Summary
תאי גזע הם מבטיחים לספקים טיפוליים לטיפול בגידולים במוח בשל הטרופיזם של הגידול הפנימי שלהם. לא פולשני אינטראנסלי תא גזע המסירה עוקף את מחסום דם מוח ומראה פוטנציאל חזק לתרגום קליני. מאמר זה מסכם את העקרונות הבסיסיים של אספקת תאי גזע אינראנסאלי במודל עכבר של גליומה.
Abstract
הטרופיזם הפנימי כלפי ממאירויות המוח גורם לתאי גזע כמובילים מבטיחים של תרופות טיפוליות נגד גידולים ממאירים. אספקת תאי גזע טיפוליים דרך התוואי הפנימי היא אסטרטגיה חלופית שהתגלתה לאחרונה, עם פוטנציאל חזק לתרגום קליני, בשל אופיו הלא פולשני בהשוואה להשתלה תוך גולגולתי או למסירה דרך נתיבי מערכת. העדר מחסום דם מוח מחזק עוד יותר את הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע העוברים כניסת מוח אינטראנסלית. מאמר זה מסכם את הטכניקות החיוניות המשמשות במחקר שלנו מתאר את העקרונות הבסיסיים של האסטרטגיה intranasal עבור משלוח תא גזע באמצעות מודל העכבר של xenografts גליומה תוך גולגולתי. אנו מדגימים את הפרוצדורות המותאמות שיוצרות תוצאות עקביות וניתנות לשחזור עם פרמטרים ניסיוניים מוגדרים מראש ומציעים הנחיות לגבי זרימת עבודה יעילה המבטיחה ביצוע יעיל ואקסימי אמיןתוצאה נטאלית. המאמר נועד לשמש בסיס להתאמה אישית ניסיונית נוספת המבוססת על היפותזה, סוגי תאי גזע, או פרטים ספציפיים.
Introduction
רעילות נמוכה, immunogenicity נמוכה, ואת המוח הטריפיזם המוחי הפנימי של תאי גזע אנושיים הם תכונות אטרקטיביות עבור משלוח של כלי רכב טיפולית 1 . טיפולים המבוססים על תאי גזע חדשניים עבור גידולי מוח ממאירים הם חידושים מבטיחים שפותחו בשנים האחרונות, וההתאמה הפנימית של האסטרטגיה הטיפולית הזו מייצגת קפיצה לתרגום קליני, בכך שמנהל לא פולשני וחוזר על עצמו עשוי להפחית באופן דרמטי את המכשול עבור יישומי המטופל יכול להיות מותאם עבור שירותי המטופל ללא הרדמה כללית או שירות ממושך המטופל הקשורים הליכים כירורגיים פולשניים 1 , 2 , 3 , 4 .
אנחנו ואחרים חלוץ את המסלול הפנימי של העברת תאי הגזע לגידולים במוח והניחנו את עבודת הקרקע עבור חלק מעקרונות היסודשל מחקר translational באמצעות מודלים xenograft העכבר 2 , 3 , 4 , כמו גם נחקר ההגירה של תאי גזע ב vivo באמצעות הדמיה מגנטית הדמיה (MRI) נושאות מגיב 2 . באמצעות חקירות ניסיוניות אלו, צברנו ניסיון רב והרכבנו תובנות כיצד לבנות בצורה הטובה ביותר אסטרטגיית הערכה קדם-קלינית איתנה באמצעות מודלים מבוססי-עכבר מבוססי-חולי של קסנוגרפט (PDX) של הדליומה הממאירה, תוך שמירה על החלטת החקירה לבדיקת פרטים מכניסטיים מתוחכמים של התופעות הביולוגיות המתוחכמות של כניסת המוח האינטראנסאלית של תאי גזע תרפויטיים הנשלחים אל חלל האף. כאן, אנו מתארים את העקרונות של פרוטוקול הפעלה סטנדרטית כדי להדגים את המצב הנוכחי של חקירות ניסיוני באמצעות מבוססת היטב האדם גזע עצביים גזע תאים HB1.F3.CD 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים נהלים חייבים להיות מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) או שווה ערך. אם קיימת אי ודאות לגבי הנהלים הספציפיים המתוארים כאן, אל תמשיך. להבהיר עם IACUC של המוסד וחבר צוות וטרינרי המיועד.
