Summary
Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).
Abstract
Genoma de todo el mapa de las interacciones proteína-ADN es fundamental para la comprensión de la regulación de genes, la remodelación de la cromatina, y otros procesos de cromatina-residente. La reticulación del formaldehído seguida por la inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (X-ChIP-seq) se ha utilizado para obtener muchas ideas valiosas sobre la biología del genoma. Sin embargo, X-ChIP-seq tiene limitaciones notables ligadas a reticulación y sonicación. ChIP nativo evita estos inconvenientes omitiendo la reticulación, pero a menudo da como resultado una recuperación deficiente de las proteínas unidas a la cromatina. Además, todos los métodos basados en ChIP están sujetos a consideraciones de calidad de anticuerpos. También se han utilizado métodos enzimáticos para correlacionar interacciones proteína-ADN, que implican la fusión de una proteína de interés con una enzima modificadora de ADN, para mapear interacciones proteína-ADN. Recientemente hemos combinado uno de estos métodos, la cromatina endógena escisión (ChEC), con alto rendimiento de secuenciación como ChEC-seq. ChEC-seq se basa en la fusión de una cromatina-assoc(MNase) para generar segmentación de ADN dirigida en presencia de calcio en células vivas. ChEC-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto eludir las preocupaciones potenciales con la reticulación, sonicación, solubilización de la cromatina, y la calidad de anticuerpos, mientras que la asignación de alta resolución con una mínima señal de fondo. Prevemos que ChEC-seq será una poderosa contrapartida a ChIP, proporcionando un medio independiente para validar los hallazgos de ChIP-seq y descubrir nuevos conocimientos sobre la regulación genómica.
Introduction
El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) 1 , para eludir estos inconvenientes.
ChIP-seq se realiza más a menudo con un paso inicial de reticulación de formaldehído (X-ChIP-seq) para preservar las interacciones proteína-ADN. Sin embargo, una serie de estudios recientes han indicado que X-ChIP-seq capta transitorios o inespecíficos interacciones proteína-ADN 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , dando lugar a falsos sitios de unión positiva. Además, la sonicación, comúnmente utilizada para fragmentar la cromatina en experimentos X-ChIP-seq, tiende preferentemente las regiones de cromatina abierta, lo que conduce a la recuperación sesgada de los fragmentos de estas regiones [ 9 , 10] . La sonicación también produce una mezcla heterogénea de longitudes de fragmentos, limitando en última instancia la resolución del sitio de unión, aunque la adición de un paso de digestión con exonucleasa puede mejorar en gran medida la resolución 11 , 12 . Los métodos nativos de ChIP tales como regiones ocupadas de genomas de cromatina naturalmente aislada purificada por afinidad (ORGÁNICOS) 13 no usan cromatina de reticulación y fragmentos con nuclease micrococcal (MNasa), aliviando los sesgos potenciales asociados con la reticulación de formaldehído y la sonicación. Sin embargo,La solubilidad de muchas proteínas ligadas a la cromatina en las condiciones relativamente suaves requeridas para la extracción nativa de cromatina es pobre, lo que podría conducir a un rango dinámico reducido y / o falsos negativos [ 14] .
Mientras que varias iteraciones de ChIP-seq son más comúnmente utilizados para el genoma de la cartografía de las interacciones entre proteínas y ADN, varias técnicas de cartografía basada en la fusión de proteínas de interés para diversas enzimas modificadoras del ADN también se han puesto en práctica. Uno de estos enfoques es la identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) 15 , en el que una proteína de unión a cromatina de interés se fusiona genéticamente con Dam y esta fusión se expresa en células o animales, dando como resultado la metilación de secuencias GATC próximas a los sitios de unión para la proteína. DamID es ventajoso porque no depende de la inmunoprecipitación y evita así la reticulación, los anticuerpos o la solubilización de la cromatina. También se realiza in vivo . sin embargo, La resolución de DamID está limitada a la escala de kilobases y la actividad de metilación de la proteína de fusión Dam es constitutiva. Un segundo método basado en la fusión enzimática es Calling Card-seq 16 , que emplea la fusión de un factor de interés para una transposasa, dirigiendo la integración de transposones específica de sitio. Al igual que DamID, Calling Card-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto tiene ventajas similares, con el beneficio añadido de una mayor resolución. Sin embargo, Calling Card-seq puede estar limitado por sesgos secuenciales de transposasas y también depende de la presencia de sitios de restricción cercanos a los sitios de inserción del transposón.
