Summary
줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.
Abstract
뇌 악성 종양에 대한 내재적 향성은 줄기 세포를 악성 종양 치료제의 유망한 매개체로 만듭니다. 비강 내 경로를 통한 치료 줄기 세포의 전달은 두개 내 이식이나 전신 경로를 통한 전달과 비교하여 비 침습적 특성으로 인해 임상 번역 가능성이 높은 최근에 발견 된 대안 전략입니다. 혈액 뇌 장벽의 부족은 비강 두뇌 진입을 겪고있는 줄기 세포의 치료 가능성을 더욱 강화시킵니다. 이 기사는 본 연구에 사용 된 필수 기술을 요약하고 마우스 모델의 두개강 내 신경 교종 이종 이식편을 사용하여 줄기 세포 전달을위한 비강 내 전략의 기본 원리를 개략적으로 설명합니다. 우리는 특정 사전 결정된 실험 매개 변수를 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 생성하는 최적화 된 절차를 시연하고 능률적 인 실행 및 신뢰할 수있는 경험을 보장하는 간소화 된 작업 흐름에 대한 지침을 제공합니다.결과. 이 기사는 가설, 줄기 세포 유형 또는 종양 특이성에 근거한 추가 실험 맞춤화를위한 기준선 역할을하도록 고안되었습니다.
Introduction
인간 줄기 세포의 낮은 독성, 낮은 면역 원성, 내인성 뇌종양의 방향성은 치료제 전달에있어 매력적인 특성입니다 1 . 최근 악성 뇌종양에 대한 새로운 줄기 세포 기반 치료법은 최근 개발 된 유망한 혁신이며이 치료 전략의 비내 적응은 비 침습적이고 반복적 인 투여가 환자의 응용에 대한 장벽을 크게 줄일 수 있다는 점에서 임상 번역으로의 도약을 의미한다. 침습적 외과 수술 1 , 2 , 3 , 4 와 관련된 전신 마취 또는 오랜 환자 서비스없이 외래 환자 서비스에 적용 할 수 있습니다.
우리와 다른 사람들은 줄기 세포 전달이 뇌종양으로가는 비강 내 경로를 개척했으며 몇 가지 기본 원칙마우스 이종 이식 모델 2 , 3 , 4 를 사용하여 번역 연구를 수행하고 MRI (magnetic resonance imaging) 시약 캐리어를 통해 생체 내에서 줄기 세포 의 이동을 조사했습니다. 이러한 파일럿 실험을 통해 우리는 확립 된 환자 유래 이종 이식 (PDX) 마우스 모델을 악성 신경 교종으로 사용하여 강력한 전임상 평가 전략을 가장 잘 구축하는 방법에 대한 실질적인 경험과 통찰력을 얻었습니다. 비강으로 전달 된 치료 용 줄기 세포의 비내 두뇌 진입의 정교한 생물학적 현상에 대한 미묘한 메커니즘의 상세한 설명. 여기서는 잘 확립 된 인간 신경 줄기 세포주 인 HB1.F3.CD 5 를 사용하여 실험적 연구의 현재 상태를 보여주기 위해 표준화 된 작동 프로토콜의 원리를 설명합니다
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Protocol
모든 동물 처치는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 또는 동등한 기관의 승인을 받아야합니다. 여기에 설명 된 특정 절차와 관련하여 불확실성이있는 경우 진행하지 마십시오. 해당 기관의 IACUC 및 지정된 수의진 직원과 명확히하십시오.
1. 배양 세포의 무균 유지 및 무균 기술 원칙 준수
- 생쥐에 투여하기 전에 모든 세포 배양 절차 및 세포 시험 및 병원체가없는 상태 확인을위한 IACUC 요구 사항의 표준 실험실 기준을 준수하십시오.
- 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 세포 인증을위한 NIH 요구 사항을 따르십시오 11 .
- 이 원고에서 설명 된 확립 된 작은 동물 수술 무균 기술을 따르십시오.
