Summary
Здесь мы представляем протокол для описания использования нейротрофина 4 (NTF4) системно и непосредственно для ремоделирования мышц гортани, стареющих на коже.
Abstract
Дисфункция гортани у пожилых людей является основной причиной инвалидности: от нарушений речи до дисфагии и потери защитных рефлексов дыхательных путей. Немногие, если таковые имеются, существуют методы лечения возрастной дисфункции гортани. Нейротрофины участвуют в мышечной иннервации и дифференциации нервно-мышечных узлов (NMJ). Считается, что нейротрофины усиливают нервно-мышечную передачу путем увеличения высвобождения нейротрансмиттеров. Нервно-мышечные соединения (NMJ) становятся меньше и менее многочисленны в стареющих мышцах гортани крысы, что свидетельствует о функциональной денервации. Мы изучили влияние NTF4 для будущего клинического применения в качестве терапевтического средства для улучшения функции старения человеческих гортанных мышц. Здесь мы предоставляем подробный протокол для системного применения и прямого впрыска NTF4 для изучения способности стареющей мышцы гортани крысы ремоделировать в ответ на применение NTF4. В этом методе крысы либо получали NTF4 либо системно через oSmotic насоса или путем прямого впрыска через голосовые складки. Затем мышцы гортани были рассечены и использованы для гистологического исследования морфологии и возрастной денервации.
Introduction
Мышцы гортани быстро и последовательно сокращаются и подвержены неблагоприятным последствиям старения. Считается, что эта постоянная активность способствует голодным проблемам или дисфагии, наблюдаемым у лиц старше 65 лет 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Несколько молекулярных и патофизиологических механизмов способствуют этой возрастной дисфункции. Эти механизмы могут включать ремоделирование слизистой оболочки гортани, атрофию или потерю мышечных волокон, отсутствие регенерации мышечных волокон или атрофию, которая вызывает поклоны голосовых складок и неспособность закрыть лоскут 8 , 9 , 10 , 11 . В настоящее время нет доказанной медицинской терапии, которая можетПредотвращают или реабилитируют эти возрастные изменения в этих мышцах.
Модуляция эффективности нервно-мышечной передачи может значительно влиять на работу нейромотора. Семейство нейротрофинов включает фактор роста нервов (NGF), фактор роста нервных клеток мозга (BDNF), нейротрофин 3 (NTF3) и NTF4 12 , 13 . Показано, что нейротрофины модулируют синаптическую эффективность 1 , 4 . Фактор роста гепатоцитов, трансформирующий фактор роста бета и фактор роста фибробластов, недавно были использованы у людей для лечения рубцов 15-17 лет . NTF4 также регулирует эффективность NMJ; Мышей, не имеющих NTF4, показывают разобранные NMJs 11 , 18 , 19 . Эти исследования приводят к многообещающим последствиям леченияТ стареющих расстройств гортани и денервации с факторами роста.
Терапия прямой инъекции тканям голосовых складок не является беспрецедентной для человека. Например, местные инъекции ботулинического токсина в настоящее время используются в качестве эффективного лечения нарушений неврологического движения, которые влияют на мышцы гортани, такие как спазматическая дисфония и двусторонний рецидивирующий паралич гортани нерва 20 , 21 . Гигель гиалуроновой кислоты является еще одним инъекционным средством, которое используется для лечения шрамов вокальных складок и гортанной недостаточности 22 , 23 . Инъекционная ларингопластика может использоваться для лечения различных нарушений связи 24 . Эти прямые методы инъекции обещают улучшить вокальную функцию и глотать в популяциях старения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Используйте крыс норвежских самцов Fischer 344-Brown в возрасте 6 и 30 месяцев для этого протокола. Крыс получали из Национального института стареющей колонии грызунов. Мы использовали крыс для этого исследования, потому что структура гортани крысы аналогична структуре человека, функционально служащей для защиты дыхательных путей и видоспецифических вокализаций. Это исследование проводилось в соответствии с Политикой PHS по увлажнению и использованию лабораторных животных, Руководство NIH по уходу и использованию лабораторных животных и Закон о благосостоянии животных (7 USC и последующие); Протокол об использовании животных был одобрен Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Кентукки.
