Summary
Her præsenterer vi en protokol for at beskrive brugen af neurotrophin 4 (NTF4) systemisk og direkte til ombygning af rotte aldrende laryngeale muskler.
Abstract
Laryngeal dysfunktion hos ældre er en væsentlig årsag til handicap, fra stemmeforstyrrelser til dysfagi og tab af luftvejsbeskyttelsesreflekser. Få, hvis nogen, findes terapier, der målretter aldersrelateret larynx muskel dysfunktion. Neurotropiner er involveret i muskelinnervation og differentiering af neuromuskulære krydsninger (NMJ'er). Det antages, at neurotrophiner forbedrer neuromuskulær transmission ved at øge neurotransmitterfrigivelsen. De neuromuskulære krydsninger (NMJ'er) bliver mindre og mindre rigelige i ældning af rotte laryngeale muskler med evidens for funktionel denervation. Vi undersøgte virkningerne af NTF4 til fremtidig klinisk anvendelse som terapeutisk for at forbedre funktionen i aldrende humane larynxmuskler. Her giver vi den detaljerede protokol til systemisk anvendelse og direkte indsprøjtning af NTF4 for at undersøge evnen til ældning af rotte laryngeal muskel til remodel som svar på NTF4 applikation. I denne metode modtog rotter enten NTF4 enten systematisk via oSmotisk pumpe eller ved direkte indsprøjtning gennem vokalfoldene. Laryngeale muskler blev derefter dissekeret og anvendt til histologisk undersøgelse af morfologi og aldersrelateret denervation.
Introduction
Laryngeale muskler samler sig hurtigt og konsekvent og er sårbare overfor de skadelige virkninger af aldring. Denne konstante aktivitet antages at bidrage til talproblemer eller dysfagi observeret hos personer over 65 år 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Flere molekylære og patofysiologiske mekanismer bidrager til denne aldersrelaterede dysfunktion. Disse mekanismer kan omfatte remodeling af larynxslimhinde, muskelfiberatrofi eller tab, mangel på regenerering af muskelfibre eller atrofi, der forårsager bøjning af vokalfoldene og manglende evne til glottislukning 8 , 9 , 10 , 11 . Der er ingen bevist medicinsk terapi på dette tidspunkt, som kan comForhindre eller rehabilitere disse aldersrelaterede ændringer i disse muskler.
Modulation af effektiviteten af neuromuskulær transmission kan i høj grad påvirke neuromotorisk ydeevne. Familien af neurotrophins indbefatter nervevækstfaktor (NGF), hjerneafledt nervevækstfaktor (BDNF), neurotrophin 3 (NTF3) og NTF4 12 , 13 . Neurotropiner har vist sig at modulere synaptisk virkning 1 , 4 . Hepatocytvækstfaktor, transformerende vækstfaktor beta og fibroblastvækstfaktor er for nylig blevet anvendt til mennesker til behandling af vokal foldearrring 15-17 . NTF4 regulerer også NMJ effektivitet; Mus mangler NTF4 viser disassembled NMJs 11 , 18 , 19 . Disse undersøgelser fører til lovende virkninger af behandlereT af aldrende larynx muskelforstyrrelser og denervation med vækstfaktorer.
Direkte injektionsbehandling til vævene i vokalfoldene er ikke hidtil uset hos mennesker. Lokale injektioner af botulinumtoksin anvendes for tiden som en effektiv behandling af neurologiske bevægelsesforstyrrelser, som påvirker musklerne i strubehovedet, såsom spasmodisk dysfoni og bilateral tilbagevendende larynx-nerveslamning 20 , 21 . Hyaluronsyre hydrogel er en anden injicerbar, som bruges til at behandle vokal fold skræmme og glottisk insufficiens 22 , 23 . Injektionslaryngoplastik kan bruges til at behandle en række kommunikationsforstyrrelser 24 . Disse direkte injektionsmetoder holder løfte om at forbedre vokalfunktionen og sluge i aldrende befolkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brug mandlige Fischer 344-Brown Norway rotter ved 6 og 30 måneder for denne protokol. Rotter blev opnået fra National Institute of Aging gnaverkoloni. Vi anvendte rotter til denne undersøgelse, fordi strukturen af rotte strubehovedet ligner den hos det menneskelige, funktionelt tjenende til luftvejsbeskyttelse og artsspecifikke vokaliseringer. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med PHS-politikken for human pleje og brug af laboratoriedyr, NIH-vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr og dyrevelfærdsloven (7 USC et seq.); Protokollen om dyreforsøg blev godkendt af University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Anæstesi af rotter
- Forbered anæstetika ved at blande ketaminhydrochlorid (dissociativ bedøvelse) og xylazinhydrochlorid (beroligende og smertestillende) i pufret saltopløsning. Koncentrationerne af ketamin og xylazin i den endelige opløsning er 100 mg / 8 mg pr. KgKropsvægt henholdsvis.
