Summary
Burada, sistemik olarak ve direkt olarak sıçan yaşlanmasına bağlı laringeal kasların yeniden şekillendirilmesi için nevrotropin 4'ü (NTF4) tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Yaşlılarda laringeal işlev bozukluğu, ses bozukluklarından disfajiye ve hava yolu koruyucu reflekslerde azalmaya neden olan önemli bir sakatlık nedenidir. Yaşa bağlı laringeal kas disfonksiyonunu hedef alan az sayıda, varsa, terapiler mevcuttur. Nörotrofinler, kas innervasyonu ve nöromüsküler kavşakların (NMJ'lerin) farklılaşmasına katılırlar. Nörotrofinlerin nörotransmitter salınımını arttırarak nöromüsküler iletimi arttırdığı düşünülmektedir. Nöromusküler kavşaklar (NMJ'ler) fonksiyonel denervasyon bulguları ile sıçan laringeal kas yaşlanmasında daha küçük ve daha az miktarda bulunur. İnsanın laringeal kas yaşlanmasında fonksiyon geliştirmek için NTF4'ün ileride klinik kullanıma yönelik terapötik olarak etkilerini araştırdık. Burada, sıçan laringeal kasının yaşlanması NTF4 uygulamasına tepki olarak yeniden şekillenme yeteneğini araştırmak için sistemik uygulama ve doğrudan NTF4 enjeksiyonu için ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Bu yöntemde, sıçanlar NTF4'ü ya sistemik olarak oSmotik pompa veya vokal kıvrımlar yoluyla doğrudan enjeksiyon yoluyla uygulanabilir. Larinks kasları ayrıldı ve morfolojinin histolojik incelenmesi ve yaşla ilişkili denervasyon için kullanıldı.
Introduction
Larinks kasları hızla ve sürekli olarak kasılır ve yaşlanmanın olumsuz etkilerine karşı savunmasızdır. Bu sabit etkinliğin, 65 yaş üzerindeki 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 numaralı kişilerde görülen ses problemlerine veya disfajiye katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Birkaç moleküler ve patofizyolojik mekanizma bu yaşla ilişkili disfonksiyona katkıda bulunmaktadır. Bu mekanizmalar laringeal mukozanın yeniden şekillendirilmesi, kas lifi atrofisi veya kaybı, vasküler kıvrımların eğilmesine ve glottis kapanmasının başarısız olmasına neden olan kas lifi rejenerasyonu veya atrofisinin eksikliği içerebilir 8,9,10,11. Şu anda, kanıtlanmış bir tıbbi tedavi yoktur.Bu kaslarda bu yaşa bağlı değişiklikleri kolayca önlemek veya rehabilite etmek.
Nöromüsküler bulaşmanın etkinliğinin modülasyonu, nöromotor performansı büyük ölçüde etkiler. Nörotrofinin ailesi, sinir büyüme faktörü (NGF), beyin türevi sinir büyüme faktörü (BDNF), nörotrofin 3 (NTF3) ve NTF4 12 , 13'ü içerir . Nörotrofinlerin sinaptik etkinliği 1 , 4'ü modüle ettiği gösterilmiştir. Hepatosit büyüme faktörü, dönüştürücü büyüme faktörü beta ve fibroblast büyüme faktörü son zamanlarda insanlarda vokal kıvrım skarlanması 15-17 tedavisinde kullanılmıştır. NTF4 ayrıca NMJ etkinliğini düzenler; NTF4'ten yoksun fareler , 11 , 18 , 19 numaralı NMJ'leri parçalamıştır. Bu çalışmalar, tedavi edici etkilere yol açmaktadırLaringeal kas bozukluklarının yaşlanması ve büyüme faktörleri ile denervasyon.
Vokal kıvrımların dokularına direkt enjeksiyon tedavileri insanlarda eşi benzeri görülmez. Örneğin, botulinum toksininin lokal enjeksiyonları şu anda spazmodik disfoni ve bilateral tekrarlayan laringeal sinir paralizisi gibi larenks kaslarını etkileyen nörolojik hareket bozuklukları için etkili bir tedavi olarak kullanılmaktadır 20,21. Hyaluronik asit hidrojel, vokal kat korkutma ve glotal yetmezliği tedavi etmek için kullanılan başka bir enjekte edilebilir 22 , 23 . Enjeksiyon larinkoplasti, çeşitli iletişim bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir 24 . Bu doğrudan enjeksiyon yöntemleri vokal fonksiyonu iyileştirmek ve yaşlanan popülasyonlarda yutmak için söz verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için 6 ve 30 aylıkken erkek Fischer 344-Brown Norveç sıçanları kullanın. Sıçanlar Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden kemirgen koloni elde edildi. Bu çalışma için sıçanlar kullandık, çünkü sıçan larenksinin yapısı, havayolu koruması ve türe özgü seslendirme işlevini yerine getiren işlevsel olarak insandakine benzerdi. Bu çalışma, PHS İnsan Gücü Bakımı ve Laboratuar Hayvanları Kullanımı, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Rehberi ve Hayvan Refahı Yasası (7 USC ve ark.); Hayvan kullanımı protokolü, Kentucky Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Sıçan Anestezi
- Ketamin hidroklorür (dissosiyatif anestetik) ve ksilazin hidroklorür (sedatif ve analjezik) tamponlu salinde karıştırılarak anestezi hazırlayın. Nihai çözeltideki ketamin ve ksilazinin konsantrasyonları kg başına 100 mg / 8 mgVücut ağırlığı.
- 25 G iğneli bir şırınga kullanarak intraperitoneal uygulama vasıtasıyla anestezi fareye enjekte edilir.
- Parmağın ayak parmağını veya ayağı forsepsle tutarak sıçanın yeterince anestezi edildiğini belirleyin. Eğer sıçan sıkışmaya tepki vermezse, ameliyat başlayabilir. Sıçan ayak parmaklarına refleks veya kasılmalar ile tepki verirse, 1-2 dakika bekleyin ve sıkma testini tekrarlayın. Sıçan tekrar tepki gösteriyorsa, sıçanı yeni bir hayvanla değiştirin ve adım 1.2'den başlayarak işlemi yineleyin.
- Sıçanın hareketsiz kaldıktan sonra sıçan gözlerine oftalmik merhem uygulayın, böylece kornealar kurumaz.
2. Osmotik Pompa İmplantasyonu
- Sıçanın ventralini aseptik cerrahi alana yerleştirin. Bir preanestetik ilaç olarak meloksikam uygulayın. 25 G'lik bir iğneli bir şırınga kullanarak intraperitoneal olarak 1-4 mg / kg vücut ağırlığı dozunda uygulayın.
- Yaklaşık birimi kaldırmak için makas kullanınBoynunun arkasından 1 "x 1" kare kürk ve omuzlar arasında yaklaşık 1 "kaudal alan olabildiğince cildin yakınına tıraş edin.
- Dezenfekte etanol (70%) ile sırt ve boynu ıslatın.
- Tıraştan sonra, boyun dorsal boyasını, alkolle bitirme iyod-alkol art arda 3 fırça ile fırçalayın.
- Sıçanın vücut ısısını, 34 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirerek koruyun.
- Aseptik olarak hazırlanmış ozmotik pompaları ya sistemik NTF4 tedavisi için 50 μL NTF4 veya tuzlu su ile doldurun ( Şekil 1 ).
- Deriden yaklaşık 2 cm genişliğinde yatay bir kesi yapmak için bir neşter kullanın, sadece kafa parçalarının arasından skapula arasında boşluk bırakın. Hemostatların ucunu yerleştirirken insizyonun arka kenarını bir elinizle forsepsle kaldırın ve posteri insizyona yavaşça itin.
- Hemostatların ucu yaklaşık 2 cm sonraKesiye giden yolda, hemostatların üzerindeki kolları açın, insizyon bölgesine subkutan içi boş bir "cep" oluşturacak şekilde ipuçlarını genişletin. Bu, pompa için yerleştirme bölgesi olacaktır.
- NTF4'ün herhangi bir etkileşimini ve cebin kesilme bölgesinin iyileşmesini en aza indirgemek için, pompa dağıtım portalı ucunu yerleştirdikten sonra yönlendirin.
- 7-14 gün boyunca 50 μL NTF4 salin verin. 7 günlük grup, toplam 47.04 mg doz için 6.72 mg / gün NTF4 aldı. 14 günlük grup, 94.08 mg NTF4 25 toplam dozu için 6.72 mg / gün aldı.
- Pompa yerleşimi için yapılan kesi kapatmak için 5-0 naylon dikiş ipliği, hemostatlar ve forseps kullanın.
- Anesteziden kurtulduklarından sıçanları en az 30 dakika izleyin. İzlemenin tamamlanması için kriterler, hayvanın faal hale gelmesi, kafesin etrafında hareket edilmesi, içme suyunun alınması ve damat tutumu gibi diğer normal faaliyetlerin başlatılmasıdır.
- Günlük hayvanları izleyinCerrahi alan iyileşmesi, normal yem ve su tüketimi ve idrar / dışkılardan geçme ve stres, ağrı veya diğer ameliyat sonrası komplikasyonların herhangi bir anormal davranış belirtileri gözlenerek ilk hafta için.
- Eğer fare ağrı ya da sıkıntılı görünüyorsa, ağrıdan kurtulmak için her 24 saatte bir 5 mg / kg subkutanöz karprofen enjeksiyonu yaptırınız.
- Bir enfeksiyon var gibi görünüyorsa, yaranın iyileşmesini sağlamak için bir veterinerle görüşün.
- Hangi deney grubuna girildiğine bağlı olarak, ipliğin tahriş olmasını önlemek için ameliyattan 7-10 gün sonra 5-0 naylon dikişini çıkarın.
3. Direkt Enjeksiyonluk Sıçan Anestezisi
- Prosedürden önceki gece fareden yemek yemeyin. Bu, endoskopu veya enjeksiyon iğnesini bloke edecek yiyecek bulunmamasını sağlar.
- Sıçanları tartın ve acepromaz 1-2 mg / kg vücut ağırlığı hazırlayın. Kas içine enjekte edin (IM konumuSol tiroksinoid kas).
- Sıçanı, indüksiyon kutusuna yerleştirin. İndüksiyon kutusunda% 5 izofluran ve 1 Ç 2 ile anestezi uygulayın.
- Sıçanı,% 2 izofluran ve 600 mL O 2 içeren burun konisine taşıyın.
- Parmağın ayak parmağını veya ayağı forsepsle tutarak sıçanın yeterince anestezi edildiğini belirleyin. Sıçan tutamağa tepki vermezse, enjeksiyon protokolü başlayabilir. Sıçan ayak parmaklarına refleks veya kasılmalar ile tepki verirse, 1-2 dakika bekleyin ve sıkma testini tekrarlayın. Sıçan tekrar tepki gösteriyorsa, sıçanı yeni bir hayvanla değiştirin ve adım 3.4'ten başlayarak yinelemeyi tekrarlayın.
4. Doğrudan Enjeksiyon ve Görselleştirme
- Enjeksiyondan önce 30 dakika boyunca 25 ° C'ye ayarlanmış bir H20 b banyosunda NTF4 veya salin içeren aseptik olarak hazırlanmış 50-μL dozajlar yerleştirin.
- Sıçanı bir pleksiglas platformda sırtüstü yatırın ve yatırın ( Şekil 2 ). SusSıçanı platformun üst kısmında bulunan bir kılavuz tel vasıtasıyla ön üst kesici uçlarından geri duran duruşta tutun.
- 1.9 mm, 30 ° sinüs endoskopuna 50 mm, 30 gauge, 100 μL şırınga takın ( Şekil 3 ).
NOT: Şırınga düzeneği kanülü sıkıca endoskopun dış duvarına tutan bir alet yardımıyla bağlanır. Endoskop vokal kıvrımların görselleştirilmesine ve şırınganın rehberliğine intraoral olarak izin verir. Kanül ucunun konumu, ucun endoskopik görünümü ( Şekil 4 ) aracılığıyla tam ve açık şekilde görülebilmesini sağlamak için her hayvandan önce ayarlanır. - Dili uzatmak ve yana doğru hareket ettirmek için lastik uçlu bir forseps kullanın. Daha sonra, oral açıklığı korumak için plastik bir spekulum takın. Kesikleri uçları kopararak pürüzsüz cilalanarak, 1.5 ila 2 cm'lik bir uzunluğa kesilen 5 mL'lik bir plastik şırınga varilinden spekulum yapın.
- Işıklardaki ışıkları kapatM ve endoskopa bir halojen ışık kaynağı takın. İşlemi kaydetmek için video kaydediciyi açın.
- Sıçanın ağzına yerleştirildiğinde cam ucu üzerinde yoğuşma gelişimini en aza indirgemek için endoskopun distal ucunu ılık suya birkaç saniye batırın.
- Monitörden gelen görsel geribildirimi kullanarak, iğne dikkatli bir şekilde sol ses katmanının alanına yönlendirilir.
- Vokal katın tümüne erişmek için solüsyonun solunum döngüsünün inspirasyon fazıyla birlikte enjeksiyon zamanı. Solunumun inspiratuar fazı boyunca vokal kat tam olarak açığa çıkar.
- Ses kıvrımı tamamen görünür hale geldiğinde, iğneyi vokal katın beyaz medyal kenarının yan tarafında bulunan sol tiroarenoid içine yerleştirin. İğne yerinde iken enjektörü şırınganın depresyondan geçirin.
- Endoskop ve video oynatıcıdaki halojen ışık kaynağını kapatın ve ro'yu geri çevirinIşıklar.
- Sıçanı evdeki kafese geri getirin ve ısıtma yastığına yerleştirin.
- Isı pedinden çıkarmadan önce sıçanın iyileşmesine izin verin. Kafesdeki yiyecek ve suyu değiştirin.
- Enjeksiyondan sonra sıçanları 7 gün boyunca izleyin ve ardından öksüzleştirin. Kriyoteksiyon için larideleri çıkarın 24 .
Sıçanların Euthanizasyonu
- Sıçanları, ketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür (100 mg / 8 mg / kg vücut ağırlığı enjekte edilen intraperitoneal enjeksiyon) ile anestezi altına alınız.
- Medial torakotomiyi takiben kanama önleme yöntemiyle euthanize olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıçanlar, 2 hafta ozmotik pompa infüzyonundan sonra veya NTF4'ün doğrudan enjeksiyonundan 1 hafta sonra ötenazi yapıldı. Larenjler hasat edildi, kriyoprotektan (% 30 sükroz ve% 70 fosfat tamponlu salin) içine yerleştirildi ve daha sonra bir kriyostat ile 10 um'lik genişlikte kesit olarak kesildi. Yaşlanma laringeal kasları, NTF4 25'in uygulanmasından etkilenir. Genç ve yaşlı sıçanın yanısıra, tiroidenoid kasların enjekte edilen ve enjekte edilmeyen tarafı karşılaştırıldı. Tipik olarak, NTF4 uygulama yoluna bağlı olarak değişen yaşla beraber lif boyutunda bir değişiklik görüyoruz ( Şekil 5 ). Az görülen fibroz da tedaviden sonra nitel olarak gözlemlenir. Denervasyon yapılan liflerin yüzdesi NTF4'ün yaşlı sıçanlarda sistemik ve doğrudan uygulanmasıyla azalmaktadır ( Şekil 6 ). NMJs miktarı da artar ( Şekil 7 ). Bu artışın önemi de Tedavi süresine veya uygulama rotasına bağlıdır.
Şekil 1: Osmotik Pompanın Temsili Görüntüsü. Pompayı NTF4 ile doldurduktan sonra, akış moderatörü pompayı kapatmak için ana gövdeye yerleştirilir.
Şekil 2: Enjeksiyon Prosedürü Platformu. Sıçan, platform üzerinde sırtüstür bir duruşa yerleştirilir ve platformun üst kısmına monte edilmiş bir kılavuz tel vasıtasıyla ön üst kesici dişlerle asılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
Şekil 3: Şırınganın Temsili Görüntüsü. Şırıngayı NTF4 ve tuz karışımı ile doldurun. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Enjeksiyon Prosedürü. ( A ) Şırınga, 19.9 mm 30 ° endoskopa (gösterilmiştir) bağlanır; (B) Işık ışığı işlem için ışık olduğundan emin olmak için kontrol edilir; ( C ) Gerçek zamanlı video iğnenin doğru yere yönlendirilmesini sağlar.
Şekil 5: Elyaf Boyutunda ve Morfolojide Değişiklikler. Temsilci o26 , 27 , 28. 30 aylarda sistemik NTF4 7 günlük tedavi edilen (sağdaki) ve işlenmemiş (sol) tiroksinoid kasların matoksilen ve eozin boyalı kesitleri. Kontrolten işlenmiş hayvanlara elyaf boyutunda bir artış var. NTF4 ile tedavi, 30-mo lif boyutunu daha genç bir 6 aylık hayvanınkine değiştirir. * 30 aya karşılık p <0.05 (resimler 40X büyütmede; Ölçek çubuğu = 25 μm, P <0.001). Üstteki resimdeki oklar fibrozun bir alanını işaret eder. Ayrıca, muamele edilen hayvanlarda fibrozun nitel bir azalması vardır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: İç DeğişikliklerNTF4 Tedavisi ile Tedaviler. 30 yaşındaki sistemik NTF4 14 günlük tedavi edilen (sağ) ve işlenmemiş (sol) tiroksinoid kaslardan temsilciler Nav1.5 lekeli bölümler (resimler 40X büyütme ile yakalandı; Ölçek çubuğu = 25 μm) 29 . Na v 1.5 etiketleme ile denervasyonun yaşla azalması vardır (yeşil). Sol panel, temsil edilmemiş Na v 1.5 (yeşil) ve phalloidin olup, tedavi edilmemiş tiroaritenoid kaslardan elyaf (kırmızı) lekelenmiş bölümleri belirtir, sağ panel tedavi edilen kaslardır. Yeşil ek, tek başına Na v 1.5 boyamadır.
Şekil 7: NTF4 Tedavisi ile NMJ'lerdeki değişiklikler. Sistemik NTF4'ten NMJ'lerin temsilci floresan mikroskobu görüntüleri, a-bungarotoksin (yeşil) ile etiketlenmiş farklı hayvanlardan 14 günlük tedavi edilen tiroksinoid kas bölümleri veFalloidin (kırmızı) NMJ sayısının 30 ayda NTF4 tedavisi ile arttığını gösteriyor (Ölçek çubuğu = 25 μm), (P <0.001) 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Larinks kasları yaşlanmanın olumsuz etkilerine karşı savunmasızdır. Önceki çalışmalar, kontraktil fonksi- yon ve miyozin izoform değişikliklerine ek olarak lif boyutu, toplam lif sayısı, rejeneratif yeteneği, NMJ boyutu ve miktarı değişikliklerini içeren yaşlanma laringeal kaslarında değişiklikler olduğunu göstermiştir 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . Yaşlanma laringeal kas nörotrofinlerin uygulanması ile değiştirilebilir. Bu değişiklikler kolaylıkla ölçülebilir. Bu nedenle sıçan laringeal kasları yaşlanmanın ve vokal hastalıkların / rahatsızlıkların etkilerini incelemek için yararlı bir model oluşturmaktadır. Bu kasların incelenmesi, yaşlanan insanda müdahale veya koruyucu süreçlerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
NTF4'ün sistemik veya direkt olarak uygulanması yöntemimiz yaşlanma sıçan larinksinde remodeling tepkisi üretirkaslar. Bu, nevrotrofinlerin yaşlanmayla ilişkili kas disfonksiyonu üzerinde terapötik potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir. Nörotrofinlerin doğrudan uygulanması, enjeksiyon vektörleri 25 olsa da, insan yaşlanma vasıflarına kolayca dönüştürülebilir.
Enjeksiyon protokolünü kullanırken göz önüne alınması gereken birçok faktör vardır. Birincisi, endoskopun ucu keskin bir iğne takılı olduğu göz önüne alındığında, laringeal vestibül çevresinde çizilmeyi ve yumuşak dokunun yaralanmasını önlemeye özen gösterilmelidir. İkincisi, hayvanların solunum döngüsünün inspiratuar fazı sırasında iğne ucunun larenks içerisine hareketinin zamanlamasıyla, enjeksiyonun doğru bir şekilde yapılması zaman alır. Üçüncü olarak, prosedürü denemeye başlamadan önce iğne ucunun net bir şekilde görülebildiğinden emin olun, önceden cihazdaki cihazı kontrol edin. Dördüncüsü, endoskopun ucunu sıcak suda birkaç saniye ısınmak, endo'nun sislenmesini kesin olarak belirlemek için önemli bir adımdır.Alan ucu önlenir. Sonunda, farenin herhangi bir skoplama prosedüründen önceki gece hızlı olması da önemlidir. Eğer yiyecek tevkifat etmezse, farenksde hala yiyecek kalıntısı olacak ve bu da enjeksiyon prosedürünü neredeyse imkansız kılıyor. Sıçanlar günlük dehidrasyon bulguları açısından kontrol edilmeli ve belirgin bir kilo kaybı olmadığından emin olmak için tartılmalıdır (vücut ağırlığının% 10'undan daha fazla).
