Summary
Wij presenteren een gedetailleerde methode om de menselijke placenta fysiologie in vivo op termijn te bestuderen. De methode combineert bloedmonsterneming van de inkomende en uitgaande vaten op de moeder- en foetale zijkanten van de placenta met ultrasone metingen van volume bloedstroom en placenta weefselmonstering.
Abstract
De menselijke placenta is zeer ontoegankelijk voor onderzoek, terwijl het nog steeds in de utero staat . Het huidige begrip van de humane placenta fysiologie in vivo is derhalve grotendeels gebaseerd op dierstudies, ondanks de grote diversiteit tussen de soorten in de anatomie van de placenta, de hemodynamica en de duur van de zwangerschap. De overgrote meerderheid van menselijke placenta studies zijn ex vivo perfusie studies of in vitro trofoblast studies. Hoewel in vitro studies en diermodellen essentieel zijn, is extrapolatie van de resultaten van dergelijke studies naar de menselijke placenta in vivo onzeker. We streven ernaar om menselijke placenta fysiologie in vivo op termijn te bestuderen en een gedetailleerd protocol van de methode te presenteren. Het gebruik van de intraabdominale toegang tot de baarmoeder ader net voor de baarmoeder incisie tijdens de geplande keizersnede verzamelen we bloedmonsters van de inkomende en uitgaande vaten op de moeder- en foetale zijkanten van de placenta. Bij het combineren van conCentratiemetingen uit bloedmonsters met volumeblodstroommetingen, kunnen we de plaatselijke en foetale opname kwantificeren en vrijkomen van een verbinding. Bovendien kunnen plasentale weefselmonsters uit dezelfde moeder-fetusparen metingen inleveren van transportdichtheid en -activiteit en andere aspecten van placentale functies in vivo . Door dit integratieve gebruik van de 4-vaten bemonsteringsmethode kunnen we in vivo een aantal van de huidige concepten van overdracht en metabolisme van de placenta-nutriënten testen, zowel bij normale als pathologische zwangerschappen. Bovendien maakt deze methode de identificatie van door de placenta uitgescheiden stoffen aan de moedercirculatie mogelijk, wat een belangrijke bijdrage kan leveren aan het zoeken naar biomarkers van placenta dysfunctie.
Introduction
Volgens de National Institutes of Health, USA, is de placenta het minst begrepen orgaan in het menselijk lichaam 1 , 2 , 3 . Het is moeilijk om de menselijke placenta in vivo te openen en te bestuderen zonder onethische risico's op de lopende zwangerschap op te leggen. Studies van placenta functie in de mens zijn daarom grotendeels gebaseerd op in vitro en ex vivo modellen. De meeste van de vorige in vivo studies van placenta transport en metabolisme zijn uitgevoerd in dieren 4 , 5 , 6 . Aangezien de structuur en de functies van de placenta echter sterk verschillen tussen soorten, moet extrapolatie van de resultaten van dieren naar mensen met voorzichtigheid worden gedaan. Slechts een paar kleinere menselijke in vivo onderzoeken hebben de placentale en foetale opname onderzocht en vervoerd onder normale fysiologischeAlle omstandigheden, en niemand heeft de geïntegreerde overdracht van verscheidene verbindingen 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 onderzocht. Deze fundamentele studies illustreren dat in vivo studies van de menselijke placenta haalbaar zijn en dat ze verschillende doeleinden kunnen dienen. In de eerste plaats kunnen huidige concepten van placenta-functies die hoofdzakelijk afkomstig zijn van in vitro , ex vivo en dierstudies in een menselijke omgeving worden getest en aldus nieuw en meer specifiek inzicht verschaffen aan de menselijke placenta. Ten tweede kunnen eigenschappen van de dysfunctionele placenta geassocieerd met afwijkende foetale groei, preeclampsie, moederdiabetes, metabolisch syndroom en andere materiële metabolische stoornissen beter worden gekenmerkt. Ten derde bieden menselijke in vivo studies de mogelijkheid om diagnoses te ontwikkelenTic en predictieve instrumenten van de placenta functie.
Op deze achtergrond streven we naar een uitgebreide verzameling fysiologische gegevens om de menselijke placenta functie in vivo te onderzoeken . Tijdens een geplande keizersnede exploiteren we de intraabdominale toegang tot de baarmoedervlies om bloedmonsters van de inkomende en uitgaande vaten op de moeder- en foetale zijkanten van de placenta te verzamelen (de bemonsteringsmethode met 4 vaten). Deze monsters worden gebruikt om de gepaarde arteriovenous concentratieverschillen van voedingsstoffen en andere stoffen 14 te berekenen. Daarnaast meten we de volumeblodstroom aan beide zijden van de placenta door middel van echografie. Bijgevolg kan placentale en foetale opname van elke verbinding worden gekwantificeerd. Verder is het mogelijk om stoffen die vrijkomen van de placenta aan de materiële en foetale circulaties 15 , 16 , 17 te bepalen . Wanneer combinerenD met klinische parameters van moeder en kind, en analyses van placenta en andere relevante weefsels, heeft deze methode het spannende potentieel om veel aspecten van placenta functies in vivo in dezelfde moederfostusparen te integreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de gegevensbeschermingsambtenaren van het Universitair Ziekenhuis van Oslo en het regionale comité voor medische en gezondheidsnavorsingsethiek, Zuid-Noorwegen 2419/2011. Alle deelnemers hebben een schriftelijke geïnformeerde toestemming ondertekend bij opname.
1. Voorbereidingen
OPMERKING: een tijdlijn voor de procedures is omschreven in figuur 1 .
Figuur 1 : Flowchart waarin de timing en het personeel betrokken zijn in de 4-vaartmonsteringsprocedure.
Eén kleur vertegenwoordigt één persoon. Gedetailleerde beschrijving van de methode is gegeven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Personeel
- Bereid de apparatuur voor, 50 ml ijskoude 1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 25 ml koude RNA stabiliserende oplossing en 5 x 0,5 ml optimale snijtemperatuurverbinding (OCT). Benoem de vacutainers en buizen. Zie voorlopige lijst van apparatuur.
2. Moederlijke kenmerken
- Noteer de klinische en niet-klinische eigenschappen van de moeder bij opname en herhaal relevante vragen en ikAsurements, inclusief gewicht, op het moment van levering. Noteer de duur van de vastenperiode voorafgaand aan de keizersnede en eventuele hypotensive episodes die tijdens de operatie plaatsvinden.
Opmerking: Inclusief de minimale materiële klinische dataset die is gerapporteerd in een recente publicatie van Global Gravity CoLaboratory (COLAB). Dit artikel bevat ook enkele zeer belangrijke aspecten bij het kiezen van studiepopulaties en moet worden aangepakt tijdens het plannen van de studie 18 . - Overweeg paternal karakteristieken, inclusief etniciteit, leeftijds- en lichaamsmassa index (BMI).
3. Echografie
- Doe het Doppler echografieonderzoek op de dag van de aflevering, met de vrouwen in een vastende toestand. Voer het onderzoek uit tijdens een periode van foetale stoornis, waarbij de vrouw in semi-rugleuning staat, zijt zij een beetje zijdelings tegenover het gebied van belang om de compressie van de aorta en vena cava te vermijden. Monitor de uitvoer inTenslotte door de mechanische en thermische indices op het display.
- Naaldvlies
- Visualiseer de navelvlies in een sagittale of schuine transectie van de foetale buik. Meet de diameter van het inwendige vaartuig in het rechte gedeelte van de intra-abdominale navelvlies, vóór eventuele zichtbare takken. Gebruik regelmatige B-modus en visualiseer het vat in een loodrechte hoekhoek voor diametermetingen en houd een aantal optimale frames voor latere metingen om het effect van veranderingen in de pulsatiele diameter te minimaliseren.
- Herhaal de maten vijf tot tien keer 19 .
- Op dezelfde plek gebruik Doppler-echografie en pas de sonde aan om zo weinig mogelijk een inspronghoek te krijgen (altijd <30 °) om de gemiddelde snelheid (TAMX) te meten. Verkrijg de snelheid over een periode van 3 - 5 s (niet-pulserende stroming).
- Visualiseer de navelvlies in een sagittale of schuine transectie van de foetale buik. Meet de diameter van het inwendige vaartuig in het rechte gedeelte van de intra-abdominale navelvlies, vóór eventuele zichtbare takken. Gebruik regelmatige B-modus en visualiseer het vat in een loodrechte hoekhoek voor diametermetingen en houd een aantal optimale frames voor latere metingen om het effect van veranderingen in de pulsatiele diameter te minimaliseren.
- Uterine arterie
- Gebruik DopplerEchografie om de uterine arterie te visualiseren als het de buitenste iliac arterie overschrijdt, onmiddellijk nadat het uit de inwendige iliaire slagader vertakt. Stel de sonde op deze site aan om een lage invalshoek te krijgen (altijd <30 °) en meet TAMX. Verkrijg de snelheid als de gemiddelde snelheid van drie hartcycli.
- Aangezien het onwaarschijnlijk is om een loodrechte hoek te krijgen op dezelfde plaats als TAMX wordt gemeten, volg het schip distaal om een juiste hoek te krijgen voor diametermetingen zo dicht bij de plaatsen met diametermetingen als haalbaar. Uitsluit de diametermetingen als er zichtbare vaten vertrekken voor deze site, zoals geëvalueerd door Doppler ultrasound.
- Gebruik regelmatige B-modus en visualiseer het vat in een loodrechte hoekhoek voor diametermetingen en houd een aantal optimale frames voor latere metingen om het effect van veranderingen in de pulsatiele diameter te minimaliseren.
- Herhaal de maten vijf tot tien keer 19 .
- Let op de positie van de placenta.
4. 4-vaten Bloedmonsterneming
OPMERKING: De tijdlijn voor de procedures is omschreven in figuur 1 en een overzicht van de monsters is geïllustreerd in figuur 2 .
Figuur 2 : Schematische illustratie van de Placental Vasculature en de bemonsteringssites.
In de 4-vaten bemonsteringsmethode worden bloedmonsters getrokken uit de baarmoederader, de radiale slagader (als proxy voor de baarmoederartherapie) en de navelstrengaders en ader. Bloedstroom in de baarmoederartherapie en de navelvlies wordt gemeten door middel van echografie. Weefselmonsters uit de placenta worden verzameld. Illustratie: Øystein H. Horgmo, Universiteit van Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
- Veiligheidsprocedures
- Zorg voor alle medewerkers in het operatie theater met handschoenen, chirurgische scrubpakken, maskers en hoofdkleding.
- Breng de chirurgen en onderzoekspersoneel in contact met het operatieveld met chirurgische scrubpakken, maskers, hoofddeksels, jurken en dubbele handschoenen. Glazen zijn optioneel.
- Personeel verlenen van de bloedmonsters met handschoenen.
- Zorg voor personeel die de placenta monsters verwerkt met handschoenen en chirurgisch masker. Homogenisatie vereist het gebruik van kappen.