Un tercer método de fusión enzimática, desarrollado en el laboratorio de Laemmli, es la cromatina endógena clivaje (ChEC) [ 17] . En ChEC, una fusión entre una proteína asociada a la cromatina y la MNasa se expresa en células, y tras la adición de calcio para activar la MNasa, el ADN se escinde proximalmente a los sitios de unión para la proteína marcada( Figura 1 ). En combinación con Southern blotting, ChEC se ha utilizado para caracterizar la estructura de la cromatina y la proteína vinculante en un número de loci individuales en la levadura 17 , 18 , y se ha combinado con análisis de microarrays de baja resolución para sondar la interacción de componentes de poros nucleares con la levadura Genoma 19 . ChEC ofrece beneficios similares a DamID y Calling Card-seq, y su resolución es casi un par de bases cuando se analiza por la extensión de cebador 19 . ChEC también es controlable: la escisión de ADN robusto por MNasa depende de la adición de calcio milimolar, asegurando que la MNasa es inactiva a las concentraciones de calcio libre bajo observado en las células de levadura vivas [ 20] .
Anteriormente, se postuló que la combinación de ChEC con secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq) proporcionaría mapas de alta resolución de los sitios de unión TF. De hecho, ChEC-seq generaron mapas de alta resolución de los factores reguladores generales (GRFs) Abf1, Rap1 y Reb1 de la levadura en ciernes a través del genoma 1 . También hemos aplicado con éxito ChEC-seq al complejo modular Mediator, un coactivador transcripcional global esencial conservado 21 , ampliando la aplicabilidad de ChEC-seq a complejos de tamaño megadalton que no entran en contacto directo con el ADN y pueden ser difíciles de mapear por ChIP- Basado en los métodos. ChEC-seq es un método poderoso tanto para la validación independiente de los resultados de ChIP-seq como para la generación de nuevos conocimientos sobre la regulación de los procesos residentes en la cromatina. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la aplicación de este método en la levadura en ciernes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generación de cepas de levadura
- Genere una cepa de levadura que tenga el factor de interés marcado con MNase.
- PCR amplifican el casete de marcado MNase del vector deseado ( Tabla 1 ) usando la mezcla de reacción especificada ( Tabla 2 ) y las condiciones de ciclación ( Tabla 3 ). Mezclar 5 μL de la reacción de PCR y 1 μl de colorante de carga de ADN 6X. Ejecutar cada alícuota de PCR en un gel de agarosa al 0,8% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 2.3 kb.
- Transformar el casete de marcado amplificado en la cepa de elección utilizando la transformación estándar de acetato de litio 22 y realizar la selección.
- Verificar la correcta integración del casete de etiquetado con PCR de colonias.
- Preparar la mezcla de reacción especificada ( Tabla 4 ) para el número de colonias que se deben tamizar. Manténgase en el hielo hasta que lo necesite.
- Escoja una porción de cada colonia para ser tesEn la parte inferior de un tubo de PCR usando un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta.
- Cocinar las colonias escogidas a alta potencia durante 1 min.
- Añadir 50 μl de mezcla de PCR ( Tabla 4 ) a cada colonia de microondas y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Realice PCR usando las condiciones de ciclo especificadas ( Tabla 5 ).
- Mezclar los 50 μL de reacción de PCR y 10 μL de colorante de carga de ADN 6X directamente en cada tubo de PCR. Ejecutar 10 μL de cada muestra en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 700 pb.
NOTA: Si se desea, verifique la expresión apropiada de la proteína de fusión MNasa mediante Western blot. Se espera un desplazamiento de aproximadamente 20,6 kilodaltons en el peso molecular de la proteína marcada.
- Generar una cepa de MNasa libre mediante clonación basada en la homología del promotor del gen de interés en pGZ136 (Tabla 1) y transformación y selección como en el paso 1.1.2.
