Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva användningen av neurotropin 4 (NTF4) systemiskt och direkt för att omforma råtta åldrande laryngeala muskler.
Abstract
Laryngeal dysfunktion hos äldre är en viktig orsak till funktionshinder, från röststörningar till dysfagi och förlust av luftvägsskyddande reflexer. Få, om några, terapier existerar som riktar åldersrelaterad laryngeal muskel dysfunktion. Neurotropiner är involverade i muskelinnervation och differentiering av neuromuskulära korsningar (NMJ). Det anses att neurotrofiner förbättrar neuromuskulär överföring genom ökad frigöring av neurotransmittorer. De neuromuskulära förbindelserna (NMJ) blir mindre och mindre rikliga i åldrande råtta laryngeala muskler, med bevis på funktionell denervering. Vi undersökte effekterna av NTF4 för framtida klinisk användning som terapeutisk för att förbättra funktionen vid åldrande mänskliga larynxmuskler. Här tillhandahåller vi det detaljerade protokollet för systemisk applicering och direkt injektion av NTF4 för att undersöka förmågan att åldra råtta laryngeal muskel för att remodel som svar på NTF4 applikation. Vid denna metod fick råttor antingen NTF4 antingen systemiskt via oSmotisk pump eller genom direkt injektion genom vokalvecken. Laryngeala muskler disserades sedan och användes för histologisk undersökning av morfologi och åldersrelaterad denervering.
Introduction
Laryngeala muskler samverkar snabbt och konsekvent och är sårbara för de negativa effekterna av åldrande. Denna konstanta aktivitet är tänkt att bidra till röstproblem eller dysfagi observerad hos personer över 65 år 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Flera molekylära och patofysiologiska mekanismer bidrar till denna åldersrelaterade dysfunktion. Dessa mekanismer kan innefatta ombyggnad av laryngeal slemhinna, muskelfiberatrofi eller förlust, brist på regenerering av muskelfibrer eller atrofi som orsakar böjning av vokalvecken och oförmåga hos glottisluckan 8 , 9 , 10 , 11 . Det finns ingen bevisad medicinsk terapi vid denna tidpunkt som kan kommaFörhindra eller rehabilitera dessa åldersrelaterade förändringar i dessa muskler.
Modulering av effektiviteten hos neuromuskulär överföring kan kraftigt påverka neuromotorisk prestanda. Familjen av neurotrofiner innefattar nervtillväxtfaktor (NGF), hjärnavledd nervtillväxtfaktor (BDNF), neurotrofin 3 (NTF3) och NTF4 12 , 13 . Neurotrofiner har visat sig modulera synaptisk effekt 1 , 4 . Hepatocyttillväxtfaktor, transformerande tillväxtfaktor beta och fibroblasttillväxtfaktor har nyligen använts hos människor för behandling av vokalviktärrbildning 15-17 . NTF4 reglerar också NMJ effektivitet; Möss som saknar NTF4 visar demonterade NMJs 11 , 18 , 19 . Dessa studier leder till lovande effekter av behandlareT av åldrande laryngeala muskelstörningar och denervering med tillväxtfaktorer.
Direktinjektionsbehandling till vävnaderna i vokalvecken är inte ovanligt hos människor. Till exempel används lokala injektioner av botulinumtoxin för närvarande som en effektiv behandling för neurologiska rörelsestörningar som påverkar musklerna i struphuvudet, såsom spasmodisk dysfoni och bilateral återkommande laryngeal-förlamning 20 , 21 . Hyaluronsyrahydrogel är en annan injicerbar, som används för att behandla vokalviktskramning och glottinsufficiens 22 , 23 . Injektionslaryngoplasti kan användas för att behandla en rad kommunikationsstörningar 24 . Dessa direkta injektionsmetoder håller lov att förbättra vokalfunktionen och svälja i åldrande populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Använd manliga Fischer 344-Brown Norway råttor vid 6 och 30 månader för detta protokoll. Råttor erhölls från National Institute of Aging gnagarkoloni. Vi använde råttor för denna studie eftersom strukturen hos råtta struphuvudet liknar den hos människa, som fungerar funktionellt för luftvägsskydd och artsspecifika vokaliseringar. Denna studie utfördes i enlighet med PHS-politiken för humanvård och användning av laboratoriedjur, NIH Guide för vård och användning av laboratoriedjur och djurskyddslagen (7 USC et seq.); Protokollet om djuranvändning godkändes av Institutionen för djurvård och användningskommitté (IACUC) vid University of Kentucky.
1. Anestesi hos råttor
- Förbered anestetika genom att blanda ketaminhydroklorid (dissociativ anestetik) och xylazinhydroklorid (lugnande och smärtstillande) i buffrad saltlösning. Koncentrationerna av ketamin och xylazin i den slutliga lösningen är 100 mg / 8 mg per kgKroppsvikt respektive
- Injicera anestetika i råttan genom intraperitoneal administrering med hjälp av en spruta med en 25 G nål.
- Bestäm att råttan är tillräckligt bedövad genom att klämma tån eller foten med tångar. Om råttan inte reagerar på nypa, kan operationen börja. Om råtta reagerar på tånklämman med reflex eller muskelkontraktioner, vänta sedan 1-2 min och repetera klämprovet. Om råttan reagerar igen, ersätt råttan med ett nytt djur och upprepa proceduren som börjar från steg 1.2.
- Applicera oftalmisk salva mot råttans ögon, efter att råtta är immobil, för att förhindra att hornhinnorna torkar ut.
2. Implantation av osmotisk pumpe
- Placera råttan ventral på det aseptiska kirurgiska området. Administrera meloxicam som preanestetisk medicinering. Administrera intraperitonealt i en dos av 1-4 mg / kg kroppsvikt med en spruta med en 25 G nål.
- Använd klippare för att ta bort en approximaTely 1 "x 1" kvadrat päls från nacken och ca 1 "caudal mellanrum mellan axlarna. Rak så nära huden som möjligt.
- Vattna ryggen och nacken med desinficerande etanol (70%).
- Efter rakning, skrubba den dorsala aspekten av nacken med 3 skrubber i följd av jodalkoholbehandling med alkohol.
- Bibehålla kroppstemperaturen hos råttan genom att placera den på en värmepanna ställd till 34 ° C.
- Fyll aseptiskt beredda osmotiska pumpar med antingen 50 μL NTF4 eller saltlösning för systemisk NTF4-behandling ( Figur 1 ).
- Använd en skalpell för att göra ett horisontellt snitt ca 2 cm bredt genom huden, bara kranialt till utrymmet mellan scapulae. Lyft in den bakre kanten av snittet med tångar med en hand medan du sätter ihop hemostatsspetsen och försiktigt trycker bakre på snittet.
- Efter spetsen av hemostaten är ca 2 cm cRöra sig till snittet, öppna handtagen på hemostaten, expandera spetsarna för att bilda en ihålig "ficka" subkutan till snittet. Detta blir placeringsplatsen för pumpen.
- Orientera pumpleveransportaländen först vid införandet för att minimera eventuell interaktion av NTF4 och läkning av fickinsnittplatsen.
- Leverera 50 μl NTF4 saltlösning för antingen 7 14 dagar. 7-dagarsgruppen fick 6,72 mg / dag av NTF4 för en total dos på 47,04 mg. 14 dagarsgruppen fick 6,72 mg / dag för en total dos av 94,08 mg NTF4 25 .
- Använd 5-0 nylon suturgänga, hemostater och tång för att stänga snittet för pumpplacering.
- Observera råttorna i minst 30 minuter när de återhämtar sig från anestesi. Kriterier för att uppfylla övervakningen innefattar att djuret blir aktivt, rör sig om buret, dricksvatten och börjar andra normala aktiviteter som grooming.
- Övervaka djur dagligenUnder den första veckan genom att observera läkning av kirurgisk plats, normal foder- och vattenförbrukning och överföring av urin / avföring och eventuella abnorma beteendemässiga tecken på stress, smärta eller andra postoperativa komplikationer.
- Om råtta verkar vara i smärta eller nöd, ge råttan en 5 mg / kg subkutan injektion av carprofen en gång var 24: e timme i upp till 5 dagar för att lindra smärta.
- Om det förefaller vara en infektion, konsultera en veterinär för att såret ska läka ordentligt.
- Beroende på vilken försöksgrupp råttan är i, ta bort 5-0 nylon suturen 7-10 dagar efter operationen för att förhindra irritation från tråden.