- Voorbereiding in de operatie theater
- Geef een briefing en geef de apparatuur aan aan alle medewerkers die de bemonstering zullen helpen voor het begin van de operatie.
- Adresseer de anesthesioloog en anesthesiologieverpleegkundige die zal helpen bij de noodzakelijke perifere arteriële en veneuze toegang en ervoor zorgen datGeen vloeistoffen worden intraveneus gegeven voor het monsterneming.
- Geef drie spuiten (10 ml) zonder naalden aan de persoon die bij het antecubitale aderproef en twee spuiten (een 20 ml en een 10 ml) en een bloedgasspuit (met heparine) bij de persoon die bij de radiale slagader helpt, helpen.
- Maak twee steriele spuiten (20 ml), vijf steriele spuiten (10 ml), drie "vlindernaalden" en twee bloedgasspuiten voor het operatieveld.
- Toegang tot bloedvaten.
- Volg de standaard procedure voor de keizersnede om perifere intraveneuze (iv) toegang te waarborgen.
OPMERKING: De antekubitale ader is de voorkeur omdat het gemakkelijker is om monsters uit deze site te trekken. - Plaats de radiale slagader bij de pols door middel van echografie of door palpatie. Na 0,5 ml subcutane lidocaïne analgesie, plaats een arteriële lijn in de radiale slagader. Verlaat de bemonstering van deze site in geval van drie mislukte invoegingen, ofAls de vrouw pijn ervaart tijdens de invoeging.
OPMERKING: Voer de chirurgische procedure van keizersnede uit volgens de standaard procedure. Alleen de aanpassingen die nodig zijn voor de bemonsteringsprocedure worden hieronder onderstreept.
- Volg de standaard procedure voor de keizersnede om perifere intraveneuze (iv) toegang te waarborgen.
- Moederbloedmonsters
OPMERKING: Verkrijg alle drie de bloedmonsters van de moeder (baarmoeder, radiale slagader en antecubitale ader) tegelijk voor de baarmoederinsnijding.- Voor de baarmoederader, na het openen van de buikholte, gebruik een retractor om de buikwand op te heffen en de hoofdtakken van de baarmoedervenen op de anterolaterale zijden van de baarmoeder bloot te leggen. Verkrijg bloed van de baarmoedertakken aan de zijkant als de placenta wanneer mogelijk of gebruik de meest prominente venexplexus als de placenta zich in de baarmoederbalk bevindt.
- Voeg een vlindernaald in op een bloedgasspuit in de baarmoedervlies met een hoek van ongeveer 30 graden en bloed door middel van zachte aspiratie om te vermijdenhemolyse. Terwijl u de iv-positie van de vlindernaald zorgvuldig vastzet, vervang de gevulde bloedgasspuit met een 20 ml en een 10 ml spuit achtereenvolgens.
OPMERKING: Optimale toegang wordt het beste verzekerd wanneer u aan de contralaterale zijde van de gekozen baarmoederader staat.
- Voeg een vlindernaald in op een bloedgasspuit in de baarmoedervlies met een hoek van ongeveer 30 graden en bloed door middel van zachte aspiratie om te vermijdenhemolyse. Terwijl u de iv-positie van de vlindernaald zorgvuldig vastzet, vervang de gevulde bloedgasspuit met een 20 ml en een 10 ml spuit achtereenvolgens.
- Voor de radiale slagader aspireren van de intra-arteriële lijn. Gooi de eerste 5 ml weg en haal vervolgens 3 ml in de injectiespuit voor de bloedgasanalyses, gevolgd door 3 ml in twee spuiten (20 + 10 ml).
- Voor de antekubitale ader, aspireren voorzichtig van de intraveneuze katheter. Gooi de eerste 5 ml weg en haal dan 30 ml in drie spuiten (10 ml) af.
- Voer een laatste inspectie van de steekproefplaats op de baarmoederaf voordat u de buik begint te sluiten.
- Voor de baarmoederader, na het openen van de buikholte, gebruik een retractor om de buikwand op te heffen en de hoofdtakken van de baarmoedervenen op de anterolaterale zijden van de baarmoeder bloot te leggen. Verkrijg bloed van de baarmoedertakken aan de zijkant als de placenta wanneer mogelijk of gebruik de meest prominente venexplexus als de placenta zich in de baarmoederbalk bevindt.
- Voetbloedmonsters
- Als het kind geboren is, haal het bloed onmiddellijk uit de navelstreng, zonder de navelstreng te klemmen of de placenta te leveren. Begin witH de spuit voor bloedgasanalyse en volg eventueel met drie 10 ml spuiten.
- Wanneer de arteriële monsters zijn bevestigd, klem het koord vast en breng het kind naar de vroedvrouw voordat u het monster uit de navelvlies (bloedgas en 20 + 10 ml injectiespuiten) verzamelt.
OPMERKING: Verkrijg alle navelmixmonsters binnen enkele seconden van de levering en met de placenta in situ, tenzij het spontaan is losgemaakt. - Volg de Noorse aanbevelingen over de late klemmen. In geval van een verdrietig kind, klem en snijd het snoer meteen en de hand het kind aan de vroedvrouw en de neonatoloog.
- Hantering van bloedmonsters
- Zet de bloedgasspuiten op ijs terwijl u de rest van de bloedmonsters voorbereidt en analyseer ze binnen 5 minuten in een bloedgasanalysator.
- Breng de bloedmonsters onmiddellijk over naar vacutainers en plaats de plasma buizen 1 tot 2 minuten op een tuimelaar voordat u ze op ijs zet. Laat de serumbuizen op de arbeidAtorische bank om 30 minuten te vestigen.
OPMERKING: Dit is een kritische stap in de procedure die extra aandacht vereist, omdat monsters uit alle vijf locaties tegelijkertijd moeten worden voorbereid om goede kwaliteit te waarborgen. - Centrifugeer de plasmamonsters zo snel mogelijk en binnen 30 minuten bij 6 ° C, 2.500 xg gedurende 20 minuten.
- Na 30 minuten centrifugeer de serummonsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 2.500 x g.
- Aliquot de supernatanten zorgvuldig aan 2 ml cryobuizen, waarbij 0,5 ml van de supernatant boven de pellet wordt gelaten om bloedplaatjesvrij plasma te waarborgen.
- Bewaar de monsters bij -80 ° C.
5. Inzameling van Placentale Weefsel
- Zet de placenta zo spoedig mogelijk na een aflevering op een ijskoelde dissectiebak. Foto en meet de langste diameter en de diameter op 90 graden.
- Weeg de placenta.
- Noteer het gewicht, de twee diameters, elke gRoss pathologie, aantal vaten in het koord en het tijdsinterval van de aflevering tot wanneer de placenta op ijs was geplaatst.
OPMERKING: Stuur de placenta naar patologisch onderzoek als klinisch aangegeven. - Plaats de placenta met het moederoppervlak naar boven en identificeer 4 - 5 bemonsteringsplaatsen die willekeurig in elk kwadrant van de placenta zijn gelegen, waarbij gebieden van frank pathologie voorkomen worden. Verwijder de decidua met behulp van een schaar om 3 - 5 mm van het moederoppervlak af te snijden. Verzamel een 1 - 2 cm 3 stuk wild weefsel uit elke site.
- Was het verzamelde weefsel zachtjes in 50 ml koude 1M PBS. Verdeel in verschillende stukken van elke steekproefplaats en aliquot.
Opmerking: De grootte van de placenta-stukken zal afhangen van de geplande analyses. - Voeg aliquots van 0,1 - 0,5 cm 3 weefselmonsters toe aan 5 cryobuizen en snap in vloeibare stikstof.
- Voeg kleine stukken van 0,1 - 0,2 cm 3 aan de buis toe met 25 ml RNA stabilisatieoplossing. Opslaan bij 46, C gedurende 24 uur, verwijder de RNA-stabilisatieoplossing en vervang deze. Bevriezen.
- Voeg stukken 0,5 cm 3 aan de 5 cryobuizen toe met 0,5 ml OCT, vul de OCT op, meng en vries.
- Bewaar de monsters bij -80 ° C tot analyse.
OPMERKING: Burton et al. Biedt een uitstekend overzicht van de praktische aspecten van de steekproeven, afhankelijk van de geplande analyses. 20 Overweeg het resterende weefsel voor de isolatie van de microveuze en basale membranen te bereiden en om decidueel weefsel te verzamelen door middel van vacuümzuigtechniek. 21 , 22
6. Neonatale kenmerken
- Noteer de neonatale eigenschappen, waaronder Apgar-score (1, 5 en 10 min), geslacht, gewicht, lengte, zwangerschapstijd en toegang tot pasgeboren intensieve zorg eenheid (lengte en uitkomst van verblijf).
- Overweeg het meten van de neonatale lichaamsamenstelling door antropometrische metingen, luchtverplaatsingMentale plethysmograaf of dubbele röntgenabsorptiometrie. 23 , 24
7. Berekeningen
- Veronderstel een soortgelijke bloed samenstelling in de radiale en uterine arterie en bereken het uteroplacente arteriovenous concentratieverschil.
Uteroplacental arteriovenous concentratieverschil = C A - C V
Variabel veneuze arteriële concentratieverschil = C v - C a
Waar C concentreert met abonnementen: A, de radiale slagader; V, de baarmoeder ader; V de navelvlies en a, de navelstrengader. - Bereken de volume bloedstroom, ml / min (Q):
Waar D de diameter van het vat is (cm), is TAMX de gemiddelde snelheid van de gemiddelde snelheid en h is de coëfficiënt voor het ruimtelijke bloedsnelheidsprofiel. Gebruik 0,5 als de coëfficiënt voor de navelvlies en0,6 voor de baarmoederslagader 25 , 26 . - Bereken de opname van de placenta en los volgens Fick's principe:
Uteroplacale opname = ( C A - C V ) x Qm
Fetale opname = ( C v - C a ) x Qf
Abonnementen: m, moeder en f, foetus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bemonsteringsmethode met 4 vaten is van toepassing in de klinische praktijk en we hebben succesvolle bloedmonsters verkregen uit 209 moeder- / zuigelingenparen. In 128 van deze hebben we ook bereikt om de volume bloedstroom te meten. Volledige sampling van 4 vaten en goede kwaliteitsmetingen van zowel moeder- als foetale vaten werden verkregen in 70 moeder-fetusparen ( Figuur 3 ). Daarnaast hebben we tot nu toe bloed- en placenta-monsters verzameld van 30 preeclamptische patiënten. We hebben eerder artikelen gepubliceerd over de overdracht van voedingsstoffen door de menselijke placenta, evenals de vrijgave van vasoactieve factoren, waarbij twee toepassingen van de methode 14 , 15 , 16 zijn aangetoond.
Voorbeeld van hoe de 4-vatenmethode wordt gebruikt om placenta-overdracht te studeren
Er zijn significante arteriOvige glucosevariaties aan beide zijden van de placenta die een in vivo uteroplacentale en foetale opname van glucose aantonen ( tabel 1 ). De plasentale overdracht van glucose hangt af van het moeder-foetale glucosegradiënt, en daardoor op het glucosegehalte van de moeder. We hebben echter eerder aangetoond dat deze gradiënt, en dus ook de glucoseoverdracht, significant beïnvloed wordt door ook foetale insuline niveaus en glucose verbruik. Dit is een voorbeeld van hoe deze methode belangrijke moeder-foetale interactie 14 illustreert.
| Vaartuig | Glucose mmol / L | p-waarde * |
| Polsslagader | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Uterine ader | 4,23 [3,94, 4,53] | |
| Naaldvlies | 3,78 [3,52, 4,06] | |
| Umbilische slagader | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Gekoppelde verschillen | ||
| Radiale slagader - baarmoeder ader | 0,29 [0,13, 0,41] | <0,001 |
| Umbilische slagader - navel | 0,54 [0,29, 0,76] | <0,001 |
| Radiale slagader - naveladerij | 1,25 [1,03, 1,51] | <0,001 |
Tabel 1: Median [Q1, Q3] Concentraties en Arterioveneuze Verschillen van Glucose
* Wilcoxon Signed-Rank test
De opname van de foetale glucose van (placenta afgifte naar) de navelstromingscirculatie wordt geacht niet alleen afhankelijk te zijn van oN het moeder-foetale gradiënt, maar op de bloedvloeistof van de placenta 5 . Evenzo kan het relevant zijn om de foetale glucose opname te bestuderen als een functie van placenta gewicht of geboortegewicht. In n = 128 vonden we een mediane [Q1, Q3] totale navelstrengveneuze stroom van 196,2 [158,3, 232,2] ml / min en berekende een mediane [Q1, Q3] foetale glucose opname van (placenta afgifte naar) de navelstromingscirculatie van 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normaliseerd voor geboortegewicht is dit gelijk aan 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. De placenta geeft 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) per kg placenta vrij.
Voorbeeld van hoe de 4-vatenmethode wordt gebruikt om de opname van de placenta te bestuderen
Dierstudies suggereren dat glutaminezuur belangrijk is bij zowel de interconversie van aminozuren in de placenta als de foetale lever en als oxidatieve brandstof in andere metabolische pathways 27 . Met behulp van de placenta 4-vaten bemonstering methode hebben we de u bestudeerdTeroplacentale en navelvormige arterioveneuze verschillen van glutaminezuur bij mensen ( tabel 2 ). We vonden een placenta opname (dus een foetale vrijgave) van glutaminezuur uit de navelstromingscirculatie. Verder vonden we een plasenta opname van glutaminezuur uit de moedercirculatie. Deze placenta opname uit beide circulaties is een voorbeeld van hoe de 4-vatenmethode kan worden gebruikt om in vivo in het mens te demonstreren dat de plasentale metabolisme van voedingsstoffen een onderdeel vormt van de regulatie van de transplacale overdracht.
| Vaartuig | Glutaminezuur μmol / L | p-waarde * |
| Polsslagader | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Uterine ader | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Naaldvlies | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Umbilische slagader | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Gekoppelde verschillen | ||
| Radiale slagader-uterine ader | 10,4 [1,6, 21,2] | <0,001 |
| Umbilische slagader - duivelse ader | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0,001 |
Tabel 2: Medianen [Q1, Q3] Concentraties en Arterioveneuze Verschillen van Glutaminezuur
* Wilcoxon Signed-Rank test
Voorbeeld van hoe de 4-vatenmethode wordt gebruikt om de vrijgave van de placenta te bestuderen
Het is vastgesteld dat de placenta progesteron afscheidt en om onze 4-vatenmethode aan de moederzijde van de placenta te valideren, hebben we de in vivo vrijgave van progesteron gemeten bij teRm 28 . We hebben een significante placenta-vrijstelling van progesteron gevonden voor de moedercirculatie ( tabel 3 ). Het waargenomen arteriovenous verschil demonstreert hoe de bemonsteringsmethode van de placenta 4-vaten kan worden gebruikt om stoffen vrij te geven die door de placenta zijn vrijgegeven, en is zeer relevant bij het bestuderen van pathologische zwangerschappen.
| Vaartuig | Progesteron nmol / L | p-waarde * |
| Polsslagader | 678 [514, 971] | |
| Uterine ader | 1852 [1059, 2786] | |
| Gekoppelde verschillen | ||
| Radiale slagader-uterine ader | -1187 [-1855, -404] | p <0.001 |
Tabel 3: Median [Q1, Q3] concentraties en uteroplacental arteriovenous verschil van progesteron
* Wilcoxon Signed-Rank test
Figuur 3 : Stroomschema's en illustratie van ingesloten en verloren deelnemers.
