Summary
هنا، نقدم بروتوكول لوصف استخدام نيوروتروفين 4 (NTF4) بشكل منهجي ومباشرة لإعادة تشكيل الجرذ الشيخوخة عضلات الحنجرة.
Abstract
ضعف الحنجرة في كبار السن هو سبب رئيسي للإعاقة، من اضطرابات الصوت إلى عسر البلع وفقدان ردود الفعل واقية مجرى الهواء. عدد قليل، إن وجد، توجد علاجات تستهدف ضعف العضلات الحنجرة المرتبطة بالعمر. وتشارك نيوروتروفينز في تعصيب العضلات والتمايز من تقاطعات العصبية والعضلية (نمجس). ويعتقد أن نيوروتروفينز تعزيز انتقال العصبي العضلي عن طريق زيادة الإفراج العصبي. تقاطعات العصبية والعضلية (نمجس) تصبح أصغر وأقل وفرة في الشيخوخة عضلات الحنجرة الفئران، مع أدلة على التعصيب الوظيفي. استكشفنا آثار NTF4 للاستخدام السريري في المستقبل باعتباره العلاجية لتحسين وظيفة في الشيخوخة عضلات الحنجرة البشرية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لتطبيق النظامية والحقن المباشر لل NTF4 للتحقيق في قدرة الشيخوخة الفئران العضلات الحنجرة لإعادة تشكيل ردا على تطبيق NTF4. في هذه الطريقة، تلقت الفئران إما NTF4 إما بشكل منهجي عبر oمضخة ضخية أو عن طريق الحقن المباشر من خلال طيات الصوتية. ثم تم تشريح عضلات الحنجرة واستخدامها للفحص النسيجي للمورفولوجيا والتعصيب المرتبط بالعمر.
Introduction
عضلات الحنجرة تتعاقد بسرعة وباستمرار، وهي عرضة للآثار السلبية للشيخوخة. ويعتقد أن هذا النشاط المستمر للمساهمة في مشاكل الصوت أو عسر البلع لوحظ في الأشخاص فوق 65 سنة من العمر 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 . تساهم العديد من الآليات الجزيئية و الفيزيولوجية المرضية في هذا الخلل المرتبط بالعمر. ويمكن أن تشمل هذه الآليات إعادة عرض الغشاء المخاطي للحنجرة، وضمور الألياف العضلية أو فقدان، وعدم تجديد الألياف العضلية أو ضمور الذي يسبب الركوع من طيات الصوتية وعدم القدرة على إغلاق المزمار 8 ، 9 ، 10 ، 11 . لا يوجد علاج طبي مؤكد في هذا الوقت يمكن أن كوممنع أو إعادة تأهيل هذه التغيرات المرتبطة بالعمر في هذه العضلات.
تعديل فعالية انتقال العصبية والعضلية يمكن أن تؤثر بشكل كبير الأداء الحركي. وتشمل عائلة نيوروتروفينز عامل نمو الأعصاب (نغف)، الدماغ المستمدة عامل نمو الأعصاب (بدف)، نيوروتروفين 3 (NTF3) و NTF4 12 ، 13 . وقد أظهرت نيوروتروفينز لتعديل فعالية متشابك 1 ، 4 . عامل نمو خلايا الكبد، وتحويل عامل النمو بيتا وعامل نمو الخلايا الليفية استخدمت مؤخرا في البشر لعلاج طية الصوتية تندب 15-17 . كما ينظم NTF4 فعالية نمج؛ الفئران تفتقر NTF4 تظهر تفكيكها نمجس 11 ، 18 ، 19 . هذه الدراسات تؤدي إلى آثار واعدة من العلاجر من الشيخوخة اضطرابات العضلات الحنجرة وإزالة التعصيب مع عوامل النمو.
العلاجات الحقن المباشر لأنسجة الطيات الصوتية ليست غير مسبوقة في البشر. على سبيل المثال، يتم استخدام الحقن المحلية من توكسين البوتولينوم حاليا كعلاج فعال لاضطرابات الحركة العصبية التي تؤثر على عضلات الحنجرة، مثل خلل النطق التشنجي والشلل العصبي الحنجري الثنائي المتكرر 20 ، 21 . حمض الهيالورونيك هيدروجيل هو آخر عن طريق الحقن، والذي يستخدم لعلاج شظية أضعاف شحذ و غلوتال قصور 22 ، 23 . حقن الحنجرة يمكن استخدامها لعلاج مجموعة متنوعة من اضطرابات الاتصالات 24 . هذه طرق الحقن المباشر عقد وعود لتحسين وظيفة الصوتية والبلع في الشيخوخة السكان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الذكور فيشر 344-براون النرويج الفئران في 6 و 30 شهرا من العمر لهذا البروتوكول. تم الحصول على الفئران من المعهد الوطني للشيخوخة مستعمرة القوارض. استخدمنا الفئران لهذه الدراسة لأن بنية حنجرة الفئران مماثلة لتلك التي من الإنسان، خدمة وظيفيا لحماية مجرى الهواء والتنوع أنواع محددة أجريت هذه الدراسة وفقا لسياسة فس بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها، وقانون رعاية الحيوان (7 أوسك وما يليها)؛ تمت الموافقة على بروتوكول استخدام الحيوان من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) من جامعة كنتاكي.
1. تخدير الفئران
- إعداد التخدير عن طريق خلط هيدروكلوريد الكيتامين (مخدر ديسوسياتيف) وهيدروكلوريد زيلازين (مهدئ ومسكن) في المياه المالحة مخزنة. تركيزات الكيتامين وزيلازين في الحل النهائي هي 100 ملغ / 8 ملغ لكل كيلوغراموزن الجسم على التوالي.
- حقن التخدير في الفئران عن طريق الإدارة داخل الصفاق باستخدام حقنة مع إبرة 25 G.
- تحديد أن الفئران هو تخدير بما فيه الكفاية من قبل معسر اصبع القدم أو القدم مع ملقط. إذا كان الفئران لا تتفاعل مع قرصة، ثم الجراحة يمكن أن تبدأ. إذا كان الفئران يتفاعل مع قرصة أخمص قدميه مع الانكماش أو تقلصات العضلات، ثم الانتظار 1-2 دقيقة وتكرار اختبار قرصة. إذا كان الفئران يتفاعل مرة أخرى، واستبدال الفئران مع حيوان جديد وتكرار الإجراء بدءا من الخطوة 1.2.
- تطبيق مرهم العيون لعيون الفئران، بعد الفئران غير متحرك، لمنع القرنيات من الجفاف.
2. زرع الاسموزي مضخة
- وضع بطني الفئران على منطقة الجراحية العقيم. إدارة ميلوكسيكام كدواء ما قبل التخدير. إدارة داخل الصفاق بجرعة 1-4 ملغم / كغم من وزن الجسم باستخدام حقنة مع إبرة 25 G.
- استخدام كليبرز لإزالة تقريباتيلي 1 "× 1" مربع من الفراء من الخلف من الرقبة، وحوالي 1 "الذيلية من الفضاء بين الكتفين.حلاقة أقرب إلى الجلد ممكن.
- رطب الظهر والرقبة مع التطهير الإيثانول (70٪).
- بعد الحلاقة، فرك الجانب الظهري من الرقبة مع 3 الدعك في الخلافة من اليود الكحول الانتهاء مع الكحول.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الفئران عن طريق وضعها على وسادة التدفئة تعيين إلى 34 درجة مئوية.
- ملء معقمة معقمة مضخات الاسموزي مع إما 50 ميكرولتر من NTF4 أو المالحة لعلاج NTF4 النظامية ( الشكل 1 ).
- استخدام مشرط لجعل شق أفقي حوالي 2 سم واسعة من خلال الجلد، فقط الجمجمة إلى الفضاء بين كتف. رفع الحافة الخلفية من شق مع ملقط بيد واحدة أثناء إدخال غيض من مرقئ ودفع بلطف الخلفي إلى شق.
- بعد غيض من مرقئ حوالي 2 سم جرانيال إلى شق، وفتح مقابض على مرقئ، وتوسيع النصائح لتشكيل جوفاء "جيب" تحت الجلد إلى موقع شق. وسوف يكون هذا الموقع التنسيب للمضخة.
- توجيه منفذ تسليم مضخة نهاية أولا على الإدراج لتقليل أي تفاعل من NTF4 وشفاء موقع شق الجيب.