1. Анестезия крыс
- Подготовьте анестетики, смешав кетамин гидрохлорид (диссоциативный анестетик) и гидрохлорид ксилазина (седативный и обезболивающий) в забуференном физиологическом растворе. Концентрации кетамина и ксилазина в конечном растворе составляют 100 мг / 8 мг на кгВес тела соответственно.
- Внедрить анестетики в крысу путем внутрибрюшинного введения с использованием шприца с иглой 25 G.
- Определите, что крысу достаточно обезболивают, зажав носок или ногу щипцами. Если крыса не реагирует на щепотку, операция может начаться. Если крыса реагирует на пальцы ног с рефлекторными или мышечными сокращениями, подождите 1-2 минуты и повторите тест пинча. Если крыса снова реагирует, замените крысу новым животным и повторите процедуру, начиная с шага 1.2.
- Нанесите офтальмическую мазь на глаза крысы, после того как крыса неподвижна, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
2. Имплантация осмотического насоса
- Поместите крысу вентральную на асептической хирургической области. Администрирование meloxicam как preanesthetic лекарства. Администрирование внутрибрюшинно в дозе 1-4 мг / кг массы тела с помощью шприца с иглой 25 G.
- Используйте клиперы для удаления аппроксимацииTely 1 "x 1" квадрат меха из затылка и приблизительно 1 "хвостовой части пространства между плечами. Бритьйте как можно ближе к коже.
- Смочите спину и шею дезинфицирующим этанолом (70%).
- После бритья, вытрите спинной аспект шеи с 3 скрабами в последовательности йодной спиртовой отделки спиртом.
- Поддерживайте температуру тела крысы, помещая ее на нагревательную подушку, установленную на 34 ° C.
- Заполните асептически подготовленные осмотические насосы с 50 мкл NTF4 или физиологическим раствором для системной обработки NTF4 ( рисунок 1 ).
- Используйте скальпель, чтобы сделать горизонтальный разрез шириной около 2 см по коже, просто черепно, чтобы пространство между лопатками. Поднимите задний край разреза с помощью щипцов одной рукой, вставляя кончик гемостатов и осторожно выдвигая назад к разрезу.
- После того, как кончик гемостаза составляет приблизительно 2 см cРанион к разрезу, откройте ручки на гемостатах, расширяя кончики, чтобы сформировать полый «карман» подкожный участок разреза. Это будет место размещения насоса.
- Сначала ориентируйтесь на портал доставки насоса при вставке, чтобы свести к минимуму любое взаимодействие NTF4 и исцеление участка разрезания кармана.
- Доставьте 50 мкл солевого раствора NTF4 в течение 7-14 дней. 7-дневная группа получала 6,72 мг / день NTF4 для общей дозы 47,04 мг. 14-дневная группа получала 6,72 мг / сут для общей дозы 94,08 мг NTF4 25 .
- Используйте шовную нить 5-0, гемостаты и щипцы, чтобы закрыть разрез, сделанный для размещения насоса.
- Наблюдайте за крысами в течение минимум 30 минут, когда они оправляются от анестезии. Критерии для завершения мониторинга включают в себя активное животное, перемещение вокруг клетки, питьевую воду и начало других обычных видов деятельности, таких как уход.
- Ежедневный мониторинг животныхВ течение первой недели, наблюдая за исцелением хирургического участка, нормальным питанием и потреблением воды и прохождением мочи / фекалий и любыми аномальными поведенческими признаками стресса, боли или других послеоперационных осложнений.
- Если крыса испытывает боль или дистресс, предоставьте крысе 5 мг / кг подкожной инъекции карпрофена один раз каждые 24 часа в течение 5 дней для облегчения боли.
- Если есть инфекция, обратитесь к ветеринару, чтобы убедиться, что рана заживает должным образом.
- В зависимости от того, в какой экспериментальной группе крыса внутри, удалите 5-0 нейлоновый шов на 7-10 дней после операции, чтобы предотвратить раздражение нити.
3. Анестезия крыс для прямой инъекции
- Удерживайте пищу у крыс в ночь перед процедурой. Это гарантирует отсутствие пищи для блокировки эндоскопа или инъекционной иглы.
- Взвесьте крысы и подготовьте ацепромазин 1-2 мг / кг массы тела. Внедрение внутримышечно (расположение IM являетсяЛевая щитовидная мышца).
- Поместите крысу в индукционную коробку. Вызывают анестезию в индукционной коробке с 5% изофлураном и 1 LO 2 .
- Переместите крысу в носовой конус с 2% изофлураном и 600 мл O 2 .
- Определите, что крысу достаточно обезболивают, зажав носок или ногу щипцами. Если крыса не реагирует на пинч, тогда может начаться протокол инъекции. Если крыса реагирует на пальцы ног с рефлекторными или мышечными сокращениями, подождите 1-2 минуты и повторите тест пинча. Если крыса снова реагирует, замените крысу новым животным и повторите процедуру, начиная с шага 3.4.
4. Прямая инъекция и визуализация
- Поместите асептически приготовленные 50 мкл дозы, содержащие NTF4 или физиологический раствор, в ванну с H 2 O, установленную до 25 ° C в течение 30 минут перед инъекцией.
- Поместите крысу в положение спины и откинутого на платформу из плексигласа ( рис. 2 ). СусОткинуть крысу в откинутой позе от их фронтальных верхних резцов через направляющую проволоку, нанизанную на верхнюю часть платформы.
- Прикрепите шприц объемом 50 мм, 30 калибра, 100 мкл к эндоскопическому синусовому углублению диаметром 1,9 мм ( рис. 3 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Узел шприца прикреплен через зажимное приспособление, которое крепко удерживает канюлю на внешней стенке эндоскопа. Эндоскоп позволяет визуализировать вокальные складки и наведение шприца внутриродовым. Положение наконечника канюли регулируют перед каждым животным, чтобы убедиться, что наконечник полностью и четко виден через эндоскопическое изображение ( рисунок 4 ). - Используйте удлиненные язычки с помощью резиновых наконечников и передвиньте их в боковом направлении. После этого вставьте пластиковое зеркало для поддержания проницаемости для полости рта. Сделайте зеркало из 5-миллилитрового пластикового шприца, который разрезается на длину от 1,5 до 2 см, при этом режущие кромки отшлифованы и полируются ровно.
- Выключить свет в рулеМ и подключить галогенный источник света к эндоскопу. Включите видеомагнитофон, чтобы выполнить процедуру.
- Погрузите дистальный конец эндоскопа в теплую воду на несколько секунд, чтобы свести к минимуму развитие конденсации на стеклянном наконечнике при вставке в рот крысы.
- Используя визуальную обратную связь с монитором, аккуратно направляйте иглу в область левой вокальной складки.
- Время инъекции раствора с инспираторной фазой цикла дыхания животных для полного доступа к голосовой складке. Во время вдоха фаза дыхания вокальная складка полностью раскрывается.
- Как только вокальная сгиб будет полностью виден, вставьте иглу в левый тироартеноид, расположенный сбоку от белого медиального края вокальной складки. С иглой на месте, доставить инъекции через нажатие шприца.
- Отключите галогенный источник света на эндоскопе и видеоплеере и вернитесь на руОм.
- Верните крысу в свою домашнюю клетку и поместите на грелку.
- Позвольте крысе восстановить до удаления с грелки. Замените пищу и воду в клетке.
- Контролируйте крыс в течение 7 дней после инъекции, а затем эвтаназируйте. Удалите ларинги для криосекции 24 .
5. Эвтаназия крыс
- Анестезируйте крыс с помощью гидрохлорида кетамина и гидрохлорида ксилазина (100 мг / 8 мг на кг массы тела, вводимого внутрибрюшинно).