- AlternatiVely, ensamblar el promotor del gen de interés y 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS en un vector de plásmido, transformar y seleccionar como en la etapa 1.1.2, y hacer crecer la cepa en la condición selectiva apropiada para el mantenimiento del plásmido.
2. ChEC
- En la tarde / noche del día anterior al experimento de ChEC, inocular 3 ml de levadura-peptona-dextrosa (YPD) o medio selectivo apropiado con una única colonia de la cepa que lleva el factor marcado con MNasa. Incubar esta cultura durante la noche (agitación 180 RPM, 30ºC).
- En la mañana del día del experimento de ChEC, diluir el cultivo durante la noche en 50 ml de medio a una densidad óptica a 600 nm (DO 600 ) de 0,2 - 0,3. Incubar este cultivo (agitación 180 RPM, 30 ° C) hasta que alcance una DO 600 de 0,5-0,7. A medida que el cultivo se aproxima a la DO 600 adecuada, se pone el bloque de calor o el baño de agua a 30ºC y se comienzan a descongelar aditivos de Tampón A ( TaBle 6).
- Preparar 5 mL de Tampón A más aditivos ( Tabla 6 ) por cultivo. Mantenga el tampón A a temperatura ambiente durante el procedimiento.
- Prepare tubos de microcentrífuga que contengan 90 μL de solución de parada ( Tabla 7 ) y 10 μL de SDS al 10% para cada punto de tiempo que se va a recoger. Para cada nuevo factor analizado, tomar las muestras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min y 10 min.
- Se decanta el cultivo en un tubo cónico de 50 ml y se centrifuga a 1.500 xg ya temperatura ambiente (RT) durante 1 min.
- Resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A y transferir las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s.
- Aspirar sobrenadante y resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s. Repita este paso una vez.
- Resuspender completamente las células en 570 μL de Tampón A. Añadir 30 μl de digitonina al 2%(0,1% de concentración final) para facilitar la permeabilización de las células, e invertir la mezcla.
- Permeabilizar las células en bloque de calor o baño de agua a 30 ° C durante 5 min.
- Pipetar la reacción hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células. Elimine una alícuota de 100 μl de células permeabilizadas como control negativo a un tubo de microcentrífuga que contenga solución de parada y SDS (paso 2.4) y agite brevemente para mezclar.
- Añadir 1,1 μ l de 1 M CaCl 2 (2 mM de concentración final) a las células permeabilizadas para activar MNase e invertir varias veces rápidamente o vórtice brevemente para mezclar. Devolver inmediatamente la reacción mezclada a 30 ° C e iniciar un temporizador.
- En cada punto de tiempo a recoger, pipetear la reacción arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme de las células, luego eliminar una alícuota de 100 μL de células permeabilizadas a un tubo de microcentrífuga que contiene solución de parada y SDS y vórtice brevemente para mezclar. Para cada nuevo factor analizado, tomar 0 s (sin CaCl 2 añadido), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min, y 10 min puntos de tiempo.
NOTA: Los experimentos de ChEC con factores que escinden rápidamente el ADN a 30 ° C se pueden realizar a temperaturas más bajas para disminuir la cinética de escisión de MNasa. - Una vez que todos los puntos de tiempo se han recogido, añadir 4 μ l de 20 mg / ml de proteinase K a cada muestra, vórtice brevemente para mezclar, e incubar a 55 ° C durante 30 min.
- Se a~naden 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamılico 25: 24: 1 a cada muestra, se agita vigorosamente para mezclar y se centrifuga a velocidad máxima y RT en una microcentrıfuga durante 5 min.
- Retirar cada fase acuosa (~ 150 μl) a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Vórtice vigorosamente para mezclar y precipitar en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa.
- El gránulo precipitó ADN a velocidad máxima y 4ºC en una microcentrífuga durante 10 min.
- Los sobrenadantes de decantación y los gránulos de lavado con 1 mL de etanol RT al 70%.
- Decantar etanol, quitando el resto invirtiendo unD golpeando suavemente los tubos sobre una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min.
- Mientras que los gránulos están secando, hacer una mezcla maestra para resuspender pellets secos en 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μl de RNasa A 10 mg / mL cada uno. Digerir el ARN a 37 ° C durante 20 min.
