Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.

Published: June 13, 2017 doi: 10.3791/55837
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Department of Rehabilitation Sciences, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Kentucky

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את השימוש של neurotrophin 4 (NTF4) באופן שיטתי ישירות כדי לשפץ עכברוש ההזדקנות שרירים הגרון.

Abstract

תפקוד לקוי של הגרון אצל קשישים הוא גורם עיקרי לחולי נכות, מהפרעות קוליות ועד לקשיי ראייה ואובדן רפלקסים מגנים על דרכי הנשימה. מעטים, אם בכלל, קיימים טיפולים כי המטרה גיל הקשורים לתפקוד שרירים בגרון. נויטרופונים מעורבים בעצב שרירים ובידול של צמתים ניירומוסקולריים (NMJs). הוא חשב כי neurotrophins לשפר את העברת neuromuscular על ידי הגדלת שחרור נוירוטרנסמיטר. הצמתים הניירומוסקולריים (NMJ) הופכים קטנים יותר ופחות בשפע בשרירי הגרון העכברים המזדקנים, עם ראיות לשימור תפקודי. בחנו את ההשפעות של NTF4 לשימוש קליני עתידי כטיפול לשיפור תפקוד ההזדקנות בשרירי הגרון האנושיים. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול מפורט עבור יישום מערכתי הזרקת ישירה של NTF4 לחקור את היכולת של הזדקנות חולדה עכברוש הגרון לשפץ בתגובה יישום NTF4. בשיטה זו, חולדות או קיבלו NTF4 או באופן שיטתי דרך oמשאבה סמוטית או על ידי הזרקה ישירה דרך קפל ווקאלי. שרירי הלוע היו אז גזור ומשמש לבדיקת היסטולוגית של מורפולוגיה ושימור הקשורים לגיל.

Introduction

שרירי הגרון מתכווצים במהירות ועקביות, והם פגיעים לתופעות הלוואי של ההזדקנות. פעילות מתמדת זו נחשבת לתורמת לבעיות קוליות או לדיספגיה שנצפתה אצל אנשים מעל גיל 65 שנים , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . מספר מנגנונים מולקולריים ו פתופיזיולוגיים תורמים לתפקוד לקוי הקשור לגיל. מנגנונים אלה יכולים לכלול שיפוץ של רירית הגרון, ניוון שריר או אובדן, חוסר סיבים שריר התחדשות או ניוון אשר גורם קשת של קפל ווקאלי חוסר יכולת של הסגר 8 , 9 , 10 , 11 . אין טיפול רפואי מוכח בשלב זה יכול comלמנוע או לשקם שינויים אלה הקשורים לגיל אלה שרירים.

אפנון האפקטיביות של שידור neuromuscular יכול להשפיע מאוד על הביצועים neuromotor. משפחת הנוירוטרופים כוללת גורם לגדילה עצבית (NGF), גורם גדילה עצבי המופק על ידי המוח (BDNF), נוירוטרופין 3 (NTF3) ו- NTF4 12 , 13 . נוירוטרופים הוכחו כדי לווסת את יעילות הסינפטי 1 , 4 . גורם הצמיחה hepatocyte, הפיכת גורם גדילה ביתא גורם הגידול fibroblast לאחרונה נעשה שימוש בבני אדם לטיפול הצטלקות קפל 15 - 17 . NTF4 גם מסדיר את יעילות NMJ; עכברים חסרים NTF4 להראות מפורקים NMJs 11 , 18 , 19 . מחקרים אלה מובילים להשפעות מבטיחות של מטפליםT של הזדקנות שרירים הגרון ואת שימור עם גורמי גדילה.