- Усыплять кровотечением после медиальной торакотомии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Крыс подвергали эвтаназии через 2 недели после введения осмотического насоса или через 1 неделю после прямой инъекции NTF4. Ларинги собирали, помещали в криопротектор (30% сахарозу и 70% забуференный фосфатом физиологический раствор), а затем последовательно секционировали с шириной 10 мкм с помощью криостата. Старение мышц гортани зависит от введения NTF4 25 . В дополнение к молодой и старой крысе мы сравнили инъецированную и неинъекционную сторону щитовидной железы. Как правило, мы видим изменение размера волокна с возрастом, которое варьируется в зависимости от пути введения NTF4 ( рисунок 5 ). Менее фиброз также качественно наблюдается после лечения. Процент денервированных волокон снижается при системном и прямом применении NTF4 у пожилых крыс ( рис. 6 ). Увеличивается также количество NMJs ( рис. 7 ). Значение этого увеличения В зависимости от продолжительности лечения или пути введения.
Рисунок 1: Репрезентативное изображение осмотического насоса. После заполнения насоса NTF4 в основной корпус встроен вентилятор потока для уплотнения насоса.
Рисунок 2: Платформа для процедуры впрыска. Крысу помещают в лежачее положение на платформе и подвешивают передние верхние резцы через направляющий провод, установленный на верхней части платформы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Типичное изображение шприца. Заполните шприц NTF4 и солевой смесью. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Процедура впрыска. ( A ) Шприц соединен с эндоскопическим эндопротезом 19,9 мм (показанный); (B) Оптический свет проверяется, чтобы убедиться в наличии света для процедуры; ( C ) Видео в реальном времени гарантирует, что игла направляется в нужное место.
Рисунок 5: Изменение размера волокна и морфологии. ПредставительМатоксилин и эозин окрашенные участки системных NTF4 7-дневных обработанных (правых) и необработанных (левых) щитовидных мышц в возрасте 30 месяцев 26 , 27 , 28 . Увеличивается размер волокна от контроля до обработанных животных. Обработка NTF4 изменяет размер волокна в 30 молей по сравнению с молодым 6-месячным животным. * P <0,05 против 30 месяцев (снимки были сняты при 40-кратном увеличении, шкала шкалы = 25 мкм, P <0,001). Стрелки в верхней картине указывают на область фиброза. Также наблюдается качественное снижение фиброза у обработанных животных. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изменения во внутреннемС лечением NTF4. Типичные окрашенные пятна Nav1.5 из системных NTF4 14-дневных обработанных (правых) и необработанных (левых) тиреоритеноидных мышц в возрасте 30 месяцев (снимки были захвачены при 40-кратном увеличении, шкала шкалы = 25 мкм) 29 . Существует снижение денервации с возрастом маркировкой Na v 1.5 (зеленый). Левая панель представляет собой типичный Na v 1.5 (зеленый) и фаллоидин, чтобы обозначить волокна (красные) окрашенные участки из необработанных щитовидных мышц, на правой панели обработаны мышцы. Зеленая вставка - однократное окрашивание Na v 1.5.
Рисунок 7: Изменения в NMJ с обработкой NTF4. Репрезентативные изображения флуоресцентной микроскопии NMJs из системных NTF4 14-дневных обработанных участков щитовидной мышцы от разных животных, помеченных α-бунгаротоксином (зеленым) иPhalloidin (красный), показывающий, что число NMJ увеличивается с обработкой NTF4 через 30 месяцев (шкала шкалы = 25 мкм), (P <0,001) 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мускулы гортани уязвимы к неблагоприятным последствиям старения. Предыдущие исследования продемонстрировали изменения в стареющих мышцах гортани, которые включают изменения размера волокна, общее количество волокон, регенеративную способность, размер и количественные изменения NMJ, в дополнение к вариациям сократительной функции и сдвигам изоформы формы миозина 4 , 11 , 27 , 30 , 31 , Старение мышц гортани может быть изменено путем применения нейротрофинов. Эти изменения можно легко измерить. Поэтому мышцы гортани крысы являются полезной моделью для изучения эффектов старения и вокальных заболеваний / расстройств. Изучение этих мышц также может помочь в развитии вмешательств или защитных процессов у стареющего человека.
Наш метод системного или прямого применения NTF4 дает ответ ремоделирования в стареющей крысиной гортанимышцы. Это демонстрирует, что нейротрофины могут иметь терапевтический потенциал в отношении дисфункции мышц, связанных со старением. Прямое применение нейротрофинов может быть легко переведено на человеческую модель вокального старения, хотя инъекционные векторы 25 .
При использовании протокола впрыска следует учитывать много факторов. Во-первых, необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить царапины и повреждение мягких тканей вокруг гортани, поскольку кончик эндоскопа имеет острую иглу. Во-вторых, синхронизация движения наконечника иглы в гортани во время вдоха фазы дыхания животных требует практики для точного времени инъекции. В-третьих, убедитесь, что наконечник иглы хорошо виден до начала процедуры, предварительно осмотрев устройство на мониторе компьютера. В-четвертых, нагревание кончика эндоскопа в горячей воде в течение нескольких секунд является важным шагом, чтобы убедиться, что запотевание эндоОбводку наконечника избегают. Наконец, важно также быстро вытащить крысу за ночь до какой-либо процедуры осмотра. Если пища не удерживается, весьма вероятно, что у них все еще будут остатки пищи в глотке, что делает процедуру инъекции практически невозможной. Крыс следует ежедневно проверять на предмет признаков обезвоживания и взвешивать, чтобы убедиться, что значительная потеря веса не превышает (более 10% от массы тела).
Двумя критическими шагами в разработке протокола были прикрепление шприца к эндоскопу и использование устного зеркала. Твердое закрепление узла шприца было необходимо для облегчения односторонней работы для вставки и впрыска. Учитывая цели исследования, в отсутствие прямой визуализации для руководства инъекцией вокальной складки эксперимент не мог быть реализован. Кроме того, создание устного зеркала было признано важным для предотвращения перемещения языка и поддержания егоE epiglottis открыта на протяжении всей процедуры.
Визуально управляемый метод инъекции проходил несколько раундов модификации, в основном связанных с поиском оптимальных способов надежного закрепления шприца и иглы в эндоскопе. После тестирования нескольких различных типов ленточных клеящих веществ было обнаружено, что коммерчески доступная эластичная спортивная лента является лучшим средством крепления шприца к корпусу эндоскопа.
Наибольшее ограничение визуально управляемого метода инъекции не было связано с прибором, а скорее с необходимостью иметь патентную глотку и дыхательные пути. Хотя, ограничивая пищу в течение 24 часов до процедуры, решая большую часть этой проблемы, крысы будут глотать что-либо в своих клетках, включая постельные принадлежности и фекалии. Когда это произошло, было два решения: (1) отложить инъекцию до тех пор, пока животное не очистит их глотку естественным образом, или (2) попытайтесь удалить блокировку вручную с помощью щипцов. Это был наш опытE, что первое было лучшим вариантом, поскольку это уменьшило риск потенциального повреждения животного области глотки.
Учитывая новизну этого протокола и необходимость непосредственного введения вокальной складки соединением, никаких других надежных методов не существует. Учитывая небольшой размер системы гортани животных, визуально управляемая инъекция через полость рта и глотки единственным способом обеспечить правильное и последовательное размещение соединения в живом животном. Единственным другим способом непосредственного введения вокальной складки было попытку сделать это из внешнего положения через кожу и хрящ гортани. Хотя этот метод успешно выполняется у людей, проходящих терапию ботулинического токсина, чтобы облегчить гортанные дистонии, методы чрескожной инъекции нецелесообразны у мелких животных.
Этот метод является надежным и может использоваться не только для инъекции вокальной складки, но и для мест инъекции в пределахГлотки и полости рта. Кроме того, этот способ может быть адаптирован для простого визуального мониторинга животного фарингала и гортанной области путем удаления шприца.
Таким образом, этот метод инъекции является новым средством изучения биологических механизмов, связанных с лечением дисфункций голода, связанных с возрастом у людей. Этот метод также может быть применен к другим моделям болезней, которые влияют на озвучивание, вокальную функцию, общение и глотание у людей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального института глухоты и других нарушений связи (R21DC010806 - CAM и JCS и R01DC011285 - CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