- Mezcle 1 μL de colorante de carga de ADN 6X con 5 μl de cada muestra y corríjase sobre un gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 40 min.
3. Selección del tamaño
NOTA: El objetivo de la selección de tamaños es eliminar fragmentos de ADN genómico de múltiples muestras de la muestra a secuenciar y enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente el tamaño del ADN nucleosómico) o más pequeños. En los datos de secuenciación, los fragmentos <400 pb se enriquecen, con un notable pico alrededor del tamaño del ADN nucleosómico (~ 150 pb) y una distribución pico o amplia de fragmentos subnucleosómicos.
<OlNOTA: El análisis de los datos de Seq de ChEC es un procedimiento complejo y está fuera del alcance de este artículo. Puede encontrar información detallada sobre el análisis de datos en las publicaciones anteriores 1 , 21 , y las secuencias de comandos personalizadas utilizadas para el análisis están disponibles en GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) también se puede utilizar para el análisis de línea de comandos de datos ChEC-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En el caso de un experimento de ChEC exitoso, el análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa revelará un aumento dependiente de calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, tal como se indica por el desprendimiento y la digestión completa final del ADN genómico. En algunos casos, se observa una escalera de bandas similar a la observada con una digestión MNasa tradicional después de una digestión prolongada. Este es el caso de ChEC análisis de Reb1, un factor regulador general que se une a nucleosome-depleted regiones (NDR) ( Figura 2 ]. Hemos encontrado, en el caso de GRFs, una digestión prolongada conduce a la pérdida de señal en sitios de unión escindidos rápidamente 1 . Idealmente, se utilizará una muestra con una reducción en el tamaño de la banda de ADN genómico que muestra manchas de alto peso molecular, tales como los puntos temporales de 30 sy 1 min para Reb1 ChEC, para la secuenciación para evitar la pérdida de señal dependiente del tiempo .
Figura 3 ). De forma similar, observamos un importante desdoblamiento del ADN mediante una fusión de la subunidad Mediator Med8 con la MNasa, pero no la MNasa libre impulsada por el promotor MED8 , 1 min después de la adición de calcio ( Figura 3 ).
Para comparar Reb1 ChEC-seq datos a ChIP-seq, obtuvimos una lista de 1,991 Reb1 picos determinados por ORGANIC 13 . Estos picos fueron centrados en el motivo con el promedio de la cuenta final del fragmento en cada posición de base en una ventana de 100 pb alrededor del motivo medio. Se observó una sorprendente asimetría en la división, con la mayoría de los extremos de los fragmentos de cartografía a la parte aguas arriba del motivo (Figura 4 ).
Figura 1 : Esquema del método de ChEC-seq. Una fusión de la proteína asociada a la cromatina (CAP) -MNasa se expresa en células de levadura. La proteína se une al ADN pero no genera escisión por encima de los niveles de fondo debido al calcio libre muy bajo en el núcleo. Tras la permeabilización de las células con digitonina y adición de calcio milimolar, las fusiones de CAP-MNasa unidas al genoma escinden el ADN, liberando fragmentos pequeños. Estos fragmentos son entonces purificados, secuenciados y mapeados de nuevo al genoma, dando picos de extremos de fragmentos próximos a los sitios de unión para la fusión de CAP-MNasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Electroforesis en gel de agarosa de ADN de un experimento ReB1 ChEC. Se analizó una alícuota de 5 μl de ADN de cada punto de tiempo de ChEC en un gel de TAE-agarosa al 1,5% antes de la selección del tamaño. Esto muestra la digestión progresiva del ADN genómico mediante la fusión de Reb1-MNasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Instantáneas del buscador de genoma de los experimentos Reb1-MNasa y MNase libre ChEC-seq. IGV vistas de fragmento de la señal final de Reb1 y MNase libre ChEC-seq 30 s después de la adición de calcio y Med8 y MNase libre ChEC-seq 1 min af Ter a lo largo de un