Summary
यहाँ हम एक उपन्यास चिकित्सीय ग्रेड अलगाव और संस्कृति विधि गुर्दे Perivascular Stromal पाचन एंजाइमों और NG2-कोशिका संवर्धन के साथ पूरे अंग छिड़काव पर आधारित कक्षों (kPSCs) के लिए मौजूद है। इस विधि के साथ, यह सेलुलर थेरेपी के लिए पर्याप्त कक्ष संख्या प्राप्त करने के लिए संभव है।
Abstract
Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) कि ट्रांसप्लांटेशन और गुर्दे की बीमारियों में लाभकारी प्रभाव दिखाया है ऊतक homeostatic और प्रतिरक्षा modulatory कोशिकाओं रहे हैं। Perivascular Stromal कोशिकाओं (पीएससी) अस्थि मज्जा MSCs (bmMSCs) के साथ विशेषताएँ साझा करें। हालांकि, वे भी, सबसे अधिक संभावना के कारण स्थानीय imprinting, ऊतक-विशिष्ट गुणों और स्थानीय ऊतक समस्थिति में एक भूमिका निभा के अधिकारी। इस ऊतक विशिष्टता ऊतक विशेष मरम्मत, भी मानव गुर्दे के भीतर में परिणाम हो सकता है। हम पहले से पता चला कि मानव गुर्दे पीएससी (kPSCs) bmMSCs इस क्षमता नहीं है, जबकि गुर्दे की उपकला घाव को बढ़ाया है। इसके अलावा, kPSCs गुर्दे की चोट में vivoउन्नति कर सकते हैं। इसलिए, kPSCs सेल थेरेपी, किडनी के रोग और गुर्दे प्रत्यारोपण के लिए विशेष रूप से के लिए एक दिलचस्प स्रोत का गठन। यहाँ हम पूरे अंग वृक्क धमनी और संवर्धन के लिए NG2 perivascular मार्कर के माध्यम से पाचन एंजाइमों के छिड़काव पर आधारित मानव गुर्दे प्रत्यारोपण-ग्रेड से kPSCs के लिए विस्तृत अलगाव और संस्कृति विधि दिखाएँ। इस तरह, बड़े सेल मात्रा कि सेलुलर चिकित्सा के लिए उपयुक्त हैं प्राप्त किया जा सकता।
Introduction
Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) को प्रतिरक्षा modulatory कोशिकाओं को अस्थि मज्जा से मूल रूप से अलग किए गए हैं। वे अपनी धुरी आकारिकी, वसा, अस्थि और उपास्थि, और प्लास्टिक के पालन में अंतर करने की क्षमता के आकार द्वारा विशेषता हैं। MSCs stromal मार्करों CD73, CD90, CD105 ऋणात्मक मार्करों CD31 और CD451,2,3के लिए किया जा रहा करते समय व्यक्त करते हैं। MSCs उनके ऊतक homeostatic और प्रतिरक्षण निश्चायक क्षमता के कारण सेल थेरेपी के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार हैं। bmMSCs वर्तमान में किडनी के रोगों और किडनी प्रत्यारोपण के रूप में कहीं और4की समीक्षा सहित कई रोगों के लिए नैदानिक परीक्षणों में अध्ययन किया जा रहा हैं।
पहले यह दिखाया था कि वसा ऊतकों सहित कई विभिन्न ठोस अंगों से, perivascular कोशिकाओं, नाल और कंकाल की मांसपेशी के साथ MSCs9विशेषताओं का हिस्सा। हालांकि, इन कोशिकाओं के भी ऊतक-विशिष्ट कार्य करता है जो organotypic मरम्मत10में परिणाम कर सकते हैं प्रदर्शन। मानव उपयोग perivascular कोशिकाओं, उदाहरण के लिए, बाद hypoxia angiogenic प्रतिक्रियाओं उत्तेजित और perivascular कोशिकाओं के अन्य ऊतकों से अलग इन क्षमता11नहीं दिखा था, जबकि cardiomyocytes में, विभेदित।
Perivascular stromal कक्ष के माउस12,13,14 और मानव किडनी15,16से अलग भी हो सकते हैं। हम बड़े पैमाने पर kPSCs विशेषता और bmMSCs के लिए इन की तुलना में। हमने पाया कि kPSCs, bmMSCs करने के लिए, समान immunosuppressive क्षमता है और नाड़ी जाल के गठन का समर्थन कर सकते हैं। हालांकि, सेल प्रकार, kPSCs एक organotypic transcriptional अभिव्यक्ति हस्ताक्षर, HoxD10 और HoxD11 nephrogenic प्रतिलेखन कारकों सहित दिखाया के रूप में विशिष्ट अंतरों ऊतक होते हैं। kPSCs, bmMSCs, विपरीत TGF-β के साथ उत्तेजना के बाद