A. Toont de deelname van de deelnemers, waarbij wordt aangetoond dat deelnemers vooral kwijt zijn aan het begin van de arbeid voorafgaand aan de keizersnede of het gebrek aan voldoende personeel om de studie te verrichten. B. Van de 179 vrouwen met normale zwangerschappen (blauw) werden volledige bloedvaten in 162 (91%) complete bloedvaten verkregen (onvolledige bloedmonsters van bloedvaten: zwarte, onvolledige moederbloedmonsters: grijs). Vijfenvijftig (28%) deelnemers waren niet inbegrepen voor ultrasone metingen door logistieke beperkingen. Van de 128 deelnemers (72%) onderworpen aan echografie, bloedstroommetingen aan de foetale kant van de placenta werden verkregen bij alle deelnemers (lichtgroen), terwijl de volledige bloedstroommetingen bij zowel de moeder- als foetuszijde werden verkregen in 77 (60%) (donkergroen). Illustratie: Øystein H. Horgmo, Universiteit van Oslo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bemonstering methode van placenta 4-vaten is relevant voor drie hoofddoeleinden. Ten eerste kan het worden gebruikt om te bestuderen hoe specifieke stoffen door de placenta aan de moederzijde worden opgevangen en eventueel overgebracht worden naar de navelstroming en de foetus, zoals aangetoond door onze glucose- en aminozuurstudies. Ten tweede is de methode zeer relevant voor het bestuderen van stoffen die door de placenta zijn geproduceerd en worden vrijgegeven aan de moeder- of foetale circulaties, zoals blijkt uit de progesteronresultaten. Ten derde kan het nuttig zijn om te bestuderen hoe de foetus in vivo afvalstoffen elimineert tijdens de snelle groei en weefselhervorming.
Kritieke stappen en logistieke problemen van de 4-vaart methode
Placenta 4-vaten bemonstering is eerder gebruikt om de plasentransmissie van macronutriënten in vivo te bepalen bij normale fysiologische zwangerschappen 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, maar met een beperkt aantal studieonderwerpen. Het beperkte gebruik van de 4-vaten steekproef is waarschijnlijk te wijten aan de veeleisende logistiek van de procedure. Een succesvolle coördinatie tussen de patiënt, de onderzoekers en het personeel bij de afdelingen van foetale geneeskunde, verloskunde en anesthesiologie is essentieel om deze methode te gebruiken. Wij vinden het een groot voordeel geweest dat een aantal van de belangrijkste onderzoekers verloskundigen zijn, wetenschappelijke routines en sleutelpersoneel kennen. Daarbij zijn de studieprocedures geïmplementeerd naast de dagelijkse klinische praktijk. Door elke stap van de procedure te coördineren en te beveiligen, hebben we monsters verkregen van meer dan 200 moeder / pasgeboren paren. Bovendien is onze strategie om de steekproefprocedure op weinig handen te houden, omdat er technische uitdagingen zijn in de procedure die bepalend zijn voor het succesvolle resultaat van de steekproefneming, en te veel bemonsteringen kunnen onnodige bronnen van variatie van de gegevens introduceren. ConsequWe raden u aan om alle sonografische examens te laten uitvoeren door dezelfde examinator met dezelfde ultrasone machine. De uitrusting moet met zorg gekozen worden, aangezien de resolutie van de schipmuur cruciaal is. De baarmoederartherapieën in het derde trimester zijn bijzonder technisch uitdagend om te meten omdat de baarmoedergrootte en de inhoud het moeilijk maken om zowel de loodrechte insonatierichting van de diametermetingen te verkrijgen en de lage insonthoekhoek voor debietmetingen op de exacte zelfde plaats. Bovendien eist succesvolle bloedmonstering de identificatie van een passende bemonsteringsplaats van de baarmoederader en zachte aspiratie. Op de navelstreng heeft de fragiliteit van de foetale erytrocyten speciale aandacht nodig voor de aspiratiekracht. Het is onze ervaring dat vertraagde bezorging of kleine stress bij de zuigeling werd geassocieerd met vroege vernauwing van de navelstrengader, wat resulteerde in verminderde arteriële monstervolume.
Methodologische / Analytische problemen van de 4-vaten methode
Het is belangrijk verschillende methodologische problemen aan te pakken bij de interpretatie van de resultaten van een placenta 4-vaart studie. Ten eerste, als het de bedoeling is om de massa van een door de placenta opgenomen stof te berekenen of uit te geven, is het belangrijk om het volume van het bloed door te gaan. Het moet in gedachten worden gehouden dat de baarmoeder ader niet alleen de placenta afvoert, maar ook de baarmoederspier afvoert en dat de baarmoedervasculatuur in verschillende mate anastomoses met de eierstokken en vaginale vasculatuur. Vervolgens is het belangrijk om te overwegen dat de uitwisseling van water over de placenta de concentratie kan beïnvloedenRantsoenen gemeten en beïnvloeden daardoor de berekende arteriovenuze concentratieverschillen. Ideaal gezien wordt dit het beste aangepakt door het aanpassen van de concentratieverschillen voor het verloren of verdwenen water in elk moederfostuspaar. Dit kan worden bereikt door middel van het meten van een stof die niet wordt opgenomen of vrijgegeven door de placenta of de baarmoeder. De hemoglobine concentraties of berekende percentages van erytrocyten (hematocrit) kunnen dienen als correctiefactoren voor wateruitwisseling. Bij het interpreteren van opname of afgifte van verbindingen aan de moederzijde van de placenta kan het ook interessant zijn om arteriovenous verschillen in andere weefsels te verkrijgen ter vergelijking. We hebben daarom een bloedmonster van de antecubitale ader opgenomen om specifieke kenmerken van de placenta te karakteriseren door de arterioveneuze verschillen over de placenta te vergelijken met die van het capillaire bed van de onderarm. We vonden deze vergelijking bijzonder interessant toen we de placenta-vrijstelling van sFlt-1 en placentale groei fa testenCtor omdat systemische endotheelcellen een potentiële bron van deze verbindingen 14 kunnen zijn . Afhankelijk van de onderzoeksvraag is het van belang om de arterioveneuze verschillen te verdelen naar het gewicht van de placenta om de placentafficiëntie te berekenen, dwz in termen van (mmol / L) / kg of (mmol / min) / kg placenta.
Beperkingen en sterke punten van de 4-vaartmethode
Hoewel placentale fysiologie minder beïnvloed wordt door keizersnede dan door de stress van vaginale afgifte, zijn er verschillende beperkingen voor deze methode. Vaginale afgifte wordt aanbevolen in de meeste gevallen van complicaties van de zwangerschap (zoals preeclampsie, diabetes, obesitas en matige foetale macrosomia), die de werving kunnen beperken en voorspellen. Zelfs bij het optimaliseren van elke stap van de methode is het moeilijk om volledige metingen en monsters in elke patiënt te verkrijgen wegens de technische moeilijkheden in de bloedmonsternemingsprocedure en ultrageluid volUme flow metingen ( figuur 3 ). Bovendien, hoewel de echografie metingen zo dicht mogelijk bij de operatie worden uitgevoerd, worden ze inherent uitgevoerd voor de ruggenmerg en de bloedmonsterneming. Hieruit volgt dat de materiële hartuitgang (CO) kan veranderen en mogelijk invloed hebben op de uteroplacente (en zelfs feto-placentale) bloedstroom. De mogelijke verandering in CO veroorzaakt door spinale anesthesiaan wordt gecompenseerd door fenylefrine die in de huidige studie werd gebruikt. Voorlopige gegevens van een deelgroep van onze deelnemers (n = 23) tonen geen significante verandering in CO voor spinale verdoving en op het moment van bemonstering (ongepubliceerde data). Met behulp van de bemonsteringsmethode van 4 vaten bij mensen beperkt, in tegenstelling tot bij dieren, zowel de mogelijkheid om een tijdvariabele in te stellen en het bloedgehalte 5 , 29 , 30 te manipuleren. Uit deze overwegingen volgt dat het 4-vaartuig Bemonsteringsmethode is dwarsdoorsnede en grotendeels observaties van aard en de verkregen gegevens moeten dienovereenkomstig worden geanalyseerd. Aan de andere kant biedt de 4-vaten bemonsteringsmethode een unieke mogelijkheid om in vivo menselijke placenta-fysiologie en pathofysiologie te bestuderen, met alle interactieve factoren die aan het spel zijn, een situatie die nooit in vitro kan worden gereproduceerd. Het biedt een uitstekende kans om hypotheses te testen die voortvloeien uit dierlijke of andere experimentele studies. Evenzo kan het nieuwe hypothesen genereren die mechanistisch in vitro en in dierstudies moeten worden getest.
Potentiële toepassingen van de 4-vaten methode
Bij pathologische zwangerschappen zijn de moeder- en foetale arteriovenuze concentratieverschillen tot nu toe afzonderlijk bestudeerd en toegelaten voor het testen van enkele van de bestaande hypothesen in vivo 15 , 16 ,Ass = "xref"> 31. De bemonsteringsmethode met 4 vaten biedt de aantrekkelijke mogelijkheid om de moeder-, placenta- en foetale eenheid samen te bestuderen in plaats van als afzonderlijke entiteiten in pathologische zwangerschappen en kan nieuw licht werpen op zowel oude als nieuwe vragen binnen de reikwijdte van maternale-foetale interactie. De bemonsteringsmethode met 4 vaten kan toegepast worden op een breed scala van onderzoeksvragen in zowel normale als pathologische zwangerschappen, afhankelijk van de verdere analyses van de monsters. De keuze van vacutainers, het bloedvolume, het bereik van placenta en andere weefselmonsters moeten volgens de onderzoeksvraag worden beslist. Burton et al. Hebben onlangs een uitstekend papier gepubliceerd waarin procedures beschreven werden om goede kwaliteitsexemplaren van placenta weefsel te verzekeren en om verschillende biobanks te combineren om bepaalde puzzels aan te pakken die een groot aantal monsters vereisen die worden opgelost 20 . De monsters van 4 vaten kunnen worden geanalyseerd om de specifieke afgifte van exosomen naar moeders te bestuderenAl circulatie, de overdracht van medicijnen, metabolieten en toxines. Analyses met grootschalige omics (metabolomics, proteomics en lipidomics) hebben de mogelijkheid om stoffen en metabolieten in moederplasma te identificeren die door de placenta worden uitgescheiden. Daarbij kan de opzet van de 4-vaartig bemonsteringsmethode de placenta afgeleide factoren in de moedercirculatie identificeren en eventuele biomarkers van de placenta functie kunnen uitroeien. Gecombineerd met technieken om de moeder-geconfronteerde microveuze en foetale geconfronteerde basale plasmamembranen van de syncytiotrofoblast te scheiden, kan overdracht van een stof samen met de activiteit en de plaats van relevante transportproteïnen 21 worden onderzocht. Verder kunnen mechanismen reguleren overdracht nutriënt in vivo worden toegelicht aan nagegaan hoeveel voedingsstoffen en microvoedingsstoffen in de vier schepen en verbinden de overdracht van voedingsstoffen aan metingen van de nutriënt en energie detectiesysteem in de placenta 32 33 . Glucose-infusie voor levering is een andere mogelijke aanpak. Placentale overdracht kan verband houden met materiële metabolische variabelen zoals BMI-, glucose- en plasma lipideprofielen en op foetale resultaten zoals geboortegewicht en lichaamsamenstelling 18 . Samen zullen deze benaderingen mogelijk de integratieve rol van de placenta verlichten, in het midden van de wisselwerking tussen moeder- en foetale condities en behoeften liggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Eerst en vooral bedanken we de moeders die deelnamen aan dit project. Vervolgens erkennen we al het personeel dat de bemonsteringsprocedure, de anesthesioloog, de verpleegkundige anesthesioloog en de chirurgische verpleegkundigen heeft geholpen en vergemakkelijkt. Het project zou niet mogelijk zijn geweest zonder financiering van de Regionale Gezondheidsinstantie Zuidoost-Noorwegen en de Noorse Adviesgroep Vrouwengezondheid, Universiteit van Oslo en lokale financiering van het Universitair Ziekenhuis van Oslo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
- Jansson, T., Powell, T. L. Role of the placenta in fetal programming: underlying mechanisms and potential interventional approaches. Clin Sci (Lond). 113 (1), 1-13 (2007).
- Hanson, M. A., Gluckman, P. D. Early developmental conditioning of later health and disease: physiology or pathophysiology. Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).
- Guttmacher, A. E., Spong, C. Y. The human placenta project: it's time for real time. Am J Obstet Gynecol. 213, 4 Suppl 3-5 (2015).
- Battaglia, F. C., Regnault, T. R. Placental transport and metabolism of amino acids. Placenta. 22 (2-3), 145-161 (2001).
- Hay, W. W. Placental-fetal glucose exchange and fetal glucose metabolism. Trans Am Clin Climatol Assoc. 117, 321-339 (2006).
- Woollett, L. A. Review: Transport of maternal cholesterol to the fetal circulation. Placenta. 32, Suppl 2 218-221 (2011).
- Prenton, M. A., Young, M. Umbilical vein-artery and uterine arterio-venous plasma amino acid differences (in the human subject). J Obstet Gynaecol Br Commonw. 76 (5), 404-411 (1969).
- Cetin, I., et al. Plasma and erythrocyte amino acids in mother and fetus. Biol Neonate. 60 (2), 83-91 (1991).
- Filshie, G. M., Anstey, M. D. The distribution of arachidonic acid in plasma and tissues of patients near term undergoing elective or emergency Caesarean section. Br J Obstet Gynaecol. 85 (2), 119-123 (1978).
- Haberey, P. P., Schaefer, A., Nisand, I., Dellenbach, P. The fate and importance of fetal lactate in the human placenta -a new hypothesis. J Perinat Med. 10 (2), 127-129 (1982).
- Prendergast, C. H., et al. Glucose production by the human placenta in vivo. Placenta. 20 (7), 591-598 (1999).
- Metzger, B. E., Rodeck, C., Freinkel, N., Price, J., Young, M. Transplacental arteriovenous gradients for glucose, insulin, glucagon and placental lactogen during normoglycaemia in human pregnancy at term. Placenta. 6 (4), 347-354 (1985).
- Zamudio, S., et al. Hypoglycemia and the origin of hypoxia-induced reduction in human fetal growth. PLoS One. 5 (1), 8551 (2010).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Lorentzen, B., Michelsen, T. M., Henriksen, T. Placental glucose transfer: a human in vivo study. PLoS One. 10 (2), 0117084 (2015).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Henriksen, T., Michelsen, T. M. In vivo uteroplacental release of placental growth factor and soluble Fms-like tyrosine kinase-1 in normal and preeclamptic pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 781-782 (2016).
- Paasche Roland, M. C., Lorentzen, B., Godang, K., Henriksen, T. Uteroplacental arterio-venous difference in soluble VEGFR-1 (sFlt-1), but not in soluble endoglin concentrations in preeclampsia. Placenta. 33 (3), 224-226 (2012).
- Brar, H. S., et al. Uteroplacental unit as a source of elevated circulating prorenin levels in normal pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 155 (6), 1223-1226 (1986).
- Myatt, L., et al. Strategy for standardization of preeclampsia research study design. Hypertension. 63 (6), 1293-1301 (2014).
- Kiserud, T., Rasmussen, S. How repeat measurements affect the mean diameter of the umbilical vein and the ductus venosus. Ultrasound Obstet Gynecol. 11 (6), 419-425 (1998).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Illsley, N. P., Wang, Z. Q., Gray, A., Sellers, M. C., Jacobs, M. M. Simultaneous preparation of paired, syncytial, microvillous and basal membranes from human placenta. Biochim Biophys Acta. 1029 (2), 218-226 (1990).
- Staff, A. C., Ranheim, T., Khoury, J., Henriksen, T. Increased contents of phospholipids, cholesterol, and lipid peroxides in decidua basalis in women with preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 180 (3), Pt 1 587-592 (1999).
- Catalano, P. M., Thomas, A. J., Avallone, D. A., Amini, S. B. Anthropometric estimation of neonatal body composition. Am J Obstet Gynecol. 173 (4), 1176-1181 (1995).
- Ellis, K. J., et al. Body-composition assessment in infancy: air-displacement plethysmography compared with a reference 4-compartment model. Am J Clin Nutr. 85 (1), 90-95 (2007).
- Haugen, G., Kiserud, T., Godfrey, K., Crozier, S., Hanson, M. Portal and umbilical venous blood supply to the liver in the human fetus near term. Ultrasound Obstet Gynecol. 24 (6), 599-605 (2004).
- Acharya, G., et al. Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep. Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).
- Wu, X., et al. Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy. Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).
- Tuckey, R. C. Progesterone synthesis by the human placenta. Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).
- Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. Fetal metabolic response to maternal starvation. Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).
- Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. Insulin effect on fetal glucose utilization. Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).
- Bujold, E., et al. Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin. J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).
- Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing. Placenta. 33, Suppl 2 23-29 (2012).
- Cetin, I. Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).
