Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एक माउस मॉडल में ग्लियोब्लास्टोमा के लिए चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं के इंट्रानेसल वितरण

Published: June 4, 2017 doi: 10.3791/55845
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

स्टेम कोशिकाओं ने अपने आंतरिक ट्यूमर ट्रिपिज्म के कारण ब्रेन ट्यूमर के इलाज के लिए चिकित्सीय वाहक का वादा किया है। गैर-इनवेसिव इंट्रानेसल स्टेम सेल डिलीवरी रक्त मस्तिष्क की बाधा को छोड़कर और नैदानिक ​​अनुवाद के लिए मजबूत क्षमता को दर्शाता है। यह आलेख ग्लिओमा के माउस मॉडल में इंट्रानैसल स्टेम सेल डिलीवरी के बुनियादी सिद्धांतों का सारांश देता है।

Abstract

मस्तिष्क की दुर्दमताओं के प्रति आंतरिक उष्णकटिबंधीय स्टेम कोशिकाओं को घातक ट्यूमर के खिलाफ चिकित्सकीय एजेंटों के वादे के रूप में पेश करता है। इन्ट्रैकैनल रूट के माध्यम से चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं की डिलीवरी एक हाल ही में खोजी हुई वैकल्पिक रणनीति है, जो कि नैदानिक ​​अनुवाद की मजबूत क्षमता के साथ होती है, क्योंकि इसकी नस-आक्रामक प्रकृति के कारण इंट्राकैर्नियल आरोपण या प्रणालीगत मार्गों के माध्यम से वितरण। रक्त मस्तिष्क की बाधा की कमी से आगे स्टेम कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता को इंट्रानेलिस ब्रेन एंट्री से गुजरती है। यह लेख हमारे अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली आवश्यक तकनीकों का सारांश देता है और इंट्राक्रानियल ग्लिमा xenografts के एक माउस मॉडल का उपयोग करके स्टेम सेल डिलीवरी के लिए इंट्रानेशल रणनीति के बुनियादी सिद्धांतों की रूपरेखा करता है। हम अनुकूलित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं जो विशिष्ट पूर्वनिर्धारित प्रायोगिक मापदंडों के साथ सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करते हैं और सुव्यवस्थित कार्य प्रवाह के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं जो कुशल निष्पादन और विश्वसनीय प्रयोग सुनिश्चित करते हैंNtal परिणाम आलेख, परिकल्पना, स्टेम सेल प्रकार, या ट्यूमर विशेषताओं के आधार पर आगे प्रयोगात्मक अनुकूलन के लिए आधार रेखा के रूप में सेवा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Introduction

मानव स्टेम सेल की कम विषाक्तता, कम इम्यूनोजेसिसिटी और आंतरिक ब्रेन ट्यूमर ट्रोपिज्म, चिकित्सीय वाहनों के वितरण के लिए आकर्षक लक्षण हैं 1 । घातक मस्तिष्क ट्यूमर के लिए उपन्यास स्टेम कोशिका आधारित चिकित्सा हाल के वर्षों में विकसित नवाचार का वादा कर रहे हैं, और इस चिकित्सीय रणनीति का इंट्रानेबल रूपांतर नैदानिक ​​अनुवाद की दिशा में एक छलांग का प्रतिनिधित्व करता है, इसमें गैर-आक्रामक और दोहराए जाने वाले प्रशासन नाटकीय ढंग से रोगी अनुप्रयोगों के लिए बाधा को कम कर सकते हैं और आकस्मिक शल्यचिकित्सा प्रक्रिया 1 , 2 , 3 , 4 से जुड़े सामान्य संज्ञाहरण के बिना आउट-मरीज सेवाओं के लिए अनुकूलनीय या लंबा-रोगी सेवा हो सकती है।

हम और दूसरों ने मस्तिष्क ट्यूमर के लिए स्टेम सेल डिलीवरी के इंट्रानेसल रूट का बीड़ा उठाया है और कुछ बुनियादी सिद्धांतोंमाउस एक्सनोग्राफ्ट मॉडल 2 , 3 , 4 के साथ-साथ ट्रांसजनल रिसर्च के साथ-साथ चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) अभिकर्मक वाहक 2 के माध्यम से विवो में स्टेम कोशिकाओं के प्रवास की जांच की। इन पायलट अन्वेषणों के माध्यम से, हमने पर्याप्त अनुभव जमा किया है और इनकी समझदारी प्राप्त की है कि जांच करने के लिए जांच करने वाले संकल्प को बनाए रखने के दौरान, बेहतर तरीके से विकसित मस्तिष्क-व्युत्पन्न एक्सनोग्रेट (पीडीएक्स) घातक ग्लियोमा के माउस मॉडल का उपयोग करके एक मजबूत पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन रणनीति का निर्माण कैसे किया जाता है नाक गुहा को वितरित चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं के इंट्रानल मस्तिष्क प्रविष्टि के परिष्कृत जैविक घटना के सूक्ष्म तंत्रिकी विवरण। यहां, हम एक मानकीकृत ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल के सिद्धांतों का वर्णन करते हैं जो एक अच्छी तरह से स्थापित मानव तंत्रिका स्टेम सेल लाइन एचबी 1। एफ 3 सीडी 5 का इस्तेमाल करते हुए प्रयोगात्मक जांच की वर्तमान स्थिति को प्रदर्शित करते हैं। 6 , 7 , 8 , जो चिकित्सीय वाहक के रूप में मानव स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके विशिष्ट ट्यूमर मॉडल या रणनीतियों के अनुकूलन करने के लिए आसानी से बदलने योग्य है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) या समकक्ष द्वारा अनुमोदित होना चाहिए। यदि यहां वर्णित विशिष्ट प्रक्रियाओं के बारे में कोई अनिश्चितता है, तो आगे बढ़ें नहीं। संस्थान के आईएसीयूसी और एक नामित पशु चिकित्सा स्टाफ सदस्य के साथ स्पष्ट करें।

1. सुसंस्कृत कोशिकाओं की स्तरीयता सुनिश्चित करना और सड़न रोकने वाली तकनीकों के सिद्धांतों का पालन करना

  1. सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं में मानक अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास का पालन करें और चूहों 9 , 10 को प्रशासन करने से पहले सेल परीक्षण और रोगजनक मुक्त स्थिति की पुष्टि के लिए IACUC आवश्यकताओं का पालन करें।
  2. पुन: उत्पादक परिणाम 11 सुनिश्चित करने के लिए सेल प्रमाणीकरण के लिए एनआईएच आवश्यकता का पालन करें
  3. इस पांडुलिपि 4 में उल्लिखित छोटे पशु शल्य चिकित्सा सस्पेक्टिक तकनीकों का पालन करें।

2. के लिए ग्लिओमा सेल की तैयारीEm> विवो प्रयोग 2 , 4 में

  1. सीरिया में युक्त संस्कृति ग्लियोमा कोशिकाएं (जीबीएम 43, जीबीएम 6 और यू 87 एमजी) (डेलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम [डीएमईएम] में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम) या सीरम मुक्त माध्यम (पूरक बी 27, एन 2, हेपरिन, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर के साथ न्यूरोबासल माध्यम [ ईजीएफ], बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक [बीएफजीएफ], एंटीबायोटिक्स, और एल-ग्लूटामाइन 12 ), एक हल्दीयुक्त सीओ 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में।
    1. वाणिज्यिक सेवा प्रदाताओं से माउस साफ़ पैनल चलाने के माध्यम से सभी सेल लाइनों का परीक्षण करें।
  2. संस्कृति माध्यम को निकालकर अनुयायी कोशिकाओं को एकत्रित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन से युक्त (टी 25 फ्लास्क के लिए 1 एमएल ऑफ़ ट्रिप्सिन, टी 75 फ्लास्क के लिए 2 एमएल, तदनुसार बड़े सतह क्षेत्र के साथ संस्कृति फ्लास्क के लिए स्केल) और तब सीए 2 + और एमजी 2+ फॉस्फेट युक्त कोशिकाओं को धो लें बफ़ेड खारा (पीबीएस)
    1. थपथपाएंकोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए फ्लास्क और सीरम से युक्त माध्यम (8 9 एमएल) के एक अतिरिक्त के साथ तुरंत बेअसर होता है। फिर सेरियॉफी ट्यूबों में सेल निलंबन का महाप्राणण करने के लिए सीरॉलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
    2. 5 मिनट के लिए 400 xg पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन बार-बार केन्द्रापसारक द्वारा 10 एमएल की पीबीएस से कम से कम दो बार सेल धो लें।
    3. सेंट्रोफ्यूगेशन (ऊपर की गति और अवधि) के माध्यम से सीरम मुक्त माध्यम के ट्यूमर क्षेत्रों के रूप में विकसित गिनीमा कोशिकाओं को एकत्रित करें; सेंटीफ्यूगेशन (400 xgx 5 मिनट) द्वारा 10 एमएल की पीबीएस के साथ दो बार धोने से पहले 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल डिटिबिट सॉल्यूशन के 1 मिली 2 मिलीलीटर में ऊष्मायन द्वारा कोशिका गोली को अलग करना।
    4. 2.5 μL प्रति 200,000 कोशिकाओं - 50,000 की एकाग्रता में बाँझ खारा में ग्लिमा को फिर से निलंबित करें। माउस मस्तिष्क में इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल नंबर प्रत्येक ग्लोमा सेल सेल की स्थापना की दर पर निर्भर करते हैं। यहां, क्रमशः जीबीएम 43 और जीबीएम 6 रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं के लिए 25,000 और 100,000 का उपयोग करें।
    5. नीस की मात्रा को दोगुना तैयार करेंप्रक्रिया के दौरान अंश के नुकसान के लिए आरोपण के लिए एसएसरी सेल नंबर इंजेक्शन सेल निलंबन को एक बाँझ माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर जगह ट्यूब। सर्जरी के दौरान 2 घंटे अधिकतम के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को रखें, नया बैच तैयार करें यदि विस्तारित सर्जरी की योजना है

3. इंट्राक्रानियल इंपैप्लेटेशन को एक्सनोग्राम माउस मॉडल बनाने के लिए ( चित्रा 1 ए ) 2 , 4 , 13

  1. सर्जरी के दिन से पहले, एक आटोक्लेव में सभी शल्यचिकित्सा उपकरण बाँध लें, और IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल प्रति प्री-सर्जिकल पशु देखभाल सामग्री तैयार करें। इंटेराएपेटिव सस्फीक परिस्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए स्टेरिएटेक्सिक फ्रेम और परिधीय उपकरण को जीवाणुरहित करें, इस प्रकार जटिलताओं को कम करना
  2. अव्यवस्था को कम करने और संदूषण की संभावना के लिए ऑपरेशन क्षेत्र को व्यवस्थित करें।
  3. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों में पोशाकIACUC आवश्यकता के अनुसार ment (पीपीई)
  4. उपयुक्त पोस्ट ऑपरेटिव रिकवरी चैम्बर सेट करें सुनिश्चित करें कि अनावश्यक अभिकर्मकों का उपयोग करके एनेस्थेटिक्स और दर्दनाशक दवाएं ताजा तैयार की जाती हैं। IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल प्रति उपयुक्त शरीर ताप रखरखाव उपकरणों को स्थापित करें।
  5. मानव रोगी-व्युत्पन्न ग्लिओमा सेल एक्सएनोग्राफ्ट्स को मानव एनएससी के इंट्रायल डिलीवरी के परीक्षण के लिए स्थापित करने के लिए लगभग 6 सप्ताह की उम्र में किसी भी लिंग के न्यू / एनयू एथिमिक माउस जैसे इम्यूनोकॉमप्रोमिज्ड माउस प्रजातियों का उपयोग करें।
  6. अनुमोदित अभिकर्मकों का उपयोग करके शरीर के वजन पर आधारित पशु को एनेस्थेटेज़ करें, या तो या तो केटामाइन (50-100 मिलीग्राम / किग्रा के मिश्रण के एक इंट्राटेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से; अनुमोदित खुराक श्रेणी के लिए संस्थागत आईएसीयूसी से परामर्श करें) और एक्सलैजिन (5-10 एमजी / 200-250 μL बाँझ खारा में, या 4-5% isoflurane संज्ञाहरण के माध्यम से एक inhalational डिवाइस का उपयोग कर के लिए संस्थागत आईएसीयूसी से अनुमोदित खुराक रेंज के लिए परामर्श)।
    1. सुनिश्चित करें कि पशु सर्जिकल संज्ञाहरण विमान बी पर पहुंच गया हैY चींटी त्वचा चीरा से पहले pinching पशु के कॉर्निया के नम राज्य को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त बाँझ नेत्र जेल लागू करें।
  7. खोपड़ी को स्टेराइलाइज करें दो बार और बारी बारी से बीटलैडीन के परिपत्र पोंछे और प्रिटचेट-कॉर्निंग एट अल प्रति आइसोप्रोपाइल शराब 14
  8. शल्य ब्लेड का उपयोग करके चीरे से पहले ब्यूपेनएक्स (0.05 - 2 मिलीग्राम / किग्रा) के एससी इंजेक्शन द्वारा पूर्व-चीरा एनलजेसिया प्रदान करें।
  9. खोपड़ी को उजागर करते हुए ऊष्माताट की मदद करने के लिए निष्फल कपास के इशारेदार उपयोग करें; आकस्मिक रक्तस्राव की निकासी को सुविधाजनक बनाने के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करें।
  10. बेंगा के पीछे 2 मिमी पार्श्व, या तो बायां या दाएं, मिडलाइन तक एक बोरर छेद बनाने के लिए, और बेंगा के पीछे 2 मिमी (स्थिति निर्देशांक आधारित अनुकूलित किया जा सकता है) के लिए बैटरी-संचालित हाथ में इलेक्ट्रिक बॉलपेप ड्रिल (कम से कम 1 मिमी चौड़ाई) का प्रयोग करें एक विशेष अध्ययन के लिए ट्यूमर मॉडल पर)।
  11. जानवर को स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम पर अपनाने के लिए माउंट करेंई प्रमुख आसन, जैसे कि डाला हैमिल्टन सूक्ष्म सिरिंज गड़गड़ाहट छेद के चारों ओर खोपड़ी की सतह के लिए लंबवत है। जानवरों की संवेदनाहारी विमान पैर की अंगुली की छिद्रण द्वारा अच्छी स्थिति में है यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना। श्वसन की दर को ध्यान में रखकर यह सुनिश्चित करें कि पशु निम्नलिखित तनाव के दौरान दर्द तनाव में नहीं है।
    * हम इन-कान बार प्लेसमेंट पर जोर नहीं देते क्योंकि:
    1. सुई की स्थिति में हमने गड़गड़ाहट के छेद को प्राथमिकता दी है, और इसलिए, सटीक खोपड़ी निर्देशांक अनावश्यक हैं;
    2. माउस कान नहर नाजुक होते हैं, और कान की सलाखों के सटीक अंतराल में अधिक प्रशिक्षण शामिल है जो हमारे उद्देश्य से प्रासंगिक नहीं है। मूरीन कान नहरों को होने वाले नुकसान के कारण एक सटीक प्लेसमेंट के लाभों से अधिक होता है;
    3. चेक का समर्थन करने के लिए प्रदर्शन और स्थिति के दौरान माउस सिर स्थिरता और संतुलन के एक ही स्तर को प्राप्त करने में सक्षम करने के लिए बहुत आसान है। यह सुनिश्चित करने के लिए कई समय-संवेदनशील सर्जरी के लिए एक अतिरिक्त लाभ हैअच्छे सेल व्यवहार्यता के साथ समय पर पूरा।
  12. स्टिरोटैक्सिक फ़्रेम घुड़दौड़ का प्रयोग करें ताकि फ्लैट टिप सूक्ष्म सिरिंज को गड़गड़ाहट के लिए रखा जा सके, फिर धीरे-धीरे इसे 3 मिमी नीचे ड्यूरा सतह के नीचे ले जाएं। ड्यूरा के नीचे 2.5 मिमी में सुई की नोक को बनाए रखने के लिए 0.5 मिमी को वापस ले लें।
  13. 1 मिनट की अवधि के दौरान प्रीलोडेड ग्लियोमा कोशिकाओं के 2.5 μL इंजेक्षन करें सुई को अपनी स्थिति को धीरे धीरे धीरे 1-2 मिनट के लिए बनाए रखें, 1 मिनट के दौरान, सुई को मस्तिष्क से बाहर निकालना और सेल बैकफ़्लो को कम करने के लिए ख्याल रखना। अतिरिक्त कर्नल ट्यूमर के विकास से बचने के लिए बाँझ हड्डी मोम लागू करें।
  14. स्टेनलेस स्टील घाव क्लिप (7 मिमी) का उपयोग कर घाव को बंद करें। बाँझ लैक्टेट किए गए घंटी के समाधान (पूर्व 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम) के एक चमड़े के नीचे के (एससी) इंजेक्शन को वितरित करें, और एक रिक्त स्थान में पशु को रखें जो कि हीटिंग पैड पर आधे रास्ते पर है।
  15. जानवरों को गतिशीलता हासिल करने के बाद वेंटिलेट रैक पर वापस लौटें और स्मुट को सुनिश्चित करने के लिए नियमित पोस्ट-ऑप देखभाल का पालन करेंज वसूली

