Summary
干细胞是有希望的治疗载体，以治疗脑肿瘤由于其内在的肿瘤向性。非侵入性鼻内干细胞传播绕过血脑屏障，并且具有很强的临床翻译潜力。本文概述了胶质瘤小鼠模型中鼻内干细胞传递的基本原理。
Abstract
对脑恶性肿瘤的内在向性使得干细胞成为治疗恶性肿瘤的有希望的载体。通过鼻内途径递送治疗性干细胞是最近发现的替代策略，由于与颅内植入或通过系统途径递送相比，其具有非侵入性，具有很强的临床翻译潜力。缺乏血脑屏障进一步加强了进行鼻内入侵的干细胞的治疗潜力。本文概述了我们研究中使用的基本技术，并概述了使用颅内神经胶质瘤异种移植小鼠模型进行干细胞传播的鼻内策略的基本原理。我们展示优化的程序，通过具体的预定实验参数产生一致和可重现的结果，并为精简的工作流程提供准则，确保有效执行和可靠的实验总结。该文章旨在作为基于假设，干细胞类型或肿瘤特异性的进一步实验定制的基准。
Introduction
人类干细胞的低毒性，低免疫原性和内在的脑肿瘤趋向性是用于递送治疗剂的有吸引力的特征1 。用于恶性脑肿瘤的新型基于干细胞的治疗剂是近年来发展的有希望的创新，并且该治疗策略的鼻内适应代表了临床翻译的飞跃，因为非侵入性和反复给药可能大大降低患者应用的障碍，可适用于门诊服务，无需全身麻醉或与侵入性外科手术1,2,3,4相关的长期住院服务。
我们和其他人开创了干细胞传播到脑肿瘤的鼻内途径，并为一些基本原则奠定了基础使用小鼠异种移植模型2,3,4的翻译研究，以及通过磁共振成像（MRI）试剂载体研究干细胞在体内的迁移。通过这些试点探索，我们积累了丰富的经验，并获得了如何使用建立良好的恶性胶质瘤患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型建立强大的临床前评估策略的洞察力，同时保持调查决议，以检查精细的机械细节，传递到鼻腔的治疗性干细胞的鼻内入脑的复杂生物现象。在这里，我们描述标准化操作方案的原理，以证明使用完善的人神经干细胞系HB1.F3.CD 5的实验研究的现状
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Protocol
所有动物手术必须经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准或等同。如果本文所述的具体步骤有任何不确定性，请勿继续。向机构的IACUC和指定的兽医工作人员澄清。
1.确保培养细胞的无菌性，并遵循无菌技术原理
- 在给予小鼠9,10之前，遵循所有细胞培养程序和IACUC细胞测试和无病原体状态确认的标准良好实验室实践。
- 遵循NIH要求进行细胞鉴定，以确保可重复的结果11 。
- 遵循本手稿中概述的已建立的小动物手术无菌技术4 。
2.制备胶质瘤细胞体内实验2，4
- 含有血清的培养物（GBM43，GBM6和U87MG）（Dulbecco's Modified Eagle's培养基[DMEM]中的10％胎牛血清）或无血清培养基（含有B27，N2，肝素，表皮生长因子的神经巴氏培养基[ EGF]，碱性成纤维细胞生长因子[bFGF]，抗生素和L-谷氨酰胺12 ），在加湿的CO 2细胞培养箱中。
- 通过从商业服务提供商运行的鼠标清除面板测试所有细胞系。
- 通过去除培养基收集贴壁细胞。在室温下与0.05％胰蛋白酶孵育5分钟（T25烧瓶1 mL胰蛋白酶，T75烧瓶2 mL，比表面积较大的培养瓶分级），然后用Ca 2+和Mg 2+游离磷酸盐洗涤细胞缓冲盐水（PBS）。
- 点击烧瓶以移出细胞，并立即用过量的含血清培养基（8-9mL）中和。然后使用血清移液管将细胞悬液吸入离心管中。
- 以400×g离心细胞悬液5分钟。通过反复离心用10mL PBS洗涤细胞至少两次。
- 通过离心（相同的速度和持续时间）离心收集在无血清培养基中作为肿瘤球生长的胶质瘤细胞;通过在1-2mL细胞分离溶液中在37℃温育5分钟来分离细胞沉淀，然后通过离心（400xgx5分钟）用10mL PBS洗涤两次。
- 重新悬浮胶体瘤无菌生理盐水浓度为每个2.5μL50,000 - 200,000个细胞。用于注射到小鼠脑中的细胞数量取决于每个胶质瘤细胞系建立的生长速率。在这里，GBM43和GBM6患者来源的肿瘤细胞分别使用25,000和100,000。
- 准备两倍的nece用于植入的ssary细胞编号以解释手术期间损失的分数。将注射细胞悬浮液转移到无菌微量离心管中，并将管置于冰上。在手术过程中将细胞留在冰上2小时，如果计划进行扩展手术，准备新的批次。
3.创建异种移植小鼠模型的颅内植入（ 图1A ）2，4，13
- 在手术之前，对高压灭菌器中的所有手术工具进行消毒，并按照IACUC批准的方案准备所有手术前和手术后的动物护理材料。灭菌立体定位框架和外围设备，以确保术中无菌条件，从而最大限度地减少并发症。
- 组织操作区域，尽量减少杂乱和污染的可能性。
- 穿着适当的个人防护装备（PPE）每IACUC要求。
- 设置适当的术后恢复室。确保使用未过期的试剂新鲜制备麻醉剂和镇痛药。根据IACUC批准的协议设置适当的体温保养仪器。
- 为了建立人类患者衍生的胶质瘤细胞异种移植物来测试人类神经干细胞的鼻内递送，在约6周龄时使用任何性别的免疫受损小鼠种类，例如nu / nu无胸腺小鼠。
- 使用批准的试剂， 即通过腹膜内（ip）注射氯胺酮（50-100mg / kg;咨询制剂IACUC用于经批准的剂量范围）和赛拉嗪（5-10mg / kg）混合使用体重麻醉动物， kg;咨询制剂IACUC批准的剂量范围），200-250μL无菌盐水，或使用吸入装置通过4-5％异氟烷麻醉。
- 确保动物已达到手术麻醉平面b在皮肤切口之前趾部捏。应用充足的无菌眼科凝胶，以确保动物角膜的潮湿状态。
- 使用每个Pritchett-Corning 等人使用betadine和异丙醇的重复和交替的圆形擦拭物来消灭头骨。 14 。
- 在使用外科手术刀切开前，通过sc注射Buprenex（0.05 - 2 mg / kg）提供切口前镇痛。
- 使用灭菌的棉花头施放器帮助止血，同时暴露头骨;使用3％过氧化氢来促进偶发性出血的清除。
- 使用电池供电的手持式电钻圆珠笔（宽度小于1毫米），可以在左侧或右侧向左侧或右侧向外侧创建一个2毫米的毛刺孔，并在Bregma后面创建2mm的位置坐标对于特定研究的肿瘤模型）。
- 将动物安置在立体定位框架上e头部姿势，使得插入的汉密尔顿微型注射器垂直于颅骨周围的颅骨表面。注意确保动物的麻醉平面处于良好的姿势，由脚趾捏住。观察呼吸频率，以确保在以下步骤中动物未受到疼痛压力。
*我们不强调入耳式酒吧刊登位置，因为：- 我们预先钻出钻孔来定位针头，因此不需要精确的头骨坐标;
- 鼠标耳道是脆弱的，耳塞的精确入耳放置需要更多的与我们的目的无关的训练。鼠耳道损伤的风险超过精确放置的好处;
- 脸颊支持更容易执行，并能够在定位期间实现相同水平的鼠标头稳定性和平衡。这对多种时间敏感的手术来说是一个额外的好处及时完成，细胞活力良好。
- 使用立体定位框架旋钮将平头微型注射器定位到钻孔，然后缓慢降低到硬脑膜表面下方3 mm。缩回0.5毫米以将针头保持在硬脑膜下方2.5毫米处。
- 在1分钟内注入2.5μL预加载的胶质瘤细胞。让针头缓慢地保持其位置1-2分钟，在1分钟的时间内将针头从大脑中取出并注意使细胞回流最小化。使用无菌骨蜡避免颅外肿瘤生长。
- 用不锈钢伤口夹（7毫米）关闭伤口。将皮下（sc）注射1 mL无菌乳酸林格氏溶液（预热至37°C），并将动物置于加热垫中途的回收室中。
- 一旦他们恢复流动性，将动物送回通风的机架，并按照常规的后期护理来确保平滑h恢复。
4. 体内生物发光成像（BLI）的肿瘤生长（ 图1B ） 15
注意：患者衍生的胶质瘤细胞被修饰以表达萤火虫荧光素酶。这使我们能够在颅内植入后跟随肿瘤进展。
- 在成像前10分钟，给予动物腹膜内注射D-萤光素，钾盐（150 mg / kg）。
- 立即将动物放置在由IACUC批准的含氧异氟烷诱导室中。
- 将动物置于加热（37°C）成像室内以使用软件设置捕获BLI信号（有关详细信息，请参阅制造商说明）。
5.全脑照射（ 图1C ）2，4，13
- 使用腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（分别为50-100mg / kg和5-10mg / kg，咨询制剂IACUC用于批准的剂量范围）与亚手术麻醉平面以适度诱导小鼠麻醉。
- 使用样品托盘将鼠标放置在室内的引线屏蔽块之间，从而允许仅头部暴露于辐射路径（ 图2 ）。