- Injicer anæstetika i rotten ved intraperitoneal administration ved hjælp af en sprøjte med en 25 G nål.
- Bestem, at rotten er tilstrækkeligt bedøvet ved at klemme tå eller fod med pincet. Hvis rotten ikke reagerer på klemmen, kan kirurgi begynde. Hvis rotten reagerer på tåhinde med refleks- eller muskelkontraktioner, vent derefter 1-2 minutter og gentag knivprøven. Hvis rotten reagerer igen, skal du erstatte rotten med et nyt dyr og gentage proceduren, der begynder fra trin 1.2.
- Påfør oftalmisk salve til rotteens øjne, efter at rotten er immobil, for at forhindre hornhinden i at tørre ud.
2. Implantation af osmotisk pumpe
- Placer rotten ventral på det aseptiske kirurgiske område. Administrer meloxicam som præanestetisk medicin. Administrer intraperitonealt i en dosis på 1-4 mg / kg legemsvægt ved hjælp af en sprøjte med en 25 G nål.
- Brug clippers til at fjerne en approximaTely 1 "x 1" kvadrat pels fra ryggen af nakke og ca. 1 "caudal mellemrum mellem skuldre. Barber så tæt på huden som muligt.
- Våd ryggen og halsen med desinficerende ethanol (70%).
- Efter barbering, skrub det dorsale aspekt af halsen med 3 skrubber efterfulgt af iod-alkohol efterbehandling med alkohol.
- Opretholde rottekropstemperaturen ved at placere den på en varmepude sat til 34 ° C.
- Fyld aseptisk fremstillede osmotiske pumper med enten 50 μl NTF4 eller saltvand til systemisk NTF4-behandling ( Figur 1 ).
- Brug en skalpel til at gøre et vandret snit ca. 2 cm bredt gennem huden, bare kranial til rummet mellem scapulae. Løft den bageste kant af snittet med tænger med en hånd, mens du sætter spidsen af hæmostater og forsigtigt skubber posterior til snittet.
- Efter spidsen af hæmostaterne er ca. 2 cm cLøbe til snittet, åbne håndtagene på hæmostaterne, udvide spidserne til at danne en hul "lomme" subkutan til snitstedet. Dette bliver placeringsstedet for pumpen.
- Orienter pumpeudleveringsportalens ende først efter indsættelse for at minimere enhver vekselvirkning af NTF4 og helingen af lommens snitsted.
- Lever 50 μL NTF4 saltvand i enten 7 14 dage. 7-dagesgruppen modtog 6,72 mg / dag NTF4 for en samlet dosis på 47,04 mg. 14-dagesgruppen modtog 6,72 mg / dag for en total dosis på 94,08 mg NTF4 25 .
- Brug 5-0 nylon sutur tråd, hæmostater og tænger til at lukke snittet lavet til pumpe placering.
- Overhold rotterne i mindst 30 minutter, da de vender tilbage fra anæstesi. Kriterier for afslutning af overvågningen inkluderer dyret bliver aktivt, flytter om buret, drikkevand og begynder andre normale aktiviteter som pleje.
- Overvåg dyr dagligtI den første uge ved at observere helingen af det kirurgiske område, normalt foder og vandforbrug og passering af urin / afføring og eventuelle unormale adfærdsmæssige tegn på stress, smerte eller andre postoperative komplikationer.
- Hvis rotten ser ud til at være i smerte eller nød, skal rotten give en 5 mg / kg subkutan injektion af carprofen en gang hver 24 time i op til 5 dage for at lindre smerter.
- Hvis der ser ud til at være en infektion, skal du konsultere en dyrlæge for at sikre, at såret heler ordentligt.
- Afhængig af hvilken eksperimentel gruppe rotten er i, skal du fjerne 5-0 nylon suturen 7-10 dage efter operationen for at forhindre irritation fra tråden.