- تسليم 50 ميكرولتر من NTF4 المالحة إما 7 14 يوما. تلقت مجموعة 7 أيام 6.72 ملغ / يوم من NTF4 لجرعة إجمالية قدرها 47.04 ملغ. تلقت المجموعة 14 يوما 6.72 ملغ / يوم لجرعة إجمالية قدرها 94.08 ملغ من NTF4 25 .
- استخدام 5-0 النايلون خياطة الموضوع، مرقئ وملقط لإغلاق شق مصنوعة لوضع المضخة.
- مراقبة الفئران لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لأنها تتعافى من التخدير. وتشمل معايير إكمال الرصد الحيوان أن تصبح نشطة، والانتقال حول القفص، ومياه الشرب، وبدء الأنشطة العادية الأخرى مثل الاستمالة.
- مراقبة الحيوانات يومياللأسبوع الأول من خلال مراقبة الشفاء من الموقع الجراحي، التغذية الطبيعية واستهلاك المياه وتمرير البول / البراز، وأي علامات السلوكية غير طبيعية من التوتر، والألم، أو غيرها من المضاعفات بعد الجراحة.
- إذا كان الفئران يبدو في الألم أو الضيق، وتوفير الفئران مع 5 ملغ / كغ حقن تحت الجلد من كاربروفين مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة تصل إلى 5 أيام لتخفيف الألم.
- إذا كان يبدو أن هناك عدوى، استشارة الطبيب البيطري أن يستتبع أن الجرح يشفي بشكل صحيح.
- اعتمادا على المجموعة التجريبية التي الفئران في، إزالة 5-0 النايلون خياطة 7-10 أيام بعد الجراحة لمنع تهيج من موضوع.
3. التخدير من الفئران للحقن المباشر
- حجب الطعام من الفئران في الليلة السابقة للإجراء. وهذا يضمن عدم وجود طعام لمنع المنظار أو حقن إبرة.
- وزن الفئران وإعداد أسيبرومازين 1-2 ملغم / كغم من وزن الجسم. حقن العضل (موقع إم هواليسار، ثيروريتينواد، موسكل).
- وضع الفئران في مربع التعريفي. تثبيط التخدير في مربع تحريض مع 5٪ إيسوفلوران و 1 لو 2 .
- نقل الفئران إلى مخروط الأنف مع 2٪ إيسوفلوران و 600 مل O 2 .
- تحديد أن الفئران هو تخدير بما فيه الكفاية من قبل معسر اصبع القدم أو القدم مع ملقط. إذا كان الفئران لا تتفاعل مع قرصة، ثم يمكن أن يبدأ بروتوكول الحقن. إذا كان الفئران يتفاعل مع قرصة أخمص قدميه مع الانكماش أو تقلصات العضلات، ثم الانتظار 1-2 دقيقة وتكرار اختبار قرصة. إذا كان الفئران يتفاعل مرة أخرى، واستبدال الفئران مع حيوان جديد وتكرار الإجراء بدءا من الخطوة 3.4.
4. الحقن المباشر والتصور
- مكان أعدت معقمة 50 ميكرولتر جرعات تحتوي على NTF4 أو المالحة في حمام H 2 O تعيين إلى 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الحقن.
- وضع الفئران في وضع ضعيف ومستلق على منصة شبكي ( الشكل 2 ). سوسبيند الفئران في الموقف متكأ من القواطع الأمامية الأمامية عن طريق سلك دليل حبلا عبر الجزء العلوي من المنصة.
- إرفاق 50 ملم، 30 المقياس، 100 حقنة ميكرولتر إلى 1.9 ملم، 30 ° المنظار الجيوب الأنفية ( الشكل 3 ).
ملاحظة: يتم إرفاق الجمعية حقنة عن طريق الرقصة التي تحمل قنية بقوة إلى الجدار الخارجي للمنظار. المنظار يسمح لتصور الطيات الصوتية وتوجيه الحقنة داخل الفم. يتم تعديل الموقف من طرف قنية قبل كل حيوان للتأكد من أن طرف هو واضح وواضح بوضوح عن طريق عرض بالمنظار ( الشكل 4 ). - استخدام زوج من المطاط ذات الرؤوس من ملقط لتوسيع اللسان ونقله أفقيا. بعد ذلك، أدخل منظار البلاستيك للحفاظ على المباح الفموي. جعل المنظار من 5 مل البلاستيك حقنة برميل التي يتم قطعها بطول 1.5 إلى 2 سم، مع حواف قطع عززت ومصقول على نحو سلس.
- إيقاف الأضواء في روم وإرفاق مصدر ضوء الهالوجين إلى المنظار. قم بتشغيل مسجل الفيديو لالتقاط اإلجراء.
- تزج نهاية البعيدة من المنظار في الماء الدافئ لبضع ثوان للحد من تطوير التكثيف على طرف الزجاج عند إدراجها في فم الفئران.
- باستخدام ردود الفعل المرئية من الشاشة، وتوجيه بعناية الإبرة إلى منطقة طية الصوتية اليسرى.
- الوقت حقن الحل مع مرحلة الشهيق من دورة التنفس الحيوانات للوصول الكامل طية الصوتية. خلال مرحلة الشهيق من التنفس، يتم عرض طية الصوتية تماما.
- مرة واحدة في أضعاف الصوتية واضحة تماما، وإدراج الإبرة في الغدة الدرقية اليسرى، وجدت الوحشي إلى حافة وسطي بيضاء من أضعاف الصوتية. مع الإبرة في مكان، وتقديم حقن عن طريق الاكتئاب من حقنة.
- إيقاف مصدر ضوء الهالوجين على المنظار ومشغل الفيديو، والعودة مرة أخرى على روأوم أضواء.
- عودة الفئران إلى قفص المنزل ومكان على وسادة التدفئة.
- السماح للفئران لاسترداد قبل إزالة من وسادة التدفئة. استبدال الطعام والماء في القفص.
- مراقبة الفئران لمدة 7 أيام بعد الحقن ثم الموت ببطء. إزالة الحنجرة ل كريوسكتيونينغ 24 .
5. الموت الرحيم من الفئران
- تخدير الفئران مع هيدروكلوريد الكيتامين وهيدروكلوريد زيلازين (100 ملغ / 8 ملغ لكل كجم من وزن الجسم حقن الحقن داخل الصفاق).
- الموت ببطء من قبل إكسينغيناتيون بعد بضع الصدر وسطي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفئران الموت الرحيم بعد 2 أسابيع من ضخ الاسموزي ضخ أو 1 أسبوع بعد الحقن المباشر من NTF4. تم حصاد الحنجرة، وضعت في كريوبروتكتانت (30٪ السكروز و 70٪ الفوسفات مخزنة المالحة) ومن ثم مقسمة تسلسلي في عرض 10- ميكرون مع ناظم البرد. تتأثر عضلات الحنجرة الشيخوخة عن طريق إدارة NTF4 25 . بالإضافة إلى الفئران الصغار والكبار، قارنا الجانب حقن وغير حقن للعضلات الدرقية. عادة ما نرى تغيير في حجم الألياف مع التقدم في السن، والذي يختلف استنادا إلى طريق إدارة NTF4 ( الشكل 5 ). ويلاحظ أيضا أقل من التليف نوعيا بعد العلاج. النسبة المئوية للألياف المزالة ينخفض مع تطبيق النظامية ومباشرة من NTF4 في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين ( الشكل 6 ). كمية من نمجس أيضا يزيد ( الشكل 7 ). أهمية هذه الزيادة دي يمتد على طول العلاج أو طريق الإدارة.
الشكل 1: صورة الممثل للمضخة التناضحي. بعد ملء مضخة مع NTF4، يتم إدخال مشرف تدفق في الجسم الرئيسي لختم المضخة.
الشكل 2: منصة لإجراءات الحقن. يتم وضع الفئران في موقف ضعيف على المنصة وعلقت من قبل القواطع العلوية الأمامية عبر سلك دليل شنت إلى الجزء العلوي من المنصة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
إايلز / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
الشكل 3: صورة ممثل المحقنة. ملء حقنة مع NTF4 وخليط ملحي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إجراء الحقن. ( A ) يقترن حقنة إلى 19.9 مم 30 ° المنظار (هو مبين). (B) يتم فحص الضوء الضوئي للتأكد من وجود ضوء لهذا الإجراء. ( C ) الفيديو في الوقت الحقيقي يضمن أن يتم توجيه الإبرة إلى المكان الصحيح.
الشكل 5: التغيرات في حجم الألياف والمورفولوجيا. ممثل انهماتوكسيلين و يوزين ملطخة أقسام النظامية NTF4 7 أيام تعامل (يمين) وغير المعالجة (اليسرى) عضلات الدرقي في 30 شهرا من العمر 26 ، 27 ، 28 . هناك زيادة في حجم الألياف من السيطرة إلى الحيوانات المعالجة. العلاج مع NTF4 يغير حجم الألياف 30-مو إلى أن أصغر من العمر 6 أشهر الحيوان القديم. * p <0.05 مقابل 30 شهرا (تم التقاط الصور في 40X التكبير؛ شريط مقياس = 25 ميكرون، P <0.001). السهام في أعلى الصورة تشير إلى منطقة التليف. وهناك أيضا نقص نوعي من التليف في الحيوانات المعالجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التغيرات في الداخليةفاتيونس مع NTF4 العلاج. أقسام الملون Nav1.5 الملون من النظامية NTF4 14 يوما تعامل (يمين) وغير المعالجة (اليسرى) عضلات الدرقي في 30 شهرا من العمر (تم التقاط الصور في التكبير 40X؛ شريط مقياس = 25 ميكرون) 29 . هناك انخفاض في إزالة التعصيب مع التقدم في السن من قبل نا v 1.5 وضع العلامات (الأخضر). اللوحة اليسرى هو ممثل نا الخامس 1.5 (الأخضر) و فالويدين، للدلالة على الألياف (الأحمر) أقسام ملطخة من عضلات ثيروريتينويد غير المعالجة، يتم التعامل مع اللوحة اليمنى العضلات. إدراج الأخضر هو نا v 1.5 تلطيخ وحدها.
الشكل 7: التغيرات في نمجس مع العلاج NTF4. صور مضان المجهر ممثل نمجس من النظامية NTF4 14 يوما علاج عضلات العضلة الحلقانية من الحيوانات المختلفة المسمى مع α-بنغاروتوكسين (الأخضر) وفالويدين (الأحمر) تبين أن عدد نمج يزيد مع العلاج NTF4 في 30 شهرا (شريط مقياس = 25 ميكرون)، (P <0.001) 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عضلات الحنجرة عرضة للآثار غير المواتية للشيخوخة. وقد أظهرت الدراسات السابقة التغيرات في عضلات الحنجرة الشيخوخة التي تشمل التغيرات في حجم الألياف، العدد الإجمالي للألياف، والقدرة التجدد، حجم نمج وكمية التغييرات، بالإضافة إلى الاختلافات في وظيفة مقلص والتحولات الإسوية ميوسين 4 ، 11 ، 27 ، 30 ، 31 . الشيخوخة العضلات الحنجرة يمكن تغييرها من خلال تطبيق نيوروتروفينز. ويمكن قياس هذه التغييرات بسهولة. ولذلك، والعضلات الحنجرة الفئران توفر نموذجا مفيدا لدراسة آثار الشيخوخة، والأمراض الصوتية / اضطرابات. دراسة هذه العضلات قد تساعد أيضا على تطوير التدخلات أو العمليات الوقائية في الشيخوخة الإنسان.
لدينا طريقة التطبيق النظامية أو المباشرة من NTF4 تنتج استجابة إعادة عرض في الشيخوخة الحنجرة الفئرانالعضلات. هذا يدل على أن نيوروتروفينز قد يكون العلاجية المحتملة على الشيخوخة المرتبطة ضعف العضلات. التطبيق المباشر لل نيوروتروفينز يمكن بسهولة أن تترجم إلى نموذج الإنسان من الشيخوخة الصوتية على الرغم من ناقلات الحقن 25 .
هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها عند استخدام بروتوكول الحقن. أولا، يجب توخي الحذر لمنع خدش وإصابة الأنسجة الرخوة حول الدهليز الحنجري النظر في طرف المنظار لديه إبرة حادة تعلق. ثانيا، توقيت حركة طرف إبرة في الحنجرة خلال مرحلة الشهيق من دورة التنفس الحيوانات يأخذ الممارسة لتوقيت بدقة الحقن. ثالثا، تأكد من أن طرف الإبرة مرئية بوضوح قبل محاولة الإجراء من خلال الفحص البصري للجهاز على شاشة الكمبيوتر مسبقا. رابعا، الاحترار غيض من المنظار في الماء الساخن لبضع ثوان هو خطوة هامة للتأكد من أن الضباب من إندويتم تجنب نطاق الطرف. وأخيرا، فمن المهم أيضا لصوم الفئران في الليلة قبل أي إجراء تحديد النطاق. إذا لم يتم حجب الطعام فمن المرجح جدا أنها سوف لا تزال لديها بقايا الطعام في البلعوم، الأمر الذي يجعل إجراء الحقن من المستحيل تقريبا لأداء. يجب فحص الفئران للحصول على علامات الجفاف يوميا ويزن للتأكد من عدم وجود فقدان الوزن كبيرة (أكبر أن 10٪ من وزن الجسم).
