Summary
Стволовые клетки являются перспективными терапевтическими носителями для лечения опухолей головного мозга из-за их внутреннего опухолевого тропизма. Неинвазивная интраназальная доставка стволовых клеток обходит гематоэнцефалический барьер и демонстрирует сильный потенциал для клинического перевода. В этой статье обобщены основные принципы доставки интраназальных стволовых клеток в мышиную модель глиомы.
Abstract
Внутренний тропизм к злокачественным новообразованиям мозга делает стволовые клетки перспективными носителями терапевтических агентов против злокачественных опухолей. Доставка терапевтических стволовых клеток по интраназальному маршруту - это недавно открытая альтернативная стратегия с сильным потенциалом для клинического перевода из-за ее неинвазивного характера по сравнению с внутричерепной имплантацией или доставкой по системным маршрутам. Отсутствие гематоэнцефалического барьера еще более усиливает терапевтический потенциал стволовых клеток, подвергающихся интраназальному вхождению мозга. В этой статье обобщаются основные методы, используемые в наших исследованиях, и излагаются основные принципы интраназальной стратегии доставки стволовых клеток с использованием мышиной модели внутричерепных ксенотрансплантатов глиомы. Мы демонстрируем оптимизированные процедуры, которые генерируют согласованные и воспроизводимые результаты с определенными заранее определенными экспериментальными параметрами и предлагают рекомендации для упрощенного рабочего потока, которые обеспечивают эффективное выполнение и надежный опытКонечный результат. Статья призвана служить базой для дальнейшей экспериментальной настройки на основе гипотезы, типов стволовых клеток или особенностей опухоли.
Introduction
Низкая токсичность, низкая иммуногенность и внутренний потоотдел опухоли мозга стволовых клеток человека являются привлекательными чертами для доставки терапевтических средств 1 . Новые терапевтические средства на основе стволовых клеток для злокачественных опухолей головного мозга являются перспективными нововведениями, разработанными в последние годы, а интраназальная адаптация этой терапевтической стратегии представляет собой скачок к клиническому переводу, поскольку неинвазивное и повторное введение может значительно снизить барьер для приложений пациентов и Могут быть адаптированы для амбулаторных услуг без общей анестезии или длительной стационарной службы, связанной с инвазивными хирургическими процедурами 1 , 2 , 3 , 4 .
Мы и другие стали инициаторами интраназального пути доставки стволовых клеток к опухолям головного мозга и заложили основы для некоторых основных принциповТрансляционных исследований с использованием моделей 2 , 3 , 4 мышиного ксенотрансплантата, а также исследовали миграцию стволовых клеток in vivo с помощью реагентов реагентов магнитно-резонансной томографии (MRI) 2 . Благодаря этим экспериментальным исследованиям мы накопили значительный опыт и получили представление о том, как наилучшим образом построить надежную стратегию доклинической оценки с использованием хорошо известных моделей мышиных ксенотрансплантатов (PDX) злокачественной глиомы, сохраняя при этом разрешение на исследование для изучения Тонкие механические детали сложных биологических явлений интраназального ввода мозга терапевтических стволовых клеток, доставляемых в полость носа. Здесь мы описываем принципы стандартизованного рабочего протокола для демонстрации текущего состояния экспериментальных исследований с использованием хорошо налаженной линии нервных стволовых клеток человека HB1.F3.CD 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных должны быть одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) или его эквивалентом. Если есть какая-либо неопределенность в отношении конкретных процедур, описанных здесь, не продолжайте. Уточнить с IACUC учреждения и назначенный ветеринарный сотрудник.
1. Обеспечение стерильности культивируемых клеток и соблюдение принципов асептических методов
- Следуйте стандартной хорошей лабораторной практике во всех процедурах клеточной культуры и IACUC для тестирования клеток и подтверждения статуса без патогенов до введения мышам 9 , 10 .
- Следуйте требованиям NIH для проверки подлинности ячеек, чтобы обеспечить воспроизводимый результат 11 .
- Следуйте установленным методам асептической хирургии мелких животных, изложенным в этой рукописи 4 .
2. Получение клеток глиомы для <Em> In Vivo Эксперимент 2 , 4
- Клетки глиомы культуры (GBM43, GBM6 и U87MG) в сыворотке (10% фетальной бычьей сыворотки в среде модифицированного орла Dulbecco [DMEM]) или в среде без сыворотки (нейробазальная среда с добавками B27, N2, гепарин, эпидермальный фактор роста [ EGF], основной фактор роста фибробластов [bFGF], антибиотики и L-глутамин 12 ), в увлажненном инкубаторе культивирования клеток CO 2 .
- Протестируйте все линии сотовой сети с помощью ясной панели мыши от коммерческих поставщиков услуг.
- Собирайте адгезивные клетки, удаляя культуральную среду. Инкубируйте с 0,05% трипсином в течение 5 минут при комнатной температуре (1 мл трипсина для колбы T25, 2 мл для колбы T75, соответственно масштабируют для культуральных колб с большей площадью поверхности), а затем промывают клетки свободным фосфатом Ca 2+ и Mg 2+ Забуференный физиологический раствор (PBS).
- НажмитеКолбу для удаления клеток и немедленно нейтрализуют избытком сывороточной среды (8-9 мл). Затем используйте серологические пипетки для аспирации суспензии клеток в центрифужные пробирки.
- Центрифужная клеточная суспензия при 400 мкг в течение 5 мин. Вымойте клетку по крайней мере дважды с 10 мл PBS повторным центрифугированием.
- Собирайте клетки глиомы, выращенные в виде опухолевых сфер в бессывороточной среде, посредством центрифугирования (с той же скоростью и продолжительностью, что и выше); Диссоциировать клеточный осадок путем инкубации в 1 - 2 мл раствора для открепления клеток при 37 ° С в течение 5 мин перед промыванием дважды 10 мл PBS центрифугированием (400 × 5 × 5 мин).
- Повторно суспендировать глиому в стерильном физиологическом растворе в концентрации 50 000 - 200 000 клеток на 2,5 мкл. Номера клеток, используемые для инъекций в мозг мыши, зависят от установленной скорости роста для каждой клеточной линии глиомы. Здесь используют 25 000 и 100 000 для опухолевых клеток, получавших GBM43 и GBM6, соответственно.
- Подготовьте вдвое больше суммыSsary cell number для имплантации для учета потери доли во время процедуры. Перенесите суспензию инъекционной клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку и поместите пробирку на лед. Держите клетки на льду в течение 2 часов максимум во время операций, подготовьте новую партию, если запланированы расширенные операции.
3. Внутричерепная имплантация для создания моделей мыши Xenograft ( рис. 1A ) 2 , 4 , 13
- Перед операционным днем стерилизовать все хирургические инструменты в автоклаве и подготовить все материалы для ухода за пре- и послеоперационными животными по протоколу, утвержденному IACUC. Стерилизовать стереотаксическую раму и периферийное оборудование для обеспечения интраоперационных асептических состояний, что минимизирует осложнения.
- Организуйте рабочую зону, чтобы свести к минимуму беспорядок и возможность загрязнения.
- Платье в подходящем индивидуальном защитном оборудовании(СИЗ) по требованию IACUC.
- Настройте соответствующую послеоперационную камеру для восстановления. Убедитесь, что анестетики и анальгетики приготовлены в свежем виде с использованием неживых реагентов. Настройте соответствующие приборы для поддержания тепла тела в соответствии с утвержденным протоколом IACUC.
- Чтобы установить ксенотрансплантаты клеток глиомы на основе человеческого пациента для тестирования интраназальной доставки НСК человека, используйте иммунокомпрометированные мышиные мыши, такие как nym / nu-асимметричная мышь любого пола в возрасте примерно 6 недель.
- Анестезируйте животное по массе тела с использованием одобренных реагентов, то есть либо с помощью внутрибрюшинной (ip) инъекции смеси кетамина (50-100 мг / кг, обратитесь в учрежденческий IACUC для одобренного диапазона доз) и ксилазина (5-10 мг / Кг, проконсультироваться с институтом IACUC для одобренного диапазона дозы) в 200-250 мкл стерильного физиологического раствора или через 4-5% изофлурановой анестезии с использованием ингаляционного устройства.
- Убедитесь, что животное достигло плоскости хирургической анестезии bПеред тем как разрезать кожу. Нанесите достаточный стерильный глазный гель, чтобы обеспечить влажное состояние роговицы животного.
- Стерилизовать череп, используя повторяющиеся и чередующиеся круглые салфетки бетадина и изопропилового спирта на Pritchett-Corning и др. 14 .
