como um controle negativo.
| Temperatura (° C) | Tempo | Ciclos |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 minuto | 35 |
| 68 | 5 min | 1 |
| 10 | Para sempre | Aguarde |
Tabela 5: Condições térmicas de ciclagem para confirmação por PCR colonia da marcação MNase. A temperatura de incubação e o tempo de extensão podem ser ajustados com base na DNA polimerase utilizada.
| Reagente | Volume | [Final] |
| Tris 1 M, pH 7,5 | 1,5 mL | 15 mM |
| KCl 1 M | 8 mL | 80 mM |
| EGTA 0,2 M | 50 mL | 0,1 mM |
| DdH 2 O | Preencha para 100ML |
Tabela 6: Receita para o tampão A. Antes do uso, adicione metade de um comprimido de inibidor de protease, 50 μL de PMSF 100 mM (1 mM final), 5 μL de espermina de 200 mM (0,2 mM final) e 2,5 μL de 1 M Espermidina (0,5 mM final) por 5 mL de solução.
| Reagente | Volume | [Final] |
| NaCl 5 M | 8 mL | 400 mM |
| EDTA 0,5 M | 4 mL | 20 mM |
| EGTA 0,2 M | 2 mL | 4 mM |
| DdH 2 O | Preencha para 100 mL |
Tabela 7: Receita para solução de parada 2x. Combine 90 μL de stoP com 10 μL de SDS a 10% em um tubo de microcentrífuga para cada ponto a ser tomado (ver passo 2.4).
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Discussion
Mostramos que o ChEC pode mapear diversas classes de proteínas de levedura na cromatina e antecipar que será amplamente aplicável a diferentes famílias de TFs e outros fatores de ligação à cromatina na levedura. O ChEC-seq é vantajoso porque não requer reticulação, solubilização da cromatina ou anticorpos. Assim, o ChEC evita artefactos potencialmente presentes no X-ChIP-seq, como o artefato 3 , 4 e o Chip nativo hiper-ChIPable, como os falsos negativos devido à solubilização incompleta da proteína 14 . A principal desvantagem do ChEC-seq, como acontece com todos os métodos de fusão enzimática, é a exigência de uma proteína de fusão. Isso pode ser alcançado rapidamente em fermento em brotação, mas é mais laborioso em metazoários. Outra limitação do ChEC-seq é que ele não pode ser implementado como é para o perfil de modificações das histonas. No entanto, um domínio de ligação de modificação pode ser fundido com MNase e expresso, permitindo que hMapeamento de modificação de istone com ChEC-seq. Nessa veia, o ChIP-seq usando domínios de ligação à modificação de histonas marcados com epítopo foi usado para mapear padrões de modificação de histonas 26 do genoma.
O uso de um controle MNase livre é importante para estabelecer a especificidade dos resultados ChEC-seq. A linhagem MNase livre carrega MNase marcada com 3xFLAG e um sinal de localização nuclear de vírus simiano (SV40 NLS) sob o controle do promotor endógeno para o gene de interesse. É conceitualmente semelhante ao controle da barragem não utilizado usado nos estudos de DamID 27 e nos controles de clivagem não específica devido à acessibilidade da cromatina. Como um controle MNase gratuito para TF ChEC-seq, nós integramos 3xFLAG-MNase-SV40 NLS conduzido pelo promotor REB1 no ura3 locus 1 . Para o Mediator ChEC-seq, expressamos 3xFLAG-MNase-SV40 NLS sob o controle do promotor MED8 em um plasmi não-integranteD vetor mantido em meio seletivo 21 . Em ambos os casos, observou-se muito pouca clivagem por MNase livre. Assim, uma única deformação de controle em que 3xFLAG-MNase-SV40 NLS é conduzida por um promotor relativamente robusto deve ser apropriada para a maioria das experiências.