1. הבטחת סטריליות של תאים תרבותיים ועקבו עקרונות של טכניקות אספטי
- בצע את נוהלי מעבדה סטנדרטיים בכל נהלי התרבות התא דרישות IACUC לבדיקת תאים ללא אישור מצב ללא הפתוגן לפני מתן כדי עכברים 9 , 10 .
- בצע את דרישת NIH לאימות התא כדי להבטיח תוצאה לשחזור 11 .
- עקוב אחר ניתוח טכניקות אספטיות קטנות שהוקמו בכתב יד זה 4 .
2. הכנת תאים גליומה עבור <Em> ב ניסוי Vivo 2 , 4
- תאים של גליומה (GBM43, GBM6 ו- U87MG) בסרום המכיל בסרום (10% בסרום העובר של דולבקו), או במדיום חופשי בסרום (בינוני נוירובאסלי עם תוספי מזון B27, N2, הפרין, גורם לגדילה באפידרמיס [ EGF], גורם הגדילה הבסיסי fibroblast [bFGF], אנטיביוטיקה, ו- L- גלוטמין 12 ), בתא humidified CO 2 תרבות החממה.
- בדוק את כל שורות תאים באמצעות לוח העכבר העכבר לרוץ מספקי שירות מסחריים.
- איסוף תאים חסיד על ידי הסרת בינוני תרבות. דגירה עם 0.05% טריפסין במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (1 מ"ל של טריפסין עבור בקבוק T25, 2 מ"ל עבור בקבוק T75, בקנה מידה בהתאם עבור צלוחיות תרבות עם שטח הפנים גדול יותר) ולאחר מכן לשטוף תאים עם Ca 2 + ו Mg 2 + פוספט חינם שנאגרו מלוחים (PBS).
- הקש עלבקבוק כדי לסלק תאים מיד לנטרל עם עודף של המדיום המכיל בסרום (8 - 9 מ"ל). לאחר מכן להשתמש בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות כדי לשאוב את ההשעיה תא צינורות צנטריפוגה.
- צנטריפוגה תא ההשעיה ב XG 400 במשך 5 דקות. לשטוף את התא לפחות פעמיים עם 10 מ"ל של PBS על ידי צנטריפוגה חוזרת.
- איסוף תאים glioma גדל כמו כדורי הגידול במדיום חופשי בסרום באמצעות צנטריפוגה (אותה מהירות ומשך כאמור); לנתק את תא גלולה על ידי הדגירה ב 1 - 2 מ"ל של פתרון ניתוק התא ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני שטיפה פעמיים עם 10 מ"ל של PBS על ידי צנטריפוגה (400 x 5xxx).
- Re- להשעות גליומה ב מלוחים סטרילית בריכוז של 50,000 - 200,000 תאים לכל 2.5 μL. מספרי תאים המשמשים להזרקה למוח העכבר תלויים בקצב הצמיחה שנקבע עבור כל שורה של תאי גליומה. הנה, להשתמש 25,000 ו 100,000 עבור GBM43 ו GBM6 החולה נגזר תאים סרטניים, בהתאמה.
- הכן כפליים את כמות nceמספר תא ssary להשתלה כדי להסביר את אובדן של שבר במהלך ההליך. מעבירים את ההשעיה תא להזרקה לצינור microcentrifuge סטרילית צינור במקום על הקרח. שמור תאים על הקרח במשך 2 שעות מקסימום במהלך ניתוחים, להכין אצווה חדשה אם ניתוחים מתמשכים מתוכננים.
3. השתלת תוך גולגולתי ליצור מודלים עכבר Xenograft ( איור 1 א ) 2 , 4 , 13
- לפני יום הניתוח, לעקר את כל כלי ניתוח ב החיטוי, ולהכין את כל טיפול שלאחר ואחרי טיפול בבעלי חיים לכל פרוטוקול מאושר IACUC. לעקר את מסגרת stereotaxic וציוד היקפי כדי להבטיח תנאי aseptic תוך, ובכך למזער סיבוכים.
- ארגן את אזור הפעולה כדי למזער את העומס ואת האפשרות של זיהום.
- השמלה בציוד מגן אישי מתאים(PPE) לפי דרישת IACUC.
- הגדרת התאוששות שלאחר הניתוח התאורה המתאימה. ודא כי הרדמה ומשככי כאבים מוכנים טרי באמצעות ריאגנטים שלא חלפו. הגדרת המתאים הגוף תחזוקת חום מכשירים לכל פרוטוקול מאושר IACUC.