myofibroblast बदलाव से गुजरना नहीं किया और adipocytes में अंतर करने में असमर्थ थे। इसके अलावा, kPSCs त्वरित उपकला अखंडता एक गुर्दे की ट्यूबलर उपकला घाव खरोंच परख में, एक घटना जो bmMSCs के साथ नहीं देखा गया था। इस एन्हांस्ड घाव की मरम्मत hepatocyte वृद्धि कारक विज्ञप्ति के माध्यम से मध्यस्थता था। इसके अलावा, kPSCs तीव्र गुर्दे की चोट15का एक माउस मॉडल में गुर्दे की चोट ameliorated. इसलिए, kPSCs बेहतर गुर्दे की मरम्मत क्षमता है लगता है और किडनी के रोगों में सेल थेरेपी के लिए एक दिलचस्प नए स्रोत रहे हैं।
KPSCs सेल चिकित्सा प्रयोजनों के लिए उपयोग करने के लिए सक्षम होने के लिए, kPSCs चिकित्सीय ग्रेड एंजाइमों और प्रोटोकॉल के साथ एक नैदानिक ग्रेड तरीके से पृथक होना चाहिए। इसके अलावा, 1 दाता से kPSCs के साथ कई रोगियों का इलाज करने में सक्षम होना करने के लिए पर्याप्त कक्ष संख्या प्राप्त की जानी चाहिए। यहाँ हम विस्तार में, चिकित्सीय ग्रेड अलगाव की प्रक्रिया पूरे प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे, से kPSCs का नैदानिक सेलुलर चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कक्षों की पर्याप्त संख्या उपज दिखाएँ।
Representative Results
चिकित्सीय ग्रेड kPSCs अलगाव विधि चित्र 1में संक्षेप है। कच्चे तेल गुर्दे की कोशिकाओं से मानव प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे collagenase छिड़काव द्वारा अलग कर रहे हैं। परिणामी सेल सस्पेंशन में 5% प्लेटलेट lysates confluent तक सभ्य है। उसके बाद perivascular stromal सेल अंश अलग NG2 अभिव्यक्ति पर आधारित है।
kPSCs प्लास्टिक के अनुयायी धुरी के आकार का कक्ष (चित्रा 2A) हैं और stromal मार्करों CD73, CD90, CD105 और perivascular मार्कर NG2, PDGFR-बी और CD146, CD31, CD34, CD45 और एचएलए-डॉ (चित्रा 2बी) के लिए नकारात्मक जबकि के लिए सकारात्मक हैं। आमतौर पर, kPSCs के एक सजातीय जनसंख्या 4 मार्ग पर पहुंचा जा सकता और kPSCs senescence 9-10 (चित्रा 2सी) के पारित होने के आसपास तक पहुँचने। हम इसलिए यात्रा 5-8 के बीच प्रयोगों को करने के लिए सलाह है।
हम पहले से पता चला कि वातानुकूलित मध्यम kPSCs की उपकला घाव भरने में यह खरोंच परख15तेज कर सकते हैं के रूप में पृथक kPSCs की कार्यात्मक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक इन विट्रो में गुर्दे की उपकला घाव खरोंच परख kPSCs, के हर नए बैच पर करते हैं। KPSC वातानुकूलित मध्यम kPSCs alphaMEM 5% प्लेटलेट lysates में 48 घंटे के लिए संवर्धन और तैरनेवाला का संग्रह द्वारा किया जाता है। अगला, अमर मानव गुर्दे की समीपस्थ tubule उपकला कोशिकाओं (एच-2)17 तक confluent सुसंस्कृत हैं और फिर एक खरोंच घाव किया जाता है। फिर या तो kPSCs या नियंत्रण माध्यम की वातानुकूलित माध्यम कुओं को जोड़ा जाता है और घाव भरने की गति मापा जाता है। जब kPSCs के वातानुकूलित माध्यम है जोड़ा गया है, घाव काफी तेजी से (चित्रा 2D) बंद कर देता है।
चित्रा 1 : नैदानिक ग्रेड अलगाव विधि से मानव kPSCs. प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे cannulated और वृक्क धमनी (A - G) के माध्यम से collagenase के साथ perfused कर रहे हैं और परिणामस्वरूप सेल सस्पेंशन धोया जाता है और या तो हिमिकृत या संस्कृति (H - K) में डाल दिया। Confluency (L) कोशिकाओं तक पहुँचने के बाद, कोशिका संवर्धन है NG2 (M) प्रदर्शन किया। कक्षों या तो confluent, जब वे trypsinized हैं proliferating या जब 3 डी संरचनाओं (N - P) दिखाई देते हैं बंद कर दिया है। KPSCs के लिए रिलीज़ मापदंड बाँझपन, मार्कर अभिव्यक्ति और क्षमता (Q) ट्यूबलर उपकला घाव भरने को बढ़ाने के लिए कर रहे हैं। तीर: वृक्क धमनी। पैमाने पर पट्टी 200 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: मानव का चरित्र चित्रण kPSCs . एक) kPSCs-धुरी के आकार, प्लास्टिक के अनुयायी कोशिकाओं रहे हैं। B) kPSCs mesenchymal मार्करों CD73, CD90, CD105, perivascular मार्करों NG2, PDGFR-β और CD146, CD31, CD34 और CD45 के लिए नकारात्मक जबकि के लिए सकारात्मक हैं। kPSCs एक्सप्रेस MHC वर्ग मैं (एचएलए-एबीसी) लेकिन नहीं वर्ग II (एचएलए-DR)। C) विकास विशेषताएं प्रवाह cytometry से तीन अलग अलग kPSC दाताओं के सजातीय NG2 सकारात्मक आबादी (पर पारित 4) की पुष्टि की। kPSCs senescence पारित होने के 9-10 के आसपास तक पहुँचने। D) kPSCs एक घाव खरोंच परख में गुर्दे की उपकला मरम्मत को बढ़ाने में सक्षम हैं। प्रतिनिधि चित्र नियंत्रण मध्यम और टी में वातानुकूलित kPSC मध्यम = 0, 4, 8 और 12 ज दिखाए जाते हैं। A में पैमाने पर पट्टी) = D में 200 माइक्रोन) 100 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
Perivascular कोशिकाओं अग्न्याशय, वसा, उपास्थि और गुर्दे की9,15,16सहित कई अलग अलग मानव ठोस अंगों से पृथक कर दिया गया है। अधिकांश विधियों, तथापि, ऊतक है, जो dissected है और बाद में पाचन एंजाइमों के साथ इलाज किया कर रहे हैं छोटे नमूनों पर आधारित हैं। इसके अलावा, यह आम तौर पर चिकित्सीय ग्रेड के उत्पादों के साथ नहीं की गई है। यह इन रणनीतियों प्रत्यक्ष नैदानिक अनुवाद के लिए कम उपयुक्त जहां चिकित्सीय ग्रेड कक्षों की एक बड़ी मात्रा आवश्यक हैं बनाता है।
यहाँ हम एक उपन्यास अलगाव विधि मानव kPSCs के पूरे अंगों के आधार पर चिकित्सीय ग्रेड एंजाइमों और सामग्री के साथ छिड़काव के लिए दिखा। प्रोटोकॉल नैदानिक लेंगर्हंस के आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल वर्तमान में हमारे केंद्र18में नैदानिक अनुप्रयोग के उपयोग से अनुकूलित है।
यह पहला नैदानिक ग्रेड पद्धति जहाँ kPSCs की एक बड़ी मात्रा प्राप्त किया जा सकता है। विभिन्नता सेल में काफी हद तक निर्भर दाता है। जब हम वर्तमान में तीन विभिन्न दानदाताओं के कच्चे तेल सेल निलंबन का एक अंश से प्राप्त सेल उपज extrapolated है, सिद्धांत रूप में, तथापि, एक औसत उपज 1012 kPSCs दाता प्रति x 2.7 के प्राप्त किया जा सकता। के रूप में एमएससी थेरेपी आमतौर पर 1-2 106 कक्षों/kg शरीर वजन4एक्स के साथ 2 कोशिका आधान के होते हैं, ये सेल संख्या निर्वाचित रोगियों के उपचार के कई के लिए पर्याप्त हैं।
Collagenase पाचन की अवधि आइसोलेशन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। पाचन की अवधि भी कम है, जब बड़े clumps ऊतक के, जो संस्कृति करने के लिए कठिन हो जाएगा रहेगा। जब छिड़काव की अवधि बहुत लंबी है, बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु मनाया जा सकता है। इसलिए, जैसे ही गुर्दे शीतल और कम पारदर्शी तरल पदार्थ बनने के लिए शुरू होता है, गुर्दे धीरे मालिश की जानी चाहिए और collagenase उपचार को रोका जाना चाहिए।
एक और महत्वपूर्ण कदम NG2 कोशिका संवर्धन के बाद कक्षों की संस्कृति है। NG2 कोशिका संवर्धन के बाद कभी-कभी, perivascular कक्षों पैदा करना या 3 डी संरचनाओं में विकसित करने के लिए प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ नहीं करते। जब कक्ष trypsinized और reseeded हैं, इस स्थिति में, कोशिकाओं आम तौर पर monolayer संस्कृति में विकसित करने के लिए शुरू कर देंगे।