خطوتين حاسمتين في تطوير البروتوكول كانت ربط المحقنة بالمنظار، واستخدام منظار الفم. وكان ترسيخ الشركة من الجمعية حقنة ضرورية لتسهيل عملية بيد واحدة لإدراج نطاق والحقن. وبالنظر إلى أهداف الدراسة، في غياب التصور المباشر لتوجيه حقن الطية الصوتية، لا يمكن أن تتحقق التجربة. بالإضافة إلى ذلك، اعتبر إنشاء منظار الفم أهمية لمنع اللسان من التحرك والحفاظ على ثe إبيغلوتيس مفتوح طوال العملية.
ذهبت طريقة الحقن الموجهة بصريا تحت ذهبت عدة جولات من التعديل ترتبط في الغالب لإيجاد الوسائل المثلى لترسيخ آمن حقنة وإبرة إلى المنظار. بعد اختبار عدة أشكال مختلفة من المواد اللاصقة الشريط، وجد أن الشريط الرياضي مرنة المتاحة تجاريا كان أفضل وسيلة لترسيخ حقنة إلى الجسم المنظار.
وكان أكبر تقييد لطريقة الحقن الموجهة بصريا لا تتعلق الأجهزة، وإنما إلى الحاجة إلى وجود البلعوم براءات الاختراع والمجاري الهوائية. على الرغم من أن تقييد الغذاء لمدة 24 ساعة قبل الإجراء حل معظم هذه المسألة، فإن الفئران استيعاب أي شيء في أقفاصهم، بما في ذلك الفراش والبراز. عندما حدث هذا، كان هناك حلين: (1) تأجيل الحقن حتى يزيل الحيوان البلعوم بهم بشكل طبيعي، أو (2) محاولة لإزالة انسداد يدويا باستخدام ملقط. كان لدينا الخبرةه، أن الأول كان الخيار الأفضل لأنه يقلل من خطر الإصابة المحتملة لمنطقة البلعوم الحيوان.
وبالنظر إلى الجدة من هذا البروتوكول والحاجة إلى حقن مباشرة أضعاف الصوتية مع المجمع، لا توجد أساليب أخرى يمكن الاعتماد عليها. ونظرا لصغر حجم نظام الحنجرة الحيوانات، والحقن الموجهة بصريا من خلال منطقة الفم والبلعوم في السبيل الوحيد لضمان التنسيب الصحيح والمتسق للمجمع في الحيوان الحي. وكانت الوسيلة الوحيدة الوحيدة لحقن الطية الصوتية مباشرة هي محاولة القيام بذلك من وضع خارجي من خلال الجلد والغضروف في الحنجرة. على الرغم من أن يتم تنفيذ هذه الطريقة بنجاح في البشر الذين يخضعون لعلاج توكسين البوتولينوم للتخفيف من عسر الهضم الحنجري، وأساليب الحقن عبر الجلد ليست مجدية في الحيوانات الصغيرة.
تقنية قوية ويمكن استخدامها ليس فقط حقن طية الصوتية، ولكن لمواقع الحقن داخلالبلعوم والمناطق الشفوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لرصد البصرية بسيطة من الحيوانات البلعوم ومنطقة الحنجرة عن طريق إزالة حقنة.
وباختصار، فإن هذا الأسلوب الحقن هو وسيلة جديدة لدراسة الآليات البيولوجية المتعلقة علاج الشيخوخة ذات الصلة الاختلالات الصوتية في البشر. هذا الأسلوب أيضا لديه القدرة على تطبيقها على نماذج الأمراض الأخرى التي تؤثر على التعبير، وظيفة الصوتية، والاتصالات، والبلع في البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصمم وغيرها من اضطرابات الاتصالات (R21DC010806 إلى كام و جسس و R01DC011285 إلى كام).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