- כדי לקבוע את המטופל האנושי הנגזרות xenografts התאים האנושיים לבדיקת משלוח intranasal של NSCs אנושיים, להשתמש מינים עכבר immunocompromised כגון nu / nu עכבר אתימי של כל מין בגיל 6 שבועות בערך.
- להרדים את החיה בהתבסס על משקל הגוף באמצעות ריאגנטים שאושרו, כלומר באמצעות הזרקה תוך-עינית (IP) של תערובת של קטמין (50-100 מ"ג / ק"ג, התייעץ עם IACUC מוסדי לטווח מינון מאושר) ו- xylazine (5-10 מ"ג / Kg; להתייעץ IACUC מוסדיים על טווח מינון שאושר) ב 200-250 μL מלח סטרילית, או באמצעות הרדמה isoflurane 4-5% באמצעות מכשיר שאיפה.
- ודא החיה הגיעה המטוס הרדמה כירורגית בY אצבע לפני צלקת העור. החל ג 'ל עיניים סטריליות מספיק כדי להבטיח את מצב לחות של הקרניות של החיה.
- לעקר את הגולגולת באמצעות מגבונים חוזרים חוזרים לסירוגין של betadine ו אלכוהול איזופרופיל לכל Pritchett-Corning et al. 14 .
- ספק את החתך טרום החתך על ידי הזרקת SC של Buprenex (0.05 - 2 מ"ג / ק"ג) לפני החתך באמצעות להב כירורגי.
- השתמש מעוקל כותנה מעוקל נוטה לעזור המוסט בעת חשיפת הגולגולת; השתמש מי חמצן 3% כדי להקל על דימום מקרי.
- השתמש במקלדת כף יד חשמלי מופעל על ידי סוללה (פחות מ 1 מ"מ רוחב) כדי ליצור חור בר ב 2 מ"מ לרוחב, שמאלה או ימינה, כדי קו האמצע, ו 2 מ"מ מאחורי ברגמה (מיקום קואורדינטות יכול להיות מותאם אישית מבוסס על מודל הגידול המיועד למחקר מסוים).
- הר החיה למסגרת stereotaxic כדי appropriatE יציבה הראש, כך המזרק המילטון מוכנס מוכנס הוא ניצב על פני השטח של הגולגולת סביב החור בר. הקפד לוודא כי המטוס הרדמה של בעל חיים הוא במצב טוב על ידי צובט הבוהן. בדוק את קצב הנשימה כדי לוודא כי החיה אינה תחת לחץ כאב במהלך השלבים הבאים.
* אנו לא מדגישים מיקומי בר אוזן משום:- יש לנו predrilled חור בור כדי למקם את המחט, ולכן, קואורדינטות הגולגולת מדויק הם מיותרים;
- תעלות האוזן עכבר שביר, ואת המיקום המדויק באוזן של סורגי האוזן דורש אימון מעורב יותר שאינו רלוונטי למטרה שלנו. הסיכון לנזק לתעלות האוזן מורין עולה על היתרונות של מיקום מדויק;
- תמיכה בלחי הרבה יותר קל לבצע ומסוגלת להשיג את אותן רמות של יציבות ראש העכבר ואיזון במהלך המיקום. זה יתרון נוסף עבור ניתוחי זמן מרובים רגישים כדי להבטיחהשלמת במועד עם כדאיות התא טוב.
- השתמש את הכפתורים מסגרת stereotaxic למקם את קצה מזרק שטוח קצה החור בר, ולאחר מכן להוריד אותו לאט עד 3 מ"מ מתחת למשטח דורה. נסוג 0.5 מ"מ כדי לשמור על קצה המחט ב 2.5 מ"מ מתחת לדורה.
- להזריק 2.5 μL של תאים דליומה preloaded על פני תקופה של 1 דקות. בואו המחט לשמור על מעמדה עוד 1-2 דקות לפני לאט, במשך 1 דקות, לסגת את המחט מתוך המוח וטיפול כדי למזער את תא backflow. החל שעווה סטרילית עצם כדי למנוע outgrowth הגידול הגולגולתי.
- סגור את הפצע באמצעות נירוסטה פצע קליפים (7 מ"מ). לספק זריקה תת עורית (sc) של 1 מ"ל של תמיסה רינגר סטרילי הנקי (מראש מחומם ל 37 מעלות צלזיוס), ומניחים את החיה בתא התאוששות אשר באמצע הדרך על כרית חימום.
- החזירו את החיות למעמד המאוורר ברגע שהן חוזרות לניידות, ועוקבות אחרי טיפול שגרתי שלאחר הטיפול כדי להבטיח את פעולתן H התאוששות.
4. ויוו הדמיה פליטת אור (BLI) של גידול הגידול ( איור 1 ב ) 15
הערה: החולה נגזר התאים הדליומה משתנים להביע בלוציפראז גחלילית. זה מאפשר לנו לעקוב אחר התקדמות הגידול לאחר השתלת תוך גולגולתי.
- תן לבעלי חיים הזרקת ה- IP של D- לוציפרין, מלח אשלגן (150 מ"ג / ק"ג) 10 דקות לפני הפגישה הדמיה.
- מיד מקום חיות בחדר חמצן isoflurane מחוממת אושרה על ידי IACUC.
- מקום חיות בתוך החדר מחומם (37 מעלות צלזיוס) הדמיה ללכוד את האות BLI באמצעות הגדרות תוכנה (לפרטים, ראה הוראות היצרן).
5. מוח כולו הקרנה ( איור 1 ג ) 2 , 4 , 13
> הערה: כדי להגביר את ההעברה של hNSCs נמסר intranasally לגידולים במוח, הקרנה מוח שלם של עכברים הנושאים xenografts הגידול תוך גולגולתי ניתן להשתמש 4 .
- השתמש הזרקת ה- IP של תערובת קטמין ו xylazine (50-100 מ"ג / ק"ג ו 5-10 מ"ג / ק"ג בהתאמה, להתייעץ IACUC מוסדיים טווח מינון מאושר) עם מטוס הרדמה תת כירורגית כדי לגרום באופן בינוני הרדמה לעכברים.
- השתמש במגש מדגם למקם את העכברים בתוך החדר בין עופרת חוסם בלוקים, המאפשר חשיפה רק ראש הנתיב קרינה ( איור 2 ).
- תן עכברים עם אישור חיובי BLI של הגידול הגידול (בדרך כלל ביום 7-8 לאחר השתלת תאים הדליומה) מנה יומית של 2 GY של הקרנה במשך 5 ימים רצופים. בצע הערכה של BLI של הגידול לאחר מינון ההקרנה האחרון.
6. שינוי גנטי של תאי גזע עצביים אנושיים (NSCs, Figur3 א) 4
- לשמור על NSCs אנושיים (לשכפל HB1.F3.CD) 6 , 7 ב מדיום DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין ב 37 ° C חממה humidified תחת 95% בחדר החדר 5% CO 2 ( N NSCs).
- בצע overexpression גנטי של קולטנים chemotaxic, כגון CXC מוטיב chemokine קולטן 4 (CXCR4), ב hNSC ידי התמרה עם קידוד lentivirus עבור CXCR4 האדם.
- כאשר NSCs הם ליד confluency 75-80%, להוסיף את lentivirus CXCR4 למדיום התרבות יחד עם polybrene (8 מיקרוגרם / מ"ל), ו דגירה של 8 שעות או לילה.
- החלף וירוס המכיל בינוני בינוני טרי המכיל blasticidin ב 4 מיקרוגרם / מ"ל לבחירה חיובית של תאים transduced.
- לאמת את רמת הביטוי CXCR4 ב hNSCs שונה ( CXCR4 NSCs) באמצעות cytometry זרימה באמצעות נוגדנים נוגדי CXCR4 ו נוגדנים תואמים isotype ו viכמותי RT-PCR באמצעות זוג primers הגברה CXCR4 ו glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) cDNAs 4 .
- יצירת בקרת NCCs וקטורית ( VC NSCs) באמצעות אותה אסטרטגיה, עם RFP מחליף את הגן CXCR4, ולאמת באמצעות מיקרוסקופיה או cytometry זרימה בשל נוכחות של הקרינה RFP.
7. תנאים מוקדמים היפוקסיים של NSCs אנושיים ( איור 3 א ) 4
- צלחת NSCs תרבותי T75 תרבות צלוחיות כפי שתואר לעיל עד confluency 90% הוא הגיע.
- מקום תא התרבות צלוחיות בתוך תא CO 2 humidified / חממה עם מתוחזקת 1% O 2 רמות במשך 24 שעות, באמצעות אספקת גז N 2 נשלט על ידי מד זרימה אוטומטי מובנית. תאים אלה נקראים H NSCs. בקרת NSCs N מתוארים בשלב 7.1.
8. טוען של הוNSCs אדם עם וירוס Oncolytic ( איור 3B -3H ) 5
- 8.1.Infect N NSCs, NSCs, VC NSCs, CXCR4 NSCs עם 50 adnovirus שכפול מותנה (CRAD) -S-pk7 חלקיקים נגיפיים / תא 4 , 16 .
- 8.2.After 2 שעה של הדגירה בטמפרטורת החדר עם תקופתיים הקשה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם התקשורת כדי להסיר חלקיקים נגיפיים מאוגדים להשעות תאים מלוחים סטריליים להזרקה.
זהירות: לבצע את כל הווירוס הקשורים בתהליכים חוץ גופית תרבות במתקנים עם הייעוד ברמה biosafety המתאים, כגון BSL2. ציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק על ידי חוקרים המטפלים בווירוס oncolytic לכל הנחיות המוסד לבעלי חיים מוסדיים 4 , 16 .
9. טעינת תאי גזע עם מיקרוN-size תחמוצות ברזל Paramagnetic (MPIO) עבור מעקב ויוו באמצעות הדמיה תהודה מגנטית (MRI, איור 3B -3H ) 2
- כדי לתאי גזע תאים, להוסיף MPIOs לתרבויות תא גזע ב confluency ~ 80%, בנוכחות מגיב transfection עבור הדגירה לילה. היעילות של תיוג תא גזע (NSCs 4 או MSCs 2 ) עם MPIOs (פלאש אדום מצומדות) נקבע על ידי cytometry הזרימה.
- כדי להמחיש הגירה תא גזע והפצה במוחם של בעלי חיים גליומה, לרכוש גם מרובה פרוסה ברזולוציה גבוהה T2 משוקלל רכישה מהירה עם שיפור הרפיה ספין הד תמונות מרובה פרוסה T1 משוקלל מהיר זווית נמוכה זריקה (FLASH) sequences הד הדרגתי כדי להעריך את המבנה באמצעות שני מטוסים העטרה ו צירית של המוח העכבר 2 .
10. Intranasal משלוח של NSCs טיפולית ( ותרשים 3D ) 2 , 4
- תרבות לאסוף NSCs ( N NSCs, NSCs, NCs VC , ו CXCR4 NSCs) על פי פרוטוקול המתואר בסעיף 3.
זהירות: כל ההליכים בבעלי חיים הקשורים NSCs נטען OV חייב להתבצע במתקנים עם הייעוד ברמה biosafety המתאים, כגון מתקני BL2 או BSL2. - להרדים עכברים באמצעות הזרקת ה- IP של תערובת קטמין ו xylazine על פי שלב 3.6.
- מקום עכברים על וילון נקי פונה כלפי מעלה עם כרית חימום מתחת לשמור על טמפרטורת הגוף. התאם כרית מרופד עשוי מגבות נייר מגולגל עם קלטות כדי להבטיח את זווית זקוף של הנחיריים כאשר הניח מתחת לראש העכבר.
הערה: Hyaluronidase מראש הטיפול (סך של 100 U כמו ארבע חיסונים חוזרים על 5 דקות אינטרוולים, 3 μL בכל נחיריים) של האף eביתית תוארה בעבר 2 , 17 . - באמצעות micropipette, לוותר 2 μL ההשעיה NSC לנחיריים של העכבר. ראייה לאשר את השאיפה של טיפה לפני המעבר העכבר הבא. המספר הכולל של תאים נמסר ניתן לקבוע על ידי המשתמש; להשתמש 62,500-125,000 תאים / μL, כך 0.5-1 מיליון תאים ניתן להעביר 4 x 2 מינונים μL.
- השתמש טיימר כדי להבטיח 5 דקות intervals בין כל ההשעיה תא הממשל, עד 4 פעמים.
- אפשר לבעלי חיים להשיב את התנועה בתא התאוששות, עם עמדת שכיבה לאורך כל הזמן.
11. ניתוח הישרדות ( איור 3E )
- הזן את נתוני משך ההישרדות של בעלי חיים בתוכנות סטטיסטיות, ובצע השוואות סטטיסטיות תוך שימוש במבחן log-rank עם ערכי החשיבות הבאים: * p < 0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
12. אוסף רקמות והיסטולוגיה / אימונוציטוכימיה אימות של תאי גזע בתאי גזע פנימיים 2 , 4
- בנקודת הסיום של המחקר, להרדים עכברים באמצעות פרוטוקולים אישרה IACUC. נוהג סטנדרטי הוא באמצעות חדר זרימה בשליטה CO 2 להקריב את החיות כמו האסטרטגיה המתת חסד העיקרי ואחריו exsanguination ידי קיבוע זלוף.
- מיד לאחר הקורבן, לבצע זלוף intracardiac עם PBS על החיה כדי להבטיח חיסול שאריות דם כלי הדם ואת שימור רקמות לניתוח היסטולוגית שלאחר מכן.
- מניחים את החיה CO 2- מורמן על גבי משטח סופג במצב שכיבה, להמשיך עם laparotomy לחשוף את שריר הסרעפת, אשר גזור יחד עם כלוב הצלעות, כדי לחשוף את הלב.
- אחרי אמאהמלך ניק על אטריום ימין באמצעות זוג מספריים לנתיחה, להאיץ את exsanguination עם 3-5 מ"ל של הזרקת PBS דרך החדר השמאלי על השיא. הזרק קר paraformaldehyde 4% (PFA) למחזור באמצעות מזרק; עוויתות שרירים היקפיים לספק אישור חזותי כי אין חסימה העיקרי במחזור זה ימנע קיבעון רקמות תקין.
- כירורגי להסיר את הראש של הפגר ולשמור בצינור 50 מ"ל צנטריפוגה 4% PFA ב 4 ° C במשך הלילה. לשנות את הפתרון סוכרוז 30% למחרת היום לנתיחה רקמת המוח עוד 24 שעות מאוחר יותר.
- הטמיעו את רקמות המוח במתחם אוקטובר והקפאה של פלאש על איזופנטן על קרח יבש. ביצוע cryosectioning של בלוק רקמה כתוצאה לייצר 10-20 סעיפים רקמות מיקרומטר עבור יישומים היסטולוגיה ו immunocytochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הן היפוקסית מראש טיפול ( איור 4 א ) 4 ו overxion CXCR4 ( דמויות 4B ו 4 ג ) 4 באופן משמעותי upregulate נוכחות קרום התא של קולטני CXCR4 כפי שהוכח על ידי cytometry הזרימה. הגידול הטרופי שהראה NSCs (חיצים כחולים), מוצג היסטולוגיה רקמת הגידול (עיגול אדום). הנוכחות של MPIO שכותרתו ( איור 4 ד ) תאי גזע בגידול הוא אישר באמצעות מכתים כחול פרוסי ( איור 4E ). 4
ניתוח רקמות עולה כי הקרנה הראש בלבד ( איור 2 ) גורם לירידה נפח הגידול, כמו גם את upFulation SDF-1 בגידול הרקמה הסובבת ( תרשימים 5A ו 5 ב )4, אשר מאשרת את ההשערה כי ביטוי קולטן CXCR4 upregulated ב NSCs עשוי להקל על הטרופי הגידול לאחר XRT.
ניתוח הישרדות עולה כי למרות קרינה (XRT) לבד מועיל להישרדות של בעלי חיים הגידול ( איור 6 א ) 4 , הטבות נוספות ניתן להשיג באמצעות NSCs H עמוס OV מעל N Ns נטען עם OV בהקשר של XRT ( איור 6 ב ) 4 . יתרונות משמעותיים של הישרדות ניתן לראות גם עם NSCs מהונדסים גנטית ב- CSCCR4 באותו משטר טיפולי הקשרי ( תרשים 6 ג ) 4 .
ניתוח רקמות מאשר כי הן NSCs H ו- CXCR4 NSCs שיפרו באופן משמעותי את המסירה ממוקדת הגידול של OVs, כפי שמוצג על ידי staאשר עבור חלבון hexon ויראלי ( איורים 7A ו 7 ב ) 4 .
איור 1: תרשים זרימה סכמטי של ההליכים הכלליים של בעלי חיים המעורבים. ( א ) מודלים הגידול נוצרות באמצעות xenograft של תאים דליומה נגזר החולה. ( ב ) גידול הגידול מתבצע באמצעות BLI. ( ג ) טיפול בהקרנה ראשונית בלבד מועבר כמתואר בהליך 6. ( ד ) תנוחת סובין ותפיסת ראש נשמרת במהלך הטיפול בתאי גזע אינראנסאליים טיפוליים, כמפורט בהליך 11. ( E ) טיפול בניטור לאחר הטיפול, בעל חיים קטן הדמיה ניתוח היסטולוגית של הרקמה במידת הצורך הם במעקב. לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הגדרת בעלי חיים עבור הקרנה. עכברים הרדים ממוקמים בין מגן מגן בתוך מגש המדגם המאפשר הקרנה הראש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תרשים זרימה להליכי הכנה כללית של תאי גזע המעורבים לפני משלוח פנים. ( AC ) טיפול מוקדם היפוקסי או שינויים גנטיים של תאי גזע כדי overexpress CXCR4. ( BD ) כביסה, דיסוציאציה אנזימטית, אוסף תאים, וספירת צעדים הם perשנוצרו עבור טעינה נוספת של תאי גזע עם מטען טיפולי או אבחון. ( E ) ריאגנטים טיפוליים, כגון וירוסים oncolytic, או tracers אבחון, כגון חלקיקי MPIO, ניתן לטעון בתאי גזע שנאספו בריכוזים מתאימים עם רועד תקופתי ותסיסה עדינה ( F ). ( GI ) תאי גזע טעון אז ניתן לרחוץ ונספרו עבור משלוח intranasal לתוך עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ניתוח של שינויים בתאי גזע עבור הביטוי CXCR4 ו MPIO טוען. ( AC ) cytometry זרימה ניתן להפעיל כדי לאמת את השינויים פנוטיפי של תאי גזע כתוצאה של היפוקסי מראש טיפול או גנטיהַנדָסָה. (פרטים ניתן למצוא Dey et al 4 ) ( DE ) זיהוי של טעינה MPIO מוצלח של תאי גזע ובתוצאות vivo ניתן להשיג באמצעות cytometry זרימה מכתים כחול פרוסי, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: ההשערה כי הקרנה להקל על SDF-1 (איתותים ירוקים) Upregulation ב Glioma ו הרקמה הסובבת אושר באמצעות היסטופתולוגיה ו Immunocytochemistry של קטעי רקמות. הקרנה מגביר ביטוי SDF-1 ב xenograft GBM43. ניתוח של מכתים H & E ו immunocytochemistry של קטעי רקמה במוח מ שליטה עכברים מופרדים מופרדיםAtes מופחת נטל הגידול אך גדל רמות SDF-1 באתרי הגידול לאחר טיפול XRT. ( A ) ביטוי SDF-1 (ירוק) הוא מקומי מאוד באתר הגידול (תיבות לבנות) לאחר XRT. ( ב ) כימות densitometry של שדות הצפייה מוכיח עלייה פי ארבעה ביטוי SDF-1 בחיות XRT מטופלים בהשוואה לבעלי חיים שליטה (n = 3 ניסויים, *** p <0.001, סטודנט של מבחן T). פרטים ניתן למצוא Dey et al. 4 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: הישרדות היתרונות של NSC השתנה נצפו (פרטים ניתן למצוא Dey et al 4 ). ( א ) ההקשר של היתרונות הטיפוליים של XRT הוקם (*** p <0.001, בדיקת דרגת יומן). ( ב ) היפוקסי מראש טיפול של תאי גזע טעון OV משפר את הישרדות בעלי חיים (* p <0.05). שיפור גנטי CXCR4 משפר עוד יותר את הישרדותם של בעלי חיים (** p = 0.0013). פרטים ניתן למצוא Dey et al. 4 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: אישור משלוח OV על ידי Hypoxia- או CXCR4 משופרת NCS כדי המוח Tumor Xenografts מושגת באמצעות זיהוי חלבון ויראלי Hexon על ידי Immunocytochemistry (נקודות ירוקות) של קטעי רקמות של המוח של עכברים מטופלים עם או H A ) או CXCR4 NSCs ( B ), *** p <0.001 t הבדיקה. פרטים ניתן למצוא Dey et al. 4 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שהמסלול התוך-עיני של אספקת התרופות נבדק באופן נרחב עבור מולקולות קטנות, ננו-רפואה ותרכובות חלבון כאחד, היישום של תאי גזע טיפוליים עבור מיקוד אינטראנסלי של הגידול במוח הוא חדש מאוד בספקטרום של תרפיית הגידול במוח תחת פיתוח 2 , 3 , 4 . ישנם סיבוכים מהותיים המעורבים בהתנהגויות של תאי גזע בחלל האף, ופרטים מולקולריים עדיין אינם ברורים. גודלם של תאי גזע ומנגנוני ההפצה שלהם לאורך העצבים הגולגולתיים שונים באופן דרמטי מאלה של ביולוגים שאינם תאים או מולקולות קטנות, ואנו עוסקים כיום בחקירות מכניסטיות מפורטות המעורבות בהתנהגויות של תאי גזע טיפוליים באפיתל האף. אינטראקציות מולקולריות מעורבים פני תא גזע ציטוקינים קולטן ביטוי פרופילים, כמו גם מטריצה תאיים(ECM) מולקולות הדבקה כגון אינטגרין, נמצאים תחת חקירה כדי לשפוך אור על היסודות של הכניסה המוחית intranasal של תאי גזע. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הנוכחי הם רב-שכבתיים: 1) הקמה נכונה של xenograft glioma תוך גולגולתי, כמו וריאציות במיקום הגידול ודפוסי הצמיחה עשוי להשפיע על chemotaxis כי NSCs להסתמך על הגירה לכיוון הגידול; 2) הכנה נכונה של NSCs ואת מצבם הבריאותי פנוטיפים המשפיעים על התנהגויות הנדיוטיות chemotaxic; 3) הכנה נאותה של חלל האף עם hyaluronidase, אשר הוכח כדי לשפר את תאי גזע הגירה מחלל האף לתוך המוח 17 ; ו 4) יציבה נכונה של עכברים של עכברים במהלך משלוח תא גזע תוך כדי למנוע אובדן תא מחוץ לנחיריים, ולאחר טיפול NSC משלוח של בעלי חיים. MRI 2 או radiotracer מבוססי טכניקות הדמיה 13 בבעלי חיים חיים יכול להיות מיושם עבור th E בזמן אמת הערכה של vivo גזע תא הגירה לאחר משלוח intranasal.
לצורך מחקר פרה - קליני באמצעות מודלים בבעלי חיים, קיימות מגבלות על מנת לחזות את התוצאה הטיפולית בתרגום למחקרים קליניים של חולים אנושיים. ישנם הבדלים משמעותיים עצב גולגולתי מסתיים דפוסי ההפצה בין מכרסמים ובני אדם 19 , 20 ; לכן, אסטרטגיות להפנות תאי גזע טיפוליים להפצה לאורך רשתות עצב מסתיימות יותר רלוונטיות לכניסת המוח האנושי דרך התוואי הפנימי צריך להיות מוקד למחקר עתידי. פרטים אלה הם מפתחות למאמצי תרגום קליניים מוצלחים, והעקרונות המתוארים כאן חיוניים כדי לבסס את הבסיס לגיוון נוסף של פרמטרים מחקריים שנועדו להבדיל בין רמזים מולקולריים לבין ההבדלים הפונקציונליים והאנטומיים בין מודלים של עכברים ופרטים ספציפיים של יישומים אנושיים.
Ent "> בהפגנה זו הטייס של העקרונות הבסיסיים של שימוש במודלים PDX העכבר של הדליומה האנושית, אנו מראים את הפוטנציאל של אסטרטגיות מגוונות כדי לשפר את הטרופיזציה של הגידול של HNSCs באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסית שיפור גנטי ב chemotropism קידום ביטוי קולטן CXCR4 לכוון הגידול, ציטוקינים הקשורים.המשמעות של תיאור מקיף זה של טכניקת העברת תאי גזע אינראנסית אינטראנסית ניכרת, שכן זהו צעד ראשון אחר שלב פרוטוקול המתאר אסטרטגיה חלופית טיפולית תא גזע משלוח למערכת העצבים המרכזית (CNS) ללא גישות פולשניות בדרך כלל הנדרשת להפרעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ומטרתה להביא פלטפורמה טיפולית ניסויית חזיתית לחזית הרפואה ההתפתחותית עבור גידולי מוח ממאירים, כך שניתן יהיה להפיק פרטים מכניסטיים גדולים יותר מחקירות מחקר רחבות בקהילה המדעית.העתיד להרחיב יישומים לטיפול בהפרעות במערכת העצבים המרכזית המורכבות ומגוון מכני יכול bשנחקרו על ידי חוקרים בתחומים המתאימים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01NS087990 (MSL, IVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
- Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
- Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
- Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
- Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
- Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
- Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
- Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
- Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
- Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
- World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
- NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
- Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
- Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
- Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
- Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).
