Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Verwendung von Neurotrophin 4 (NTF4) systemisch und direkt zu modulieren Rattenalterung Larynx Muskeln zu beschreiben.
Abstract
Kehlkopfdysfunktion bei älteren Menschen ist eine Hauptursache für Behinderung, von Stimmungsstörungen bis hin zu Dysphagie und Verlust von Atemwegsschutzreflexen. Nur wenige, wenn überhaupt, gibt es Therapien, die eine altersbedingte Larynxmuskel-Dysfunktion erreichen. Neurotrophine sind an der Muskelinnervation und Differenzierung von neuromuskulären Übergängen (NMJs) beteiligt. Es wird angenommen, dass Neurotrophine die neuromuskuläre Transmission durch Erhöhung der Neurotransmitterfreisetzung verstärken. Die neuromuskulären Kreuzungen (NMJs) werden kleiner und weniger reich an alternden Ratten-Larynxmuskeln, mit Anzeichen einer funktionalen Denervation. Wir untersuchten die Auswirkungen von NTF4 auf zukünftige klinische Anwendung als Therapeutikum zur Verbesserung der Funktion bei der Alterung menschlicher Larynxmuskulatur. Hier stellen wir das detaillierte Protokoll für die systemische Anwendung und die direkte Injektion von NTF4 zur Verfügung, um die Fähigkeit des alternden Ratten-Larynxmuskels zu untersuchen, um in Reaktion auf NTF4-Applikation umzuwandeln. Bei dieser Methode erhielten Ratten entweder NTF4 entweder systemisch über oSmotische Pumpe oder durch direkte Injektion durch die Stimmlippen. Larynxmuskeln wurden dann seziert und für die histologische Untersuchung der Morphologie und der altersbedingten Denervation verwendet.
Introduction
Larynx Muskeln kontrahieren schnell und konsequent und sind anfällig für die nachteiligen Auswirkungen des Alterns. Diese ständige Aktivität wird dazu gedacht, zu Stimmproblemen oder Dysphagie bei Personen über 65 Jahre im Alter von 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 zu helfen. Mehrere molekulare und pathophysiologische Mechanismen tragen zu dieser altersbedingten Dysfunktion bei. Diese Mechanismen können die Umgestaltung von Kehlkopfschleimhaut, Muskelfaseratrophie oder -verlust, Mangel an Muskelfaser-Regeneration oder Atrophie, die eine Verbeugung der Stimmlippen und Unfähigkeit des Glottis-Verschlusses 8 , 9 , 10 , 11 bewirken , umfassen . Es gibt keine bewährte medizinische Therapie zu diesem Zeitpunkt, die comDiese altersbedingten Veränderungen in diesen Muskeln zu verhindern oder zu rehabilitieren.
Die Modulation der Wirksamkeit der neuromuskulären Transmission kann die Neuromotorleistung stark beeinflussen. Die Familie der Neurotrophine umfasst den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den Gehirn-abgeleiteten Nervenwachstumsfaktor (BDNF), Neurotrophin 3 (NTF3) und NTF4 12 , 13 . Es wurde gezeigt, dass Neurotrophine die synaptische Wirksamkeit 1 , 4 modulieren. Hepatocytenwachstumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktor Beta und Fibroblastenwachstumsfaktor wurden vor kurzem beim Menschen für die Behandlung von Stimmfalten Narben 15 - 17 verwendet. NTF4 reguliert auch die NMJ-Wirksamkeit; Mäuse ohne NTF4 zeigen zerlegt NMJs 11 , 18 , 19 . Diese Studien führen zu vielversprechenden Wirkungen von BehandlungenT der alternden Larynxmuskelstörungen und der Denervation mit Wachstumsfaktoren.
Direkte Injektionstherapeutika zu den Geweben der Stimmlippen sind beim Menschen nicht beispiellos. Zum Beispiel werden lokale Injektionen von Botulinumtoxin derzeit als wirksame Behandlung für neurologische Bewegungsstörungen verwendet, die die Muskeln im Kehlkopf beeinflussen, wie krampfhafte Dysphonie und bilaterale rezidivierende Larynxnervenlähmung 20 , 21 . Hyaluronsäure-Hydrogel ist eine weitere injizierbare, die verwendet wird, um Stimmfalten Angst und Glottal Insuffizienz 22 , 23 zu behandeln. Injektion Laryngoplastie kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Kommunikationsstörungen zu behandeln 24 . Diese Direktinjektionsmethoden versprechen, die Stimmfunktion und das Schlucken in alternden Populationen zu verbessern.