טיפול הזרקה ישירה לרקמות של קפל ווקאלי הם לא תקדים בבני אדם. לדוגמה, זריקות מקומיות של toxin botulinum משמשים כיום כטיפול יעיל להפרעות תנועה נוירולוגיות המשפיעות על השרירים בגרון, כגון דיספוניה של עוויתות ושיתוק עצבי חוזר דו-צדדי חוזר 20 , 21 . חומצה היאלורונית הידרוגנית נוספת היא זריקה, המשמשת לטיפול מפחיד ווקאלי קיפול וחסר glutal 22 , 23 . הזריקה laryngoplasty ניתן להשתמש כדי לטפל במגוון של הפרעות בתקשורת 24 . שיטות הזרקה ישירה אלו מקיימות הבטחה לשיפור תפקוד הקול והבלעה באוכלוסיות ההזדקנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השתמש זכר Fischer 344-Brown חולדות נורבגיה בגיל 6 ו 30 חודשים של גיל עבור פרוטוקול זה. חולדות התקבלו מן המכון הלאומי של זקנה מכרסמים המושב. השתמשנו עכברושים עבור מחקר זה, כי המבנה של הגרון חולדה דומה לזו של האדם, פונקציונלית המשרתים להגנה על דרכי הנשימה ו vocalizations המין המיוחד מחקר זה בוצע בהתאם למדיניות PHS על טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה, מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, וחוק רווחת בעלי חיים (7 USC et seq); פרוטוקול השימוש בבעלי חיים אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) של אוניברסיטת קנטקי.

1. הרדמה של חולדות

  1. הכן את ההרדמה על ידי ערבוב קטמין הידרוכלוריד (הרדמה דיסוציאטיבית) ו xylazine hydrochloride (הרגעה משכך כאבים) ב שנאגרו מלוחים. ריכוז ketamine ו xylazine בפתרון הסופי הם 100 מ"ג / 8 מ"ג לק"גמשקל הגוף בהתאמה.
  2. להזריק את הרדמה לתוך החולדה על ידי הממשל intraperitoneal באמצעות מזרק עם מחט 25 G.
  3. לקבוע כי החולדה הוא הרדים מספיק על ידי צביטה הבוהן או הרגל עם מלקחיים. אם החולדה לא מגיבה על קמצוץ, ואז הניתוח יכול להתחיל. אם החולדה מגיבה על קמצוץ הבוהן עם התכווצויות רפלקס או שריר, ואז לחכות 1-2 דקות לחזור על מבחן קמצוץ. אם החולדה מגיבה שוב, להחליף את החולדה עם בעל חיים חדש הליך חוזר החל מ שלב 1.2.
  4. להחיל משחה עיניים לעיניים של חולדה, לאחר החולדה הוא נייח, כדי למנוע את הקרניות להתייבש.

2. אוסמוטי משאבת ההשתלה

  1. מניחים את החולדה הגחון על אזור כירורגי aseptic. ניהול meloxicam כתרופה preanesthetic. ניהול intraperitoneally במינון של 1-4 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף באמצעות מזרק עם מחט 25 G.
  2. השתמש בקוצץ כדי להסיר קירובTale 1 "x 1" מרובע פרווה מגב הצוואר, וכ 1 "הזנב של שטח בין כתפיים. להתגלח קרוב ככל האפשר לעור.
  3. רטוב את הגב והצוואר עם אתנול חיטוי (70%).
  4. לאחר גילוח, לשפשף את היבט הגב של הצוואר עם 3 מקרצף ברצף של אלכוהול האלכוהול הגמר עם אלכוהול.
  5. לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה על ידי הנחת אותו על כרית חימום מוגדר 34 מעלות צלזיוס.
  6. ממלאים משאבות אוסמוטי מוכן aseptically עם או 50 μL של NTF4 או מלוחים עבור טיפול NTF4 מערכתית ( איור 1 ).
    1. השתמש באזמל כדי לבצע חתך אופקית כ 2 ס"מ רחב דרך העור, רק גולגולתי לחלל בין scapulae. הרם את הקצה האחורי של החתך עם מלקחיים עם יד אחת תוך החדרת קצה hemostats בעדינות דוחף אחורי החתך.
    2. לאחר קצה hemostats הוא כ 2 ס"מ cרץ את החתך, לפתוח את הידיות על hemostats, הרחבת הקצות כדי ליצור חלול "כיס" תת עורית לאתר החתך. זה יהיה המיקום מיקום המשאבה.
  7. אוריינט את המשאבה משלוח הפורטל בסוף הראשון עם הכניסה כדי למזער כל אינטראקציה של NTF4 ואת הריפוי של אתר החתך כיס.
  8. ספק 50 μL של מלוחים NTF4 עבור 7 או 7 ימים. קבוצת 7 ימים קיבלה 6.72 מ"ג ליום של NTF4 במינון כולל של 47.04 מ"ג. קבוצת הגיל 14 קיבלה 6.72 מ"ג ליום עבור מינון כולל של 94.08 מ"ג של NTF4 25 .
  9. השתמש חוט 5-0 ניילון תפר, hemostats ו מלקחיים כדי לסגור את החתך עשה עבור מיקום המשאבה.
  10. שים לב חולדות במשך מינימום של 30 דקות כפי שהם להתאושש מהרדמה. הקריטריונים להשלמת הניטור כוללים את החיה להיות פעיל, נע על הכלוב, מי שתייה, ומתחילים פעילויות רגילות אחרות כגון טיפוח.
  11. צג חיות היומיבשבוע הראשון על ידי התבוננות בריפוי של אתר כירורגי, תזונה נורמלית וצריכת מים וחולפת שתן / צואה, וכל סימנים התנהגותיים חריגים של לחץ, כאב או סיבוכים לאחר הניתוח.
  12. אם חולדה נראה כואב או מצוקה, לספק חולדה עם 5 מ"ג / ק"ג הזרקת תת עורית של carprofen פעם כל 24 שעות עד 5 ימים כדי להקל על הכאב.
  13. אם יש זיהום, להתייעץ עם וטרינר כדי לגרום כי הפצע מרפא כראוי.
  14. בהתאם קבוצה ניסיונית החולדה ב, להסיר את תפר 5-0 ניילון 7-10 ימים לאחר הניתוח כדי למנוע גירוי מהחוט.

3. הרדמה של חולדות להזרקת ישיר

  1. למנוע מזון מן החולדות בלילה לפני ההליך. זה מבטיח כי אין מזון לחסום את אנדוסקופ או מחט הזרקת.
  2. לשקול חולדות ולהכין acepromazine 1-2 מ"ג / ק"ג משקל גוף. להזריק intramuscularly (מיקום IM הואשריר thyroarytenoid שמאל).
  3. מניחים את החולדה בתיבה אינדוקציה. להשרות הרדמה בתיבה אינדוקציה עם 5% isoflurane ו 1 LO 2 .
  4. להעביר את החולדה על חרוט האף עם isoflurane 2% ו 600 מ"ל O 2 .
  5. לקבוע כי החולדה הוא הרדים מספיק על ידי צביטה הבוהן או הרגל עם מלקחיים. אם החולדה לא מגיבה על קמצוץ, אז פרוטוקול ההזרקה יכול להתחיל. אם החולדה מגיבה על קמצוץ הבוהן עם התכווצויות רפלקס או שריר, ואז לחכות 1-2 דקות לחזור על מבחן קמצוץ. אם החולדה מגיבה שוב, להחליף את החולדה עם בעל חיים חדש הליך חוזר החל מ שלב 3.4.

4. הזרקה ישירה ויזואליזציה

  1. מקום מוכן aseptically 50 μL מינונים המכילים NTF4 או מלוחים ב H 2 O אמבטיה להגדיר 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני ההזרקה.
  2. מניחים את החולדה במצב שכיבה ו שכיבה על פלטפורמת פרספקס ( איור 2 ). סוסמכופפים את העכברוש בתנוחה השעורה מהחלק העליון של החותכות הקדמיות, דרך חוט תיל המתוח על החלק העליון של הרציף.
  3. צרף 50 מ"מ, 30 מד, 100 מזרק μL ל 1.9 מ"מ, 30 ° סינוס אנדוסקופ ( איור 3 ).
    הערה: מכלול המזרק מחובר באמצעות חפיפה המחזיקה את הצינורית בחוזקה לקיר החיצוני של האנדוסקופ. האנדוסקופ מאפשר הדמיה של קפל ווקאלי והכוונה של מזרק intraorally. המיקום של קצה צינורית מותאם לפני כל חיה כדי להבטיח את קצה במלואו וברור לעין באמצעות תצוגה אנדוסקופית ( איור 4 ).
  4. השתמש זוג מוטה גומי מורט להאריך את הלשון ולהזיז אותו רוחבית. לאחר מכן, הכנס משקולת פלסטיק כדי לשמור על הפטנט בעל פה. הפוך את speculum מ 5 מ"ל חבית פלסטיק חבית כי הוא חתך באורך של 1.5 עד 2 ס"מ, עם הקצוות לחתוך deburred ו מלוטש חלקה.
  5. כבה את האורות ברוומ 'ו לצרף מקור האור הלוגן ל אנדוסקופ. הפעל את מקליט הווידאו כדי ללכוד את ההליך.
  6. לטבול את הקצה הדיסטלי של אנדוסקופ במים חמים למשך כמה שניות כדי למזער את הפיתוח של עיבוי על קצה זכוכית כאשר מוכנס לתוך הפה של החולדה.
  7. באמצעות משוב חזותי מהצג, בקפידה להנחות את המחט לאזור הקפל השמאלי השמאלי.
  8. הזמן את הזרקת הפתרון עם השלב השראה של מחזור הנשימה של בעלי חיים כדי לגשת באופן מלא לקפל ווקאלי. במהלך שלב ההשראה של הנשימה, קפל הקול נחשף במלואו.
