Summary
Vi har utvecklat ett nytt protokoll för att studera heterocellulär populationsdynamik som svar på störningar. Detta manuskript beskriver en bildbaserad plattform som producerar kvantitativa dataset för samtidig karakterisering av flera cellulära fenotyper av heterocellulära populationer på ett robust sätt.
Abstract
Cellprocesser är komplexa och härrör från samspelet mellan flera celltyper och deras miljö. Befintliga cellbiologitekniker tillåter ofta inte korrekt tolkning av detta samspel. Med hjälp av ett kvantitativt bildbaserat tillvägagångssätt presenterar vi ett protokoll med hög innehåll för att karakterisera de dynamiska fenotypiska svaren ( dvs. morfologiska förändringar, proliferation, apoptos) hos heterogena cellpopulationer för förändringar i miljöstimuli. Vi belyser vår förmåga att särskilja mellan celltyper baserade på antingen fluorescensintensitet eller inneboende morfologiska funktioner beroende på applikationen. Denna plattform möjliggör en mer omfattande karaktärisering av subpopulationsrespons på störning medan man utnyttjar kortare tid, mindre mängder reagenser och lägre sannolikhet för fel än traditionella cellbiologiska analyser. I vissa fall kan dock cellpopulationer vara svåra att identifiera och kvantifiera baserat på komplex celluLar funktioner och kommer att kräva ytterligare felsökning Vi lyfter fram några av dessa omständigheter i protokollet. Vi demonstrerar denna ansökan med hjälp av läkemedel i en cancermodell; Det kan emellertid lätt appliceras bredare på andra fysiologiska processer. Detta protokoll tillåter att man identifierar subpopulationer inom ett samkultursystem och karakteriserar varje specifikt svar på externa stimuli.
Introduction
Cellbaserade analyser har varit en arbetshorse i grundforskning och läkemedelsutvecklingsinställningar. Gränserna för dessa standardanalyser har emellertid blivit alltmer uppenbara med skillnaden mellan in vitro och kliniska data och misslyckandet hos de flesta läkemedel för att få FDA-godkännande. Här presenterar vi en ny metod för att utnyttja kvantitativ bildbehandling för att samtidigt analysera heterocellulära fenotyper som svar på relevanta, medfödda miljöstimuli.
Traditionella cellbaserade analyser som används för att mäta cellleabilitet innefattar: trypanblå uteslutningsanalyser, MTT / MTS och Annexin V-FITC flödescytometrifärgning. Trypan Blue Exclusion analyser, samtidigt som de är enkla och billiga, kräver ett stort antal celler, är tidskrävande, och påverkas ofta av användarförspänning 1 . MTT- och MTS-analyser mäter indirekt cellleabilitet genom mätningar av mitokondriell metabolisk hastighet. Emellertid metaboliska aktiviTyget av celler kan påverkas av olika odlingsbetingelser (såsom media eller syrekoncentration), vilket leder till felaktiga resultat och förhindrar standardisering över celltyper och förhållanden 2 , 3 . En annan stor nackdel med dessa tekniker är deras oförmåga att särskilja mellan flera celltyper - de flesta biologiska systemen är heterocellulära. Även om flödescytometrimetoder har möjlighet att särskilja mellan flera cellpopulationer krävs celletiketter, dynamisk provtagning är utmanande, och när man använder vidhäftande celler blir denna applikation tidskrävande och felaktig.
Andra viktiga cellulära fenotyper, inklusive morfologiska förändringar, uppträder som svar på miljöstimuli, men fångas inte av traditionella cellbaserade analyser. Profilerande celltillstånd genom morfologisk karakterisering och kartläggning av likheter över prov är ett kraftfullt, opartiskt verktyg med aFörmåga att ge nya insikter i många aspekter av grundläggande och translationell forskning, inklusive grundläggande cellbiologi och läkemedelsupptäckt 4 . Vidare har tumörcellmorfologi visat sig korrelera med tumörsubtyper 5 och aggressivitet 6 . Det är därför av stor intresse att studera dessa cellulära egenskaper och hur de relaterar till specifika miljöförstörningar. Dessutom kan man använda skillnader i morfologiska egenskaper för att diskriminera mellan delpopulationer i samkultursystem. Fluorescensmärkande celler har nedfall ( dvs att ändra inneboende cellegenskaper, tidskrävande) och därför är ytterligare fördelar för att klassificera celltyper fördelaktiga.
Mikroskopibaserad bildbehandling är en alternativ metod för profilering av cellulära fenotyper på ett multiplexerat, kvantitativt och robust sätt. I det här manuskriptet tillämpar vi vår kvantitativa bildrörledning för att lyfta fram evolutioNära dynamiken hos heterogena cellpopulationer inom en tumör. Vi fokuserar på interaktionen mellan celler med lungcancer (NSCLC) och Cancer-Associated Fibroblasts (CAF), den mest framträdande stromalcellstyp som finns i tumörer. CAF har implicerats i tumörinitiering, progression och terapeutiskt svar; Därför kan utföra fenotypiska analyser på tumörceller i frånvaro av CAFs vara vilseledande 7 , 8 , 9 . I synnerhet utvärderade vi effekterna av CAF på tumörceller som svar på erlotinib, en liten molekyl som riktar sig mot den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) som ofta används vid klinisk behandling av NSCLC. Vi utnyttjade en screeningplattform med hög innehåll och dess medföljande bildanalysprogramvara för utvärdering. Men i ett försök att göra denna metod tillgänglig för andra forskare har vi också utvecklat ett jämförbart nedströmsprotokoll med hjälp av open source-mjukvaran:CellProfiler 10 och CellProfiler Analyst 11 . De flesta bildbaserade högupplösta screeningsanalyser analyseras med kommersialiserad programvara som är specifik för en given instrumentmodell. Resultat är svåra att replikera i andra laboratorier med olika program eftersom de underliggande algoritmerna ofta är proprietära. Med användning av denna bildbaserade pipeline uppmättes cellproliferation, död och morfologi för varje subpopulation av en heterocellulär kultur som svar på läkemedelsbehandling med användning av både fluorescens- och morfologibaserad klassificering. Följande protokoll tillhandahåller en robust metod för sondering av komplexa cellulära processer.
Protocol
1. Cellkultur
OBS! Här undersöktes fenotypiska responser av NSCLC-celler (H3255) till EGFR-målmedlet, erlotinib, när de odlades med lungfibroblaster (CCD-19Lu GFP). För samma dataset utfördes fluorescensbaserad och morfologibaserad klassificering av de två cellpopulationerna (H3255 och CCD-19Lu GFP) för att exemplifiera deras konkordans. Dock behöver endast en klassificeringsmetod användas och bör väljas utifrån ansökan.
- Förbered 500 ml RPMI-1640 kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS och 1% penicillin / streptomycin.
OBS: Tillväxtmediet och tillskott kan bytas ut som krävs för andra celltyper. - Kulturceller i 10 cm 3 plattor som rena populationer i 5% CO2 vid 37 ° C och passera vid lämpligt förhållande var tredje 3-4 dagar.
2. Framställning av celler
- För att bereda en cellsuspension, ta bort cEll media och tvättceller med 5 ml 1X fosfatbuffert saltlösning (PBS).
- Aspirera bort PBS, tillsätt 1 ml 0,05% trypsin värmd till 37 ° C och inkubera i 5 min (eller tills cellerna inte längre klistras vid plattan) vid 37 ° C.
- För att neutralisera trypsin, tillsätt 4 ml RPMI till H3255 och CCD-19Lu GFP-plattor och pipett celllösningarna i 15 ml koniska rör.
- Centrifugera celler vid 150 xg i 5 min vid RT.
- Aspirera av supernatanten och resuspendera cellpellets i 10 ml RPMI-media i koniska rör för att förbereda sig för sådd.
3. Cellplätering
- Räkna cellerna för att standardisera sådd.
- Invertera rör för att blanda celler i lösning. Pipettera 10 μl av varje cellsuspension i ett mikrocentrifugrör och tillsätt 10 μl trypanblå.
- Pipettera 10 μL av denna lösning i en cellräknande bild och sätt in i en automatiserad cellräknare.
OBS: Andra metoder för cellräkning ( dvs.. Hemocytometer) kan användas. - Upprepa antalet celler minst tre gånger, eller tills de erhållna räkningarna är konsekventa.
- Fröceller på en flervägsplatta
OBS: Antalet plattor till utsäde är beroende av antalet tidpunkter som ska avbildas. Alternativt kan en platta återbildas över tiden om cellerna transduceras med histon-2B-GFP (eller andra stabila lentivirala nukleära fläckar som ger tillräcklig nukleär segmentering).- Seed totalt 1 500 celler / brunn i 100 pl RPMI. Förbered trecellssuspensioner till platta tre cellpopulationer: H3255, CCD-19Lu GFP och 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Utför varje i tre exemplar med identiska plattformsuppsättningar för varje tidpunkt.
OBS: Inledande sådddensiteter bör optimeras för varje celllinje och plåtstorlek. - Seedceller i 3 x 96-brunnsplattor med en flerkanalspipett. Inkubera celler O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
- Seed totalt 1 500 celler / brunn i 100 pl RPMI. Förbered trecellssuspensioner till platta tre cellpopulationer: H3255, CCD-19Lu GFP och 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Utför varje i tre exemplar med identiska plattformsuppsättningar för varje tidpunkt.
4. Läkemedelsdosering
- Tillsätt DMSO till erlotinibpulver för att göra en slutlig erlotinib stamlösning med 10 mM koncentration.
OBS: Läkemedlet kan ersättas enligt önskemål. - Späd läkemedlet med cellodlingsmedium till 2x slutkoncentrationen med den högsta slutkoncentrationen vid 10 | jM och seriellt utspädd fyra gånger vid ett 1:10 förhållande, för totalt fem läkemedelskoncentrationer och ingen läkemedelskontroll.
OBS! Om koncentrationen av DMSO är lika med eller överskrider 0,1% v / v vid högsta läkemedelsdos, ska ingen läkemedelskontroll innehålla motsvarande mängd DMSO för att säkerställa att observerade observerade effekter inte beror på DMSO-toxicitet. - Pipettera 100 μl läkemedelslösning i lämplig brunn för en slutlig läkemedelskoncentration av 1x utspädd i media.
5. Bildförvärv
OBS! Bilderna erhölls på dagarna 0, 2 och 3. Beroende på celltyper och cellulära processer som studeras, oDe önskade tidpunkterna kan studeras.
- Stänkceller för att förbereda sig för avbildning.
- Fyll upp färgämneslösningen vid följande slutliga koncentrationer.
- För fluorescensbaserad klassificering bereda 5 μg / ml nukleär fläck och 5 μM dödcellsfläck i PBS (se tabell över material ).
- För morfologibaserad klassificering bereda 5 μg / ml nukleär fläck, 5 μM dödcellsfläck och 5 μM cellfläck i PBS (se tabell över material ).
- Tillsätt 20 μL färglösning till varje brunn. Inkubera i 30 min vid 37 ° C skyddad från ljus.
- Fyll upp färgämneslösningen vid följande slutliga koncentrationer.
- Optimera och skaffa bilder.
- Ta bort brunnsplattan från inkubatorn, torka botten av plattan med 70% EtOH och placera plattan i bildkammaren.
- På fliken "Inställningar" klickar du på knappen "+" under "Kanalval" för att lägga till lämpliga kanaler tillBild ( dvs. ljusfält, nukleär fläck, dödcellsfläck, GFP och RFP signaler).
- Klicka på "Layout Selection" och ta z-staplade testbilder varje 2 μm med början på 0 μm och sluta med 20 μm för att identifiera fokusplanet. Ange detta avstånd för varje kanal under "Höjd".
- Klicka på "Snapshot" under varje kanal för att utvärdera intensiteter och optimera exponeringstiderna. Ange högre eller lägre värden under "Tid" efter behov.
- På höger sida av skärmen markera lämpliga brunnar (som ska avbildas) på skivan. I brunnarna schematiskt nedan markerar du de tjugofem fälten som ska avbildas på ett liknande sätt.
- Under 'Run Experiment' identifierar du plattan i 'Plate Name' på vänster flik och klickar på knappen 'Start' (nedan) för att köra bildförvärvsprotokollet med ett 10X-objekt att generera gråskaliga TIFF-bilder i de ovan nämnda kanalerna.
OBS! Steg-för-steg instRörelser för bildbehandling kan skilja sig mellan instrument, men parametervärdena bör fortfarande optimeras. - Upprepa avbildningen på dag två och tre.
6. Bildanalys
OBS: All bildanalys utfördes med proprietär programvara. Men eftersom det inte är offentligt tillgängligt, har även jämförbara analyser utformats på CellProfiler 2.2 och CellProfiler Analyst 2.0, med ett kort protokoll som anges nedan och detaljerat protokoll tillhandahållet som tilläggsmaterial (testbilder laddas redan i pipelines för att testa arbetsflödet). Bilderna från detta experiment gruppades ihop per brunn så att varje brunn kunde laddas individuellt. CellProfiler-pipelinerna nedan innehåller ett regelbundet uttryck som analyserar metadatainformation från varje bildfilnamn och tillåter att bilderna grupperas vidare efter kanal.
- Hämta och installera open source-programvaran: 'CellProfiler9; Och "CellProfiler Analyst". Godkänn alla standardalternativ och tillägg under installationen.
- Klassificera heterocellulära kulturer i subpopulationer.
- Öppna "CellProfiler" -programvaran, klicka på "Arkiv" | "Importledning" | 'From File' och välj lämplig fil ("Fluorescence_Classification.cppipe" för fluorescensbaserad klassificering , eller "Morphology_Classification.cppipe" för morfologibaserad klassificering).
OBS! Dessa filer innehåller protokoll för grundläggande bildbehandling och kärnor / cellsegmentering. På grund av den ojämna Hoechst-fläcken som är närvarande över dessa celler segmenterades och förstorades kärnor och användes därefter för att maskera bilden för att möjliggöra segmentering av kärnor med lägre intensiteter.- Välj den fluorescensbaserade klassificeringsrörledningen för att klassificera celler som antingen H3255 eller CCD-19Lu baserat på eGFP-intensitet och för att beräkna morfologiska funktioner.
OBS: CCD-19Lu-celler transducerades med GFP. - Välj den morfologibaserade klassificeringsrörledningen för att segmentera kärnor och celler och för att beräkna morfologiska funktioner.
OBS: Ytterligare nedströmsanalys i "CellProfiler Analyst" behövs för klassificering. Döda celler klassificeras via fluorescensbaserad klassificering.
- Välj den fluorescensbaserade klassificeringsrörledningen för att klassificera celler som antingen H3255 eller CCD-19Lu baserat på eGFP-intensitet och för att beräkna morfologiska funktioner.
- Klicka på "Visa utmatningsinställningar" längst ner till vänster på skärmen. Välj platsen för bildfilerna för analys ('Standardinmatningsmapp') och destinationen för den extraherade data ('Standardutmatningsmapp').
- Klicka på "Analysera bilder" för att börja analysen. När analysen är klar klickar du på "OK" och går till "Standardutmatningsmappen" för att visa de beräknade uppgifterna.
OBS ! Exempelparametervärden och bilder finns i Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf . - För morfologibaserad klassificering (endast) gör följande.
- Öppna "CellProfiler Analyst" -programvaran, välj databasegenskapsfilen som genereras i CellProfiler, och klicka på "Öppna".
- Klicka på fliken "Klassificerare" längst upp till vänster på skärmen. För att ringa slumpmässiga cellbilder från experiment, klicka på "Hämta"; Bilder kommer att visas i det oklassificerade fönstret.
- Klassificera celler manuellt som positiva (H3255) eller negativa (CCD-19Lu) genom att välja och dra celler till lämplig bin (se Supplemental File 2-Pipeline.pdf : Figur B ). Efter att ha klassificerat minst 50 celler per subpopulering klickar du på "Träklasserare" och klickar sedan på "Kontrollera framsteg".
OBS: Celler klassificeras via en användarövervakad slumpmässig skogsmaskininlärningsalgoritm 12 . Om noggrannheten inte överstiger godkänd tröskel (> 90%), kan det vara nödvändigt att gå tillbaka och optimera cellsegmenteringen på "CellProfiler", eller cellerna kanske inte är idealiska för klassenFying genom morfologi. - Klicka på "Score All" för att skapa en tabell med cellantal för varje delpopulation.
- Öppna "CellProfiler" -programvaran, klicka på "Arkiv" | "Importledning" | 'From File' och välj lämplig fil ("Fluorescence_Classification.cppipe" för fluorescensbaserad klassificering , eller "Morphology_Classification.cppipe" för morfologibaserad klassificering).
Representative Results
Vi genererade en bildsats bestående av 25 fält / brunn, 54 brunnar / platta (3 cellpopulationer x 6 läkemedelskoncentrationer x 3 replikat), över tre plattor för totalt 4 050 enskilda bilder. Bildsätten som genererades under experimentets gång analyserades med användning av proprietär programvara (se tabell över material) för att extrahera olika kvantitativa egenskaper hos celler ( dvs morfologi, fluorescens) som då skulle kunna användas för att klassificera celldelpopulationer. Men eftersom den kommersiella programvaran som används har begränsad åtkomst skapades jämförbara nedströmsledningar i CellProfiler och CellProfiler Analyst.
Heterocellulär klassificering i delpopulationer
Nukleär identifierades och segmenterades baserat på DNA-fläcken (här Hoechst) och cellpopulationer klassificerades antingen baserat på fluorescens eller moRfologi ( figur 1 ). För fluorescensbaserad klassificering transducerades fibroblasterna (CCD-19Lu) tidigare med GFP-lentivirus. GFP-intensitetsnivåerna mättes för varje kärna, och de som beräknades över den accepterade tröskeln (baserad på bakgrundssignalen) klassificerades som CCD-19Lu medan de nedan identifierades som tumörceller (H3255). För morfologibaserad klassificering färgades celler tidigare med en icke-toxisk cellulär fläck (se tabell över material) och detta användes för att identifiera och segmentera cytoplasman. En maskininlärningsalgoritm utbildades med ~ 50-100 celler från varje population. Morfologiska egenskaper identifierades som var signifikant olika mellan populationerna, vilka sedan användes för att designa en linjär klassificerare för att skilja mellan CCD-19Lu och H3255-celler. Fluorescens- och morfologi-klassificeringsprotokollerna var 97,4% (n = 1403) överensstämmande för att skilja mellan de två cellbefolkningenAtioner i obehandlade förhållanden och 92,5% (n = 916) överensstämmande vid läkemedelsbehandlade betingelser (1 uM erlotinib) ( Figur 2 ).
Fenotypiska analyser av delpopulationer
Förutom att skilja mellan celltyper, syftade vi till att karakterisera fenotypiska egenskaper hos varje subpopulation. Multiplexningsanalyser sparar tid och reagenser, ökar konsistens och ger ytterligare information om det system som studeras. Det finns många potentiella fenotypiska utgångar och man bör välja dem baserat på frågor av intresse. Här undersöktes förändringar i cellmorfologin och lönsamhetsstatus som svar på erlotinibbehandling. Efter tre dygn av läkemedelsbehandling observerades en minskning av kärnområdet och en ökning av cellområdet hos H3255-cellerna ( Figur 3A ). Den genomsnittliga skillnaden i kärnområde mellan"Behandlade populationer med" narkotika "och" läkemedel "visade sig vara statistiskt signifikanta via en tvåsidig typ 2 (lika varians) t- test ( p = 7,92 x 10 -16 ). Vi förutser att denna observation är ett cellulärt svar på den stress som läkemedelsbehandling ålägger.
Det är också av intresse att studera huruvida ett läkemedel har en cytotoxisk ( dvs. ökad antal döda celler över tiden) eller cytostatisk ( dvs minskning av antalet cellfödelser över tiden) på celler, eftersom detta har en djup klinisk effekt. Exempelvis inducerar en cytostatisk läkemedelseffekt tillväxtstopp men eliminerar inte cellerna från tumören, så det finns potential för att cancerceller återinitierar cellproliferation när läkemedlet är avlägsnat. Läkemedelseffekter kan ofta vara beroende av kontext, koncentration och celltyp. Vi har tidigare observerat erlotinib som framkallar ett cytotoxiskt svar i en celltyp, samtidigt som man visar acYtostatiskt svar i en annan 13 .
Traditionella bärbarhetsanalyser matar ut relativt celltal och diskriminerar därför inte mellan tillväxtstopp och celldöd. Därefter identifierades döda celler baserat på propidiumjodidfärg ( Figur 3B ). Både cytotoxiska och cytostatiska effekter av erlotinib på H3255-celler observerades, med en ökning av antalet dödsfall och en minskning av antalet födda efter läkemedelsbehandling ( Figur 3C ). Det är värt att notera att antalet döda celler sjunker efter dag 1 sannolikt på grund av cellröjning. CCD-19Lu-celler påverkades inte av läkemedlet. En ytterligare fördel med denna plattform är genereringen av kvantitativa data. Till exempel i vårt samkulturexperiment befanns en initial subpopulation av 1,118 (75,8%) H3255-celler vara 2,817 (87,9%) eller 396 (57,2%) efter tre dagar utan eller med erlotinIb behandling ( Figur 4 ). Eftersom vi kan generera faktiska cellantal i stället för relativ procentandel (som med flödescytometrimetoder), drar vi slutsatsen att förändringen i kompositionen under läkemedelsbehandling beror på en minskning av H3255-celler och inte en ökning av CCD-19Lu. Det är inget värt att dödsgraden kan underskattas på grund av cellreling, vilket är svårt att bedöma experimentellt och sannolikt skiljer sig åt mellan celltyper.
Figur 1: Översikt över bildanalysprotokollet. Två potentiella nedströms bildanalys pipeliner för att klassificera heterocellulära populationer med antingen morfologibaserad klassificering eller fluorescensbaserad klassificering. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka på henneE för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konkordans mellan morfologi och fluorescensbaserad klassificering. ( A ) Concordance plot som visar överlappningen av de två klassificeringsprotokollen. Samma celler klassificerades som H3255 med användning av både morfologi- och fluorescensbaserad klassificering. De båda protokollen var överens med klassificering för 97,4% (n = 1403) obehandlade celler och 92,5% (n = 916) celler behandlade med erlotinib (Obs: det vita området är för litet för att visualisera). ( B ) 10X bilder som visar exempel på bra och dålig överensstämmelse mellan fluorescensbaserad och morfologibaserad klassificering. De vita pilarna pekar ut celler som inkonsekvent klassificerades mellan plattformar. Input bild: blåkärnor (Hoechst); Grön - CCD19Lu (GFP). klassiFication bilder: Red - H3255; Grön - CCD-19Lu. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Multiplexerade fenotypa mätningar från en enda experimentell inställning. ( A ) Morfologiska särdrag, såsom kärnor och cellarea, beräknades på enkelcellsnivån i närvaro och frånvaro av läkemedel. Anm .: Cellområden som mäter mindre än 100 μm 2 betraktades som skräp och uteslutna från analyser. Box-diagrammet visar median med första och tredje kvartilområdet och 95% konfidensintervallfelstavar. ( B ) H3255 (blå) och CCD-19Lu (gröna) celler samkulturerades och döda celler identifierades baserat på intensiteten av propidIumjodidfärg (röd) och avbildad med användning av ett 10X-mål. Skala bar = 1 mm (övre panel); 100 μm (bottenbilder). ( C ) Totalt antal levande och döda celler beräknades över tre dagar med eller utan läkemedelsbehandling, med en uppenbar minskning av antalet levande celler och ökning av döda celler med tillsats av erlotinib. Felstänger representerar standardfel av medelvärdet baserat på tre replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Subpopulation Dynamics över tiden. Representativa 10X bilder av brunnar innehållande H3255 (blå) och CCD-19Lu (grön) på dag 0 eller dag 3 med och utan läkemedel. Celler som tillhör varje subpopulation räknades och proportionella cirkeldiagram visar aKtual förändring i befolkningskomposition över prov. Skalstänger = 1 mm (mittpaneler, inkommande i; yttersta panelen), 1 mm (toppbild), 100 μm (bottenbilder). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 och U54CA143907 för att upprätta fysiska vetenskap-Oncology Centers (PS-OC) vid Dana-Farber Cancer Institute och University of Southern California. SM Mumenthaler fick en PS-OC-transnetworkpris som stödde något av detta arbete.
Vi vill uttrycka vår djupaste tacksamhet till våra filantropiska anhängare, särskilt Stephenson-familjen, Emmet, Toni och Tessa, för deras donation av Operetta HCS-plattformen. Vi vill också tacka J. Foo som vägledare och center för ledamöter för tillämpad molekylärmedicin: D. Agus för klinisk vägledning och mentorskap, K. Patsch för meningsfulla diskussioner med experimentell design, R. Rawat för hjälp i bildanalysprotokoll , J. Katz för tekniskt bistånd med operetten, och P. Macklin och D. Ruderman för användbara diskussioner och feedback.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
- Kanemura, Y., et al. Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity. J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Hsu, S., et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes. J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).
- Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).
- Sero, J. E., et al. Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells. Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).
- Chen, J. F., et al. Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases. Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Paraiso, K. H., Smalley, K. S. Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).
- Dao, D., et al. CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets. Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).
- Garvey, C. M., et al. A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics. Sci Rep. 6, 29752 (2016).
- Juarez, E. F., et al. Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD. BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).
- Mumenthaler, S. M., et al. The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells. Cancer Inform. 14, Suppl 4. 19-31 (2015).