4. ट्यूमर ग्रोथ ( चित्रा 1 बी ) के विवो बिलीमिंसेंस इमेजिंग (बीएलआई) में

नोट: रोगी-व्युत्पन्न ग्लिओमा कोशिकाओं को फायरफ़ीली ल्यूसिफेरेस को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया है। यह हमें इंट्राक्रानियल आरोपण के बाद ट्यूमर प्रगति का पालन करने की अनुमति देता है।

  1. इमेजिंग सत्र से 10 मिनट पहले जानवरों को डी-ल्यूएफ़ेरिन, पोटेशियम नमक (150 मिलीग्राम / किग्रा) का एक आईपी इंजेक्शन दें।
  2. आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित एक ऑक्सीजन युक्त आईसोफ्ल्यूरन प्रेरण चैम्बर में जानवरों को तुरंत स्थानांतरित करें।
  3. बीएलआई सिग्नल को सॉफ्टवेयर सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) इमेजिंग चैम्बर के अंदर जानवरों को रखें (विवरण के लिए, निर्माता निर्देश देखें)।

5. पूरे मस्तिष्क विकिरण ( चित्रा 1 सी ) 2 , 4 , 13

4 में किया जा सकता है।

  1. उप-सर्जिकल संज्ञाहरण विमान के साथ-साथ चूहों के लिए एनेस्थेसिया को मध्यम रूप से प्रेरित करने के लिए केटामाइन और एक्सयलैनी मिश्रण (50-100 मिलीग्राम / किग्रा और क्रमशः 5-10 एमजी / किग्रा के आईपी इंजेक्शन का प्रयोग करें) अनुमोदित खुराक श्रेणी के लिए संस्थागत आईएसीयूसी से परामर्श करें।
  2. लीड शील्डिंग ब्लॉकों के बीच चैम्बर के अंदर चूहों की स्थिति में एक नमूना ट्रे का उपयोग करें, जिससे केवल-विकिरण पथ ( चित्रा 2 ) के लिए केवल सिर का जोखिम होता है।
  3. सकारात्मक BLI ट्यूमर की वृद्धि की पुष्टि के साथ चूहों (आम तौर पर glioma कोशिकाओं आरोपण के बाद 7-8 दिन पर) लगातार 5 दिनों के लिए विकिरण के 2 Gy की एक दैनिक खुराक दें। अंतिम विकिरण की खुराक के बाद ट्यूमर के बीएलआई मूल्यांकन का प्रदर्शन

6. मानव नियोल स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन (एनएससी;ई 3 ए) 4

  1. 95% कमरे में हवा और 5% सीओ 2 ( एन एनएससी) के तहत एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मानव एनएससी (क्लोन एचबी 1.एफ 3.सीडी) 6 , 7 में 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम माध्यम बनाए रखें।
  2. मानव सीएक्ससीआर 4 के लिए लेन्टीवियरस एन्कोडिंग के साथ ट्रांसएक्शन द्वारा एचएनएनसी में सीएक्ससी मटेफ केमोकीन रिसेप्टर 4 (सीएक्ससीआर 4) जैसे किमोटेक्सिक रिसेप्टर्स के आनुवंशिक ओवीएक्सेशन का प्रदर्शन करना।
    1. जब एनएससी 75-80% सामंजस्य के निकट होता है, तो पॉलिबिन (8 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ संस्कृति माध्यम के लिए सीएक्ससीआर 4 लैन्टीवायरस जोड़ते हैं, और 8 घंटे या रात भर के लिए सेवन करते हैं।
    2. ट्रांसडुस्ड कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के लिए 4 μg / mL में ब्लोस्टीडिन वाला ताजा माध्यम युक्त वायरस युक्त माध्यम बदलें।
    3. संशोधित एचएनएनसी (सीएक्ससीआर 4 एनएससी) में सीएक्ससीआर 4 की अभिव्यक्ति के स्तर को मान्य करें- सीएक्ससीआर 4 एंटीबॉडी और मेलिंग एसोटोटाइप एंटीबॉडी और वीआई का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम सेसीएक्ससीआर 4 और ग्लिसराइडहाइड -3 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच) सीडीएनए 4 के बढ़ते प्राइमरों की एक जोड़ी का उपयोग करके एक मात्रात्मक आरटी-पीसीआर
    4. वैक्टर नियंत्रण एनएससी ( वीसी एनएससी) को उसी रणनीति का उपयोग करते हुए, सीएक्ससीआर 4 जीन की जगह आरएफपी के साथ, और आरएफपी प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के कारण माइक्रोस्कोपी या फ्लो साइटमैट्री के माध्यम से सत्यापित करें।

7. मानव एनएससी ( चित्रा 3 ए ) की हाइफोक्सिक प्रीकंडिशनिंग 4

  1. ऊपर वर्णित के रूप में T75 संस्कृति फ्लास्क में प्लेट सुसंस्कृत एनएससी 90% तक संगम तक पहुंचा है।
  2. एक निहित सीओ 2 चैम्बर / इनक्यूबेटर के अंदर 24 घंटे के लिए बनाए रखा 1% हे 2 स्तर के अंदर सेल संस्कृति फ्लास्क रखें, एक स्वचालित निर्मित फ्लो मीटर द्वारा नियंत्रित एन 2 गैस की आपूर्ति के माध्यम से। इन कोशिकाओं को एच एनएससी के रूप में संदर्भित किया जाता है। नियंत्रण एन एनएससी चरण 7.1 में वर्णित हैं।

8. हू का लोडिंगओनकोलाइट वायरस ( चित्रा 3 बी -3 एच ) के साथ आदमी एनएससी 5

  1. 8.1. एन एसएससी, एच एनएससी, वीसी एनएससी, और सीएक्ससीआर 4 एनएससी को 50 सशर्त प्रतिकृति एडिनोवायरस (सीआरएडी) -एस-पीके 7 वायरल कण / सेल 4 , 16 के साथ ठीक करें ।
  2. 8.2। आवधिक टैपिंग के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को तीन बार अनबाउंड वायरल कणों को निकालने के लिए और इंजेक्शन के लिए बाँझ लवणों में कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए मीडिया के साथ तीन बार धोएं।
    सावधानी: बीएसएल 2 जैसे उचित जैव सुरक्षा स्तर के पदों के साथ इन विट्रो सेल संस्कृति प्रक्रियाओं में सभी वायरस से संबंधित मामलों को निकालें। संस्थागत पशु सुविधा दिशानिर्देशों 4 , 16 के अनुसार ऑन्कोलिक वायरस से निपटने वाले शोधकर्ताओं द्वारा उपयुक्त निजी सुरक्षा उपकरण पहना जाना चाहिए।

9. माइक्रो के साथ स्टेम सेल लोड हो रहा हैमैग्नेटिक रेज़ोनेंस इमेजिंग (एमआरआई; आकृति 3 बी -3 एच ) 2 के माध्यम से विवो ट्रैकिंग के लिए एन-साइज पैरामाग्नेटिक आयरन ऑक्साइड ( एमपीआईओ ) 2

  1. स्टेम कोशिकाओं को लेबल करने के लिए, रात में ऊष्मायन के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक की उपस्थिति में, ~ 80% सामंजस्य पर सेल संस्कृतियों को रोकने के लिए एमपीआईओ को जोड़ें। एमपीआईओ (फ्लैश लाल संयुग्मित) के साथ स्टेम सेल लेबलिंग (एनएससी 4 या एमएससी 2) की दक्षता प्रवाह साइटोमैट्री द्वारा निर्धारित की जाती है।
  2. स्लोम सेल माइग्रेशन और ग्लिओमा-असर वाले जानवरों के दिमाग में वितरण को देखने के लिए, बहु-स्तरीय उच्च संकल्प T2 भारित रैपिड अधिग्रहण, आराम से संवर्धन स्पिन इको छवियों और बहु-टुकड़ा T1 भारित फास्ट लो एंगल शॉट (FLASH) ग्रेडिएंट इको दृश्यों के साथ माउस दिमाग 2 के दोनों कोरोनल और अक्षीय विमानों के माध्यम से संरचना का मूल्यांकन करें।

10. चिकित्सीय एनएससी की इंट्रानेलास डिलिवरी ( चित्रा 3 डी ) 2 , 4

  1. खंड 3 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार संस्कृति और एनएससी ( एन एनएससी, एच एनएससी, वीसी एनएससी और सीएक्ससीआर 4 एनएससी) एकत्रित करें।
    सावधानी: ओवी लोडेड एनएससी से जुड़े सभी पशु प्रक्रियाओं को उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर के पदों, जैसे कि बीएल 2 या बीएसएल 2 सुविधाओं के साथ किया जाना चाहिए।
  2. कदम 3.6 के अनुसार एक केटामाइन और xylazine मिश्रण के आईपी इंजेक्शन के माध्यम से चूहों को anesthetize।
  3. शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए नीचे एक हीटिंग पैड के साथ सामना करने के लिए एक स्वच्छ रेड पर चूहों रखें। माउस के सिर के नीचे रखा गया नाक के ऊपरी कोण को सुनिश्चित करने के लिए टेप वाले कागज़ के तौलिये से बना हुआ गद्देदार तकिया को समायोजित करें।
    नोट: नायल ई के हरलुरिनीडेस पूर्व उपचार (प्रत्येक यूं में 3 μL), 5 मिनट के अंतराल पर चार बार दोहराए गए उपायों के अनुसार 100 यू का कुल)पिटेलियम को पहले 2 , 17 वर्णित किया गया था।
  4. माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करना, माउस के प्रत्येक नथुने पर एनएससी निलंबन के 2 μL बांटना। अगले माउस पर जाने से पहले छोटी बूंद की आकांक्षा की पुष्टि करें उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित सेल की कुल संख्या निर्धारित की जा सकती है; 62,500-125,000 कोशिकाओं / μL का उपयोग करें, जैसे कि 0.5-1 मिलियन कोशिकाओं को 4 x 2 μL मात्रा में वितरित किया जा सकता है
  5. प्रत्येक सेल निलंबन प्रशासन के बीच 5 मिनट के अंतराल को सुनिश्चित करने के लिए टाइमर का प्रयोग करें, जो कि 4 गुना तक है।
  6. जानवरों को वसूली कक्ष में गतिशीलता हासिल करने की अनुमति दें, साथ में लापरवाह स्थिति के दौरान बनाए रखा।

11. जीवन रक्षा विश्लेषण ( चित्रा 3 ई )

  1. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में जानवरों की जीवित रहने की अवधि डेटा दर्ज करें, और निम्नलिखित महत्वपूर्ण पदनामों के साथ लॉग-रैंक परीक्षा का उपयोग करके सांख्यिकीय तुलना करें: * p < 0.05, ** p <0.01, *** पी <0.001

12. इंट्रानेबल स्टेम सेल मस्तिष्क की प्रविष्टि 2 , 4 के ऊतक संग्रह और हिस्टोलॉजी / इम्युनोसायटोकमेस्ट्री सत्यापन