segmento representativo del genoma de la levadura. Los conjuntos de datos se normalizaron dividiendo el número de extremos de fragmentos asignados a cada posición de base por el número total de extremos de fragmentos asignados y multiplicando por el número total de bases mapeadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Enriquecimiento de fragmentos de fragmentos liberados por Reb1-MNasa alrededor de sitios orgánicos Reb1. Promedio de 30 s Reb1 y libre de la MNase ChEC-seq fragmento de señal alrededor de 1,991 Reb1 motivos determinados por ORGÁNICOS 13 . Los datos se normalizaron como en la Figura 3 .Lank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Plásmido | Marcador de levadura seleccionable | Notas | Número de plásmido del adenoma |
| PGZ108 | KanMX6 | 3xFLAG-MNase etiquetado, 33 aa enlazador | 70231 |
| PGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase etiquetado, 33 aa enlazador | 70232 |
| PGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase etiquetado, 33 aa enlazador | 70233. |
| PGZ136 | URA3 | Expresa 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS bajo el control del promotor REB1 | 72273 |
| PGZ173 | KanMX6 | MNase etiquetado, 8 aa linker | 70234 |
Tabla 1: Detalles de los plásmidos ChEC. Todos los vectores marcadores se basan en vectores pFA6a y por lo tanto son compatibles con los pares de cebadores de marcado F2 / R1 comúnmente utilizados. El casete de etiquetado consiste en un enlazador de la longitud indicada, un epítopo 3xFLAG para facilitar la detección por transferencia Western (excepto en el caso de pGZ173, donde el enlazador ha sido acortado para eliminar la etiqueta 3xFLAG), la cadena madura de MNasa (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), y el marcador seleccionable indicado.
| Reactivo | Volumen | [Final] |
| 5x tampón de PCR | 10 ml | 1x (MgCl _ { 2 } 2 mM) |
| 10 mM dNTP mezcla (2,5 mM cada dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM cada dNTP) |
| 10 mM F2 primer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| 10 mM R ^ {1}Borde | 2,5 ml | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1 - 5 ng / ml) | 1 ml | |
| 2 U / μL de polimerasa de alta fidelidad de arranque en caliente | 0,5 ml | 1 U |
| DdH 2 O | 32,5 ml |
Vskip1.000000 baselineskip TABLA 2 Mezcla de reacción para amplificación por PCR de 3 cassettes de marcaje FLAG - MNasa. Las secuencias de cebadores F2 / R1 se pueden encontrar en http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatura (° C) | Hora | Ciclos |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 minutos | 1 |
| 10 | Por sienpre | Sostener |
Tabla 3: Condiciones de ciclación térmica para la amplificación por PCR de 3 cassettes de marcado con FLAG-MNasa. Puede ser necesario ajustar la temperatura de incubación y el tiempo de extensión basándose en la ADN polimerasa utilizada.
| Reactivo | Volumen | [Final] |
| Tampón Taq 10x | 5 ml | 1x (MgCl _ { 2 } 1,5 mM) |
| 10 mM dNTP mezcla (2,5 mM cada dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM cada dNTP) |
| 10 mM Check primer | 1 ml | 0,2 mM |
| IMMasa-R 10 mM o cebador de control negativo | 1 ml | 0,2 mM |
| 5 U / ml Taq polimerasa | 0,5 ml | 2,5 U |
| DdH 2 O | 41,5 ml |
Vskip1.000000 baselineskip TABLA 4 Mezcla de reacción para confirmación de PCR de colonias de marcado con MNasa. Las secuencias de primeras verificaciones se pueden encontrar en http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. El cebador de verificación se usa como cebador directo junto con un cebador inverso dentro de MNasa (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') y un cebador inverso ~ 500 pares de bases (bp) aguas abajo del gen respectivo como control negativo.
| Temperatura (° C) | Hora | Ciclos |
| 95 | 5 minutos | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 minuto | 35 |
| 68 | 5 minutos | 1 |
| 10 | Por sienpre | Sostener |
Tabla 5: Condiciones de ciclismo térmico para la confirmación de PCR de colonias de marcado con MNasa. Puede ser necesario ajustar la temperatura de incubación y el tiempo de extensión basándose en la ADN polimerasa utilizada.