3. Anestesi hos råttor för direkt injektion
- Håll mat från råttorna natten före proceduren. Detta säkerställer att det inte finns mat för att blockera endoskopet eller injektionsnålen.
- Väg råttor och förbered acepromazin 1-2 mg / kg kroppsvikt. Injicera intramuskulärt (IM-platsen ärVänster thyroarytenoid muskel).
- Placera råttan i induktionsboxen. Inducerar anestesi i induktionsboxen med 5% isofluran och 1 LO2.
- Flytta råttan till en näskon med 2% isofluran och 600 ml O2.
- Bestäm att råttan är tillräckligt bedövad genom att klämma tån eller foten med tångar. Om råttan inte reagerar på nypa, kan injektionsprotokollet börja. Om råtta reagerar på tånklämman med reflex eller muskelkontraktioner, vänta sedan 1-2 min och repetera klämprovet. Om råttan reagerar igen, ersätt råttan med ett nytt djur och upprepa proceduren som börjar från steg 3.4.
4. Direkt injektion och visualisering
- Placera aseptiskt beredda 50 μl doser innehållande NTF4 eller saltlösning i ett H2O-bad satt till 25 ° C under 30 minuter före injektion.
- Placera råttan i en bakre och lutande position på en plexiglasplattform ( Figur 2 ). SusPendra råttan i den lutande hållningen från sina främre frambringar med hjälp av en styrtråd spänd över plattformens övre del.
- Fäst en 50 μl, 30 gauge, 100 μL spruta till ett 1,9 mm, 30 ° sinus endoskop ( Figur 3 ).
ANMÄRKNING: Sprutaaggregatet är fastsatt via en jig som håller kanylen fast mot endoskopets yttervägg. Endoskopet möjliggör visualisering av vokalvecken och styrningen av sprutan intraoralt. Kanylspetsens position ställs in före varje djur för att säkerställa att spetsen är fullständigt och tydligt synlig via endoskopisk vy ( Figur 4 ). - Använd ett gummipippat par tångar för att förlänga tungan och röra den i sidled. Därefter sätter du in ett plastspekulum för att hålla oral patency. Gör spekulatet ur en 5 ml plast sprutkolv som är skuren i en längd av 1,5 till 2 cm, med skurna kanter avböjda och polerade släta.
- Stäng av lamporna i rooM och fäst en halogenljuskälla till endoskopet. Slå på videobandspelaren för att fånga proceduren.
- Fördjupa endoskopets distala ände i varmt vatten i några sekunder för att minimera utvecklingen av kondens på glasspetsen när den sätts in i råttans mun.
- Använd visuell återkoppling från monitorn, var noga med att styra nålen till området för vänster vokalvals.
- Tidsinjicera lösningen med inspirationsfasen av djurens respirationscykel för att få tillgång till vokalvalsen. Under inspirationsfasen av andning är vokalväggen helt utsatt.
- När vokalvecken är helt synlig, sätt in nålen i vänster thyroarytenoid, som hittas i sidled mot den vita medialkanten av vokalvecken. Med nålen på plats, leverera injektionssprut genom depression av sprutan.
- Stäng av halogenljuskällan på endoskopet och videospelaren och sätt tillbaka på roOm ljus.
- Återför råttan till sin hemmabur och placera den på en värmepanna.
- Låt råttan återhämta sig före avlägsnande från värmepuden. Byt mat och vatten i buret.
- Övervaka råttor i 7 dagar efter injektionen och sedan euthanize. Ta bort laryngerna för kryosektion 24 .
5. Euthanization av råttor
- Bedöda råttor med ketaminhydroklorid och xylazinhydroklorid (100 mg / 8 mg per kg kroppsvikt injicerad intraperitoneal injektion).
- Euthanize av exsanguination efter en medial thoracotomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Råttorna avlivades efter 2 veckor av osmotisk pumpinfusion eller 1 vecka efter direkt injektion av NTF4. Larynger skördades, placerades i kryoskyddande medel (30% sackaros och 70% fosfatbuffrad saltlösning) och sedan seriellt snittad i 10 μm bredder med en kryostat. Åldrande larynxmuskler påverkas av administrering av NTF4 25 . Förutom unga och gamla råttor jämförde vi den injicerade och icke-injicerade sidan av thyroarytenoidmusklerna. Vanligtvis ser vi en förändring i fiberstorlek med ålder, vilket varierar beroende på administreringsväg för NTF4 ( Figur 5 ). Mindre fibros observeras också kvalitativt efter behandling. Procenten av denerverade fibrer minskar med systemisk och direkt applicering av NTF4 hos åldrade råttor ( Figur 6 ). Mängden NMJ ökar också ( Figur 7 ). Betydelsen av denna ökning de Beror på längden av behandlingen eller administreringssättet.
Figur 1: Representativ bild av osmotisk pump. Efter att pumpen fyllts med NTF4 sätts flödesmoderatorn i huvudkroppen för att täta pumpen.
Figur 2: Plattform för injektionsförfarande. Råttan är placerad i en bakre hållning på plattformen och upphängd av de främre övre snedställningarna via en ledningstråd monterad på toppen av plattformen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
Figur 3: Representativ bild av sprutan. Fyll in sprutan med NTF4 och saltlösning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Injektionsförfarande. ( A ) Sprutan kopplas till ett 19,9 mm 30 ° endoskop (visat); (B) Det optiska ljuset kontrolleras för att säkerställa att det finns ljus för proceduren. ( C ) Realtidsvideoen säkerställer att nålen styrs till rätt plats.
Figur 5: Förändringar i fiberstorlek och morfologi. Representant hanMatoxylin och eosinfärgade sektioner av systemisk NTF4 7-dagars behandlad (höger) och obehandlad (vänster) thyroarytenoid muskler vid 30 månaders ålder 26 , 27 , 28 . Det finns en ökning av fiberstorleken från kontroll till behandlade djur. Behandling med NTF4 ändrar 30-mo-fiberstorleken till det hos ett yngre 6 månader gammalt djur. * P <0,05 mot 30 månader (bilderna fångades vid 40X förstoring; Skala bar = 25 μm, P <0,001). Pilar i toppbilden pekar på ett område av fibros. Det finns också en kvalitativ minskning av fibros i de behandlade djuren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Förändringar i InnerBehandlingar med NTF4-behandling. Representativa Nav1.5-färgade sektioner från systemisk NTF4 14-dagars behandlad (höger) och obehandlade (vänster) thyroarytenoidmuskler vid 30 månaders ålder (bilderna fångades vid 40X förstoring; Skala bar = 25 μm) 29 . Detervärdet minskas med ålder med Na v 1.5-märkning (grön). Vänsterpanelen är representativ Na v 1.5 (grön) och phalloidin, för att beteckna fibrer (röda) färgade sektioner från obehandlade thyroarytenoidmuskler, den högra panelen behandlas muskler. Grön insats är Na v 1.5 färgning ensam.
Figur 7: Förändringar i NMJ med NTF4-behandling. Representativa fluorescensmikroskopibilder av NMJ från systemiska NTF4 14-dagars behandlade tyroarytenoidmuskelavsnitt från olika djur märkta med a-bungarotoxin (grönt) ochPhalloidin (röd) som visar att NMJ-talet ökar med NTF4-behandling vid 30 månader (Skala bar = 25 μm), (P <0,001) 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laryngeala muskler är sårbara för de ogynnsamma effekterna av åldrande. Tidigare studier har visat förändringar i åldrande larynxmuskler som inkluderar förändringar i fiberstorlek, totalt antal fibrer, regenerativ förmåga, NMJ-storlek och kvantitetsförändringar, förutom variationer i kontraktil funktion och myosinisoformskift 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . Åldrande laryngeala muskler kan förändras genom användning av neurotrofiner. Dessa ändringar kan lätt mätas. Därför ger råtta laryngeala muskler en användbar modell för att studera effekterna av åldrande och stämningssjukdomar / störningar. Studien av dessa muskler kan också bidra till att utveckla ingrepp eller skyddsprocesser hos den åldrande människan.
Vår metod för systemisk eller direkt applicering av NTF4 ger ett remodeling svar vid åldrande råtta laryngealmuskler. Detta visar att neurotrofiner kan ha terapeutisk potential för åldringsrelaterad muskeldysfunktion. Den direkta appliceringen av neurotrofiner kan enkelt översättas till den humana modellen av vokalfördröjning, trots injektionsvektorer 25 .
Det finns många faktorer att överväga när du använder injektionsprotokollet. Först måste man försäkra sig för att förhindra repor och skador på mjukvävnad runt laryngealbryggan med tanke på endoskopets spets har en skarp nål fastgjort. För det andra ökar timing av nålspetsens rörelse i struphuvudet under den inspirerande fasen av djurs andningscykel att träna för att noggrant stoppa injektionen. För det tredje försäkra dig om att nålspetsen är tydlig synlig innan du försöker proceduren genom att visuellt inspektera apparaten på datorskärmen i förväg. Fjärde uppvärmningen av endoskopets spets i hett vatten i några sekunder är ett viktigt steg för att säkerställa att dimma av endoRäckviddstips undviks. Slutligen är det också viktigt att snabba råttan natten före ett omfattningsförfarande. Om mat inte hålls kvar är det högst sannolikt att de fortfarande kommer att ha matrester i struphuvudet, vilket gör injektionsförfarandet praktiskt taget omöjligt att utföra. Råttor bör inspekteras för tecken på uttorkning dagligen och vägas för att säkerställa att det inte finns någon signifikant viktminskning (större än 10% kroppsvikt).
Två kritiska steg i protokollets utveckling var anslutningen av sprutan till endoskopet och användningen av ett oralt spekulum. Fast förankring av sprutanordningen var nödvändig för att underlätta enhändig operation för insättning och injektion av räckvidd. Med tanke på studiernas mål, i avsaknad av direkt visualisering för att styra injektionen av vokalvalsen, kunde experimentet inte ha realiserats. Dessutom var skapandet av ett oralt spekulum ansett viktigt för att förhindra att tungan flyttade och för att behålla thE epiglottis öppen under hela proceduren.
Den visuellt ledda injektionsmetoden under gick flera omgångar av modifiering mest relaterade till att hitta det optimala sättet att säkert förankra sprutan och nålen till endoskopet. Efter testning av flera olika former av tejplimer fann man att kommersiellt tillgängligt elastiskt atletiskt band var det bästa sättet att förankra sprutan till endoskopkroppen.
Den största begränsningen av den visuellt inledda injektionsmetoden var inte relaterad till instrumentation, utan snarare till behovet av att ha patentvalaryx och luftväg. Även om att begränsa mat i 24 timmar före förfarandet löste det mesta av detta problem, kommer råttor att sätta in någonting i sina burar, inklusive sängkläder och avföring. När detta inträffade fanns det två lösningar: (1) skjuta in injektionen tills djuret rensar deras farskott naturligt, eller (2) försöker ta bort blockeringen manuellt med hjälp av tångar. Det var vår upplevelseE, att den förra var det bättre alternativet eftersom det minskade risken för potentiell skada på djurets faryngeal region.
Med tanke på nyheten i detta protokoll och behovet att direkt injicera vokalvikt med föreningen finns inga andra tillförlitliga metoder. Med tanke på den lilla storlekens djupa storlek, visuellt styrd injektion genom mun- och pharyngeal regionen på det enda sättet för att säkerställa korrekt och konsekvent placering av föreningen i levande djur. Det enda andra sättet att direkt injicera vokalvecken var att försöka göra det från en yttre position genom strupen och brusk i struphuvudet. Fastän denna metod framgångsrikt utförts hos människor som genomgår botulinumtoxinterapier för att lindra laryngealdystoni, är transkutana injektionsmetoder inte möjliga hos små djur.
Tekniken är robust och kan användas för inte bara injektion av vokalveck, utan för injektionsställen inomDe ventrikel- och orala områdena. Dessutom kan metoden anpassas för enkel visuell övervakning av faryngeala och laryngeala djur genom att avlägsna sprutan.
Sammanfattningsvis är denna injektionsmetod ett nytt sätt att studera biologiska mekanismer relaterade till behandling av åldringsrelaterade röstdysfunktioner hos människor. Denna metod har också potential att tillämpas på andra sjukdomsmodeller som påverkar voicing, vokalfunktion, kommunikation och sväljning hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute on Dövhet och andra kommunikationsstörningar (R21DC010806 till CAM och JCS och R01DC011285 till CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