  1. अध्ययन के अंत में IACUC- अनुमोदित प्रोटोकॉल के माध्यम से चूहों को euthanize। प्रधानाचार्य निर्धारण द्वारा exsanguination द्वारा पीछा प्राथमिक इच्छामृत्यु रणनीति के रूप में एक मानक अभ्यास जानवरों को बलिदान करने के लिए प्रवाह दर से नियंत्रित CO 2 कक्ष का उपयोग कर रहा है।
  2. बलिदान किए जाने के तुरंत बाद, पीबीएस के साथ एक इंट्राकार्डिअक इरिफ्यूज़ेशन को जानवरों पर रक्त वाहिकाओं से रक्त के अवशेषों के उन्मूलन और बाद के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए ऊतकों के संरक्षण को सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन करें।
  3. लापरवाह स्थिति में एक शोषक पैड के शीर्ष पर सीओ 2- म्यूटिअंस पशु रखें, डाईफ्रैम मांसपेशी का पर्दाफाश करने के लिए एक लैपरोटमी के साथ आगे बढ़ें, जो रिब पिंजरे के साथ विच्छेदित है, दिल का पर्दाफाश करने के लिए।
  4. मा के बादराजा विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके सही एट्रीम पर एक निक, एपीएक्स में बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से पीबीएस इंजेक्शन के 3-5 एमएल के साथ उत्सर्जन को तेज करता है। एक सिरिंज का उपयोग करके बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड (पीएफए) परिसंचरण में इंजेक्शन; परिधीय मांसपेशियों की ऐंठन दृश्य पुष्टि प्रदान करती है कि परिसंचरण में कोई बड़ी रुकावट नहीं है जो उचित ऊतक निर्धारण को रोक देगा।
  5. शव से सिर के सिर को निकालने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 4% पीएफए ​​में 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सुरक्षित रखें। मस्तिष्क के ऊतक विच्छेदन से 24 घंटों बाद में 30% सूक्रोज का समाधान बदलें।
  6. ओसीटी परिसर में मस्तिष्क के ऊतक को एम्बेड करें और सूखी बर्फ पर isopentane पर फ्लैश फ्रीज करें। हिस्टोलॉजी और इम्युनोसायटोकैमिस्ट्री अनुप्रयोगों के लिए 10-20 माइक्रोन ऊतक वर्गों को उत्पन्न करने के लिए परिणामस्वरूप ऊतक ब्लॉक के cryosectioning करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

दोनों हाइपोक्सिक प्री-उपचार ( चित्रा 4 ए ) 4 और सीएक्ससीआर 4 ऑवरएक्सेशन ( आंकड़े 4 बी और 4 सी ) 4 सीएक्ससीआर 4 रिसेप्टर्स की कोशिका झिल्ली की उपस्थिति को काफी कम करते हैं, जैसा कि प्रवाह साइटमैट्री द्वारा दिखाया गया है। एनएससी (नीले तीर) द्वारा प्रदर्शित ट्यूमर ट्रिपिज्म, ट्यूमर टिशू ऊतक विज्ञान (लाल वृत्त) में दिखाया गया है। ट्यूमर में MPIO- लेबल ( चित्रा 4 डी ) स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति प्रशियाय नीले धुंधला ( चित्रा 4 ई ) के माध्यम से पुष्टि की गई है। 4

ऊतक विश्लेषण से पता चलता है कि सिर केवल विकिरण ( चित्रा 2 ) ट्यूमर की मात्रा में कमी, साथ ही साथ ट्यूमर और आस-पास के ऊतकों ( आंकड़े 5 ए और 5 बी) में एसडीएफ -1 अपरग्यूलेशन4, जो इस परिकल्पना की पुष्टि करता है कि सीएक्ससीआर 4 रिसेप्टर एनएससी में अभिव्यक्त अपरिवर्तनीय अभिव्यक्ति एक्सआरटी के बाद ट्यूमर ट्रिपिज्म की सुविधा दे सकता है।

उत्तरजीविता विश्लेषण से संकेत मिलता है कि यद्यपि विकिरण (एक्सआरटी) अकेले ट्यूमर वाले जानवरों ( चित्रा 6 ए ) 4 के अस्तित्व के लिए फायदेमंद है, एक्सआरटी के संदर्भ में ओवी के साथ भारित एन एनएससी पर ओवी के साथ लोड एच एनएससी ( चित्रा 6 बी ) 4 उल्लेखनीय उपचारात्मक आहार ( चित्रा 6 सी ) में आनुवंशिक रूप से इंजीनियर सीएक्ससीआर 4 एनएससी के साथ महत्वपूर्ण अस्तित्व लाभ भी देखा जा सकता है।

ऊतक विश्लेषण यह पुष्टि करता है कि दोनों एच एनएससी और सीएक्ससीआर 4 एनएससी ने ओवी के ट्यूमर-लक्षित डिलीवरी को काफी बढ़ाया, जैसा कि एसटीए द्वारा दिखाया गया हैवायरल हेक्सन प्रोटीन ( आंकड़े 7 ए और 7 बी ) के लिए 4 इंजेक्शन

आकृति 1
चित्रा 1: सामान्य पशु प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट शामिल। ( ए ) ट्यूमर के मॉडल रोगी व्युत्पन्न ग्लिओमा कोशिकाओं के एक्सनोग्राफ़्ट के माध्यम से बनाए जाते हैं। ( बी ) बीएलआई द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी की जाती है ( सी ) सिर-केवल विकिरण चिकित्सा प्रक्रिया 6 में वर्णित के रूप में दिया जाता है। प्रक्रिया ( डी ) में बताई गई चिकित्सीय इंट्रानेसल स्टेम सेल डिलीवरी के दौरान सुपैन और सिर-झुकाव की स्थिति बनाए रखी जाती है। ( ई ) पोस्ट चिकित्सा जीवित निगरानी, ​​छोटे जानवर इमेजिंग और ऊतक का ऊतक विश्लेषण यदि आवश्यक हो तो इसका पालन किया जाता है। कृपया देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण

चित्र 2
चित्रा 2: इरेडिएशन के लिए पशु का सेटअप। Anesthetized चूहों नमूना ट्रे के अंदर प्रमुख शील्ड के बीच तैनात हैं केवल सिर विकिरण के लिए अनुमति है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: जनरल स्टेम सेल तैयारी प्रक्रियाओं के लिए एक फ्लो चार्ट इंट्रानेबल डिलिवरी से पहले शामिल है। ( एसी ) सीएक्ससीआर 4 में हाइपोक्सिक प्रीटाएमेंट या स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधनों के लिए। ( बीडी ) धुलाई, एंजाइमिक पृथक्करण, कोशिका संग्रह, और गिनती चरण प्रति हैंचिकित्सीय या नैदानिक ​​माल के साथ स्टेम कोशिकाओं के बाद लोडिंग के लिए बनाई गई। ( ई ) चिकित्सीय अभिकर्मकों, जैसे कालिकॉलिक वायरस, या नैदानिक ​​ट्रैसर जैसे कि एमपीआईओ कण, एकत्रित स्टेम कोशिकाओं में आवधिक मिलाते हुए और कोमल आंदोलन ( एफ ) के साथ उचित सांद्रता में लोड किया जा सकता है। ( जीआई ) भरी हुई स्टेम कोशिकाओं को फिर से धोया जा सकता है और इनस्रासेल डिलीवरी के लिए चूहों में गिना जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: सीएक्ससीआर 4 अभिव्यक्ति और एमपीआईओ लोडिंग के लिए स्टेम सेल संशोधनों का विश्लेषण। ( एसी ) हाइपोसिक पूर्व उपचार या आनुवंशिक के परिणामस्वरूप स्टेम कोशिकाओं के फेनोटाइपिक संशोधनों को सत्यापित करने के लिए फ्लो साइटमैट्री चलाया जा सकता हैअभियांत्रिकी। (विवरण डे एट अल। 4 में पाया जा सकता है) ( डीई ) स्टेम कोशिकाओं के सफल एमपीआईओ लोडिंग का पता लगाने और विवो परिणामों में क्रमशः फ्लो साइटोमेट्री और प्रेशियन नीले रंग के धुंधले के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: गहराई और आस-पास के ऊतकों में कृत्रिमरण एसडीएफ -1 (ग्रीन सिग्नल) अपरग्यूलेशन की सुविधा प्रदान करता है। ऊतक विभागों के हिस्टोपैथोलॉजी और इम्युनोसायटोकैमिस्ट्री के माध्यम से इरडिडाएशन एसडीएफ -1 अभिव्यक्ति जीबीएम43 एक्सनोग्राफ्ट में बढ़ाता है। नियंत्रण और विकिरणित चूहों के प्रदर्शन से मस्तिष्क के ऊतक वर्गों के एच एंड ई स्टेंसिंग और इम्युनोसायटोकैमिस्ट्री का विश्लेषणएटीएस ने ट्यूमर के बोझ को कम किया, लेकिन XRT उपचार के बाद ट्यूमर साइट पर एसडीएफ-1 के स्तर में वृद्धि हुई। ( ए ) एसडीएफ -1 अभिव्यक्ति (हरा) XRT के बाद ट्यूमर साइट (सफेद बक्से) पर जोरदार स्थानीयकृत है ( बी ) देखने के क्षेत्रों की डेंसिटोमेट्री मात्रा का ठहराव नियंत्रण जानवरों (एन = 3 प्रयोगों, *** पी <0.001, छात्र के टी-परीक्षण) की तुलना में XRT के इलाज वाले जानवरों में एसडीएफ -1 अभिव्यक्ति में चार गुना वृद्धि दर्शाता है। विवरण डे एट अल में पाए जा सकते हैं 4 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: संशोधित एनएससी के अस्तित्व के लाभों को ध्यान में रखा गया था (विवरण डे एट अल। 4 में पाया जा सकता है ) ( ए ) एक्सआरटी के चिकित्सीय लाभों का संदर्भ स्थापित किया गया था (*** पी <0.001, लॉग रैंक परीक्षा)। ( बी ) ओ.ए.पी. के साथ भरी हुई स्टेम कोशिकाओं के हाइपोसिक पूर्व उपचार पशु अस्तित्व को बढ़ाता है (* p <0.05)। सी। सीसीसीआर 4 आनुवंशिक वृद्धि जानवरों के अस्तित्व में सुधार करती है (** p = 0.0013) विवरण डे एट अल में पाए जा सकते हैं 4 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: हाइपोक्सिया द्वारा ओवी डिलिवरी की पुष्टि- या सीएक्ससीआर 4-एनएसीएस ने मस्तिष्क ट्यूमर एक्सनोग्राफ्ट को वायरस हेक्सोन प्रोटीन डिटेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया है या तो एच के साथ इलाज किये गये मस्तिष्क के टिशू सेक्शन के इम्यूनोसायटोकमेस्ट्री (ग्रीन डॉट्स) द्वारा हासिल किया गया है। ए ) या सीएक्ससीआर 4 एनएससी ( बी ), *** पी <0.001 टी परीक्षा विवरण डे एट अल में पाए जा सकते हैं 4 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यद्यपि इंट्रामनल मार्ग के इंट्रानेसल मार्ग को व्यापक रूप से छोटे अणुओं, नैनोमिडीसिन और प्रोटीन यौगिकों जैसे 18 के लिए खोजा गया है, इंट्रानेलिस ब्रेन ट्यूमर के लिए चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं के प्रयोग को विकास 2 , 3 के तहत ब्रेन ट्यूमर थेरेप्यूटिक्स के स्पेक्ट्रम में बहुत नया है , 4 नाक गुहा में स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार के संबंध में आंतरिक जटिलताएं शामिल हैं, और आणविक विवरण अभी भी अस्पष्ट रहते हैं। स्टेम कोशिकाओं का आकार और क्रेनियल नसों के साथ उनकी वितरण तंत्र गैर-कोशिका जीवविज्ञान या छोटे अणुओं के नाटकीय रूप से भिन्न होते हैं, और वर्तमान में हम नासकीय एपिथेलिया में चिकित्सीय स्टेम सेल के व्यवहार से संबंधित विस्तृत यंत्रविस्तिक जांच में लगे हुए हैं। स्टेम सेल की सतह साइटोकिन रिसेप्टर अभिव्यक्ति प्रोफाइल, साथ ही बाह्य मैट्रिक्स को शामिल करने वाले आणविक इंटरैक्शन(ईसीएम) आइडियेशन अणुओं जैसे कि इंटीग्रिन, स्टेम कोशिकाओं के इंट्रानल मस्तिष्क प्रविष्टि के आधार पर प्रकाश डालने की जांच में हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम कई गुणा हैं: 1) इंट्राकैनलियल ग्लिओमा एक्सनोग्राफ्ट की उचित स्थापना, ट्यूमर के स्थान और विकास के पैटर्न में भिन्नता के कारण किमोटाक्सिस को प्रभावित हो सकता है कि एनएससी ट्यूमर की ओर प्रवास के लिए निर्भर करती है; 2) एनएससी की उचित तैयारी और उनके स्वास्थ्य की स्थिति और फेनोटाइप्स जो किमोटेक्सिक प्रवासी व्यवहार पर प्रभाव डालते हैं; 3) हाइलूरोनिडास के साथ नाक गुहा की पर्याप्त तैयारी, जिसे नाक गुहा से मस्तिष्क में स्टेम कोशिकाओं के प्रवास में सुधार करने के लिए प्रदर्शन किया गया है; और 4) नाक के बाहर कोशिका के नुकसान को रोकने के लिए, और पशुओं के एनएससी की देखभाल के बाद की देखभाल के लिए, इंट्रानेबल स्टेम सेल डिलीवरी के दौरान चूहों की सही लापरवाह मुद्रा। एमआरआई 2 या रेडियोोट्रेसर आधारित इमेजिंग तकनीकों 13 जी पशुओं के लिए 13 वीं के लिए लागू हो सकती हैं इंट्रानेबल डिलीवरी के बाद विवो स्टेम सेल माइग्रेशन में वास्तविक समय मूल्यांकन