Ao planejar um experimento ChEC, a consideração estrutural da proteína de interesse pode ser importante. Por exemplo, descobrimos que anexar MNase ao C-terminal de Reb1 deu um padrão de clivagem assimétrica em torno de motivos Reb1, enquanto a expressão de Reb1 com MNase N-terminal forneceu um padrão de clivagem simétrica 1 . Atribuímos esses diferentes padrões de clivagem à estrutura do Reb1. O domínio de ligação ao DNA de Reb1 está localizado no seu terminal C; Assim, o C-terminal é estruturado e próximo do DNA, limitando a amplitude de movimento da MNase e apenas permitindo a clivagem C-terminal. Em contraste, o terminal C do Abf1 é relativamente não estruturado e, portanto, pode atuar para aumentar paraAlcance de MNase, permitindo clivagem em ambos os lados dos sites de ligação de Abf1. No caso de Rap1, outro GRF de fermento, descobrimos que encurtar o linker entre o terminal C e o MNase de 33 a 8 aa foi suficiente para reduzir severamente a clivagem, talvez devido à distância proposta da porção C-terminal de Rap1 de DNA 28 . Essa consideração estrutural também é provável que seja importante ao tentar mapear a ligação de proteínas presentes em grandes complexos. Para a nossa análise ChEC-seq da ligação do Mediador ao genoma de levedura 21 , selecionamos subunidades cujos terminais C foram predispostamente estruturalmente expostos, em vez de enterrados dentro do complexo. Das três subunidades fundidas com a MNase, não houve uma forte clivagem do DNA, sugerindo que restrições estéticas ou interações com outros fatores de ligação ao DNA atenuaram a clivagem do DNA.
Descobrimos que ChEC-seq detecta 4-12 vezes mais picos para leveduras GRFs Abf1, Rap1 e Reb1 do que várias abordagens de ChIP quando todos os pontos de tempo foram considerados juntos 1 . Esses sites podem ser divididos em duas classes com base na cinética de clivagem de MNase. A análise dos dados do ChEC-seq para GRF de levedura revelou duas classes temporalmente distintas de sites de ligação 1 . O primeiro, denominado "rápido", mostrou clivagem máxima <1 minuto após a adição de cálcio e geralmente contém fósforos robustos com motivos de consenso conhecidos. O segundo, denominado "lento", levou vários minutos para alcançar níveis apreciáveis de clivagem e foram esgotados de fósforos de motivos. Ambas as classes de sites foram, em média, enriquecidas para ligação em conjuntos de dados ChIP, embora não fossem necessariamente chamados como picos nos estudos ChIP. A maioria dos sites para um determinado fator eram locais lentos. Nós especulamos que os sites rápidos são representativos dos sites de ligação do fator de transcrição de alta afinidade, enquanto que os locais lentos representam loci amostrados transitoriamente durante a varredura do site de ligação. O obA servidão de duas classes de locais de ligação separados pela cinética da clivagem de MNase pode explicar a observação em muitos conjuntos de dados de Chip-seq que um grande número de picos para um determinado fator com uma especificação de ligação de DNA bem estabelecida não contém um motivo de consenso 29 : A reticulação de formaldeído, realizada por 10 a 15 minutos na maioria dos protocolos de ChIP, pode capturar repetidamente interações temporárias ou oportunistas de um fator com o genoma, levando a inflação de sinal. Na verdade, a comparação de ChIP-exo e imagens de células vivas sugere que este é o caso 2 . Notavelmente, não observamos uma diminuição tão dramática dependente do tempo nos sinais Mediator ChEC-seq 21 , com o sinal Mediator ChEC-seq relativamente constante de 30 s a 20 min. Dadas essas observações, recomendamos a realização de ChEC-seq de curta duração para recuperar sites de ligação de alta confiança.
Nós antecipamos que ChEC-seq pode ser adaptado para fermento não ferrosoSistemas. A concentração de cálcio livre em células de mamífero não estimuladas é de 50-300 nM 30 , 32 , muito abaixo do limiar para uma eficiente ativação de MNase. O passo limitante para o estabelecimento de ChEC-seq em sistemas metazoários é, portanto, a geração de proteínas de fusão, que permanece muito mais trabalhosa em metazoários do que as células de levedura. No entanto, a marcação endógena de genes metazoários foi grandemente facilitada pelo advento da engenharia de genoma baseada em CRISPR 33 , e, portanto, essa limitação deve ser facilmente superada. Alternativamente, as proteínas de fusão MNase podem ser expressas a baixos níveis de plasmídeos. Esta abordagem tem sido bastante bem sucedida para DamID em Drosophila 34 , 35 e células humanas 36 e, portanto, também pode facilitar ChEC-seq em células metazoárias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Moustafa Saleh e Jay Tourigny pela leitura crítica do manuscrito e Steven Hahn e Steven Henikoff para orientação e apoio durante o desenvolvimento do ChEC-seq e sua aplicação ao complexo do Mediador. O SG é suportado por concessões do NIH R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ é suportado pelos fundos de inicialização da Universidade de Indiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
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