- 给予具有阳性BLI确认肿瘤生长的小鼠（通常在神经胶质瘤细胞植入后第7-8天）每天2Gy的照射剂量连续5天。在最后一次照射剂量后进行BLI评估肿瘤。
6.人类神经干细胞的遗传修饰（NSCs; Figure 3A） 4
- 在95％室温和5％CO 2 （ N NSCs）下，在潮湿的37℃培养箱中，在具有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM培养基中维持人类NSCs（克隆HB1.F3.CD） 6,7 。
- 通过用编码人CXCR4的慢病毒转导，在hNSC中进行趋化性受体（如CXC基序趋化因子受体4（CXCR4））的遗传过表达。
- 当NSCs接近75-80％融合时，将CXCR4慢病毒与聚凝胺（8μg/ mL）一起加入到培养基中，并孵育8小时或过夜。
- 用含有4μg/ mL杀稻瘟素的新鲜培养基代替含病毒培养基用于阳性选择转导的细胞。
- 通过使用抗CXCR4抗体和匹配的同种型抗体和vi的流式细胞术验证修饰的hNSC（ CXCR4 NSCs）中CXCR4表达的水平使用扩增CXCR4和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）cDNA的一对引物进行定量RT-PCR。
- 使用相同的策略产生载体控制NSCs（ VC NSCs），RFP替代CXCR4基因，并且由于存在RFP荧光， 通过显微镜或流式细胞术验证。
7.人类NSCs的缺氧预处理（ 图3A ） 4
- 在如上所述的T75培养瓶中培养的培养的NSCs直至达到90％汇合。
- 将细胞培养瓶置于保持1％O 2水平的加湿CO 2室/培养箱中24小时， 通过由自动内置流量计控制的N 2气体供应。这些细胞被称为H NSCs。在步骤7.1中描述了控制N个 NSCs。
胡装载具有溶瘤病毒的人NSCs（ 图3B- 3H） 5
- 8.1。具有50个条件复制腺病毒（CRAd）-S-pk7病毒颗粒/细胞的N NSCs， H NSCs， VC NSCs和CXCR4 NSCs 4,16。
- 8.2。室温孵育2小时后，定期敲打，用培养基洗涤细胞三次以除去未结合的病毒颗粒，并将细胞悬浮于无菌盐水中进行注射。
小心：在具有适当生物安全等级名称的设施中进行与病毒相关的体外细胞培养程序，如BSL2。处理溶瘤病毒的研究人员必须佩戴适当的个人防护装备，每个机构动物设施指南4,16。
9.用微量加载干细胞通过磁共振成像进行体内追踪的n型顺磁性氧化铁（MPIO）（MRI; 图3B- 3H） 2
- 为了标记干细胞，在转染试剂的存在下，以约80％融合的方式，将MPIO添加到干细胞培养物中进行过夜孵育。通过流式细胞术测定干细胞标记（NSCs 4或MSC 2 ）与MPIO（闪红染色）的效率。
- 为了可视化胶质瘤动物脑中的干细胞迁移和分布，采用松弛增强自旋回波图像和多切片T1加权快速低角度射击（FLASH）梯度回波序列获得多切片高分辨率T2加权快速采集通过小鼠脑的冠状面和轴向平面评估结构2 。
10.鼻内递送治疗性NSCs（ 图3D ） 2，4
- 根据第3节中描述的方案培养和收集NSCs（ N NSCs， H NSCs， VC NSCs和CXCR4 NSCs）。
小心：涉及OV载荷的神经干细胞的所有动物手术必须在具有适当生物安全等级的设施中进行，例如BL2或BSL2设施。 - 根据步骤3.6通过ip注射氯胺酮和赛拉嗪混合物麻醉小鼠。
- 将小鼠放在一个干净的悬垂物上，面朝上放置一块加热垫，以保持体温。用胶带调整由卷起的纸巾制成的填充枕头，以确保放置在鼠标头下方时鼻孔的直立角度。
注意：透明质酸酶预处理（总共100 U，以5分钟间隔四次重复接种，每只鼻孔3μL）鼻e前述2，17描述了上皮。 - 使用微量移液管，将2μLNSC悬浮液分配给小鼠的每个鼻孔。在移动到下一个鼠标之前，目视确认液滴的抽吸。传送的单元总数可由用户确定;使用62,500-125,000个细胞/μL，使得可以以4×2μL剂量递送0.5-1,000个细胞。
- 使用定时器确保每个细胞悬液给药间隔5分钟，最多4次。
- 允许动物在恢复室恢复流动，整个仰卧位。
11.生存分析（ 图3E ）
- 在统计软件中输入动物的生存期数据，并使用具有以下有效指标的对数秩检验进行统计学比较：* p < 0.05，** p <0.01，*** p <0.001。
12.组织收集和组织学/免疫细胞化学验证鼻内干细胞脑输入2，4
- 在研究的终点， 通过 IACUC批准的方案安乐死小鼠。标准做法是使用流量控制的CO 2室来牺牲动物作为主要的安乐死策略，然后通过灌注固定放血。
- 处死后，立即用PBS对动物进行心内灌注，以确保从血管中清除血液残留物并保存组织用于随后的组织学分析。
- 将CO 2 -安乐死的动物置于仰卧位置的吸收垫的顶部，进行剖腹术以暴露与肋骨一起解剖的隔膜肌肉以暴露心脏。
- 之后使用一对解剖剪刀在右心房使用一个切口，通过顶点的左心室加入3-5mL PBS注射液的放血。使用注射器将冰冷的4％多聚甲醛（PFA）注入循环;外周肌肉痉挛提供视觉确认，循环中没有严重的阻塞，会阻止适当的组织固定。
- 手术去除胴体的头部，并在4℃的PFA中在50mL离心管中保存4℃过夜。第二天将溶液更换为30％的蔗糖，然后再进行脑组织切除24小时。
- 将脑组织嵌入OCT化合物并在干冰上快速冷冻在异戊烷上。对所得组织块进行冷冻切片以产生组织切片和免疫细胞化学应用的10-20μm组织切片。
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Representative Results
低氧预处理（ 图4A ） 4和CXCR4过表达（ 图4B和4C ） 4显着上调了CXCR4受体的细胞膜存在，如流式细胞术所证实的。 NSCs表现出的肿瘤趋向性（蓝色箭头）显示在肿瘤组织组织学（红色圆圈）中。通过普鲁士蓝染色确认肿瘤中MPIO标记（ 图4D ）干细胞的存在（ 图4E ）。 4
组织分析表明，仅头部照射（ 图2 ）诱导肿瘤体积的减少以及肿瘤和周围组织中的SDF-1上调（ 图5A和5B ）4，这证实了CXCR4受体上调NSCs表达的假说可能促进XRT后的肿瘤向性。
生存分析表明，虽然单独的照射（XRT）对于荷瘤动物的存活有益（ 图6A ） 4 ，但是在XRT的背景下，通过装载OV的N个 NSCs的H NSCs可以实现额外的益处（ 图6B ） 4 。在相同的情境治疗方案中，基因工程的CXCR4 NSCs也可以看到显着的生存益处（ 图6C ）。
组织分析证实， H NSCs和CXCR4 NSCs都显着增强了OVs的肿瘤靶向递送，如sta引入病毒六邻体蛋白（ 图7A和7B ） 4 。
图1：涉及的一般动物程序的示意图。 （ A ）通过患者衍生的胶质瘤细胞的异种移植产生肿瘤模型。 （ B ）通过BLI监测肿瘤生长。 （ C ）如步骤6所述进行仅头照射治疗。（ D ）在治疗性鼻内干细胞递送期间维持仰卧位和俯仰姿势，如方法11所详述。（ E ）治疗后生存监测，小动物如果需要，对组织的成像和组织学分析进行跟踪。 请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：照射动物的设置。麻醉的小鼠位于样品盘内的铅屏蔽之间，仅允许头部照射。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：在鼻内递送前参与的一般干细胞制备程序的流程图。 （ AC ）低氧预处理或干细胞过表达CXCR4的遗传修饰。 （ BD ）洗涤，酶解，细胞收集和计数步骤形成用于随后加载具有治疗或诊断货物的干细胞。 （ E ）可以定期摇动和温和搅拌（ F ），将适当浓度的治疗试剂如溶瘤病毒或诊断示踪剂（如MPIO颗粒）装入收集的干细胞中。 （ GI ）然后可以洗涤加载的干细胞并计数鼻内输送到小鼠中。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：CXCR4表达和MPIO载体的干细胞修饰分析。 （ AC ）可以运行流式细胞术，以验证由于缺氧预处理或遗传的干细胞的表型修饰工程。 （详见Dey et al。4）（ DE ）分别通过流式细胞术和普鲁士蓝染色检测干细胞成功的MPIO载量和体内结果。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：证实了辐射促进SDF-1（绿色信号）神经胶质瘤和周围组织上调的假说 通过组织病理学和组织切片的免疫细胞化学。照射增加GBM43异种移植物中的SDF-1表达。来自对照和照射小鼠的脑组织切片的H＆E染色和免疫细胞化学分析显示在XRT治疗后，肿瘤部位减少肿瘤负荷，但增加SDF-1水平。 （ A ）SDF-1表达（绿色）在XRT后强烈定位于肿瘤部位（白盒子）。 （ B ）与对照动物（n = 3个实验，*** p <0.001，Student t检验）相比，XRT处理的动物的SDF-1表达增加了4倍。详细信息请见Dey et al。 4 请点击此处查看此图的较大版本。
图6：观察到修饰的NSCs的生存益处（详见Dey et al ）。 （ A ）建立了XRT治疗益处的背景（*** p <0.001，对数秩检验）。 （ B ）负载OV的干细胞的缺氧预处理可提高动物存活（* p <0.05）。 C. CXCR4遗传增强进一步提高动物的生存（** p = 0.0013）。详细信息请见Dey et al。 4 请点击此处查看此图的较大版本。
图7：缺氧或CXCR4增强的NCS对脑肿瘤异种移植物的OV递送的确认通过来自用H治疗的小鼠的组织组织的组织切片的免疫细胞化学（绿点）的病毒黑素蛋白检测来实现A ）或CXCR4 NSCs（ B ），*** p <0.001 t检验。详细信息请见Dey et al。 4 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
虽然药物递送的鼻内途径已被广泛地用于小分子，纳米医学和蛋白质化合物18 ，但是用于鼻内脑肿瘤靶向的治疗性干细胞的应用在开发中的脑肿瘤治疗剂谱2 中是非常新的， 4 。鼻腔干细胞的行为有内在的复杂性，分子细节尚不清楚。干细胞的大小及其与颅神经的分布机制与非细胞生物制剂或小分子显着不同，目前我们正在进行详细的机械研究，涉及治疗性干细胞在鼻上皮细胞中的作用。分子相互作用涉及干细胞表面细胞因子受体表达谱，以及细胞外基质（ECM）粘附分子如整联蛋白正在研究中，以揭示鼻内入侵干细胞的基础。目前的方案中的关键步骤是多方面的：1）正确建立颅内神经胶质瘤异种移植物，作为肿瘤位置和生长模式的变化可能会影响NSCs依赖于肿瘤迁移的趋化性; 2）正确准备NSCs及其健康状况和表型，影响趋化性迁移行为; 3）用透明质酸酶充分制备鼻腔，已被证明可以改善干细胞从鼻腔向脑内的迁移17 ;和4）在鼻内干细胞递送期间正确仰卧姿势的小鼠，以防止鼻孔外的细胞损失，以及动物后NSC递送护理。可以应用活体动物中的MRI 2或放射性示踪剂成像技术13鼻内递送后体内干细胞迁移的实时评估。
对于使用动物模型的临床前研究，在临床人类患者研究的翻译中预测治疗结果存在局限性。啮齿动物与人类颅神经末梢分布模式有显着差异19,20;因此，直接治疗性干细胞分布在通过鼻内途径进入人脑的神经末梢网络的策略应成为未来研究的重点。这些细节是成功的临床翻译工作的关键，本文描述的原则对于建立进一步多样化研究参数的基础是必不可少的，旨在区分分子线索和小鼠模型与人类应用细节之间的功能和解剖学差异。
在本次试点示范使用人类胶质瘤小鼠PDX模型的基本原理中，我们展示了多种策略的潜力，通过缺氧预处理和增强CXCR4受体表达的靶向肿瘤细胞增殖的基因增强来增强hNSC的肿瘤趋向性，这种综合描述鼻内治疗性干细胞传递技术的意义是显而易见的，因为它是第一个分步骤方案，描述了一种替代治疗干细胞向中枢神经系统（CNS）传递策略，而无侵入性方法我们的目标是为恶性脑肿瘤发展医学的前沿带来强大的实验性治疗平台，从而在科学界广泛的研究探索中出现更多的机械细节。未来扩大的应用来治疗广泛的CNS疾病复杂性和机械多样性可以b由各方面的研究人员探索。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有声明利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到NIH R01NS087990（MSL，IVB）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
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