सामग्री शुरू करने के रूप में, मानव प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे शल्य चिकित्सा कारणों के लिए मुख्य रूप से छोड़ दिए थे। इन कार्यात्मक अंग प्रमुख फाइब्रोसिस के बिना कर रहे हैं। हम स्वीकार करते हैं कि यह एक अपेक्षाकृत दुर्लभ है के रूप में यह एक सीमा हो सकता है और अंग स्रोत प्राप्त करने के लिए मुश्किल। Explanted गुर्दे एक और स्रोत हो सकता है; हालांकि, गुर्दे की explantation के कारण, के आधार पर इन गुर्दे अधिक फाइब्रोसिस और इस प्रकार myofibroblasts हो सकता है, और के बाद से myofibroblasts अलग हो सकता है और perivascular कक्षों के बजाय सुसंस्कृत इसलिए ध्यान रखा जाना चाहिए।
अलग kPSCs के रूप में इस प्रोटोकॉल शो के साथ गुर्दे की उपकला के साथ organo-typic गुण घाव चिकित्सा क्षमता15, किडनी के रोग में kPSCs के साथ सेल थेरेपी और प्रत्यारोपण एक दिलचस्प भविष्य अनुप्रयोग होगा। इस उद्देश्य के लिए, कक्ष/सेल उत्पाद वितरण के कई रणनीतियों रहे हैं। पहली रणनीति IV अर्क kPSCs, के रूप में वर्तमान में bmMSC नैदानिक अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। एक और दिलचस्प आवेदन kPSCs या प्रत्यारोपण से पहले मशीन छिड़काव में kPSC-उत्सर्जित कारकों का उपयोग है। इस तरह, जो प्रत्यारोपण के बाद बेहतर गुर्दे समारोह करने के लिए नेतृत्व कर सकते explanted गुर्दे की गुणवत्ता में सुधार हो सकता है। दोनों रणनीति के लिए, kPSCs और नैदानिक प्रयोजनों के लिए अन्वेषण करें करने के लिए एक दिलचस्प नए सेल स्रोत हैं।
Disclosures
D.G.L., M.A.E., और T.J.R. इस शोध के बारे में एक पेटेंट आवेदन के साथ जुड़े रहे हैं। अन्य लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अनुसंधान यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से (FP7/2007-2013) वित्त पोषण अनुदान के तहत अनुबंध संख्या 305436 प्राप्त हुआ है तारकीय।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
platelet lysate | custom made | ||
Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
transfusion system | Codan | 455609 | |
DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
UW | Bridge to life | 32911 | |
Heparin | Leo Pharma | ||
collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
pump head | metrohm | x077202600 | |
perfusion tray | custom made | ||
LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
pulmozyme | Roche | ||
culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
Trypsin | sigma | t4174 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
CD34 FITC | BD | 555821 | |
CD45 APC | BD | 555485 | |
CD146 PE | BD | 550315 | |
NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
CD90 PE | BD | 555596 | |
HLA ABC APC | BD | 555555 | |
CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
HLA DR APC | BD | 559866 | |
CD56 PE | BD | 555516 | |
CD73 PE | BD | 550257 | |
CD31 FITC | BD | 555445 | |
CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
IgG2b PE | BD | 555743 | |
goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
sodium azide | Merck | 822335 | |
DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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