| Reactivo | Volumen | [Final] |
| Tris 1 M, pH 7,5 | 1,5 ml | 15 mM |
| KCl 1 M | 8 ml | 80 mM |
| 0.2 M EGTA | 50 ml | 0,1 mM |
| DdH 2 O | Rellene hasta 100Ml |
Tabla 6: Receta para tampón A. Antes de su uso, añada la mitad de una tableta de inhibidor de proteasa, 50 μL de PMSF 100 mM (1 mM final), 5 μL de espermina 200 mM (final 0,2 mM) y 2,5 μl de 1 M Espermidina (final 0,5 mM) por 5 ml de solución.
| Reactivo | Volumen | [Final] |
| NaCl 5 M | 8 ml | 400 mM |
| EDTA 0,5 M | 4 ml | 20 mM |
| 0.2 M EGTA | 2 ml | 4 mM |
| DdH 2 O | Rellene hasta 100 mL |
Tabla 7: Receta para la solución de parada 2x. Combine 90 μl de stoP con 10 μl de SDS al 10% en un tubo de microcentrífuga para cada punto de tiempo que se debe tomar (ver paso 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemos demostrado que ChEC puede mapear diversas clases de proteínas de levadura en la cromatina, y anticipar que será ampliamente aplicable a diferentes familias de TFs y otros factores de unión a la cromatina en la levadura. ChEC-seq es ventajoso en que no requiere reticulación, solubilización de cromatina, o anticuerpos. Por lo tanto, ChEC evita artefactos potencialmente presentes en X-ChIP-seq, como el artefacto hiper-ChIPable 3 , 4 , y ChIP nativo, tales como falsos negativos debido a la solubilización de proteínas incompleta [ 14] . El mayor inconveniente de ChEC-seq, como con todos los métodos de fusión enzimática, es el requisito de una proteína de fusión. Esto se puede lograr rápidamente en la levadura en ciernes, pero es más laborioso en los metazoos. Otra limitación de ChEC-seq es que no se puede implementar como es para el perfil de las modificaciones de las histonas. Sin embargo, un dominio de unión a la modificación podría fusionarse con la MNasa y expresarse, permitiendo que hMapeo de la modificación istone con ChEC-seq. En esta vena, ChIP-seq utilizando epítopo etiquetados histona modificación vinculante dominios se ha utilizado para el mapa genoma patrones de ampliación de la histona modificación [ 26] .
El uso de un control de MNasa libre es importante para establecer la especificidad de los resultados de ChEC-seq. La cepa de MNasa libre lleva la MNasa marcada con 3xFLAG y una señal de localización nuclear del virus simio 40 (SV40 NLS) bajo el control del promotor endógeno para el gen de interés. Es conceptualmente similar al control de la Presa sin fundar utilizado en los estudios DamID 27 y los controles para la escisión no específica debido a la accesibilidad de la cromatina. Como un control de MNasa libre para TF ChEC-seq, hemos integrado 3xFLAG-MNase-SV40 NLS impulsado por el promotor REB1 en el locus ura3 1 . Para Mediator ChEC-seq, expresamos 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS bajo el control del promotor MED8 en un no-integrando plasmiD vector mantenido en medio selectivo 21 . En ambos casos, se observó muy poca escisión por la MNasa libre. Por lo tanto, una única cepa de control en la que 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS es impulsada por un promotor relativamente robusto debe ser apropiada para la mayoría de los experimentos.
Al planificar un experimento de ChEC, la consideración estructural de la proteína de interés puede ser importante. Por ejemplo, se encontró que la adición de MNase a la C-terminal de Reb1 dio un patrón de división asimétrica alrededor Reb1 motivos, mientras que la expresión de Reb1 con N-terminal de la MNasa dio una simetría clivaje patrón [ 1] . Atribuimos estos diferentes patrones de división a la estructura de Reb1. El dominio de unión a ADN de Reb1 está situado en su extremo C-terminal; Por lo tanto, el C-terminal está estructurado y cerca de ADN, lo que limita el rango de movimiento de la MNasa y sólo permite la clivaje C-terminal. En contraste, el extremo C-terminal de Abf1 es relativamente no estructurado y puede actuar así para aumentar aAlcance de la MNasa, permitiendo la escisión en ambos lados de los sitios de unión Abf1. En el caso de Rap1, otro GRF de levadura, se encontró que acortar el enlazador entre el extremo C-terminal y la MNasa de 33 a 8 aa fue suficiente para reducir severamente la escisión, tal vez debido a la distancia propuesta de la porción C-terminal de Rap1 de ADN 28 . Tal consideración estructural también es probable que sea importante cuando se intenta mapear la unión de proteínas presentes en grandes complejos. Para nuestro análisis de ChEC-Seq de Mediator vinculante a la levadura genoma 21 , se seleccionaron las subunidades C-terminales estructuralmente se predice que están expuestos, en lugar de enterrado dentro del complejo. De las tres subunidades fusionadas a la MNasa, una no escindió fuertemente el ADN, lo que sugiere que las limitaciones estéticas o las interacciones con otros factores de unión al ADN atenuaron la escisión del ADN.