2. Glioma 세포의 준비 <em> Vivo 실험 2 , 4
- Dulbecco 수정 된 이글의 배지 (DMEM) 또는 혈청이없는 배지 (보충제 B27, N2, 헤파린, 상피 세포 성장 인자 (BMP)를 함유 한 Neurobasal 배지)의 혈청 함유 (10 % 태아 혈청 혈청) 배양 신경 교종 세포 (GBM43, GBM6 및 U87MG) EGF], 염기성 섬유 모세포 성장 인자 [bFGF], 항생제, L- 글루타민 12 )을 가습 CO 2 세포 배양기에 넣었다.
- 상용 서비스 제공 업체가 운영하는 마우스 클리어 패널을 통해 모든 세포주를 테스트하십시오.
- 배양 배지를 제거하여 부착 세포를 수집하십시오. 실온에서 5 분 동안 0.05 % 트립신 (T25 플라스크 용 트립신 1 mL, T75 플라스크 용 2 mL,보다 큰 표면적을 가진 배양 플라스크에 따라 스케일)과 함께 인큐베이션 한 다음 칼슘 2+ 및 Mg 2+ 인산염 완충 식염수 (PBS).
- 탭플라스크에 넣고 세포를 제거하고 과량의 혈청 함유 배지 (8 - 9 mL)로 즉시 중화합니다. 그런 다음 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 원심 분리 튜브로 흡입합니다.
- 5 분 400 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 반복 원심 분리로 PBS 10 mL로 세포를 적어도 두 번 씻으십시오.
- 원심 분리를 통해 혈청이없는 배지에서 종양 구체로서 성장한 신경 교종 세포를 수집하십시오 (위와 동일한 속도와 지속 시간); 원심 분리 (400 xgx 5 분)에 의해 PBS 10 ML로 두 번 씻기 전에 5 분 37 ° C에서 세포 분리 솔루션의 1-2 ML의 부화로 세포 펠렛을 해리.
- 2.5 μL 당 50,000 - 200,000 세포의 농도로 멸균 생리 식염수에 신경 교종을 재 정지시킵니다. 마우스 두뇌에 주사에 사용되는 세포 번호는 각 신경 교종 세포주의 확립 된 성장 속도에 달려 있습니다. 여기에 GBM43 및 GBM6 환자 유래 종양 세포에 대해 각각 25,000 및 100,000을 사용하십시오.
- nece의 양을 두 배 준비하십시오.프로 시저 동안 분수의 손실을 설명하기 위해 이식을위한 ssary 세포 번호. 주사 가능한 세포 현탁액을 멸균 된 미세 원심 분리기 튜브에 옮기고 얼음에 튜브를 놓습니다. 수술 중 최대 2 시간 동안 세포를 얼음 위에 올려 놓고 연장 수술을 계획하면 새로운 배치를 준비하십시오.
3. Xenograft 마우스 모델을 만들기위한 두개 내 주입 ( 그림 1A ) 2 , 4 , 13
- 수술 일 전에 오토 클레이브의 모든 수술 도구를 소독하고 IACUC 승인 프로토콜에 따라 모든 수술 전 및 수술 후 동물 보호 재료를 준비합니다. stereotaxic 프레임 및 주변 장비를 소독하여 수술 중 무균 상태를 보장함으로써 합병증을 최소화합니다.
- 혼잡과 오염 가능성을 최소화하기 위해 작업 영역을 구성하십시오.
- 적절한 개인 보호 장비 착용IACUC 요건에 따라 PPE (정신과 의사)
- 적절한 수술 후 회복 챔버를 설치하십시오. 만성적 인 시약을 사용하여 마취제와 진통제를 신선한 상태로 준비하십시오. IACUC 승인 프로토콜에 따라 적절한 체열 관리기구를 설치하십시오.
- 인간 NSC의 비내 전달 검사를 위해 인간 환자 유래 신경 교종 세포 이종 이식편을 확립하려면 약 6 주령의 임의의 성별의 nu / nu 흉선 마우스와 같은 면역 저하 마우스를 사용하십시오.
- 승인 된 시약, 즉 ketamine (50-100 mg / kg, 승인 된 용량 범위에 대한 기관 IACUC)과 xylazine (5-10 mg / kg)의 복강 내 (ip) 주사를 통해 체중을 기준으로 동물을 마취합니다. kg), 승인 된 용량 범위에 대해서는 기관 IACUC에 문의하십시오.) 200-250 μL 멸균 생리 식염수 또는 4-5 % isoflurane 마취를 통해 흡입 장치를 사용하십시오.
- 동물이 수술 마취기에 도착했는지 확인하십시오. b발가락이 피부 절개 전에 핀치. 동물의 각막의 축축한 상태를 보장하기 위해 충분한 멸균 안과 젤을 적용합니다.
- Pritchett-Corning et al.에 의해 betadine과 isopropyl alcohol을 반복적으로 번갈아 사용하여 두개골을 살균하십시오 . 14 .
- 수술 블레이드를 사용하여 절개 전에 Buprenex (0.05 - 2 mg / kg)를 주사하여 절개 전 진통을 제공하십시오.
- 두개골을 노출시키면서 멸균 된 면봉 팁을 사용하여 지혈을 돕습니다. 부수적 인 출혈의 제거를 용이하게하기 위해 3 % 과산화수소를 사용하십시오.
- 배터리 구동 휴대용 전자식 볼펜 드릴 (너비가 1mm 미만)을 사용하여 좌우 2mm, 왼쪽 또는 오른쪽, 중간 선 및 브레 그마 뒤 2mm에 버 구멍을 만듭니다 (위치 좌표는 특정 연구를 위해 의도 된 종양 모델에서).
- 동물을 stereotaxic frame에 고정시킨다.삽입 된 해밀턴 마이크로 주사기가 버어 구멍 주변의 두개골의 표면에 수직이되도록 삽입한다. 동물의 마취기가 꼬집음으로써 양호한 자세를 유지하도록주의하십시오. 다음 단계에서 동물이 통증을 느끼지 않도록 호흡 수를 관찰하십시오.
* 다음과 같은 이유로 인 - 이어 바 게재 위치를 강조하지 않습니다.- 우리는 바늘의 위치를 정하기 위해 구멍을 미리 뚫어 놓았으므로 정확한 두개골 좌표는 불필요합니다.
- 마우스 귀의 운하는 약해서 귀마개의 정확한 귀에 거는 배치는 우리의 목적과 관련이없는보다 복잡한 훈련을 필요로합니다. 쥐 귀의 파열로 인한 위험은 정확한 배치의 이점을 능가합니다.
- 뺨 지원은 수행하기가 훨씬 쉬우 며 마우스 헤드 안정성과 위치 조정 중 균형을 동일하게 유지할 수 있습니다. 시간에 민감한 여러 번의 수술을 통해 추가적인 이점을 얻을 수 있습니다.적절한 세포 생존 능력으로 적기에 완료하십시오.
- stereotaxic 프레임 손잡이를 사용하여 평면 팁 마이크로 주사기를 버어 구멍에 위치시킨 다음 천천히 dura 표면 아래 3mm까지 내립니다. 경막 아래 2.5mm 지점에서 바늘 끝을 유지하려면 0.5mm 후퇴.
- 1 분 동안 미리 장착 된 신경 교종 세포 2.5 μL를 주입합니다. 주사 바늘을 1 ~ 2 분간 천천히 천천히 올려 놓고 바늘을 뇌에서 빼내고 세포 역류를 최소화하도록주의하십시오. 두개강 내 종양 성장을 막기 위해 멸균 뼈 왁스를 바르십시오.
- 스테인레스 스틸로 감긴 클립 (7 mm)을 사용하여 상처를 닫습니다. 멸균 lactated 링거 솔루션 (미리 37 ° C로 따뜻하게) 1 ML의 피하 (SC) 주사를 제공하고 가열 패드의 중간에있는 복구 챔버에 동물을 넣으십시오.
- 이동성이 회복되면 환기 랙으로 동물을 되돌려 놓고 일상적인 수술 후 관리를 통해 평온함을 보장합니다.h 회복.
4. 종양 성장의 생체 내 Bioluminescence 이미징 (BLI) ( 그림 1B ) 15
참고 : 환자 유래 신경 교종 세포는 개똥 벌레 루시퍼 라제를 발현하도록 변형됩니다. 이것은 우리가 intracranial 주입 후 종양의 진행을 따르도록 허락합니다.
- 이미징 세션 10 분 전에 동물에게 D- 루시 페린, 칼륨 염 (150 MG / kg)의 IP 주사를 줘.
- 즉시 IACUC에서 승인 한 산소가 첨가 된 이소 플루 란 유도 챔버에 동물을 놓으십시오.
- 동물을 가열 된 (37 ° C) 이미징 챔버에 넣고 소프트웨어 설정을 사용하여 BLI 신호를 캡처합니다 (자세한 내용은 제조업체 지침 참조).
5. 전체 뇌 조사 ( 그림 1C ) 2 , 4 , 13
4 .
- 쥐에게 마취를 적당히 유도하기 위해 부 수술 수술 마취기를 사용하여 ketamine과 xylazine 혼합물 (각각 50-100 mg / kg 및 5-10 mg / kg, 승인 된 용량 범위에 대해 기관 IACUC와상의)을 ip 주사합니다.
- 샘플 트레이를 사용하여 리드 차폐 블록 사이에서 챔버 내부의 마우스를 위치시키고, 방사선 경로에 대한 헤드 전용 노출을 허용합니다 ( 그림 2 ).
- 생쥐에게 5 일 연속 2 Gy 조사량의 종양 성장 (정상적으로 신경아 교종 세포 이식 후 7-8 일째)의 양성 BLI 확인을 제공하십시오. 마지막 조사 선량 후 종양의 BLI 평가를 수행합니다.
6. 인간 신경 줄기 세포의 유전자 변형 (NSCs, Figure 3A) 4
- 95 % 실내 공기 및 5 % CO 2 ( N NSCs)하에 가습 된 37 ° C 배양기에서 10 % FBS 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 인간 NSC (클론 HB1.F3.CD) 6 , 7 을 유지한다.
- CXCR4를 코딩하는 렌티 바이러스로 형질 도입함으로써 hNSCs에서 CXC 모티프 케모카인 수용체 4 (CXCR4)와 같은 화학 주성 수용체의 유전 적 과발현을 수행한다.
- NSC가 75-80 % confluency 근처에있을 때 polybrene (8 μg / mL)과 함께 CXCR4 lentivirus를 배양 배지에 넣고 8 시간 또는 밤새 배양하십시오.
- 형질 감염된 세포의 양성 선택을 위해 4 μg / mL의 blasticidin을 함유하는 새로운 배지로 바이러스 함유 배지를 대체하십시오.
- 항 -CXCR4 항체와 일치하는 isotype 항체 및 vi를 사용하여 유세포 분석을 통해 변형 된 hNSCs ( CXCR4 NSCs)에서 CXCR4 발현의 수준을 확인합니다.CXCR4와 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) cDNAs를 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 사용한 정량적 RT-PCR 4 .
- CXCR4 유전자를 대체하는 RFP와 동일한 전략을 사용하여 벡터 제어 NSC ( VC NSC)를 생성하고 RFP 형광의 존재로 인해 현미경 또는 유동 세포 계측법 을 통해 검증하십시오.
7. 인간 NSCs의 hypoxic preconditioning ( 그림 3A ) 4
- 상기 한 바와 같이 T75 배양 플라스크에서 배양 한 NSC는 90 %의 confluency에이를 때까지 배양 하였다.
- 자동화 된 내장 유량계로 제어되는 N 2 가스 공급 을 통해 24 시간 동안 1 % O 2 수준을 유지 한 가습 된 CO2 챔버 / 인큐베이터에 세포 배양 플라스크를 놓습니다. 이러한 세포를 H NSC라고합니다. Control N NSC는 단계 7.1에 설명되어 있습니다.
8. 후진타오의 로딩Oncolytic Virus를 가진 사람 NSCs ( 그림 3B -3H ) 5
- 8.1. 50 개의 조건부 복제 아데노 바이러스 (CRAd) -S-pk7 바이러스 입자 / 세포 4 , 16을 갖는 N 개의 NSCs, H NSCs, VC NSCs 및 CXCR4 NSCs.
- 주기적 두드리기와 함께 실온에서 2 시간 인큐베이션 한 후, 언 바운드 바이러스 성 입자를 제거하기 위해 배지로 세포를 세 번 씻고 주사 용 멸균 생리 식염수에 세포를 부순다.
주의 : BSL2와 같은 적절한 생물 안전성 레벨 지정이있는 시설에서 모든 바이러스 관련 시험관 세포 배양 절차를 수행하십시오. 적절한 개인 보호 장비는 기관 동물 시설 지침 4 , 16에 따라 온 콜리 틱 바이러스를 다루는 연구원이 착용해야합니다.
9. 줄기 세포를 마이크로로 적재자기 공명 영상 (MRI; 그림 3B -3H )을 통한 In Vivo 추적을위한 n 크기의 상자성 산화철 (MPIO) 2
- 줄기 세포를 표시하려면 밤새 배양을위한 transfection 시약이있는 상태에서 ~ 80 % confluency에서 줄기 세포 배양에 MPIO를 추가하십시오. MPIOs (플래시 레드 공액)와 줄기 세포 라벨 (NSCs 4 또는 MSCs 2 )의 효율은 유동 세포 계측법에 의해 결정됩니다.
- 신경 교종 보유 동물의 뇌에서 줄기 세포의 이동과 분포를 시각화하기 위해서는 Relaxation Enhancement 스핀 에코 이미지와 멀티 슬라이스 T1 가중 Fast Lo Angle Shot (FLASH) 그래디언트 에코 시퀀스를 다중 슬라이스 고해상도 T2 가중 급속 수집과 마우스 뇌의 관상면과 축면을 통해 구조를 평가하십시오 2 .
10. 치료 용 NSC의 비강 내 전달 ( 그림 3D ) 2 , 4
- (3)에서 설명한 프로토콜에 따라 NSC ( N NSC, H NSC, VC NSC 및 CXCR4 NSC)를 수집하고 수집합니다.
주의 : OV로드 된 NSC와 관련된 모든 동물 절차는 BL2 또는 BSL2 시설과 같은 적절한 생물 안전성 수준 지정이있는 시설에서 수행되어야합니다. - 단계 3.6에 따라 ketamine과 xylazine 혼합물의 IP 주입을 통해 마우스를 마취.
- 쥐를 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드가있는 깨끗한 드레이프 위에 올려 놓습니다. 쥐의 머리 밑에 놓았을 때 콧 구멍의 수직을 확보하기 위해 테이프로 말린 종이 타월로 만든 패딩 된 베개를 조정하십시오.
참고 : 비강 내 Hyaluronidase 전처리 (5 분 간격으로 4 회 반복 접종하여 100 U, 각 비공에 3 μL)pithelium 이전에 2,17 설명했다. - micropipette를 사용하여 마우스의 각 콧 구멍에 NSC 현탁액 2 μL를 분배합니다. 다음 마우스로 이동하기 전에 드롭 릿의 흡인을 육안으로 확인하십시오. 배달 된 총 셀 수는 사용자가 결정할 수 있습니다. 5 ~ 1 백만 개의 세포가 4 x 2 μL 용량으로 전달 될 수 있도록 62,500-125,000 개의 세포 / μL를 사용하십시오.
- 타이머를 사용하여 최대 4 회 각 세포 현탁 투여 사이에 5 분 간격을 확보하십시오.
- 회복 실에서 동물이 이동성을 되 찾는 것을 허용하며, 전체적으로 앙와위가 유지됩니다.
11. 생존 분석 ( 그림 3E )
- 통계 소프트웨어에서 동물의 생존 기간 데이터를 입력하고 다음 유의 기호를 사용하여 로그 순위 테스트를 사용하여 통계 비교를 수행하십시오. * p < 0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
12. 조직 수집 및 조직학 / Immunocytochemistry 비내 감염의 줄기 세포 뇌 항목의 확인 2 , 4
- 연구의 마지막 시점에서 IACUC 승인 프로토콜 을 통해 생쥐 를 안락사시켰다. 표준 관행은 유량 조절 CO 2 챔버를 사용하여 일차 안락사 전략으로 동물을 희생 한 다음 재관류 고정에 의한 삽혈로 이어집니다.
- 희생당한 즉시 혈관에서 혈액 잔류 물이 제거되고 이후의 조직 학적 분석을 위해 조직이 보존되도록 동물에게 PBS로 심내 관류를 실시하십시오.
- CO 2 - euthanized 동물을 앙와위의 흡수 패드 위에 놓고 개복술로 진행하여 흉곽과 함께 절개 된 횡경막 근육을 노출시켜 심장을 노출시킵니다.
- 엄마 후절개 가위를 사용하여 우심방에 딱지를 붙이고 정점에있는 좌심실을 통해 PBS 주사 3-5 mL로 방 사를 촉진합니다. 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 순환 주사하십시오. 말초 근육 경련은 적절한 조직 고정을 방지하는 혈액 순환 장애를 막지 못한다는 시각적 인 확인을 제공합니다.
- 외과 적으로 시체의 머리를 제거하고 4 ° C에서 4 % PFA 50 ML 원심 튜브에 보관하십시오. 다음 24 시간 후 뇌 조직 해부 전에 30 % 자당으로 솔루션을 변경합니다.
- OCT 화합물에 뇌 조직을 삽입하고 드라이 아이스에서 이소 펜탄으로 섬광 동결. 조직학 및 immunocytochemistry 애플 리케이션을위한 10-20 μm의 조직 섹션을 생성하는 결과 조직 블록의 cryosectioning를 수행합니다.
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Representative Results
저산소 전처리 ( 그림 4A ) 4 와 CXCR4 과다 발현 ( 그림 4B 와 4C ) 4 모두는 유동 세포 계측법에 의해 입증 된 것처럼 CXCR4 수용체의 세포막 존재를 현저히 상향 조절합니다. NSC에 의해 입증 된 종양 향성 (파란 화살표)은 종양 조직 조직학 (빨간색 원)에 표시됩니다. 종양에서 MPIO로 표지 된 ( 도 4D ) 줄기 세포의 존재는 프 러시안 블루 염색을 통해 확인된다 ( 도 4E ). 4
조직 분석은 종양 및 주변 조직에서의 SDF-1의 상향 조절뿐만 아니라 두부 단독 조사 ( 도 2 )가 종양 부피의 감소를 유도한다는 것을 나타낸다 ( 도 5A 및 5B )4는 NSC에서 CXCR4 수용체가 상향 조절 된 발현이 XRT 후 종양 향성을 촉진 할 수 있다는 가설을 확인시켜 준다.
생존 분석은 방사선 조사 (XRT)만이 종양 보유 동물 ( 도 6A ) 4 의 생존에 유익하지만, XRT의 맥락에서 OV를 N NSCs 이상으로 부하 한 H NSC를 사용하여 추가적인 이점을 얻을 수 있음을 나타낸다 6B ) 4 . 동일한 문맥 치료 요법 ( 그림 6C ) 4 에서 유 전적으로 조작 된 CXCR4 NSC를 사용하면 생존율을 크게 높일 수 있습니다 4 .
조직 분석 결과, H NSCs와 CXCR4 NSCs 모두가 종양 표적화 된 OV의 전달을 유의하게 향상시켰다바이러스 헥슨 단백질에 대한 도입 ( 그림 7A 및 7B ) 4 .
그림 1 : 관련된 일반 동물 절차의 개략적 인 흐름도. ( A ) 종양 모델은 환자 유래 신경아 교 세포의 이종 이식을 통해 생성됩니다. ( B ) 종양 성장은 BLI를 통해 모니터링됩니다. ( C ) 머리 - 전용 방사선 요법은 절차 6에 설명 된대로 전달됩니다. ( D ) 소변과 머리 기울임 자세는 절차 11에 설명 된대로 치료 비강의 줄기 세포 전달 중에 유지됩니다. ( E ) 치료 후 생존 모니터링, 작은 동물 필요한 경우 조직의 영상 및 조직 학적 분석을 수행합니다. 보시려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전.
그림 2 : 조사 용 동물의 셋업. 마취 된 마우스는 시료 트레이 내부의 납 보호막 사이에 위치하여 머리 부분만을 조사 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 비강 내 투여 전의 일반적인 줄기 세포 준비 과정의 흐름도. ( AC ) CXCR4를 과발현시키기위한 줄기 세포의 저산소 전처리 또는 유전자 변형. ( BD ) 세척, 효소 해리, 세포 수집 및 계수 단계는줄기 세포를 치료 용 또는 진단용화물과 함께 로딩하기 위해 형성된다. ( E ) 온 콜리 틱 바이러스와 같은 치료 시약 또는 MPIO 입자와 같은 진단 추적자는 정기적 인 흔들림과 완만 한 교반 ( F )을하여 적절한 농도로 수집 된 줄기 세포에 넣을 수 있습니다. ( GI )로드 된 줄기 세포는 마우스로 비내 전달을 위해 씻고 세어 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : CXCR4 발현 및 MPIO 로딩에 대한 줄기 세포 수정 분석 ( AC ) 저산소 전처리 또는 유전 적 결과로 줄기 세포의 표현형 변형을 확인하기 위해 유동 세포 계측법을 실행할 수 있습니다공학. (자세한 내용은 Dey 등 4 ) ( DE ) 줄기 세포 및 생체 내 결과의 성공적인 MPIO 로딩의 검출은 각각 유동 세포 계측법 및 프로이센 블루 염색을 통해 달성 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 5 : 조사가 SDF-1 (녹색 신호)를 촉진하는 가설은 신경 교종 및 주위 조직에있는 상향 조절이 확인됩니다 조직 절편의 조직 병리학 및 면역 세포 화학을 통해. 방사선 조사는 GBM43 이종 이식에서 SDF-1 발현을 증가시킵니다. 대조군과 조사 마우스에서 얻은 뇌 조직 절편의 H & E 염색 및 면역 세포 화학 분석XRT 치료 후 종양 부위에서 종양 부하를 감소 시키나 SDF-1 수치를 증가시켰다. ( A ) SDF - 1 표현 (녹색) XRT 후 종양 사이트 (흰색 상자)에 강력하게 현지화됩니다. ( B ) 시야의 농도 계량화는 대조 동물과 비교하여 XRT 처리 동물에서 SDF-1 발현이 4 배 증가 함을 입증한다 (n = 3 실험, *** p <0.001, 학생의 t- 검정). 자세한 내용은 Dey et al. 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 6 : 수정 된 NSCs의 생존 이득은 관찰되었습니다 (세부 사항은 Dey 그 외 여러분 4 에서 발견 될 수 있습니다 ). ( A ) XRT의 치료 효과의 맥락이 확립되었다 (*** p <0.001, log rank test). ( B ) OV로로드 된 줄기 세포의 저산소 전처리는 동물의 생존을 증가시킨다 (* p <0.05). C. CXCR4 유전 증진은 동물의 생존을 더욱 향상시킨다 (** p = 0.0013). 자세한 내용은 Dey et al. 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 : 저산소 또는 CXCR4- 강화 된 NCS에 의한 뇌 종양 이종 이식편에 대한 OV 전달의 확인은 H를 처리 한 마우스의 뇌로부터의 조직 절편의 면역 세포 화학 (녹색 점)에 의한 바이러스 성 헥슨 단백질 검출을 통해 달성된다. A ) 또는 CXCR4 NSCs ( B ), *** p <0.001 t test. 자세한 내용은 Dey et al. 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
약물 전달의 비강 경로가 소분자, 나노 메디신 및 단백질 화합물 모두에 대해 광범위하게 탐구되었지만, 비내심 뇌종양 표적화를위한 치료 줄기 세포의 적용은 발달중인 뇌종양 치료제 스펙트럼에서 매우 새롭다 2 , 3 , 4 . 비강 내 줄기 세포의 행동과 관련된 본질적인 복잡성이 있으며, 분자의 세부 사항은 아직 명확하지 않습니다. 줄기 세포의 크기와 뇌 신경에 따른 분포 메커니즘은 비 세포 생물학적 물질이나 작은 분자의 것과 크게 다르며, 현재 우리는 비강 상피 세포에서 치료 줄기 세포의 행동과 관련된 상세한 기계 연구에 종사하고있다. 줄기 세포 표면 사이토 카인 수용체 발현 프로파일뿐만 아니라 세포 외 매트릭스와 관련된 분자 상호 작용(ECM) 접착 분자 인 인테그린이 줄기 세포의 비내 두뇌 진입의 토대에 대한 조명을 밝히기 위해 조사 중이다. 현재 프로토콜 내에서 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 종양 위치 및 성장 패턴의 변화가 NSC가 종양으로의 이동에 의존하는 화학 주성에 영향을 미칠 수 있으므로, 1) 두개 내 신경 교종 이종 이식의 적절한 설정. 2) chemotaxic migratory behaviors에 영향을 미치는 NSC와 그 건강 상태 및 표현형의 적절한 준비; 3) 비강에서 비강으로의 줄기 세포 이동을 향상시키는 것으로 입증 된 hyaluronidase로 비강을 적절하게 준비하는 것. 4) 콧 구멍 바깥 쪽의 세포 손실을 막기 위해 비강 내 줄기 세포를 전달하는 동안 생쥐의 올바른 눕힘 자세와 동물의 NSC 전달 후 관리. MRI 2 또는 방사능 추적자 기반 영상 기법 13 은 살아있는 동물에서 비내 전달 후 생체 내 줄기 세포 이동의 실시간 평가.
동물 모델을 사용한 전임상 연구에서 임상적인 인간 환자 연구로의 번역에서 치료 결과를 예측하는 데 한계가있다. 설치류와 사람 사이의 뇌 신경 종결 분포 패턴에는 유의 한 차이가있다 19 , 20 ; 따라서 비강 내 경로를 통해 인간의 뇌 진입과 더 관련이있는 신경 결말 네트워크를 따라 치료 줄기 세포를 유도하는 전략이 미래 연구의 초점이되어야합니다. 이러한 세부 사항은 성공적인 임상 번역 노력의 열쇠이며 여기에 설명 된 원리는 분자 신호와 마우스 모델과 인간의 응용 특성 사이의 기능적 및 해부학 적 차이를 구별하도록 고안된 연구 매개 변수의 추가 다각화를위한 기반을 확립하는 데 필수적입니다.
ent "> 인간 신경 교종의 마우스 PDX 모델을 사용하는 기본 원리에 대한이 시범 시연에서 저산소 전처리 및 화학 요법의 유전 증진을 통해 hNSC의 종양 향성을 향상시키는 다양한 전략이 CXCR4 수용체 발현을 촉진하여 종양 - Intranasal 치료 줄기 세포 전달 기술에 대한 포괄적 인 설명의 중요성은 분명히 침략적 접근없이 중추 신경계 (CNS)에 대한 대안적인 치료 줄기 세포 전달 전략을 기술 한 최초의 단계별 프로토콜이기 때문에 분명합니다. 우리는 악성 뇌종양에 대한 발달 적 의학의 최전방에 강력한 실험적 치료 플랫폼을 제공하여 과학적 공동체에서의 광범위한 연구 탐색으로부터 더 큰 기계적 세부 사항이 나타날 수 있도록하는 것을 목표로합니다. 복잡성과 기계 론적 다양성은 be는 각 분야의 연구자가 탐구했다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 선언 할 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01NS087990 (MSL, IVB)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
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