Protokolün geliştirilmesinde iki kritik adım şırınganın endoskopa tutturulması ve bir oral spekulum kullanılması idi. Şırınga takımının firma çapa bağlanması, kapsam ekleme ve enjeksiyon için tek elle operasyonu kolaylaştırmak için gerekliydi. Araştırmanın amaçları göz önüne alındığında, vokal kılıfın enjeksiyonu için doğrudan görselleştirme yokluğunda, deney gerçekleştirilemedi. Buna ek olarak, sözlü spekulum oluşturulması, dili hareket ettirmemesi ve ağız sağlığını korumak açısından önem taşımaktadır.Progranda epiglotlar açıktır.
Görsel olarak yönlendirilen enjeksiyon yöntemi, şırınga ve iğneyi endoskopa güvenli bir şekilde tespit etmenin en uygun araçlarını bulmakla ilgili birkaç turluk değişikliğe gitti. Çeşitli farklı bant yapıştırıcılarını test ettikten sonra, ticari olarak temin edilebilen elastik atletik bandın, şırıngayı endoskop gövdesine demirlemenin en iyi aracı olduğu bulundu.
Görme rehberliğindeki enjeksiyon yönteminin en büyük kısıtlılığı enstrümantasyonla değil, daha çok bir patent farinks ve havayolu gereksinimi ile ilgiliydi. Usul öncesi 24 saat boyunca yiyeceklerin kısıtlanması bu sorunun çoğunu çözmüş olmasına rağmen, sıçanlar yatak takımları ve dışkılar da dahil kafeslerindeki herhangi bir şeyi yutacak. Bu gerçekleştiğinde, iki çözüm vardı: (1) hayvanın gırtlağını doğal olarak temizleyene kadar enjeksiyonu ertelemek veya (2) forseps kullanarak elle tıkanıklığı gidermeye çalışmak. Bizim deneyimdiE, bunun daha iyi bir seçenek olduğu, çünkü hayvanın faringeal bölgedeki yaralanma riskini azalttı.
Bu protokolün yeniliği ve vokal katın doğrudan bileşik ile enjekte edilmesi ihtiyacı göz önüne alındığında, güvenilir herhangi bir yöntem mevcut değildir. Hayvanların larinks sisteminin küçüklüğü göz önüne alındığında, canlı hayvanda bileşiğin doğru ve tutarlı yerleştirilmesini sağlamak için tek yol olarak oral ve farengeal bölgede görsel olarak yönlendirilmiş enjeksiyon. Vokal katın doğrudan enjekte edilmesinin tek yolu, bunu harici bir konumdan, gırtlak cildi ve kıkırdak yoluyla yapmaya çalışmaktı. Larstitüsyon distonilerini hafifletmek için botulinum toksini tedavisi gören insanlarda bu yöntem başarıyla uygulansa da, küçük hayvanlarda transkutanöz enjeksiyon yöntemleri uygulanabilir değildir.
Teknik sağlamdır ve sadece vokal katın enjeksiyonu için değil, aynı zamanda enjeksiyon bölgelerindeFarengeal ve oral bölgeler. Buna ek olarak, bu yöntem şırınganın çıkarılmasıyla farenjeal ve laringeal bölgenin basit görsel denetimi için uyarlanabilir.
Özetle, bu enjeksiyon yöntemi, insanlardaki yaşlanmaya bağlı ses bozukluklarının tedavisi ile ilgili biyolojik mekanizmaları incelemek için yeni bir araçtır. Bu yöntemin ayrıca, vokal, sesli fonksiyon, iletişim ve insanlarda yutma sorunlarını etkileyen diğer hastalık modellerine uygulanma potansiyeli vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsünün (R21DC010806'dan CAM ve JCS'ye ve R01DC011285'den CAM'e) hibeleriyle desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