Se encontró que ChEC-seq detecta 4-12 veces más picos para la levadura GRFs Abf1, Rap1, y Reb1 que varios enfoques de ChIP cuando todos los puntos de tiempo fueron considerados juntos 1 . Estos sitios podrían dividirse en dos clases basadas en cinética de división de MNasa. Análisis de ChEC-seq datos de levadura GRFs reveló dos temporalmente distintas clases de sitios de unión [ 1] . El primero, denominado 'rápido', mostró una disociación máxima <1 min después de la adición de calcio y que generalmente contenía concordancias robustas con motivos de consenso conocidos. El segundo, llamado "lento", tomó varios minutos para alcanzar niveles apreciables de escisión y se agotaron de los partidos de motivo. Ambas clases de sitios fueron, en promedio, enriquecido para la vinculación en los conjuntos de datos ChIP, aunque no necesariamente fueron llamados como picos en los estudios ChIP. La mayoría de los sitios para un factor dado eran sitios lentos. Se especula que los sitios rápidos son representativos de los sitios de unión de factor de transcripción de alta afinidad, mientras que los sitios lentos representan loci transitoriamente muestreados durante el escaneo del sitio de unión. El obLa servación de dos clases de sitios de unión separados por la cinética de la segmentación de MNasa puede explicar la observación en muchos datos ChIP seq-datos de que un gran número de picos para un determinado factor con una bien establecida DNA vinculante especificidad no contienen un motivo consenso 29 : Formaldehído, realizada durante 10-15 minutos en la mayoría de los protocolos ChIP, puede capturar repetidamente interacciones transitorias o oportunistas de un factor con el genoma, dando lugar a la inflación de la señal. De hecho, la comparación de ChIP-exo y células vivas de imágenes sugiere que este es el caso [ 2] . Notablemente, no observamos una disminución tan dramática dependiente del tiempo en Mediator ChEC-seq señales 21 , con Mediator ChEC-Seq señal relativamente constante de 30 s a 20 min. Dadas estas observaciones, se recomienda realizar corta duración ChEC-seq para recuperar los sitios de alta confianza de unión.
Anticipamos que ChEC-seq se puede adaptar a no-levaduraSistemas. La concentración de calcio libre en células de mamífero no estimuladas es 50-300 nM 30 , 32 , muy por debajo del umbral para la activación eficiente de MNasa. El paso limitante para el establecimiento de ChEC-seq en los sistemas de metazoos es, por tanto, la generación de proteínas de fusión, que sigue siendo mucho más laborioso en metazoan que las células de levadura. Sin embargo, el marcado endógeno de los genes metazoarios ha sido enormemente facilitado por el advenimiento de la ingeniería del genoma basada en CRISPR 33 , por lo que esta limitación debe ser fácilmente superada. Alternativamente, las proteínas de fusión de MNasa podrían expresarse a niveles bajos a partir de plásmidos. Este enfoque ha sido bastante exitoso para DamID en Drosophila 34 , 35 y humanos 36 células y, por tanto, también podría facilitar ChEC-seq en metazoan células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Moustafa Saleh y Jay Tourigny por la lectura crítica del manuscrito y Steven Hahn y Steven Henikoff por su mentoría y apoyo durante el desarrollo de ChEC-seq y su aplicación al complejo Mediator. SG es apoyado por las concesiones de NIH R01GM053451 y R01GM075114 y GEZ es apoyado por fondos de la puesta en marcha de la universidad de Indiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