- Поставьте предварительную анальгезию путем инъекции бупренекса (0,05-2 мг / кг) до разреза с помощью хирургического лезвия.
- Используйте стерилизованный аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы помочь гемостату при обнажении черепа; Используйте 3% перекись водорода для облегчения клиренса случайного кровотечения.
- Используйте ручную электрическую шариковую катушку с батарейным питанием (шириной менее 1 мм), чтобы создать отверстие для заусенцев на 2 мм поперечном, левом или правом, на средней линии и на 2 мм позади Брегмы (координаты положения могут быть настроены на основе На модель опухоли, предназначенную для конкретного исследования).
- Поднесите животное к стереотаксической рамке к соответствующемуТак что вставленный микробный шприц Гамильтона перпендикулярен поверхности черепа вокруг заусенца. Позаботьтесь о том, чтобы анестезирующий план животного находился в хорошем состоянии, зажав ногой. Наблюдайте за частотой дыхания, чтобы убедиться, что животное не испытывает болевого стресса в течение следующих шагов.
* Мы не выделяем места размещения в ушных барах, потому что:- Мы предварительно просверлили отверстие заусенцев, чтобы расположить иглу, и поэтому точные координаты черепа не нужны;
- Ушные каналы для мыши являются хрупкими, и точное размещение ушных вкладышей в ухе требует более активного обучения, которое не имеет отношения к нашей цели. Риски повреждения мышиных ушных каналов перевешивают преимущества точного размещения;
- Поддержка щеки намного легче выполнять и способна достигать одинаковых уровней стабильности и баланса головки мыши во время позиционирования. Это дополнительное преимущество для нескольких операций, чувствительных к времени, для обеспеченияСвоевременное завершение с хорошей жизнеспособностью клеток.
- Используйте стереотаксические ручки рамки, чтобы поместить микротип шприца с плоским концом в отверстие для заусенцев, затем медленно опустите его на 3 мм ниже поверхности твердой мозговой оболочки. Отведите 0,5 мм, чтобы поддерживать кончик иглы на 2,5 мм ниже твердой.
- Внесите 2,5 мкл предварительно нагруженных клеток глиомы в течение 1 мин. Дайте игле удерживать свое положение еще на 1-2 мин, прежде чем медленно, в течение 1 мин, выньте иглу из мозга и следите за тем, чтобы минимизировать обратный поток клеток. Применяйте стерильный костяной воск, чтобы избежать экстракраниального роста опухоли.
- Закройте рану с помощью зажимов из нержавеющей стали (7 мм). Доставить подкожную (sc) инъекцию 1 мл стерильного лактированного раствора Рингера (предварительно нагретого до 37 ° C) и поместить животное в камеру для восстановления, которая находится на полпути на нагревательной подушке.
- Верните животных в проветриваемую стойку, как только они вернутся к мобильности, и следите за повседневной опекой после ухода, чтобы обеспечить сглаживаниеH восстановление.
4. In Vivo Bioluminescence Imaging (BLI) роста опухоли ( рис. 1B ) 15
ПРИМЕЧАНИЕ. Выведенные из организма клетки глиомы модифицированы для экспрессии люциферазы светлячков. Это позволяет нам следить за прогрессированием опухоли после внутричерепной имплантации.
- Дайте животным ip-инъекцию D-люциферина, калиевой соли (150 мг / кг) за 10 минут до сеанса визуализации.
- Немедленно поместите животных в кислородсодержащую индукционную камеру изофлюрана, одобренную IACUC.
- Поместите животных в камеру с подогревом (37 ° C) для захвата сигнала BLI с помощью настроек программного обеспечения (подробнее см. Инструкцию изготовителя).
5. Облучение всего мозга ( рис. 1С ) 2 , 4 , 13
4 .
- Используйте инфузионную инъекцию смеси кетамина и ксилазина (50-100 мг / кг и 5-10 мг / кг соответственно, консультируйтесь с институтом IACUC для одобренного диапазона дозы) с помощью подоперационной анестезии, чтобы умеренно вызвать анестезию для мышей.
- Используйте лоток для образца, чтобы расположить мышей внутри камеры между экранирующими блоками свинца, позволяя только воздействие на излучение пути только на голову ( рисунок 2 ).
- Дайте мышам положительное BLI подтверждение роста опухоли (обычно на 7-8 день после имплантации клеток глиомы) суточная доза облучения 2 Гр в течение 5 последовательных дней. Выполните BLI-оценку опухоли после последней дозы облучения.
6. Генетическая модификация нейронных стволовых клеток человека (NSCs; FigurE 3A) 4
- Поддерживать человеческие НСК (клон HB1.F3.CD) 6 , 7 в среде DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином в увлажненном 37 ° C инкубаторе при 95% комнатной температуре и 5% CO 2 ( N NSC).
- Выполните генетическую сверхэкспрессию хемотаксических рецепторов, таких как хемокиновый рецептор 4 CXC-монокристалла (CXCR4), в hNSC путем трансдукции с лентивирусом, кодирующим CXCR4 человека.
- Когда NSC находятся около 75-80% слияния, добавьте лентивирус CXCR4 в культуральную среду вместе с полибреном (8 мкг / мл) и инкубируйте в течение 8 часов или в течение ночи.
- Замените вируссодержащую среду свежей средой, содержащей бластицидин, при 4 мкг / мл для положительного отбора трансдуцированных клеток.
- Подтвердите уровень экспрессии CXCR4 в модифицированных hNSC ( CXCR4 NSC) с помощью проточной цитометрии с использованием антитела против CXCR4 и соответствующего изотипного антитела и viКоличественную ОТ-ПЦР с использованием пары праймеров, амплифицирующих CXCR4 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) кДНК 4 .
- Сгенерировать векторные контрольные NSC ( VC NSC), используя ту же стратегию, с RFP, заменяющим ген CXCR4, и проверить с помощью микроскопии или проточной цитометрии из-за наличия флуоресценции RFP.
7. Гипоксическое предварительное кондиционирование НСК человека ( рисунок 3А ) 4
- Пластинчатые культивируемые NSC в колбах культуры T75, как описано выше, до достижения 90% слияния.
- Поместите клеточные культуральные колбы внутри увлажненной камеры / инкубатора CO 2 с поддерживаемыми уровнями 1% O 2 в течение 24 часов, через подачу газа N 2, контролируемую автоматическим встроенным расходомером. Эти ячейки называются Н НСК. Контрольные N NSC описаны на шаге 7.1.
8. Загрузка ХуЧеловеческие НСК с онколитическим вирусом ( рис. 3Б- 3Н ) 5
- 8.1. Инфекционные N NSC, H NSC, VC NSC и CXCR4 NSC с 50 условными репликативными аденовирусными (CRAd) -S-pk7 вирусными частицами / клеткой 4 , 16 .
- 8.2. Через 2 часа инкубации при комнатной температуре с периодическим нарезанием резьбы три раза промывайте клетки средой для удаления несвязанных вирусных частиц и суспендируйте клетки в стерильном физиологическом растворе для инъекций.
ВНИМАНИЕ: Проведите все связанные с вирусом процедуры культивирования клеток in vitro на объектах с соответствующим обозначением уровня биобезопасности, таких как BSL2. Соответствующие средства индивидуальной защиты должны использоваться исследователями, которые обращаются с онколитическим вирусом в соответствии с руководящими принципами для учреждений животного происхождения 4 , 16 .
9. Загрузка стволовых клеток с помощью MicroN-размерные парамагнитные оксиды железа (MPIO) для отслеживания In Vivo с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ, рис. 3B -3H ) 2
- Чтобы маркировать стволовые клетки, добавьте MPIO в культуры стволовых клеток при ~ 80% слияния, в присутствии трансфекционного реагента для инкубации в течение ночи. Эффективность маркировки стволовых клеток (NSCs 4 или MSCs 2 ) с помощью MPIO (с красным конъюгированием) определяется проточной цитометрией.
- Чтобы визуализировать миграцию и распределение стволовых клеток в мозге глиомы-носителей, приобретите как многослойное взвешенное быстрое взвешенное T2 с высокой разрешающей способностью с помощью реверсивно-ускорительных спиновых эхо-изображений, так и многослойных градиентных эхо-последовательностей с быстрым низкоугловым снимком (FLASH) Оценивают структуру как с помощью корональной, так и осевой плоскостей мозга мыши 2 .
10. Интраназальная доставка терапевтических НСК ( рисунок 3D ) 2 , 4
- Культура и сбор NSC ( N NSC, H NSC, VSC NSC и CSCC4 NSC) согласно протоколу, описанному в разделе 3.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все процедуры для животных, в которых используются NSC, нагруженные OV, должны выполняться на объектах с соответствующим обозначением уровня биобезопасности, таких как установки BL2 или BSL2. - Анестезируйте мышей с помощью инъекции кетамина и ксилазина в соответствии с этапом 3.6.
- Поместите мышей на чистую драпировку вверх, используя нагревательную подушку внизу, чтобы поддерживать температуру тела. Отрегулируйте подушечку из проложенных бумажных полотенец лентами, чтобы обеспечить вертикальный угол ноздрей при размещении под головкой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ. Предварительная обработка гиалуронидазы (всего 100 мкА в виде четырех повторных прививок с 5-минутными интервалами, 3 мкл в каждой ноздре) носовойПителий был описан ранее 2 , 17 . - Используя микропипетку, распределите 2 мкл суспензии NSC для каждой ноздри мыши. Визуально подтвердите аспирирование капли перед тем, как перейти к следующей мыши. Общее количество доставленных ячеек может быть определено пользователем; Используйте 62 500-125000 клеток / мкл, так что 0,5-1 млн клеток могут быть доставлены в дозах 4 х 2 мкл.
- Используйте таймер для обеспечения 5-минутных интервалов между каждым назначением суспензии клеток, до 4 раз.
- Позвольте животным восстанавливать подвижность в камере восстановления, при этом положение лежа на спине поддерживается повсюду.
11. Анализ выживания ( рисунок 3Е )
- Введите данные о продолжительности жизни животных в статистическом программном обеспечении и выполните статистические сопоставления с использованием теста логарифмического ранжирования со следующими значениями: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.
12. Сбор тканей и гистология / Иммуноцитохимия. Проверка вставки мозгового стержня в стенку 2 , 4
- В конце исследования мы проводим эвтаназию мышей по протоколам, одобренным IACUC. Стандартная практика заключается в использовании камеры CO 2 с контролируемой скоростью потока, чтобы принести в жертву животных в качестве основной стратегии эвтаназии, за которой следует кровоподтекание путем перфузионной фиксации.
- Сразу после того, как вы жертвуете, выполняйте внутрисердечную перфузию с PBS на животном, чтобы обеспечить удаление остатков крови из кровеносных сосудов и сохранение тканей для последующего гистологического анализа.
- Поместите CO 2 -увеличенное животное поверх абсорбирующей подушечки в положении лежа на спине, продолжайте лапаротомию, чтобы выставить диафрагменную мышцу, которая рассечена вместе с грудной клеткой, чтобы выставить сердце.
- После маКороль ник на правом атриуме с помощью пары ножниц для вскрытия, ускорьте кровоизлияние с 3-5 мл инъекции PBS через левый желудочек на вершине. Внедрить ледяной 4% параформальдегид (PFA) в кровоток с использованием шприца; Периферические мышечные спазмы обеспечивают визуальное подтверждение того, что в кровообращении нет серьезной блокировки, которая предотвратила бы правильную фиксацию ткани.
- Хирургически удалите головку тушки и сохраните ее в 50 мл центрифужной пробирке в 4% PFA при 4 ° C в течение ночи. Измените раствор до 30% сахарозы на следующий день до вскрытия мозговой ткани еще через 24 часа.
- Вставьте мозговую ткань в соединение OCT и заморозить замораживание на изопентане на сухом льду. Выполните криосистему результирующего тканевого блока для получения секций ткани 10-20 мкм для применения в гистологии и иммуноцитохимии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как гиперксическая предварительная обработка ( фиг. 4А ) 4, так и сверхэкспрессия CXCR4 ( фиг. 4B и 4C ) 4 значительно усиливают присутствие клеточной мембраны рецепторов CXCR4, как показано проточной цитометрией. Опухолевый тропизм, продемонстрированный НСК (синие стрелки), показан в гистологии опухолевой ткани (красный круг). Присутствие в опухоли MPIO-меченых ( рис. 4D ) стволовых клеток подтверждается окрашиванием прусскими голубыми ( рис. 4Е ). 4
Анализ ткани показывает, что облучение только на голове ( фиг. 2 ) вызывает уменьшение объема опухоли, а также повышение активности SDF-1 в опухоли и окружающих тканях ( фиг. 5A и 5B )4, что подтверждает гипотезу о том, что экспрессируемая рецептором CXCR4 рецептор в NSC может способствовать опухолевому тропизму после XRT.
Анализ выживаемости показывает, что, хотя облучение (XRT) само по себе является полезным для выживания животных, несущих опухоль ( рис. 6A ) 4 , дополнительные преимущества могут быть достигнуты с использованием H NSC, нагруженных OV над N NSC, нагруженных OV в контексте XRT ( рисунок 6B ) 4 . Значительные преимущества выживания можно также наблюдать с помощью генетически модифицированных NSC в CXCR4 в одном и том же контекстуальном терапевтическом режиме ( рис. 6C ) 4 .
Анализ тканей подтверждает, что как H NSC, так и NSCs CXCR4 значительно улучшили доставку OV, нацеленной на опухоль, как показано sta( Фиг.7А и 7В ) 4 .
Рисунок 1: Схематическая схема работы общих процедур для животных. ( A ) Модели опухолей создаются с помощью ксенотрансплантата клеток глиомы, полученных из пациентов. ( B ) Наблюдается рост опухоли через BLI. ( C ) Допускается облучающая терапия только для головы, как описано в процедуре 6. ( D ) Положение супинации и наклона головы поддерживается во время доставки терапевтических интраназальных стволовых клеток, как описано в процедуре 11. ( E ) Мониторинг выживаемости после терапии, небольшое животное Визуализация и гистологический анализ ткани при необходимости. Нажмите здесь, чтобы посмотретьБолее крупная версия этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка животных для облучения. Анестезируемые мыши располагаются между свинцовыми экранами внутри лотка для образцов, что позволяет облучать только голову. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема потока для процедур подготовки общих стволовых клеток, принятых до интраназальной доставки. ( AC ) Гипоксическая предварительная обработка или генетические модификации стволовых клеток для сверхэкспрессии CXCR4. ( BD ). Стирка, ферментативная диссоциация, сбор клеток и этапы счета заОбразованный для последующей загрузки стволовых клеток терапевтическим или диагностическим грузом. ( E ) Терапевтические реагенты, такие как онколитические вирусы или диагностические индикаторы, такие как частицы MPIO, могут быть загружены в собранные стволовые клетки в соответствующих концентрациях с периодическим встряхиванием и мягким перемешиванием ( F ). ( GI ) Затем загруженные стволовые клетки можно промыть и подсчитать для интраназальной доставки мышам. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ модификаций стволовых клеток для экспрессии CXCR4 и загрузки MPIO. ( AC ) проточную цитометрию можно проводить для проверки фенотипических модификаций стволовых клеток в результате гипоксической предварительной обработки или генетическоймашиностроение. (Подробнее см. В Dey et al., 4 ) ( DE ). Обнаружение успешной загрузки MPIO стволовых клеток и результатов in vivo может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии и окраски прусского синего, соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гипотеза о том, что облучение способствует восстановлению SDF-1 (зеленые сигналы) в глиоме и окружающей ткани С помощью гистопатологии и иммуноцитохимии тканей. Облучение увеличивает экспрессию SDF-1 в ксенотрансплантате GBM43. Анализ H & E-окрашивания и иммуноцитохимии секций ткани головного мозга от контрольных и облученных мышейУменьшает опухолевую нагрузку, но повышает уровень SDF-1 на опухолевых участках после лечения XRT. ( A ) Экспрессия SDF-1 (зеленая) сильно локализована на участке опухоли (белые ящики) после XRT. ( B ) Денситометрическая количественная оценка полей обзора демонстрирует четырехкратное увеличение экспрессии SDF-1 у животных, обработанных XRT, по сравнению с контрольными животными (n = 3 эксперимента, *** p <0,001, t-тест Стьюдента). Подробности можно найти в Dey et al. 4 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Преимущества выживаемости модифицированных НСК наблюдались (подробности можно найти в Dey et al., 4 ). ( A ) Был определен контекст терапевтических преимуществ XRT (*** p <0,001, тест рангового теста). ( B ) Гипоксическая предварительная обработка стволовых клеток, нагруженных OV, повышает выживаемость животных (* p <0,05). C. Генетическое улучшение CXCR4 дополнительно улучшает выживаемость животных (** p = 0,0013). Подробности можно найти в Dey et al. 4 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Подтверждение доставки OV с помощью HN-оксидов с Hypoxia- или CXCR4-усилением к опухолевым ксенотрансплантатам головного мозга достигается с помощью обнаружения вирусного гексонового белка с помощью иммуноцитохимии (зеленые точки) секций тканей от мозгов мышей, обработанных либо H A ) или CXCR4 NSC ( B ), *** p <0,001 t тест. Подробности можно найти в Dey et al. 4 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя интраназальный путь доставки лекарств широко изучен для небольших молекул, наномедицинов и белковых соединений 18 , применение терапевтических стволовых клеток для нацеливания опухолей внутрипозвоночного мозга является очень новым в спектре терапевтических опухолей головного мозга в процессе развития 2 , 3 , 4 . Существуют внутренние сложности, связанные с поведением стволовых клеток в полости носа, а молекулярные детали все еще остаются неясными. Размер стволовых клеток и их механизмы распределения вдоль черепных нервов резко отличаются от размеров неклеточных биологических или малых молекул, и в настоящее время мы занимаемся подробными механистическими исследованиями, связанными с поведением терапевтических стволовых клеток в носовом эпителии. Молекулярные взаимодействия, включающие профили экспрессии рецептора поверхностных цитокиновых рецепторов стволовых клеток, а также внеклеточный матрикс(ECM), такие как интегрин, исследуются, чтобы пролить свет на основы интраназального входа в мозг стволовых клеток. Критические этапы в текущем протоколе многообразны: 1) правильное установление ксенографа внутричерепной глиомы, поскольку изменения в расположении опухоли и моделях роста могут влиять на хемотаксис, который НСК используют для миграции в сторону опухоли; 2) Надлежащая подготовка НСК и их состояния здоровья и фенотипов, которые влияют на хемотаксическое миграционное поведение; 3) Адекватная подготовка носовой полости с гиалуронидазой, которая, как было продемонстрировано, улучшает миграцию стволовых клеток из полости носа в мозг 17 ; И 4) Корректная опорная поза мышей при доставке интраназальных стволовых клеток, чтобы предотвратить потерю клеток за пределами ноздрей, а также уход за животными после ухода за НСК. МРТ 2 или методы визуализации на основе радиосигналов 13 у живых животных могут быть применены для E в реальном времени оценка миграции стволовых клеток in vivo после интраназальной доставки.
Для доклинического исследования с использованием моделей на животных существуют ограничения для прогнозирования терапевтического результата при переводе в клинические исследования пациентов с пациентами. Существуют существенные различия в схемах распределения конечности черепно-мозговых нервов между грызунами и людьми 19 , 20 ; Таким образом, стратегии, направленные на то, чтобы направлять терапевтические стволовые клетки для распространения по сетям нервного окончания, более важным для проникновения человеческого мозга через интраназальный маршрут, должны быть в центре внимания будущих исследований. Эти данные являются ключом к успешным усилиям в области клинического перевода, а принципы, описанные здесь, необходимы для создания основы для дальнейшей диверсификации параметров исследования, предназначенных для различения молекулярных сигналов, а также функциональных и анатомических различий между моделями мыши и спецификой применения человека.
В этой экспериментальной демонстрации основных принципов использования мышиных PDX-моделей глиомы человека мы показываем потенциал для разнообразных стратегий для усиления опухолевого тропизма hNSC посредством гипоксической предварительной кондиции и генетического улучшения в хемотропизме, стимулирующего экспрессию рецептора CXCR4 для нацеливания на опухоле- Ассоциированных с цитокинами. Значимость этого всестороннего описания метода доставки интраназальных терапевтических стволовых клеток очевидна, поскольку это первый пошаговый протокол, описывающий альтернативную стратегию доставки терапевтических стволовых клеток в центральную нервную систему (ЦНС) без инвазивных подходов, как правило, Требуются для расстройств ЦНС. Мы стремимся создать надежную экспериментальную терапевтическую платформу на переднем крае лекарственной медицины для злокачественных опухолей головного мозга, так что более широкие механистические детали могут возникнуть в результате широкого исследования исследований в научном сообществе. Будущие расширенные применения для лечения расстройств ЦНС широкого спектра Сложность и механистическое разнообразие могут bИсследованы исследователями в соответствующих областях.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для объявления.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R01NS087990 (MSL, IVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
- Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
- Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
- Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
- Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
- Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
- Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
- Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
- Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
- Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
- World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
- NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
- Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
- Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
- Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
- Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).