3. Anæstesi af rotter til direkte injektion
- Hold mad fra rotterne natten før proceduren. Dette sikrer, at der ikke er mad til at blokere endoskopet eller injektionsnålen.
- Væg rotter og forberede acepromazin 1-2 mg / kg legemsvægt. Injicer intramuskulært (IM placering erVenstre thyroarytenoid muskel).
- Placer rotten i induktionsboksen. Inducer anæstesi i induktionsboksen med 5% isofluran og 1 LO2.
- Flyt rotten til en næse kegle med 2% isofluran og 600 ml O2.
- Bestem, at rotten er tilstrækkeligt bedøvet ved at klemme tå eller fod med pincet. Hvis rotten ikke reagerer på klemmen, kan injektionsprotokollen starte. Hvis rotten reagerer på tåhinde med refleks- eller muskelkontraktioner, vent derefter 1-2 minutter og gentag knivprøven. Hvis rotten reagerer igen, skal du erstatte rotten med et nyt dyr og gentage proceduren, der begynder fra trin 3.4.
4. Direkte injektion og visualisering
- Anbring aseptisk fremstillede 50 μl doser indeholdende NTF4 eller saltvand i et H20 bad indstillet til 25 ° C i 30 minutter før injektion.
- Placer rotten i en liggende og tilbagelænet stilling på en plexiglasplatform ( figur 2 ). susPend rotten i den tilbagelagte kropsholdning fra deres frontal topforhøjninger via en styretråd spændt over toppen af platformen.
- Vedhæft en 50 mm, 30 gauge, 100 μL sprøjte til et 1,9 mm, 30 ° sinus endoskop ( figur 3 ).
BEMÆRK: Sprøjteaggregatet er fastgjort via en jig, der holder kanylen fast til endoskopets ydervæg. Endoskopet muliggør visualisering af vokalfoldene og styringen af sprøjten intraoralt. Kanylspidsens position justeres før hvert dyr for at sikre, at spidsen er helt og tydeligt synlig via endoskopisk visning ( figur 4 ). - Brug et gummipippet par tang for at udvide tungen og bevæge den sideværts. Herefter indsættes et plastikspekulum til opretholdelse af oral patency. Lav spekulumet fra en 5 ml plast sprøjte tønde, der er skåret i en længde på 1,5 til 2 cm, med skærekanterne afbøde og poleret glat.
- Sluk lysene i rooM og vedhæft en halogen lyskilde til endoskopet. Tænd videooptageren for at indlæse proceduren.
- Sænk den distale ende af endoskopet i varmt vand i nogle få sekunder for at minimere udviklingen af kondens på glasspidsen, når den sættes ind i munden af rotten.
- Brug visuel tilbagemelding fra skærmen, før nålen forsigtigt til området for den venstre vokalfold.
- Tid indsprøjtningen af opløsningen med inspirationsfasen af dyrets åndedrætcyklus for fuldt adgang til vokalfolden. Under inspirationsfasen af åndedræt er vokalfoldet fuldt eksponeret.
- Når vokalfoldet er helt synligt, indsæt nålen i venstre thyroarytenoid, der findes sideværts til den hvide medialkant af vokalfoldet. Med nålen på plads, lever injiceren gennem sprøjtens depression.
- Sluk halogen lyskilden på endoskopet og videoafspilleren og vend tilbage på roOm lys.
- Ret rotten til sit hjem bur og sæt på en varmepude.
- Lad rotten gendannes før fjernelse fra varmepuden. Udskift mad og vand i buret.
- Overvåg rotter i 7 dage efter injektionen og derefter euthanize. Fjern laryngerne til kryosektion 24 .
5. Euthanisering af rotter
- Bedøve rotter med ketaminhydrochlorid og xylazinhydrochlorid (100 mg / 8 mg pr. Kg legemsvægt injiceret intraperitoneal injektion).
- Euthanize ved exsanguination efter en medial thoracotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotterne blev euthaniseret efter 2 uger med osmotisk pumpeinfusion eller 1 uge efter direkte injektion af NTF4. Larynger blev høstet, anbragt i kryobeskyttelsesmiddel (30% saccharose og 70% phosphatpufret saltopløsning) og derefter serielt snittet i 10 μm bredder med en kryostat. Aldring i larynx muskler påvirkes af administration af NTF4 25 . Ud over den unge og gamle rotte sammenlignede vi den injicerede og ikke-injicerede side af thyroarytenoidmusklerne. Typisk ses vi en ændring i fiberstørrelsen med alderen, som varierer afhængigt af administrationsvejen for NTF4 ( Figur 5 ). Mindre fibrose observeres også kvalitativt efter behandling. Procenten af denerverede fibre falder med systemisk og direkte anvendelse af NTF4 hos alderen rotter ( Figur 6 ). Mængden af NMJ øges også ( figur 7 ). Betydningen af denne stigning de Afhænger af længden af behandlingen eller indgivelsesvejen.
Figur 1: Repræsentativ billede af osmotisk pumpe. Efter påfyldning af pumpen med NTF4 indsættes flow moderator i hovedlegemet for at forsegle pumpen.
Figur 2: Platform til injektionsprocedure. Rotten er anbragt i en liggende stilling på platformen og suspenderet af de forreste øvre snitere via en føringstråd monteret på toppen af platformen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
Figur 3: Repræsentativt billede af sprøjte. Fyld sprøjten med NTF4 og saltopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Injektionsprocedure. ( A ) Sprøjten er koblet til et 19,9 mm 30 ° endoskop (vist); (B) Det optiske lys kontrolleres for at sikre, at der er lys for proceduren; ( C ) Videoen i realtid sikrer, at nålen styres til den rigtige placering.
Figur 5: Ændringer i fiberstørrelse og morfologi. Repræsentant hanMatoxylin og eosinfarvede sektioner af systemisk NTF4 7-dages behandlet (højre) og ubehandlede (venstre) thyroarytenoidmuskler ved 30 måneders alder 26 , 27 , 28 . Der er en stigning i fiberstørrelse fra kontrol til behandlede dyr. Behandling med NTF4 ændrer 30-mo-fiberstørrelsen til en yngre 6 måneder gammel dyr. * P <0,05 mod 30 måneder (billeder blev fanget ved 40X forstørrelse; Skala bar = 25 μm, P <0,001). Pile i det øverste billede peger på et område af fibrose. Der er også et kvalitativt fald i fibrose hos de behandlede dyr. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Ændringer i InnerVationer med NTF4 behandling. Repræsentative Nav1.5-farvede sektioner fra systemisk NTF4 14-dages behandlet (højre) og ubehandlede (venstre) thyroarytenoidmuskler ved 30 måneders alder (billeder blev fanget ved 40X forstørrelse; Skalbjælke = 25 μm) 29 . Derervation er en reduktion af denervation med alderen ved Na v 1.5 mærkning (grøn). Venstre panel er repræsentativt Na v 1.5 (grøn) og phalloidin, for at betegne fibre (rød) farvede sektioner fra ubehandlede thyroarytenoide muskler, behandles højre panel muskler. Grøn indsats er Na v 1.5 farvning alene.
Figur 7: Ændringer i NMJ'er med NTF4 behandling. Repræsentative fluorescensmikroskopiebilleder af NMJ'er fra systemiske NTF4 14-dages behandlede tyroarytenoid muskelafsnit fra forskellige dyr mærket med a-bungarotoxin (grøn) ogPhalloidin (rød), der viser, at NMJ-tallet stiger med NTF4-behandling efter 30 måneder (Skalbjælke = 25 μm), (P <0,001) 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laryngeale muskler er sårbare overfor de ugunstige virkninger af aldring. Tidligere undersøgelser har vist ændringer i aldring i laryngeale muskler, der omfatter ændringer i fiberstørrelse, totalt antal fibre, regenerativ evne, NMJ størrelse og mængdeændringer, ud over variationer i kontraktil funktion og myosin isoformskift 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . Aging laryngeal muskel kan ændres ved anvendelse af neurotrophins. Disse ændringer kan let måles. Derfor giver rotte laryngeale muskler en nyttig model til at studere virkningerne af aldring og vokalsygdomme / lidelser. Undersøgelsen af disse muskler kan også bidrage til at udvikle interventioner eller beskyttelsesprocesser i det aldrende menneske.
Vores metode til systemisk eller direkte anvendelse af NTF4 producerer et remodeling svar i aldring rotte laryngealmuskler. Dette demonstrerer, at neurotrophiner kan have terapeutisk potentiale på aldringsrelateret muskel dysfunktion. Den direkte anvendelse af neurotrophins kan let oversættes til den menneskelige model af vokal aldring, selvom injektionsvektorer 25 .
Der er mange faktorer at overveje, når du bruger injektionsprotokollen. For det første skal man sørge for at forhindre ridser og beskadigelse af blødt væv omkring laryngealvestibulen i betragtning af endoskopets spids har en skarp nål fastgjort. For det andet tager timing af nålespidsens bevægelse ind i strubehovedet under inspirationsfasen af dyrets åndedrætscyklus praksis for at præcis tide injektionen. For det tredje skal du sikre dig, at nålespidsen er tydelig synlig, inden du forsøger proceduren ved forudgående at inspicere apparatet på computerskærmen. For det fjerde er opvarmning af tipet af endoskopet i varmt vand i nogle få sekunder et vigtigt skridt for at sikre, at fogning af endoenOmfangstips undgås. Endelig er det også vigtigt at fastholde rotten natten før en scoping procedure. Hvis mad ikke holdes tilbage, er det højst sandsynligt, at de stadig vil have madrester i svælget, hvilket gør injektionsproceduren næsten umulig at udføre. Rotter skal inspiceres for tegn på dehydrering dagligt og vejes for at sikre, at der ikke er nogen signifikant vægttab (større end 10% legemsvægt).
To kritiske trin i udviklingen af protokollen var fastgørelsen af sprøjten til endoskopet og brugen af et oralt spekulum. Fast forankring af sprøjteaggregatet var nødvendig for at lette enhændig operation for indføring og indsprøjtning af indslag. I betragtning af målene med undersøgelsen kunne eksperimentet ikke have været realiseret i mangel af direkte visualisering for at styre indsprøjtningen af vokalfoldet. Desuden blev oprettelsen af et mundtligt spekulum anset for vigtigt for at forhindre tungen i at bevæge sig og at opretholde thE epiglottis åben igennem hele proceduren.
Den visuelt styrede injektionsmetode under gik adskillige runder af modifikation mest relateret til at finde de optimale midler til sikkert at forankre sprøjten og nålen til endoskopet. Efter at have testet flere forskellige former for tapeklæbemidler blev det konstateret, at kommercielt tilgængeligt elastisk atletisk tape var det bedste middel til at forankre sprøjten til endoskopkroppen.
Den største begrænsning af den visuelt styrede injektionsmetode var ikke relateret til instrumentering, men snarere til behovet for at have patentfalsk og luftvej. Selvom begrænsning af mad i 24 timer før proceduren løste det meste af dette problem, vil rotter indtage noget i deres bur, herunder sengetøj og afføring. Når dette skete, var der to løsninger: (1) udsætte injektionen, indtil dyret rydder deres pharynx naturligt, eller (2) forsøger at fjerne blokering manuelt ved hjælp af pincet. Det var vores oplevelseE, at den tidligere var den bedre mulighed, fordi det reducerede risikoen for potentiel skade på dyrets pharyngeal region.
I betragtning af novellen af denne protokol og behovet for direkte at injicere vokalfoldet med forbindelsen eksisterer der ingen andre pålidelige metoder. På grund af den lille størrelse af dyrene larynx systemet, visuelt styret injektion gennem mund- og pharyngeal regionen på den eneste måde at sikre korrekt og konsistent placering af forbindelsen i levende dyr. Det eneste andre middel til direkte indsprøjtning af vokalfoldet var at forsøge at gøre det fra en ekstern position gennem larynxens hud og brusk. Skønt denne metode med succes udføres hos mennesker, der gennemgår botulinumtoksinterapier for at lindre larynxdystonier, er transkutane injektionsmetoder ikke mulige i små dyr.
Teknikken er robust og kan bruges til ikke kun injektion af vokalfoldet, men til injektionssteder indenforDe pharyngeale og orale regioner. Derudover kan fremgangsmåden tilpasses til simpel visuel overvågning af dyrene i pharyngeal og laryngealområdet ved at fjerne sprøjten.
Sammenfattende er denne injektionsmetode et nyt middel til at studere biologiske mekanismer relateret til behandling af aldringsrelaterede stemmedysfunktioner hos mennesker. Denne metode har også potentiale til anvendelse på andre sygdomsmodeller, der påvirker voicing, vokal funktion, kommunikation og indtagelse hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute for Døvhed og Andre kommunikationsforstyrrelser (R21DC010806 til CAM og JCS og R01DC011285 til CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