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Protocol
Verwenden Sie männliche Fischer 344-Brown Norwegen Ratten in 6 und 30 Monate alt für dieses Protokoll. Ratten wurden von der National Institute of Aging Nagetier Kolonie erhalten. Wir haben Ratten für diese Studie verwendet, weil die Struktur des Rattenkehlkopfes ähnlich der des Menschen ist, funktionell für den Atemwegsschutz und Spezies-spezifische Vokalisationen dient Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der PHS-Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labor-Tiere durchgeführt, Der NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und das Tierschutzgesetz (7 USC ff.); Wurde das Tiernutzungsprotokoll vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky genehmigt.
1. Anästhesie der Ratten
- Bereiten Sie die Anästhetika vor, indem Sie Ketaminhydrochlorid (dissoziatives Anästhetikum) und Xylazinhydrochlorid (Beruhigungsmittel und Analgetikum) in gepufferter Kochsalzlösung mischen. Die Konzentrationen von Ketamin und Xylazin in der Endlösung betragen 100 mg / 8 mg pro kgKörpergewicht.
- Injektion der Anästhetika in die Ratte durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel.
- Bestimmen Sie, dass die Ratte genügend betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Fuß mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nicht auf die Prise reagiert, dann kann die Operation beginnen. Wenn die Ratte auf die Zehen-Prise mit Reflex- oder Muskelkontraktionen reagiert, dann warten Sie 1-2 min und wiederholen Sie den Prise Test. Wenn die Ratte wieder reagiert, ersetzen Sie die Ratte durch ein neues Tier und wiederholen Sie das Verfahren ab Schritt 1.2.
- Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen der Ratte, nachdem die Ratte unbeweglich ist, um zu verhindern, dass die Hornhäute austrocknen.
2. Osmotische Pumpenimplantation
- Lege die Ratte ventral auf den aseptischen chirurgischen Bereich. Meloxicam als präanästhetische Medikamente verabreichen. Intraperitoneal in einer Dosierung von 1-4 mg / kg Körpergewicht unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel verabreichen.
- Verwenden Sie Clippers, um eine approxima zu entfernen1 "x 1" Quadrat des Pelzes von der Rückseite des Halses, und ungefähr 1 "kaudal des Raumes zwischen den Schultern. Rasieren Sie so nah an der Haut wie möglich.
- Den Rücken und den Nacken mit deminfizierendem Ethanol (70%) benetzen.
- Nach der Rasur, schrubben die dorsalen Aspekt des Halses mit 3 Scrubs in Folge von Jod-Alkohol Finishing mit Alkohol.
- Halten Sie die Körpertemperatur der Ratte, indem Sie sie auf einen Heizkissen legen, der auf 34 ° C eingestellt ist.
- Füllen Sie aseptisch hergestellte osmotische Pumpen mit entweder 50 μl NTF4 oder Kochsalzlösung für die systemische NTF4-Behandlung (Abbildung 1 ).
- Benutzen Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt ungefähr 2 cm breit durch die Haut zu bilden, gerade kranial zum Raum zwischen den scapulae. Heben Sie die hintere Kante des Schnittes mit einer Pinzette mit einer Hand an, während Sie die Spitze der Hämostaten einsetzen und vorsichtig nach hinten in den Einschnitt schieben.
- Nach der Spitze der Hämostaten ist ca. 2 cm cRanial zum Einschnitt, öffnen Sie die Griffe auf den Hämostaten, erweitern die Spitzen, um eine hohle "Tasche" subkutan zu der Inzisionsstelle zu bilden. Dies ist die Platzierungsstelle für die Pumpe.
- Richten Sie das Pumpenförderportal zuerst nach der Einfügung aus, um jegliche Wechselwirkung des NTF4 und die Heilung der Pocket Inzisionsstelle zu minimieren.
- 50 μl NTF4 Kochsalzlösung für 7 14 Tage geben. Die 7-tägige Gruppe erhielt 6,72 mg / Tag NTF4 für eine Gesamtdosis von 47,04 mg. Die 14-tägige Gruppe erhielt 6,72 mg / Tag für eine Gesamtdosis von 94,08 mg NTF4 25 .