जानवरों के मॉडल का इस्तेमाल करते हुए पूर्वकाल के अध्ययन के लिए, चिकित्सीय मानव रोगी अध्ययनों में अनुवाद में चिकित्सीय परिणाम का अनुमान लगाने की सीमाएं हैं। कृन्तकों और मनुष्यों के बीच क्रानिक तंत्रिका अंत वितरण पद्धतियों में महत्वपूर्ण अंतर हैं , 1 9 , 20 ; इस प्रकार, चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं को निर्देशित करने के लिए रणनीतियों, इंट्राনাল मार्ग के माध्यम से मानव मस्तिष्क की प्रविष्टि के लिए अधिक प्रासंगिक तंत्रिका समापन नेटवर्क के साथ वितरित करने के लिए भविष्य के अनुसंधान के लिए फोकस होना चाहिए। ये विवरण सफलतापूर्वक नैदानिक ​​अनुवाद प्रयासों की कुंजी हैं, और यहां वर्णित सिद्धांत आणविक संकेतों को अलग करने के लिए डिज़ाइन किए गए शोध मानकों के आगे विविधीकरण के लिए आधार स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं और माउस मॉडल और मानव अनुप्रयोग विशेषताओं के बीच कार्यात्मक और संरचनात्मक मतभेद हैं।

Ent "> मानव ग्लियोमा के माउस पीडीएक्स मॉडलों का उपयोग करने के बुनियादी सिद्धांतों के इस पायलट प्रदर्शन में, हम एचएएनसीएस के ट्यूमर ट्रिपिज्म को हाइपोसिक प्रीदंडीशनिंग और जेनेटिक एन्हांसमेंट के माध्यम से सीएक्ससीआर 4 रिसेप्टर एक्सप्रेशन को बढ़ावा देने के लिए ट्यूमर- इंट्रानेसल चिकित्सीय स्टेम सेल डिलीवरी तकनीक के इस व्यापक विवरण का महत्व स्पष्ट है, क्योंकि यह पहला कदम-दर-चरण प्रोटोकॉल है जिसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के लिए वैकल्पिक चिकित्सीय स्टेम कोशिका वितरण रणनीति का वर्णन आम तौर पर बिना आक्रामक तरीके से किया जाता है सीएनएस विकारों के लिए जरूरी है। हम एक घातक मस्तिष्क ट्यूमर के लिए विकासात्मक दवाओं के आगे एक मजबूत प्रयोगात्मक चिकित्सीय प्लेटफॉर्म को लाने का लक्ष्य रखते हैं, ताकि वैज्ञानिक समुदाय में व्यापक शोध के विस्तार से उभर सकते हैं। भविष्य के विस्तार के लिए सीएनएस विकार जटिलता और यंत्रवत् विविधता बी कर सकते हैंई संबंधित क्षेत्रों में शोधकर्ताओं द्वारा खोजा गया

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

घोषित करने के लिए लेखकों के पास ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच R01NS087990 (एमएसएल, आईवीबी) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator ThermoFisher Scientific VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics) ThermoFisher Scientific Varies Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 75002490 Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R  ThermoFisher Scientific 75004240 Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) Hamilton Company 80400 Flat tip
Sample Tray for Irradiator Best Theratronics A13826 To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope Leica Microsystem Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat Leica Microsystem Custom setup
Exel International Insulin Syringe ThermoFisher Scientific 14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline Corning Cellgro/ThermoFisher 21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Corning Cellgro/ThermoFisher 11965-084
Trypsin 0.05% Corning Cellgro/ThermoFisher 25300054
Hyaluronidase from bovine testes MilliporeSigma H3506

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
  2. Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
  3. Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
  4. Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
  5. Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
  6. Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
  7. Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
  8. Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
  9. Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
  10. World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
  11. NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
  12. Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
  13. Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
  14. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  15. Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
  16. Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
  17. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
  18. Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
  19. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
  20. Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).

Tags

चिकित्सा अंक 124 मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम कोशिकाएं आनुवंशिक वायरस आनुवांशिक संशोधन हाइपोक्सिया इंट्रानेसल वितरण
एक माउस मॉडल में ग्लियोब्लास्टोमा के लिए चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं के इंट्रानेसल वितरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S.,… More

Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (124), e55845, doi:10.3791/55845 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter