Summary
ここでは、ラットの老化喉頭筋をリモデリングするために、ニューロトロフィン4（NTF4）の使用を全身的かつ直接的に記述するためのプロトコールを提示する。
Abstract
高齢者における喉頭機能不全は、声調障害から嚥下障害および気道保護反射障害の主要な原因である。年齢関連の喉頭筋機能不全を対象とする治療法は、あるとしてもごくわずかです。ニューロトロフィンは、神経筋接合部（NMJ）の筋肉の神経支配および分化に関与する。神経栄養因子は、神経伝達物質放出を増加させることによって神経筋伝達を増強すると考えられている。神経筋接合部（NMJ）は、ラットの喉頭筋の老化において、機能低下を示す証拠とともに、より小さく、豊富ではない。私たちは、ヒトの喉頭筋の高齢化における機能を改善するための治療薬としての将来の臨床用途へのNTF4の影響を探った。ここでは、NTF4の適用に応答してラット喉頭筋の老化能力を調べるための、NTF4の全身投与および直接注射のための詳細なプロトコールを提供する。この方法では、ラットはNTF4を全身的に oまたは声帯を介して直接注入することによって行われる。喉頭筋を解剖し、形態学および年齢関連の脱神経の組織学的検査に用いた。
Introduction
喉頭の筋肉は急速かつ一貫して収縮し、老化の悪影響を受け易い。この一定の活動は、65歳以上の人の1日 、 2日 、 3日 、 4日 、 5日 、 6日 、 7日に観察される声の問題または嚥下障害に寄与すると考えられている。いくつかの分子的および病態生理学的機序がこの年齢関連機能不全に寄与する。これらのメカニズムには、喉頭粘膜の改造、筋繊維萎縮または喪失、筋繊維再生の欠如、または声帯の屈曲および声門閉鎖の不可能化を引き起こす萎縮が含まれ得る（8,9,10,11）。現時点で実証された治療法はありませんこれらの筋肉の年齢に関連した変化を徹底的に防止またはリハビリします。
神経筋伝達の有効性の調節は、神経運動の性能に大きく影響する可能性がある。ニューロトロフィンのファミリーには、神経成長因子（NGF）、脳由来神経成長因子（BDNF）、ニューロトロフィン3（NTF3）およびNTF4 12,13が含まれる 。ニューロトロフィンは、シナプスの効力を調節することが示されている1,4 。肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータおよび線維芽細胞成長因子は、最近、ヒトにおいて声帯瘢痕の治療のために使用されている15-17。 NTF4はNMJの有効性も規制している。 NTF4を欠くマウスは、分解されたNMJ11,18,19を示す。これらの研究は、治療薬の有望な効果をもたらす老人性喉頭筋障害の老化および成長因子による衰弱。
声帯の組織への直接注射療法は、ヒトにおいて前例のないことではない。例えば、ボツリヌス毒素の局所注入は、現在、喉頭の筋肉に影響を与える神経運動障害、例えば痙攣性発声障害および両側性再発性喉頭神経麻痺に対する有効な治療として使用されている20,21 。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、別の注射剤であり、声帯怖さと声門不全を治療するために使用される22,23 。注射喉頭形成術は、様々なコミュニケーション障害を治療するために使用することができる24 。これらの直接注射方法は、高齢者の声機能および嚥下を改善することを約束している。
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Protocol
このプロトコールには、オスのFischer 344-Brownノルウェーラットを6ヶ月齢および30ヶ月齢で使用する。ラットは国立老化げっ歯類コロニーから入手した。ラット喉頭の構造はヒトのものと類似しており、機能的に気道保護および種特異的発声に役立つので、この研究のためにラットを使用した。この研究は、実験動物の人間のケアおよび使用に関するPHS方針に従って行われ、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイド、および動物福祉法（7 USC以下）;動物使用プロトコールは、ケンタッキー大学の施設動物用ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認された。
1.ラットの麻酔
- 緩衝生理食塩水中でケタミン塩酸塩（解離麻酔薬）と塩酸キシラジン（鎮静薬と鎮痛薬）を混合して麻酔薬を調製する。最終溶液中のケタミンおよびキシラジンの濃度は、100mg / 8mg / kg体重をそれぞれ測定した。
- 25Gの針を備えた注射器を用いて腹腔内投与によりラットに麻酔薬を注入する。
- つま先または足を鉗子で挟むことによってラットが十分に麻酔されていることを確認する。ラットがピンチに反応しない場合、手術が始まります。ラットが反射または筋収縮を伴ってつま先のつまみに反応する場合は、1-2分待ってピンチ試験を繰り返します。ラットが再び反応する場合は、ラットを新しい動物に交換し、ステップ1.2から始まる手順を繰り返す。
- 角膜が乾燥するのを防ぐために、ラットが動かなくなった後、ラットの眼に眼科用軟膏を塗布する。
2.浸透圧ポンプインプラント
- ラットを腹側の無菌手術領域に配置する。メラキシカムを麻酔薬として投与する。 25Gの針を備えた注射器を使用して体重1kgあたり1-4mgの用量で腹腔内投与する。
- クリッパーを使って近似値を削除する首の後ろから毛皮を1 "x 1"平方に、肩の間に約1 "の尾を付けてください。できるだけ皮膚に近づけてください。
- エタノール（70％）を消毒して背中と首を濡らします。
- シェービングした後、アルコールでヨウ素 - アルコール仕上げをしながら、3回のスクラブで首の背面を擦ってください。
- 34℃に設定された加熱パッド上に置くことによってラットの体温を維持する。
- 全身NTF4処理のために、50μLのNTF4または生理食塩水で無菌的に調製した浸透圧ポンプを充填する（ 図1 ）。
- メスを使用して、肩甲骨間の空間に頭皮だけで約2cmの幅の水平切開を行う。片側の手で鉗子で切開の後端を持ち上げながら、止血の先端を挿入し、切開の後部を静かに押す。
- 止血鉗子の先端が約2cm cの後喉頭部を切開部に切開し、止血鉗子のハンドルを開き、切開部の皮下に中空の「ポケット」を形成するために先端を広げる。これはポンプの設置場所になります。
- NTF4とポケット切開部位の治癒との相互作用を最小限にするために、挿入時にポンプ送達ポータルの端部を先に向けます。
- いずれかのNTF4生理食塩水50μLを7 14日間送達する。 7日群には6.72mg /日のNTF4を投与し、総投与量は47.04mgであった。 14日群は6.72mg /日を受け、総用量94.08mgのNTF4 25を与えた 。
- 5-0ナイロン縫合糸、止血鉗子を使用して、ポンプを配置するために作られた切開を閉じる。
- 彼らが麻酔から回復するにつれて、ラットを最低30分間観察する。モニタリングの完了基準は、動物が活動的になり、ケージの周りを移動し、水を飲み、グルーミングなどの他の正常な活動を開始することを含む。
- 動物を毎日監視する最初の1週間は、手術部位の治癒、正常な飼料および水の消費、尿/糞の通過、およびストレス、痛みまたは他の術後合併症の異常な行動徴候を観察することにより、
- ラットに痛みや苦痛があると思われる場合は、痛みを和らげるために、カルプロフェンの5mg / kg皮下注射を24時間毎に5日間まで与える。
- 感染が疑われる場合は、獣医に相談して、傷が適切に治癒するようにしてください。
- ラットが入っている実験群に応じて、糸からの刺激を防ぐために、手術の7-10日後に5-0ナイロン縫合糸を外す。
3.直接注射用ラットの麻酔
- 処置の前夜にラットの食物を控える。これにより、内視鏡または注射針を塞ぐ食物がないことが保証される。
- ラットを秤量し、アセプロマジン1〜2mg / kg体重を調製する。筋肉内に注射する（IMの場所は甲状腺機能亢進症の筋肉を残した）。
- 誘導箱にラットを置きます。 5％イソフルランおよび1 LO 2を有する誘導ボックス内の麻酔を誘導する。
- 2％イソフルランおよび600mLのO 2を用いてラットをノーズコーンに移動する。
- つま先または足を鉗子で挟むことによってラットが十分に麻酔されていることを確認する。ラットがピンチに反応しない場合、注入プロトコールを開始することができる。ラットが反射または筋収縮を伴ってつま先のつまみに反応する場合は、1-2分待ってピンチ試験を繰り返します。ラットが再び反応する場合、ラットを新しい動物に交換し、ステップ3.4から手順を繰り返す。
直接注入および視覚化
- NTF4または生理食塩水を含む無菌的に調製した50μL用量を、注入前に25℃に設定したH 2 O浴に30分間置く。
- プレキシガラスプラットホーム上の仰臥位およびリクライニング位置にラットを配置する（ 図2 ）。サスラットを前傾姿勢で、プラットホームの頂部を横切って引っ張られたガイドワイヤーを介して、前頭部の切歯から懸垂する。
- 50 mm、30ゲージ、100μLシリンジを1.9 mm、30°の洞内視鏡に取り付けます（ 図3 ）。
注：シリンジアセンブリは、カニューレを内視鏡の外壁にしっかりと保持する治具を介して取り付けられています。内視鏡は、声帯の視覚化および注射器の口腔内誘導を可能にする。カニューレ先端の位置は、各動物の前に調整され、先端が内視鏡視野（ 図4 ）によって完全かつ明確に視認可能であることを保証する。 - 舌を伸ばして横に動かすには、ゴムで先端を覆われた鉗子のペアを使用します。その後、口腔開存性を維持するためにプラスチックの鏡を挿入します。 1.5〜2 cmの長さに切断された5 mLのプラスチックシリンジバレルから検鏡を行い、切断された端をバリ取りして滑らかに研磨する。
- ロアーのライトを消すハロゲン光源を内視鏡に取り付ける。手順をキャプチャするには、ビデオレコーダーをオンにします。
- ラットの口に挿入したときにガラス先端に結露が発生するのを最小限にするために、内視鏡の遠位端を温水に数秒間浸します。
- モニターからの視覚フィードバックを使用して、針を注意深く左の声帯の領域に導く。
- 声帯に完全にアクセスするために、動物の呼吸サイクルの吸息段階で、溶液の注入に時間を合わせる。呼吸の吸気段階の間、声帯は完全に露出される。
- 声帯が完全に見えるようになったら、針を声帯の白い内側の縁の横方向に見られる左甲状腺腫に挿入します。注射針を適所に置いて、シリンジの押し込みによって注射液を送達する。
- 内視鏡とビデオプレーヤーのハロゲン光源をオフにして、オムライト。
- ラットをそのホームケージに戻し、加熱パッド上に置く。
- 加熱パッドから取り出す前にラットを回復させる。ケージ内の食品と水を交換してください。
- 注射後7日間ラットをモニターし、安楽死させる。凍結切除のための喉頭を取り除く24 。
5.ラットの安楽死
- ラットをケタミン塩酸塩およびキシラジン塩酸塩（100mg / kg体重当たり8mgの腹腔内注射）で麻酔する。
- 内側のthoracotomy後に放血によって安楽死させる。
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Representative Results
2週間の浸透圧ポンプ注入後またはNTF4の直接注入後1週間後にラットを安楽死させた。喉頭を収穫し、凍結保護剤（30％スクロースおよび70％リン酸緩衝生理食塩水）に入れ、次にクライオスタットで10μmの幅で連続的に切片化した。高齢の喉頭筋はNTF4の投与によって影響を受ける25 。若年ラットおよび老齢ラットに加えて、我々は、甲状腺機能亢進の筋肉の注入側および非注入側を比較した。典型的には、NTF4の投与経路に基づいて変化する、年齢とともに繊維サイズの変化を見る（ 図5 ）。より少ない線維症も、治療後に定性的に観察される。老化した繊維の割合は、老齢ラットにおいてNTF4の全身的および直接的適用によって低下する（ 図6 ）。 NMJの量も増加している（ 図7 ）。この増加の意義de処置の長さまたは投与経路に依存する。
図1：浸透圧ポンプの代表的な画像。ポンプにNTF4を充填した後、流量調整器を本体に挿入してポンプを密閉する。
図2：注入手順のためのプラットフォーム。ラットをプラットフォーム上の仰臥位に置き、プラットホームの頂部に取り付けられたガイドワイヤーを介して前側上部切歯によって懸架する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3：シリンジの代表的な画像 NTF4と生理食塩水の混合液でシリンジを満たしてください。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：注入手順。 （ A ）シリンジは、19.9mmの30度の内視鏡に連結されている（図示されている）。 （B）光の光をチェックして、手順の光があることを確認する。 （ C ）リアルタイムビデオは、針が正しい位置に誘導されることを保証する。
図5：繊維のサイズと形態の変化。代表者30ヵ月齢26,27,28 において、全身NTF4 7日間処置（右）および未処置（左）甲状腺筋のマトキシリンおよびエオシン染色切片。対照から処置動物までの繊維サイズの増加がある。 NTF4による治療は、30ヶ月の繊維サイズを、より若い6ヶ月齢の動物のものに変更する。 * p <0.05対30ヶ月（40倍の倍率で撮影;スケールバー=25μm、P <0.001）。上の図の矢印は、線維化の領域を指し示している。また、処置動物における線維症の質的低下もある。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6：インナーの変化NTF4治療との合意。代表的なNav1.5は30ヵ月齢の全身NTF4 14日処理（右）および未処理（左）甲状腺機能亢進筋からの切片を染色した（40倍の倍率で撮影;スケールバー=25μm）。 Na v1.5標識（緑色）によって年齢とともに脱神経が減少する。左パネルは、代表的なNa v 1.5（緑）およびファロイジンであり、未処理の甲状腺筋からの繊維（赤色）染色切片を示し、右パネルは、治療された筋肉である。緑色のインサートはNa v 1.5染色単独である。
図7：NTF4治療によるNMJの変化 αブンガロトキシン（緑色）で標識された異なる動物由来の全身性NTF4 14日処理甲状腺筋肉切片からのNMJの代表的蛍光顕微鏡画像およびファロイジン（赤色）は、NMJ数が30ヶ月でNTF4治療で増加することを示す（スケールバー=25μm）、（P <0.001） 11 。
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Discussion
喉頭の筋肉は、老化の好ましくない影響を受け易い。以前の研究では、収縮機能およびミオシンアイソフォームシフトの変化に加えて、繊維サイズの変化、繊維の総数、再生能力、NMJサイズおよび量の変化を含む老齢喉頭筋の変化が示されている4,11,27,30,31 。高齢の喉頭筋は、ニューロトロフィンの適用によって変化させることができる。これらの変化は容易に測定することができる。したがって、ラット喉頭筋は、老化および声帯疾患/障害の影響を研究するための有用なモデルを提供する。これらの筋肉の研究は、高齢者の介入や保護プロセスの開発にも役立つかもしれません。
NTF4の全身または直接適用の我々の方法は、老齢ラット喉頭でリモデリング反応を生じる筋肉。これは、神経栄養因子が加齢に関連する筋肉機能不全に治療可能性を有し得ることを実証する。ニューロトロフィンの直接的な適用は、注入ベクター25を通じた声の老化のヒトモデルに容易に変換することができる25 。
注入プロトコルを使用する際には、考慮すべき多くの要素があります。第1に、内視鏡の先端に鋭い針が取り付けられていることを考慮して、喉頭前庭周辺の軟組織への引っかき傷および損傷を防ぐために注意を払わなければならない。第2に、動物の呼吸サイクルの吸気段階の間に針先の喉頭への移動を計時することは、注射を正確に計時することを実践する。第3に、事前にコンピュータモニタ上の装置を視覚的に検査することによって、針先端がはっきりと見えるようにしてから、手順を試してください。第4に、内視鏡の先端を温水で数秒間温めることは、内視鏡の曇りを確実にする重要なステップであるスコープのヒントが回避されます。最後に、スコープ操作の前に夜間にラットを早くすることも重要です。食べ物が保留されていないと、咽頭に食物残渣が残っている可能性が高くなります。そのため、注射手順は事実上不可能になります。ラットは毎日脱水症状の兆候がないか検査し、体重の10％を超える重大な体重減少がないことを確認するように体重を測定する必要があります。
プロトコールの開発における2つの重要なステップは、注射器を内視鏡に取り付けること、および口腔検鏡を使用することであった。スコープの挿入および注射のための片手操作を容易にするためには、シリンジアセンブリのしっかりした固定が必要でした。この研究の目標を考慮すると、声帯の注入を誘導するための直接視覚化がない場合、実験は実現できなかった。さらに、口腔鏡を作成することは、舌が動くのを防ぎ、眼を維持するために重要であると考えられたプロシージャ全体を通して喉頭蓋が開いている。
視覚誘導注射法は、シリンジと針を内視鏡にしっかりと固定する最適な手段を見つけることに主に関連するいくつかの修正を行った。いくつかの異なる形態のテープ接着剤を試験した後、市販の弾性アスレチックテープがシリンジを内視鏡本体に固定する最良の手段であることが判明した。
視覚誘導注射法の最大限の制限は、計装に関連するものではなく、咽頭および気道の特許を有する必要性に関するものであった。処置の24時間前に食物を制限することで、この問題のほとんどが解決されましたが、ラットは寝具や糞便を含めたケージに何かを摂取します。これが起こったとき、2つの解決策があった：（1）動物が咽頭を自然に浄化するまで注射を延期する、または（2）鉗子を用いて手動で詰まりを取り除こうとする。私たちの経験だったeは、動物の咽頭領域の潜在的な傷害のリスクを低減したため、前者がより良い選択肢であったことを示しています。
このプロトコールの新規性および声帯に化合物を直接注入する必要性があるので、他の信頼できる方法は存在しない。動物の喉頭系のサイズが小さいので、生きている動物に化合物を正確かつ一貫して配置するための唯一の方法で口腔および咽頭領域を視覚的に誘導する。声帯を直接注射する唯一の他の手段は、喉頭の皮膚および軟骨を通して外部の位置からそうすることを試みることでした。この方法は、喉頭ジストニアを軽減するためにボツリヌス毒素療法を受けているヒトにおいて首尾よく行われるが、経皮的注射法は小動物では実現不可能である。
この技術は堅牢であり、声帯の注射だけでなく、注射部位のために使用することができる咽頭および口腔領域。さらに、この方法は、シリンジを取り外すことによって動物の咽頭および喉頭領域を簡単に視覚的に監視するように適合させることができる。
要約すると、この注射方法は、ヒトの加齢に関連した声機能不全の治療に関連する生物学的メカニズムを研究するための新規な手段である。この方法はまた、人間の発声、声機能、コミュニケーション、および嚥下に影響を及ぼす他の疾患モデルに適用する可能性を有する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、国立難聴者およびその他のコミュニケーション障害研究所（R21DC010806からCAMおよびJCSおよびR01DC011285からCAMへの助成金）の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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