- Verwenden Sie 5-0 Nylon Naht Faden, Hämostaten und Pinzette, um den Einschnitt für Pumpe Platzierung zu schließen.
- Beobachten Sie die Ratten für mindestens 30 min, wie sie sich von der Anästhesie erholen. Kriterien für die Vollendung der Überwachung gehören das Tier aktiv, bewegt sich über den Käfig, Trinkwasser, und beginnen andere normale Aktivitäten wie Pflege.
- Tiere täglich überwachenFür die erste Woche durch Beobachtung der Heilung der chirurgischen Stelle, normale Futtermittel und Wasserverbrauch und Verabschiedung von Urin / Kot und irgendwelche abnorme Verhaltenszeichen von Stress, Schmerzen oder anderen postoperativen Komplikationen.
- Wenn die Ratte in Schmerzen oder Not zu sein scheint, versorgen Sie die Ratte mit einer 5 mg / kg subkutanen Injektion von Carprofen einmal alle 24 Stunden für bis zu 5 Tage, um Schmerzen zu lindern.
- Wenn es scheint, eine Infektion zu sein, konsultieren Sie einen Tierarzt, um zu folgen, dass die Wunde richtig heilt.
- Je nachdem, welche experimentelle Gruppe die Ratte in innen, entfernen Sie die 5-0 Nylon Naht 7-10 Tage nach der Operation, um Reizungen aus dem Faden zu verhindern.
3. Anästhesie der Ratten für die direkte Injektion
- Verzehr von den Ratten in der Nacht vor dem Eingriff. Dadurch wird sichergestellt, dass es keine Nahrung gibt, um das Endoskop oder die Injektionsnadel zu blockieren.
- Wiegen Sie Ratten und bereiten Sie Acepromazin 1-2 mg / kg Körpergewicht vor. Inaktiv intramuskulär (der IM - Standort ist derLinks thyroarytenoid muskel).
- Legen Sie die Ratte in die Induktionsbox. Anästhesie im Induktionskasten mit 5% Isofluran und 1 LO 2 induzieren.
- Bewegen Sie die Ratte auf einen Nasenkonus mit 2% Isofluran und 600 ml O 2 .
- Bestimmen Sie, dass die Ratte genügend betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Fuß mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nicht auf die Prise reagiert, kann das Injektions-Protokoll beginnen. Wenn die Ratte auf die Zehen-Prise mit Reflex- oder Muskelkontraktionen reagiert, dann warten Sie 1-2 min und wiederholen Sie den Prise Test. Wenn die Ratte wieder reagiert, ersetzen Sie die Ratte durch ein neues Tier und wiederholen Sie das Verfahren ab Schritt 3.4.
4. Direkteinspritzung und Visualisierung
- Platzieren Sie aseptisch hergestellte 50-μL-Dosierungen, die NTF4 oder Kochsalzlösung enthalten, in einem H 2 O-Bad, das auf 25 ° C für 30 min vor der Injektion eingestellt wurde.
- Legen Sie die Ratte in eine Rückenlage und verstellbare Position auf einer Plexiglas-Plattform (Abbildung 2 ). SusHängen Sie die Ratte in die zurückgelehnte Haltung von ihren vorderen oberen Schneidezähnen über einen Führungsdraht, der über die Oberseite der Plattform geschleudert wird.
- Befestigen Sie eine 50 mm, 30 gauge, 100 μl Spritze auf ein 1,9 mm, 30 ° Sinus Endoskop (Abbildung 3 ).
HINWEIS: Die Spritzenanordnung wird über eine Lehre befestigt, die die Kanüle fest an der Außenwand des Endoskops hält. Das Endoskop ermöglicht die Visualisierung der Stimmlippen und die Injektion der Spritze. Die Position der Kanülenspitze wird vor jedem Tier eingestellt, um sicherzustellen, dass die Spitze über die endoskopische Ansicht vollständig sichtbar ist (Abbildung 4 ). - Verwenden Sie eine gummi-pippige Pinzette, um die Zunge zu verlängern und verschieben Sie sie seitlich. Danach legen Sie ein Plastikspekulum ein, um die mündliche Durchgängigkeit zu bewahren. Machen Sie das Spekulum aus einem 5 ml Plastikspritzenfaß, der auf eine Länge von 1,5 bis 2 cm geschnitten ist, wobei die Schnittkanten entgratet und poliert sind.
- Schalte die Lichter ausM und befestige eine Halogen-Lichtquelle zum Endoskop. Schalten Sie den Videorecorder ein, um die Prozedur zu erfassen.
- Tauchen Sie das distale Ende des Endoskops für einige Sekunden in warmes Wasser ein, um die Entwicklung der Kondensation auf der Glasspitze zu minimieren, wenn sie in den Mund der Ratte eingeführt wird.
- Mit der visuellen Rückmeldung vom Monitor führen Sie die Nadel sorgfältig in den Bereich der linken Stimmlippe.
- Zeit die Injektion der Lösung mit der Inspirationsphase des Atmungszyklus der Tiere, um vollständig auf die Stimmfalte zuzugreifen. Während der inspiratorischen Phase der Atmung ist die Stimmfalte vollständig ausgesetzt.
- Sobald die Stimmfalte vollständig sichtbar ist, stecke die Nadel in das linke Thyreoheldoid ein, das seitlich zur weißen medialen Kante der Stimmlippe gefunden wird. Mit der Nadel an Ort und Stelle, liefern die Injektion durch Depression der Spritze.
- Schalten Sie die Halogen-Lichtquelle auf dem Endoskop und dem Videoplayer aus und drehen Sie den Rack wieder anOm leuchtet
- Bringt die Ratte in den Hauskäfig zurück und platziere auf einem Heizkissen.
- Lassen Sie die Ratte vor dem Entfernen aus dem Heizkissen zurückgewinnen. Ersetzen Sie Nahrung und Wasser im Käfig.
- Überwachen Sie Ratten für 7 Tage nach der Injektion und dann euthanisieren. Entfernen Sie die Larynges für die Kryoschaltung 24 .
5. Euthanisierung von Ratten
- Anästhesieren von Ratten mit Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid (100 mg / 8 mg pro kg Körpergewicht injiziert intraperitoneale Injektion).
- Euthanisieren durch Exsanguination nach einer medialen Thorakotomie.
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Representative Results
Die Ratten wurden nach 2 Wochen osmotischer Pumpeninfusion oder 1 Woche nach Direkteinspritzung von NTF4 euthanasiert. Larynge wurden geerntet, in Kryoschutzmittel (30% Saccharose und 70% phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gegeben und dann seriell in 10 & mgr; m Breite mit einem Kryostat geschnitten. Alterung der Larynxmuskulatur wird durch die Verabreichung von NTF4 25 beeinflusst. Neben der jungen und alten Ratte verglichen wir die injizierte und nicht injizierte Seite der Thyrearystenoidmuskulatur. Typischerweise sehen wir eine Veränderung der Fasergröße mit dem Alter, die je nach Verabreichungsweg von NTF4 variiert (Abbildung 5 ). Weniger Fibrose wird auch nach der Behandlung qualitativ beobachtet. Der Prozentsatz der denervierten Fasern nimmt mit systemischer und direkter Anwendung von NTF4 bei gealterten Ratten ab (Abbildung 6 ). Die Menge an NMJs nimmt ebenfalls zu (Abbildung 7 ). Die Bedeutung dieser Zunahme de Hängt von der Behandlungsdauer oder dem Verabreichungsweg ab.
Abbildung 1: Repräsentatives Bild der Osmotischen Pumpe. Nach dem Befüllen der Pumpe mit NTF4 wird der Durchflussmoderator in den Grundkörper eingesetzt, um die Pumpe abzudichten.
Abbildung 2: Plattform für Injektionsverfahren. Die Ratte wird in einer Rückenlage auf der Plattform platziert und durch die vorderen oberen Schneidezähne über einen Führungsdraht aufgehängt, der an der Oberseite der Plattform angebracht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Repräsentatives Bild der Spritze. Füllen Sie die Spritze mit NTF4 und Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Injektionsverfahren. ( A ) Die Spritze ist mit einem 19,9 mm 30 ° Endoskop (gezeigt) gekoppelt; (B) Das optische Licht wird überprüft, um sicherzustellen, dass es Licht für die Prozedur gibt; ( C ) Das Echtzeit-Video sorgt dafür, dass die Nadel an der richtigen Stelle geführt wird.
Abbildung 5: Änderungen der Fasergröße und der Morphologie. Repräsentativ erMatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitten von systemischen NTF4 7-Tage-behandelten (rechts) und unbehandelten (linken) Thyroarytenoidmuskeln bei 30 Monaten 26 , 27 , 28 . Es gibt eine Zunahme der Fasergröße von der Kontrolle zu den behandelten Tieren. Die Behandlung mit NTF4 ändert die 30-Mo-Fasergröße zu der eines jüngeren 6 Monate alten Tieres. * P <0,05 versus 30 Monate (Bilder wurden bei 40-facher Vergrößerung aufgenommen, Skala bar = 25 μm, P <0,001). Pfeile im oberen Bild zeigen auf einen Bereich der Fibrose. Es gibt auch eine qualitative Abnahme der Fibrose in den behandelten Tieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Änderungen im InnerenVationen mit NTF4 Behandlung. Repräsentative Nav1.5 gefärbte Abschnitte von systemischen NTF4 14-Tage-behandelten (rechts) und unbehandelten (links) Thyroarytenoid-Muskeln im Alter von 30 Monaten (Bilder wurden bei 40-facher Vergrößerung erfasst, Skalenstab = 25 μm) 29 . Es gibt eine Verringerung der Denervation mit dem Alter durch Na v 1.5 Etikettierung (grün). Die linke Tafel ist repräsentativ Na v 1,5 (grün) und Phalloidin, um Fasern (rote) gefärbte Abschnitte von unbehandelten Thyrearytenoidmuskeln zu bezeichnen, die rechte Tafel wird Muskeln behandelt. Grüner Einsatz ist Na v 1.5 Färbung allein.
Abbildung 7: Änderungen in NMJs mit NTF4-Behandlung. Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie von NMJs aus systemischen NTF4 14-tägig behandelten Thyroarytenoidmuskelabschnitten aus verschiedenen, mit α-Bungarotoxin (grün) markierten Tieren undPhalloidin (rot) zeigt an, dass die NMJ-Zahl mit der NTF4-Behandlung bei 30 Monaten ansteigt (Scale bar = 25 μm), (P <0,001) 11 .
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Discussion
Larynxmuskulatur ist anfällig für die ungünstigen Auswirkungen des Alterns. Frühere Studien haben Veränderungen in der Alterung der Kehlkopfmuskulatur gezeigt, die Veränderungen in der Fasergröße, die Gesamtzahl der Fasern, die Regenerationsfähigkeit, die NMJ-Größe und die Mengenänderungen zusätzlich zu den Variationen der kontraktilen Funktion und der Myosin-Isoformverschiebungen 4 , 11 , 27 , 30 , 31 einschließen . Alterung Larynx Muskel kann durch Anwendung von Neurotrophinen verändert werden. Diese Änderungen können leicht gemessen werden. Daher bieten Ratten-Kehlkopfmuskeln ein nützliches Modell, um die Auswirkungen des Alterns und Stimmkrankheiten / -störungen zu untersuchen. Das Studium dieser Muskeln kann auch dazu beitragen, Interventionen oder Schutzprozesse im alternden Menschen zu entwickeln.
Unsere Methode der systemischen oder direkten Anwendung von NTF4 produziert eine Remodeling-Antwort im alternden RattenkehlkopfMuskeln Dies zeigt, dass Neurotrophine therapeutisches Potential auf alterungsbedingter Muskel-Dysfunktion haben können. Die direkte Anwendung von Neurotrophinen kann leicht in das menschliche Modell der Stimmalterung umgewandelt werden, obwohl die Injektionsvektoren 25 .
Es gibt viele Faktoren zu berücksichtigen, wenn mit dem Injektionsprotokoll. Zuerst muss darauf geachtet werden, dass Kratzer und Verletzungen des Weichgewebes um das Kehlkopfvestibulum vermieden werden, wenn man die Spitze des Endoskops betrachtet, hat eine scharfe Nadel befestigt. Zweitens, das Timing der Bewegung der Nadelspitze in den Kehlkopf während der Inspirationsphase des Atemzyklus der Tiere, braucht die Praxis, um die Injektion genau zu bestimmen. Drittens stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze deutlich sichtbar ist, bevor Sie den Vorgang durch visuelles Prüfen des Gerätes auf dem Computermonitor vorab ausführen. Viertens, Erwärmung der Spitze des Endoskops in heißem Wasser für ein paar Sekunden ist ein wichtiger Schritt, um sicherzustellen, dass Beschlag der endoGeltungsbereich wird vermieden. Schließlich ist es auch wichtig, die Ratte in der Nacht vor jedem Scoping-Verfahren zu fasten. Wenn das Essen nicht zurückgehalten wird, ist es höchstwahrscheinlich, dass sie im Rachen noch Nahrungsmittelreste haben werden, was das Injektionsverfahren praktisch unmöglich macht. Ratten sollten auf Anzeichen von Dehydrierung täglich überprüft werden und gewogen, um sicherzustellen, dass es keine signifikanten Gewichtsverlust (größer, dass 10% des Körpergewichts).
Zwei kritische Schritte bei der Entwicklung des Protokolls waren die Befestigung der Spritze am Endoskop und die Verwendung eines oralen Spekulums. Eine feste Verankerung der Spritzenmontage war notwendig, um die Einhandbedienung für die Einfügung und Injektion des Bereichs zu erleichtern. In Anbetracht der Ziele der Studie, in Abwesenheit einer direkten Visualisierung, um die Injektion der Stimmfalte zu begleiten, konnte das Experiment nicht realisiert werden. Darüber hinaus wurde die Schaffung eines mündlichen Spekulums als wichtig erachtet, um zu verhindern, dass sich die Zunge bewegt und beibehalten würdeE epiglottis während des gesamten Verfahrens geöffnet.
Die visuell geführte Injektionsmethode unterging mehrere Modifikationsrunden, die meistens im Zusammenhang mit der Suche nach dem optimalen Mittel zur sicheren Verankerung der Spritze und der Nadel zum Endoskop stehen. Nach dem Testen mehrerer Formen von Bandklebstoffen wurde festgestellt, daß ein handelsübliches elastisches Leichtathletikband das beste Mittel war, um die Spritze an den Endoskopkörper zu verankern.
Die größte Begrenzung der visuell geführten Injektionsmethode war nicht mit der Instrumentierung, sondern mit der Notwendigkeit eines Patents Pharynx und Atemweg verbunden. Obwohl die Beschränkung der Nahrung für 24 Stunden vor dem Verfahren die meisten dieser Ausgabe gelöst, werden Ratten alles in ihren Käfigen, einschließlich Bettwäsche und Kot. Als dies geschah, gab es zwei Lösungen: (1) verschieben die Injektion, bis das Tier ihren Pharynx natürlich freigibt, oder (2) versuchen, die Blockade manuell mit Pinzette zu entfernen. Es war unser ErlebnisE, dass das erstere die bessere Option war, weil es das Risiko einer möglichen Verletzung der Pharynxregion des Tieres verringerte.
Angesichts der Neuheit dieses Protokolls und der Notwendigkeit, die Stimmfalte direkt mit der Verbindung zu injizieren, gibt es keine anderen zuverlässigen Methoden. Angesichts der geringen Größe der Tiere Larynx-System, visuell geführte Injektion durch die Mund-und Rachen-Region auf die einzige Möglichkeit, um eine korrekte und konsistente Platzierung der Verbindung in das lebende Tier zu gewährleisten. Die einzige andere Möglichkeit, die Stimmfalte direkt einzuspritzen, war, aus einer äußeren Position durch die Haut und den Knorpel des Kehlkopfes zu versuchen. Obwohl diese Methode erfolgreich bei den Menschen durchgeführt wird, die Botulinumtoxin-Therapien unterziehen, um Kehlkopfdystonien zu lindern, sind transkutane Injektionsmethoden bei kleinen Tieren nicht möglich.
Die Technik ist robust und kann nicht nur für die Injektion der Stimmlippe, sondern auch für Injektionsorte eingesetzt werdenDie pharyngealen und oralen Regionen. Zusätzlich kann das Verfahren für eine einfache visuelle Überwachung der Tiere Pharynx- und Kehlkopfregion durch Entfernen der Spritze angepasst werden.
Zusammenfassend ist diese Injektion Methode ein neuartiges Mittel, um biologische Mechanismen im Zusammenhang mit der Behandlung von alterungsbedingten Stimmungsstörungen beim Menschen zu untersuchen. Diese Methode hat auch das Potenzial, auf andere Krankheitsmodelle angewendet zu werden, die Stimmhaftigkeit, Gesangsfunktion, Kommunikation und Schlucken beim Menschen beeinflussen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien des Nationalen Instituts für Taubheit und andere Kommunikationsstörungen (R21DC010806 bis CAM und JCS und R01DC011285 bis CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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