    1. לאחר קפל ווקאלי גלוי לחלוטין, הכנס את המחט לתוך thyroarytenoid שמאל, נמצא לרוחב קצה המדיאלי הלבן של קפל ווקאלי. עם המחט במקום, לספק את הזרקת דרך דיכאון של המזרק.
  9. כבה את מקור האור הלוגן על אנדוסקופ ונגן וידאו, ופנה בחזרה על roאורות אום.
  10. להחזיר את החולדה לכלוב הבית שלה במקום על כרית חימום.
  11. אפשר עכברוש להתאושש לפני הסרת כרית החימום. החלף מזון ומים בכלוב.
  12. מעקב חולדות במשך 7 ימים לאחר ההזרקה ולאחר מכן להרדים. הסר את הגרונות עבור cryosectioning 24 .

5. הרדמה של חולדות

  1. להרדים חולדות עם קטמין הידרוכלוריד ו xylazine hydrochloride (100 מ"ג / 8 מ"ג לכל ק"ג משקל גוף מוזרק זריקה intraperitoneal).
  2. להרדים על ידי exsanguination לאחר thoracotomy המדיאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חולדות היו מורדמים לאחר שבועיים של עירוי משאבת אוסמוטי או 1 שבוע לאחר הזרקה ישירה של NTF4. Larynges נקצרו, הניח cryoprotectant (סוכרוז 30% ו 70% פוספט שנאגרו מלוחים) ולאחר מכן מקוטע סדרתי ברוחב 10 מיקרומטר עם cryostat. הזדקנות שרירי הגרון מושפעים על ידי הממשל של NTF4 25 . בנוסף חולדה צעירה וישנה, ​​השווה את הצד מוזרק ולא מוזרק של השרירים thyroarytenoid. בדרך כלל אנו רואים שינוי בגודל סיבי עם הגיל, אשר משתנה בהתאם לתוואי של ניהול NTF4 ( איור 5 ). פחות fibrosis הוא גם ציין איכותית לאחר הטיפול. אחוז סיבים משומש פוחת עם יישום מערכתית ישירה של NTF4 בחולדות בגילאי ( איור 6 ). כמות NMJs גם מגדילה ( איור 7 ). המשמעות של עלייה זו דה על אורך הטיפול או על דרך הניהול.

איור 1
איור 1: תמונה נציג של משאבת אוסמוטי. לאחר מילוי המשאבה ב - NTF4, מנחה הזרימה מוכנס לגוף הראשי כדי לאטום את המשאבה.

איור 2
איור 2: פלטפורמה להליך הזרקה. החולדה ממוקמת בתנוחת פרקדן על הרציף ומוחזקת על ידי החותכות העליונות חזיתית באמצעות תיל מנחה המונח על ראש הרציף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
איור 3: תמונה מייצגת של מזרק. ממלאים את המזרק עם NTF4 תערובת מלוחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: נוהל הזרקה. ( א ) המזרק הוא מצמידים ל אנדוסקופ 19.9 מ"מ 30 ° (מוצג); (ב) האור האופטי נבדק כדי לוודא שיש אור עבור ההליך; ( ג ) וידאו בזמן אמת מבטיח כי המחט מודרכת למיקום הנכון.

איור 5
איור 5: שינויים בגודל סיבים ומורפולוגיה. נציג הואMatoxylin ו eosin קטעים מוכתמים של מערכתית NTF4 7 ימים מטופלים (ימין) ולא מטופל (משמאל) שרירים thyroarytenoid בגיל 30 חודש 26 , 27 , 28 . יש גידול בגודל סיבי משליטה לבעלי חיים מטופלים. הטיפול ב- NTF4 משנה את גודל הסיב של 30 מ 'לזה של בעל חיים צעיר בן 6 חודשים. * P <0.05 לעומת 30 חודש (תמונות נתפסו בהגדלה 40X, סולם בר = 25 מיקרומטר, P <0.001). החצים בתמונה העליונה מצביעים על שטח של פיברוזיס. יש גם ירידה איכותית של פיברוזיס אצל בעלי החיים שטופלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: שינויים בפניםעם טיפול NTF4. נציג Nav1.5 קטעים מוכתמים של מערכתית NTF4 14 יום מטופלים (ימין) ולא מטופל (שמאל) שרירים thyroarytenoid בגיל 30 חודש (תמונות נתפסו בהגדלה 40X, קנה מידה בר = 25 מיקרומטר) 29 . יש ירידה של שימור עם הגיל על ידי Na v 1.5 תיוג (ירוק). פאנל שמאלי הוא נציג Na v 1.5 (ירוק) ו phalloidin, כדי לציין סיבים (אדום) קטעים מוכתמים של שרירים thyroarytenoid מטופל, הפאנל הימני מטופל השרירים. הוספה ירוקה היא Na v 1.5 מכתים לבד.

איור 7
איור 7: שינויים ב- NMJ עם טיפול ב- NTF4. נציג תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של NMJs מ NTF4 14 ימים מטופלים סעיפים שרירים thyroarytenoid מ בעלי חיים שונים שכותרתו עם α-bungarotoxin (ירוק) וPhalloidin (אדום) מראה כי מספר NMJ עולה עם טיפול NTF4 ב 30 חודש (קנה מידה בר = 25 מיקרומטר), (P <0.001) 11 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שרירי הגרון חשופים להשפעות של הזדקנות. מחקרים קודמים הראו שינויים בשרירי הגרון המזדקנים הכוללים שינויים בגודל הסיבים, מספר הסיבים הכולל, יכולת התחדשות, גודל NMJ ושינויים בכמות, בנוסף לשינויים בתפקוד הקונסטרוקלי ובמיוסין איזופורם משמרות 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . הזדקנות שריר הגרון ניתן לשנות על ידי יישום של נוירוטרופים. שינויים אלו ניתנים למדידה. לכן, שרירי הגרון חולדה לספק מודל שימושי כדי לחקור את ההשפעות של הזדקנות, ווקאלי מחלות / הפרעות. המחקר של השרירים האלה עשוי גם לסייע בפיתוח התערבויות או תהליכי הגנה אצל האדם המזדקן.

השיטה שלנו של יישום שיטתי או ישיר של NTF4 מייצרת תגובה שיפוץ הזדקנות חולדה העכבריםשרירים. זה מוכיח כי neurotrophins עשוי להיות פוטנציאל טיפולי על תפקוד לקוי של שרירים הקשורים להזדקנות. היישום הישיר של נויטרופינים יכול בקלות לתרגם את המודל האנושי של ההזדקנות ווקאלית למרות וקטורים הזרקת 25 .

ישנם גורמים רבים שיש להביא בחשבון בעת ​​שימוש בפרוטוקול ההזרקה. ראשית, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע גירוד ופגיעה ברקמות הרכות סביב הפרוזדור הגרון בהתחשב קצה אנדוסקופ יש מחט חדה המצורפת. שנית, עיתוי התנועה של קצה המחט לתוך הגרון במהלך השלב מעוררת השראה של מחזור נשימה של בעלי חיים לוקח להתאמן כדי במדויק את הזריקה. שלישית, להבטיח את קצה המחט נראה בבירור לפני שתנסה את ההליך על ידי ויזואלית לבדוק את המנגנון על צג המחשב מראש. רביעית, ההתחממות קצה אנדוסקופ במים חמים במשך כמה שניות הוא צעד חשוב כדי לוודא כי ערפל של endoהיקף נמנעת. לבסוף, חשוב גם לצום את החולדה בלילה לפני כל הליך קביעת. אם המזון אינו נמנע סביר מאוד כי הם עדיין יש שאריות מזון הלוע, מה שהופך את הליך ההזרקה כמעט בלתי אפשרי לבצע. חולדות יש לבדוק את הסימנים של התייבשות היומי ושקל כדי לוודא שאין ירידה משמעותית במשקל (יותר כי 10% ממשקל הגוף).

שני שלבים קריטיים בפיתוח הפרוטוקול היו התקשרות של המזרק לאנדוסקופ, ושימוש במשאב בעל פה. עיגון מוצק של מכלול המזרק היה הכרחי כדי להקל על פעולה חד פעמית להכנסת היקף והזרקת. בהתחשב במטרות המחקר, בהעדר הדמיה ישירה להנחת הזרקה של קפל הקול, הניסוי לא היה יכול להתממש. בנוסף, יצירתה של ספקולום אוראלי נחשב חשוב למנוע את הלשון מלהזיז ולשמור על הEiglottis פתוח במהלך ההליך.

שיטת הזריקה מודרכת ויזואלית תחת הלך מספר סיבובים של שינוי הקשורים בעיקר למציאת האמצעים האופטימלי של עיגון מאובטח מזרק ומחט האנדוסקופ. לאחר בדיקה של צורות שונות של דבקים קלטת, נמצא כי מסחרי זמין קלטת אתלטי גמיש היה האמצעי הטוב ביותר לעגן את המזרק לגוף אנדוסקופ.

המגבלה הגדולה ביותר של שיטת הזריקה המודרכת מבחינה ויזואלית לא הייתה קשורה למכשור, אלא לצורך צורך בפטנט ובדרכי הנשימה. אמנם, הגבלת מזון במשך 24 שעות לפני הליך לפתור את רוב הבעיה, חולדות יהיה לבלוע כל דבר בכלובים שלהם, כולל מצעים צואה. כאשר זה קרה, היו שני פתרונות: (1) לדחות את הזריקה עד החיה מנקה את הלוע שלהם באופן טבעי, או (2) מנסה להסיר את החסימה ידנית באמצעות מלקחיים. זה היה הניסיון שלנוE, כי לשעבר היתה אפשרות טובה יותר, כי זה הפחית את הסיכון של פגיעה פוטנציאלית באזור הלוע של החיה.

בהתחשב בחידוש של פרוטוקול זה ואת הצורך להזריק ישירות את קפל ווקאלית עם המתחם, אין שיטות אמינים אחרים קיימים. בהתחשב בגודל קטן של מערכת בעלי חיים הגרון, הזריק מודרך חזותית דרך אזור הפה והלוע בדרך היחידה להבטיח מיקום נכון ועקבי של המתחם של חיה חיה. האמצעי האחיד היחיד להזרקה ישירה של קפל הקול היה לנסות לעשות זאת ממיקום חיצוני דרך העור והסחוס של הגרון. למרות שיטה זו מבוצעת בהצלחה בבני אדם העוברים טיפולי toxin botulinum כדי להקל על דיסטוניאס הגרון, שיטות הזרקה transcutaneous אינם בריאים בבעלי חיים קטנים.

הטכניקה היא חזקה וניתן להשתמש בה לא רק הזרקה של קפל ווקאלי, אלא עבור אתרי הזרקה בתוךהאזורים הלועיים והאזוריים. בנוסף, השיטה יכולה להיות מותאמת עבור ניטור חזותית פשוטה של ​​החיה הלועי באזור הגרון על ידי הסרת המזרק.

לסיכום, שיטת הזרקה זו היא אמצעי חדש לחקר המנגנונים הביולוגיים הקשורים לטיפול בתפקוד הקול הקשור להזדקנות בבני אדם. שיטה זו יש גם את הפוטנציאל להיות מיושם על מודלים אחרים של המחלה המשפיעים על קול, תפקוד קולי, תקשורת, בליעה בבני אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (R21DC010806 ל- CAM ו- JCS ו- R01DC011285 ל- CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30 ° endoscope Stoltz 61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 mL syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 124 גורמי גדילה גרון משאבה אוסמוטית שריר נוירוטרופין 4 (NTF4) הזרקת גרון חולדה הזדקנות
תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andreatta, R. D., Stemple, J. C.,… More

Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter