Summary
Stamceller er lovende terapeutiske bærere til å behandle hjernesvulster på grunn av deres egen tumor-tropisme. Ikke-invasiv intranasal stamcelleavlevering omgår blodhjernebarrieren og viser sterkt potensial for klinisk oversettelse. Denne artikkelen oppsummerer de grunnleggende prinsippene for intranasal stamcelle levering i en musemodell av gliom.
Abstract
Den egentlige tropismen mot maligniteter i hjernen gjør stamceller som lovende bærere av terapeutiske midler mot maligne tumorer. Leveransen av terapeutiske stamceller via den intranasale ruten er en nylig oppdaget alternativ strategi, med sterkt potensial for klinisk oversettelse, på grunn av sin ikke-invasive natur sammenlignet med intrakranial implantasjon eller levering via systemiske veier. Mangelen på blodhjernebarriere styrker det terapeutiske potensialet til stamceller som undergår intranasal hjerneoppføring. Denne artikkelen oppsummerer de grunnleggende teknikkene som brukes i våre studier, og skisserer de grunnleggende prinsippene for intranasal strategi for stamcelleavlasting ved hjelp av en musemodell av intrakraniell gliomentral. Vi demonstrerer de optimaliserte prosedyrene som genererer konsistente og reproducerbare resultater med bestemte forhåndsbestemte eksperimentelle parametere og gir retningslinjer for strømlinjeformet arbeidsflyt som sikrer effektiv utførelse og pålitelig eksperimentNtal utfall. Artikkelen er utformet for å fungere som en basislinje for videre eksperimentell tilpasning basert på hypotese, stamcelletyper eller svittspesifikasjoner.
Introduction
Lav toksisitet, lav immunogenicitet og egenartet hjerne-tumor-tropisme av menneskelige stamceller er attraktive egenskaper for levering av terapeutiske kjøretøy 1 . Nye stamceller-baserte terapeutiske midler for ondartede hjernesvulster er lovende innovasjoner utviklet de siste årene, og den intranasale tilpasningen av denne terapeutiske strategien representerer et skritt mot klinisk oversettelse, fordi ikke-invasiv og gjentatt administrasjon kan dramatisk redusere barrieren for pasientapplikasjoner og Kan være tilpasningsdyktig for pasientrelaterte tjenester uten generell bedøvelse eller langvarig pasientstjeneste i forbindelse med invasive kirurgiske prosedyrer 1 , 2 , 3 , 4 .
Vi og andre har pioneret den intranasale ruten for stamcelleavlasting til hjernesvulster og har lagt grunnarbeidet for noen av de grunnleggende prinsippeneAv translasjonsforskning ved hjelp av musen xenograft-modeller 2 , 3 , 4 , samt undersøkte migrering av stamceller in vivo via magnetisk resonans imaging (MR) reagensbærere 2 . Gjennom disse pilotundersøkelsene har vi samlet stor erfaring og fått innsikt i hvordan man best kan konstruere en robust preklinisk evalueringsstrategi ved å bruke veletablerte pasient-avledede xenograft (PDX) musemodeller av ondartet gliom, samtidig som undersøkelsesoppløsningen ble holdt for å undersøke Nyanserte mekaniske detaljer om de sofistikerte biologiske fenomenene av den intranasale hjernen oppføring av terapeutiske stamceller levert til nesehulen. Her beskriver vi prinsippene for en standardisert driftsprotokoll for å demonstrere den nåværende tilstanden for eksperimentelle undersøkelser ved å bruke en veletablert human neural stamcellelinje HB1.F3.CD 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer må godkjennes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) eller tilsvarende. Hvis det er noen usikkerhet om de spesifikke prosedyrene beskrevet her, fortsett ikke. Avklare med institusjonens IACUC og et utpekt veterinærmedarbeider.
1. Sikre sterilitet av dyrkede celler og følg prinsippene for aseptiske teknikker
- Følg standard god laboratorieøvelse i alle cellekulturprosedyrer og IACUC-krav for celleprøving og patogenfri statusbekreftelse før administrering til mus 9 , 10 .
- Følg NIH-kravet for celleautentisering for å sikre reproduserbart utfall 11 .
- Følg etablerte aseptiske teknikker for små dyrkirurgi som er skissert i dette manuskriptet 4 .
2. Fremstilling av gliomceller for <Em> In vivo-eksperiment 2 , 4
- Kulturgliomceller (GBM43, GBM6 og U87MG) i serumholdig (10% føtalt bovint serum i Dulbecco's Modified Eagle's medium [DMEM]) eller serumfritt medium (Neurobasal medium med kosttilskudd B27, N2, heparin, epidermal vekstfaktor [ EGF], basisk fibroblastvekstfaktor [bFGF], antibiotika og L-glutamin 12 ) i en fuktet CO 2 -kellekultur-inkubator.
- Test alle cellelinjer via det musiske panelet som kjøres fra kommersielle tjenesteleverandører.
- Samle adherente celler ved å fjerne kulturmedium. Inkuber med 0,05% trypsin i 5 minutter ved romtemperatur (1 ml trypsin for T25-kolbe, 2 ml for T75-kolbe, skala tilsvarende for dyrkningskolber med større overflateareal) og vask deretter celler med Ca 2+ og Mg 2+ fritt fosfat Buffert saltvann (PBS).
- Trykk påKolbe for å løsrive celler og umiddelbart nøytralisere med et overskudd av serumholdig medium (8 - 9 ml). Bruk deretter serologiske pipetter til å aspirere cellesuspensjonen i sentrifugerør.
- Sentrifugesuspensjon ved 400 xg i 5 min. Vask cellen minst to ganger med 10 ml PBS ved gjentatt sentrifugering.
- Samle gliomceller som vokser som svulsterkuler i serumfritt medium via sentrifugering (samme hastighet og varighet som ovenfor); Dissocier cellepellet ved inkubering i 1 - 2 ml celleoppløsningsoppløsning ved 37 ° C i 5 minutter før det vaskes to ganger med 10 ml PBS ved sentrifugering (400 x 5 x 5 min).
- Gjenoppløs glioma i steril saltløsning ved en konsentrasjon på 50.000 - 200.000 celler per 2,5 μl. Celletall som brukes til injeksjon i mushjerne, er avhengig av den etablerte veksthastigheten for hver gliomcellelinje. Bruk 25.000 og 100.000 for henholdsvis GBM43 og GBM6 pasient-avledede svulstceller.
- Forbered doble mengden av neuenSsary celle nummer for implantasjon for å regne for tap av en brøkdel under prosedyren. Overfør injeksjonscellesuspensjonen til et sterilt mikrocentrifugerør og plasser rør på is. Hold celler på is i maksimalt 2 timer under operasjoner, utarbeide nytt batch hvis utvidede operasjoner er planlagt.
3. Intrakranial Implantation for å lage Xenograft Mouse Modeller ( Figur 1A ) 2 , 4 , 13
- Før operasjonsdagen steriliseres alle kirurgiske verktøy i en autoklav, og tilbereder alt pre- og postkirurgisk dyrepleiemateriale per IACUC-godkjent protokoll. Steriliser stereotaksisk ramme og perifert utstyr for å sikre intraoperative aseptiske forhold, og dermed minimere komplikasjoner.
- Organiser operasjonsområdet for å minimere rot og mulighet for forurensning.
- Kle på passende personlig beskyttelsesutstyrMent (PPE) per IACUC-krav.
- Sett opp riktig postoperativt gjenvinningskammer. Sørg for at anestetika og smertestillende preparater er fremstilt friske ved hjelp av uventede reagenser. Sett opp passende kroppsvarmevedlikeholdsinstrumenter per IACUC-godkjent protokoll.
- For å etablere menneskelige pasient-avledede gliomacellexenotater for testing av intranasal tilførsel av humane NSC, bruk immunokompromitterte musetyper som nå / nu atymisk mus av noe kjønn ved ca. 6 uker.
- Bedøve dyret basert på kroppsvekt ved hjelp av de godkjente reagensene, enten via en intraperitoneal (ip) injeksjon av en blanding av ketamin (50-100 mg / kg, konsulter institusjonell IACUC for godkjent doseområde) og xylazin (5-10 mg / Kg, konsulter institusjonell IACUC for godkjent doseområde) i 200-250 μL steril saltløsning, eller via 4-5% isofluranbedøvelse ved bruk av en inhalasjonsanordning.
- Sørg for at dyret har nådd det kirurgiske bedøvelsesplanet bTå knuste før huden snittet. Påfør rikelig steril oftalmisk gel for å sikre den fuktige tilstanden til hornhinnen til dyret.
- Steriliser skallen ved hjelp av gjentatte og alternerende sirkulære kluter av betadin og isopropylalkohol pr. Pritchett-Corning et al. 14 .
- Tilveie pre-incision analgesia ved sc injeksjon av Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) før snittet ved hjelp av kirurgisk blad.
- Bruk sterilisert bomullstipsapplikator for å hjelpe hemostat mens du utsetter skallen; Bruk 3% hydrogenperoksid for å lette oppklaringen av tilfeldig blødning.
- Bruk en batteridrevet håndholdt elektrisk ballpointbor (mindre enn 1 mm i bredden) for å lage et burrhull ved 2 mm lateral, enten til venstre eller høyre, til midtlinjen og 2 mm bak Bregma (posisjonskoordinatene kan tilpasses basert På svulstmodellen beregnet for en bestemt studie).
- Monter dyret til den stereotaksiske rammen til riktigE hodeposisjon, slik at den innførte Hamilton mikrosprøyten er vinkelrett på overflaten av skallen rundt burrhullet. Pass på at dyrets bedøvelsesplan er i god stand ved tåen. Vær oppmerksom på åndedrettsfrekvensen for å forsikre deg om at dyret ikke har smertestress under de følgende trinnene.
* Vi legger ikke vekt på plasseringer i ear-bar fordi:- Vi har prerilled burrhullet til å plassere nålen, og derfor er nøyaktige skalleskoordinater unødvendige;
- Musørørskanaler er skjøre, og den nøyaktige plassering av ørebjelker i øret krever mer involvert trening som ikke er relevant for vårt formål. Risikoen for skade på murine ørekanaler oppveier fordelene med en presis plassering;
- Cheek support er mye lettere å utføre og i stand til å oppnå de samme nivåene av musen hode stabilitet og balanse under posisjonering. Det er en ekstra fordel for flere tidsfølsomme operasjoner for å sikreRettidig fullføring med god celle levedyktighet.
- Bruk de stereotaksiske rammeknappene til å plassere den flate spissmikrosprøyten til burrhullet, senk det sakte til 3 mm under dura-overflaten. Trekk tilbake 0,5 mm for å opprettholde nålens spiss ved 2,5 mm under dura.
- Injiser 2,5 μL forhåndsbelastede gliomceller i løpet av 1 min. La nålen opprettholde sin posisjon i ytterligere 1-2 minutter før sakte, i løpet av 1 min, trekke nålen ut av hjernen og pass på å minimere cellebakgrunnen. Påfør steril benvoks for å unngå ekstrakraniell svulstutvekst.
- Lukk såret ved hjelp av sårklemmer av rustfritt stål (7 mm). Lever en subkutan (sc) injeksjon av 1 ml steril, laktert Ringer-løsning (oppvarmet til 37 ° C), og legg dyret i et gjenvinningskammer som er halvveis på en varmepute.
- Returner dyrene til ventilert rack når de gjenvinne mobilitet, og følg rutinemessig etterpleie for å sikre smootH gjenoppretting.
4. In vivo Bioluminescence Imaging (BLI) av tumorvekst ( Figur 1B ) 15
MERK: De pasient-avledede gliomcellene er modifisert for å uttrykke firefly luciferase. Dette tillater oss å følge tumorprogresjon etter intrakranial implantasjon.
- Gi dyr en ip-injeksjon av D-luciferin, kaliumsaltet (150 mg / kg) 10 min før bildesesjonen.
- Plasser dyr umiddelbart i et oksygenert isofluran-induksjonskammer godkjent av IACUC.
- Plasser dyr inne i det oppvarmede (37 ° C) bildekammeret for å fange BLI-signalet ved hjelp av programvareinnstillinger (for detaljer, se produsentens instruksjon).
5. Hele hjernestråling ( figur 1C ) 2 , 4 , 13
4 .
- Bruk en ip-injeksjon av en ketamin og xylazinblanding (henholdsvis 50-100 mg / kg og 5-10 mg / kg, se institusjonell IACUC for godkjent doseområde) med subkirurgisk anestesi-plan for å moderat indusere anestesi for mus.
- Bruk en prøvebrett til å plassere musene inne i kammeret mellom blybeskyttelsesblokker, slik at det kun er eksponering for stråling i hodet ( Figur 2 ).
- Gi mus med positiv BLI-bekreftelse på svulstvekst (normalt på dag 7-8 etter gliomcelleimplantasjon) en daglig dose på 2 Gy bestråling i 5 sammenhengende dager. Utfør BLI-vurdering av svulst etter den siste bestrålingsdosen.
6. Genetisk modifikasjon av humane neurale stamceller (NSCs; FigurE 3A) 4
- Opprettholde humane NSCs (klon HB1.F3.CD) 6 , 7 i DMEM-medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i en fuktig 37 ° C inkubator under 95% romluft og 5% CO 2 ( N NSC).
- Utfør genetisk overekspresjon av kjemotaksiske reseptorer, som CXC-motokemokinreceptor 4 (CXCR4), i hNSCs ved transduksjon med lentiviruskoding for human CXCR4.
- Når NSC er nær 75-80% konfluens, legg CXCR4 lentivirus til kulturmediet sammen med polybrene (8 μg / mL) og inkuber i 8 timer eller over natten.
- Erstatt virusholdig medium med friskt medium inneholdende blasticidin ved 4 μg / ml for positivt utvalg av transduserte celler.
- Validere nivået av CXCR4-ekspresjon i modifiserte hNSCs ( CXCR4 NSC) via strømningscytometri ved bruk av anti-CXCR4 antistoff og matchende isotype antistoff og viEn kvantitativ RT-PCR ved bruk av et par primere som amplifiserer CXCR4 og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) cDNA 4 .
- Generer vektorkontroll NSCs ( VC NSCs) ved hjelp av samme strategi, med RFP som erstatter CXCR4-genet, og verifiser via mikroskopi eller flytcytometri på grunn av tilstedeværelsen av RFP-fluorescens.
7. Hypoksisk forkjøling av humane NSCer ( Figur 3A ) 4
- Plate-kultiverte NSC'er i T75-kulturflasker som beskrevet ovenfor inntil 90% konfluens er nådd.
- Plasser cellekulturflasker inne i et fuktet CO 2 kammer / inkubator med opprettholdte 1% O 2 nivåer i 24 timer, via N 2 gassforsyning styrt av en automatisert innebygd flytmåler. Disse cellene refereres til som H NSCs. Kontroll N NSC er beskrevet i trinn 7.1.
8. Lasting av HuMann NSC med onkolytisk virus ( figur 3B -3H ) 5
- 8.1.Infect N NSC, H NSC, VC NSC og CXCR4 NSC med 50 betingede replikative adenovirus (CRAd) -S-pk7 viruspartikler / celle 4 , 16 .
- 8.2. Etter 2 timer inkubasjon ved romtemperatur med periodisk tapping, vask celler tre ganger med media for å fjerne ubundne viruspartikler og suspendere celler i steril saltløsning til injeksjon.
FORSIKTIG: Utfør alle virusrelaterte in vitro cellekulturprosedyrer i anlegg med riktig biosikkerhetsnivåbetegnelse, for eksempel BSL2. Passende personlig verneutstyr må bæres av forskere som håndterer oncolytic viruset per retningslinjer for institusjonelle dyrs anlegg 4 , 16 .
9. Laster stamceller med mikroN-størrelse paramagnetiske jernoksyder (MPIO) for sporing i vivo via magnetisk resonansimaging (MR, figur 3B -3H ) 2
- For å merke stamceller, legg til MPIO til stamcellekulturer ved ~ 80% konfluens, i nærvær av transfeksjonsreagens for inkubasjon over natten. Effektiviteten av stamcellemerking (NSCs 4 eller MSCs 2 ) med MPIOs (rød rød konjugert) bestemmes av strømningscytometri.
- For å visualisere stamcellemigrasjon og distribusjon i hjernen til gliomaholdige dyr, få tak i både multi-slice høyoppløselig T2-vektet rask oppkjøp med avspenningsforbedrende spin-ekkobilder og multi-skive T1-vektede hurtige lavvinkelsprang (FLASH) -gradient-ekkosekvenser til Evaluer strukturen via både coronal og aksialplanene i musens hjerne 2 .
10. Intranasal levering av terapeutiske NSC ( Figur 3D ) 2 , 4
- Kultur og samle NSC ( N NSC, H NSC, VC NSC og CXCR4 NSC) i henhold til protokollen beskrevet i avsnitt 3.
FORSIKTIG: Alle dyreprosedyrer som involverer OV-lastet NSC, må utføres i anlegg med riktig biosikkerhetsnivåbetegnelse, for eksempel BL2 eller BSL2-anlegg. - Bedøve mus via ip injeksjon av en ketamin og xylazinblanding i henhold til trinn 3.6.
- Plasser mus på en ren drape vendt opp med en varmepute under for å opprettholde kroppstemperatur. Juster en polstret pute laget av opprullede papirhåndklær med bånd for å sikre oppreist vinkel på neseborene når de plasseres under musens hode.
MERK: Forbehandling av hyaluronidase (totalt 100 U som fire gjentatte inokulasjoner med 5 minutters intervaller, 3 μl i hver nesebor) i nasal ePithelium ble beskrevet tidligere 2 , 17 . - Bruk en mikropipett, dispensere 2 μL NSC suspensjon til hver nesebor i musen. Visuelt bekreft aspirasjonen av dråpen før du beveger deg til neste mus. Det totale antall levert celler kan bestemmes av brukeren; Bruk 62 500-125 000 celler / μL, slik at 0,5-1 millioner celler kan leveres i 4 x 2 μL doser.
- Bruk en timer for å sikre 5 minutter mellom hver cellepensjonadministrasjon, opptil 4 ganger.
- Tillat dyr å gjenvinne mobilitet i et gjenvinningskammer, med den bakre posisjonen opprettholdt i hele.
11. Overlevelsesanalyse ( figur 3E )
- Skriv inn data om overlevelsesvarighet for dyr i statistisk programvare, og utfør statistiske sammenligninger ved hjelp av log-rank-testen med følgende signifikante betegnelser: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0.001.
12. Vevssamling og histologi / immunokytokjemi Verifikasjon av intranasal stamcellehjerneinngang 2 , 4
- Ved sluttpunktet av studien euthaniserer mus via de IACUC-godkjente protokollene. En standard praksis bruker et strømningsstyrt CO 2 -kammer for å ofre dyrene som den primære eutanasi-strategien etterfulgt av ekssanguering ved perfusjonsfiksering.
- Umiddelbart etter å ha blitt ofret, utfør en intrakardiell perfusjon med PBS på dyret for å sikre eliminering av blodrester fra blodkar og bevaring av vev for etterfølgende histologisk analyse.
- Plasser CO 2 -utyret dyr på toppen av en absorberende pute i den bakre posisjonen, fortsett med en laparotomi for å avsløre membranmusklen som er dissekert sammen med ribbeholderen for å utsette hjertet.
- Etter maKong et kjeft på høyre atrium ved hjelp av et par disseksjonssaks, akselerere ekssanguinasjonen med en 3-5 ml PBS-injeksjon via venstre ventrikel ved toppunktet. Injiser iskald 4% paraformaldehyd (PFA) i sirkulasjon ved hjelp av en sprøyte; Perifere muskelpasmer gir visuell bekreftelse på at det ikke er noen større blokkering i sirkulasjonen som ville forhindre riktig vevfiksering.
- Ta kirurgisk av hovedet og bevar det i et 50 ml sentrifugerør i 4% PFA ved 4 ° C over natten. Endre oppløsningen til 30% sukrose neste dag før hjernevævsdisseksjonen ytterligere 24 timer senere.
- Legg inn hjernevævet i OCT-sammensetning og blås på isopentan på tøris. Utfør krysoseksjon av den resulterende vevblokken for å generere 10-20 μm vevseksjoner for histologi og immuncytokjemiapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både hypoksisk forbehandling ( Figur 4A ) 4 og CXCR4-overekspresjon ( figur 4B og 4C ) 4 oppregner signifikant cellemembran-nærværet av CXCR4-reseptorer som vist ved strømningscytometri. Tumor tropismen demonstrert av NSCs (blå piler), er vist i tumorvevshistologi (rød sirkel). Tilstedeværelsen av MPIO-merkede ( Figur 4D ) stamceller i svulsten er bekreftet via preussisk blå farging ( figur 4E ). 4
En vevsanalyse indikerer at strålestråling ( Figur 2 ) induserer reduksjon i tumorvolum, så vel som SDF-1 oppregulering i tumor og omgivende vev ( figur 5A og 5B )4, som bekrefter hypotesen om at CXCR4-reseptor oppregulert ekspresjon i NSC kan muliggjøre tumor tropisme etter XRT.
Overlevelsesanalyse indikerer at selv om bestråling (XRT) alene er gunstig for overlevelse av tumorbærende dyr ( figur 6A ) 4 , kan ytterligere fordeler oppnås ved å bruke H NSCer lastet med OV over N NSCer lastet med OV i sammenheng med XRT ( Figur 6B ) 4 . Signifikante overlevelsesfordeler kan også ses med genetisk utviklede CXCR4 NSC i samme kontekstuelle terapeutiske regime ( Figur 6C ) 4 .
Vevsanalyse bekrefter at både H NSC og CXCR4 NSCs forbedret vesentlig den tumor-målrettede leveransen av OV, som vist av staInn for et viralt heksonprotein ( figur 7A og 7B ) 4 .
Figur 1: Skjematisk flytdiagram over de generelle dyreprosedyrene involvert. ( A ) Tumormodeller opprettes via xenotransplantasjon av pasientavledede gliomceller. ( B ) Tumorvekst overvåkes via BLI. ( C ) Behandlingsbehandlingsbehandling av hodet er levert som beskrevet i Prosedyre 6. ( D ) Supine- og hodetilstilling holdes under den terapeutiske intranasale stamcelleavlevering som beskrevet i Prosedyre 11. ( E ) Overlevelse etter overvåkning av terapi, lite dyr Imaging og histologisk analyse av vev om nødvendig blir fulgt opp. Vennligst klikk her for å seEn større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av dyr for bestråling. Anestesierte mus er plassert mellom ledeskjoldene inne i prøvefeltet, slik at det kun kan bestråles på hodet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et flytdiagram for generelle stamcelleforberedelsesprosedyrer involvert før intranasal levering. ( AC ) Hypoksisk forbehandling eller genetiske modifikasjoner av stamceller for å overuttrykke CXCR4. ( BD ) Vasking, enzymatisk dissosiasjon, celleinnsamling, og tellingstrinn er perDannet for påfølgende lasting av stamceller med terapeutisk eller diagnostisk last. ( E ) Terapeutiske reagenser, som onkolytiske virus eller diagnostiske sporstoffer, som MPIO-partikler, kan lastes i samle stamceller i passende konsentrasjoner med periodisk risting og forsiktig omrøring ( F ). ( GI ) De ladede stamceller kan deretter vaskes og telles for intranasal levering til mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av stamcelle modifikasjoner for CXCR4 Expression og MPIO Loading. ( AC ) Flowcytometri kan kjøres for å verifisere fenotypiske modifikasjoner av stamceller som følge av hypoksisk forbehandling eller genetiskengineering. (Detaljene finner du i Dey et al. 4 ) ( DE ) Påvisning av vellykket MPIO-belastning av stamceller og in vivo utfall kan oppnås henholdsvis gjennom flowcytometri og prussian blå farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Den hypotese som bestråling muliggjør SDF-1 (grønne signaler) Oppregulering i glioma og omgivende væv er bekreftet Via histopatologi og immunocytokjemi av vævsseksjoner. Bestråling øker SDF-1 ekspresjon i GBM43 xenograft. Analysen av H & E-farging og immuncytokjemi av hjernevevseksjoner fra kontroll og bestrålet mus demonstrererAtes reduserte tumorbelastning, men økte SDF-1-nivåer på svulstene etter XRT-behandling. ( A ) SDF-1-uttrykk (grønt) er sterkt lokalisert på tumorstedet (hvite bokser) etter XRT. ( B ) Densitometri-kvantifisering av betraktningsfeltene viser en fire ganger økning i SDF-1-ekspresjon i XRT-behandlede dyr i sammenligning med kontrolldyr (n = 3 eksperimenter, *** p <0,001, Studentens t-test). Detaljer finner du i Dey et al. 4 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Overlevelsesfordeler ved modifiserte NSCs ble observert (Detaljer kan bli funnet i Dey et al. 4 ). ( A ) Konteksten av terapeutiske fordeler ved XRT ble etablert (*** p <0.001, lograngeringsprøve). ( B ) Hypoksisk forbehandling av stamceller lastet med OV øker dyreoverlevelse (* p <0,05). C. CXCR4 genetisk forbedring forbedrer ytterligere dyrs overlevelse (** p = 0,0013). Detaljer finner du i Dey et al. 4 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bekreftelse av OV-levering av Hypoxia- eller CXCR4-forsterkede NCSer til Brain Tumor Xenografts oppnås via viral Hexon Protein Detection ved Immunocytochemistry (Green Dots) av Tissueseksjoner fra hjerner av mus behandlet med enten H A ) eller CXCR4 NSCs ( B ), *** p <0,001 t test. Detaljer finner du i Dey et al. 4 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om den intranasale ruten for legemiddellevering er blitt utbredt for små molekyler, nanomedisiner og proteinforbindelser likt 18 , er anvendelsen av terapeutiske stamceller for intranasal hjernesvulster-måling meget ny i spekteret av hjernetumorbehandlingene under utvikling 2 , 3 , 4 . Det er inneboende kompleksiteter involvert angående betegnelsen av stamceller i neshulen, og molekylære detaljer forblir fortsatt uklare. Størrelsen på stamceller og deres distribusjonsmekanismer langs kraniale nerver varierer dramatisk fra de som ikke er cellebiologer eller små molekyler, og vi er for tiden engasjert i detaljerte mekanistiske undersøkelser som involverer atferdene av terapeutiske stamceller i nasepitelene. Molekylære interaksjoner som involverer stamcelleoverflate-cytokinreceptoruttrykksprofiler, samt ekstracellulær matrise(ECM) adhesjonsmolekyler som integrin, blir undersøkt for å kaste lys på undergrunnen til intranasal hjerneoppføring av stamceller. De kritiske trinnene i den nåværende protokollen er multifold: 1) Riktig etablering av intrakraniell gliomenograft, som variasjoner i tumorsted og vekstmønstre kan påvirke kjemotaksen som NSCs stole på for migrasjon mot tumor; 2) Riktig forberedelse av NSC og deres helsestatus og fenotyper som påvirker den kjemotaksiske migrerende oppførselen; 3) Tilstrekkelig forberedelse av nesehulen med hyaluronidase, som har blitt vist å forbedre stamcellermigrasjonen fra nesehulen til hjernen 17 ; Og 4) Korrekt stillestilling av mus under intranasal stamcelle levering for å forhindre celle tap utenfor neseborene, og etter NSC leveringspleie av dyrene. MRI 2 eller radiotracer-baserte bildebehandlingsteknikker 13 i levende dyr kan påføres for th E sanntidsvurdering av in vivo stamcellemigrasjon etter intranasal levering.
For en preklinisk studie ved hjelp av dyremodeller, er det begrensninger for å forutsi terapeutisk utfall i oversettelsen til kliniske humane pasientstudier. Det er signifikante forskjeller i kranialnervenende distribusjonsmønstre mellom gnagere og mennesker 19 , 20 ; Derfor skal strategier for å lede terapeutiske stamceller til å distribuere langs nerveverkende nettverk som er mer relevante for menneskelig hjerneoppføring gjennom den intranasale ruten, være fokus for fremtidig forskning. Disse detaljene er nøkler til vellykket klinisk oversettelse, og prinsippene beskrevet her er avgjørende for å etablere grunnlaget for videre diversifisering av forskningsparametere designet for å skille mellom molekylære signaler og de funksjonelle og anatomiske forskjellene mellom musemodeller og menneskelige applikasjonsdetaljer.
Ent "> I denne pilotdemonstrasjonen av de grunnleggende prinsippene for bruk av mus PDX-modeller av humant gliom, viser vi potensialet for diversifiserte strategier for å forbedre tumor-tropisme av hNSCs via hypoksisk forbehandling og genetisk forbedring i kjemotropisme som fremmer CXCR4-reseptoruttrykk for å målrette tumor- Tilknyttede cytokiner. Betydningen av denne omfattende beskrivelsen av intranasal terapeutisk stamcelle-leveringsteknikk er tydelig, da det er den første trinnvise protokollen som beskriver en alternativ terapeutisk stamcelleleveringsstrategi til sentralnervesystemet (CNS) uten invasive tilnærminger typisk Kreves for CNS-lidelser. Vi tar sikte på å bringe en robust eksperimentell terapeutisk plattform til forkant av utviklingsmedisin for ondartede hjernesvulster, slik at større mekaniske detaljer kan komme fra omfattende forskningsundersøkelser i det vitenskapelige samfunn. Fremtidige utvidede applikasjoner for å behandle CNS-lidelser i bred Kompleksitet og mekanistisk mangfold kan bE utforsket av forskere i de respektive feltene.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen interessekonflikt til å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01NS087990 (MSL, IVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
- Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
- Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
- Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
- Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
- Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
- Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
- Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
- Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
- Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
- World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
- NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
- Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
- Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
- Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
- Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).
