Summary
Nous présentons une méthode détaillée pour étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme. La méthode combine l'échantillonnage du sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta avec des mesures ultrasonores du flux sanguin volumique et de l'échantillonnage du tissu placentaire.
Abstract
Le placenta humain est très inaccessible à la recherche alors qu'il est encore in utero . La compréhension actuelle de la physiologie du placenta humain in vivo repose en grande partie sur des études sur les animaux, malgré la grande diversité des espèces en anatomie placentaire, l'hémodynamique et la durée de la grossesse. La grande majorité des études sur le placenta humain sont des études de perfusion ex vivo ou des études de trophoblastes in vitro . Bien que les études in vitro et les modèles animaux soient essentiels, l'extrapolation des résultats de ces études au placenta humain in vivo est incertaine. Nous avons visé à étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme et à présenter un protocole détaillé de la méthode. En exploitant l'accès intra-abdominal à la veine utérine juste avant l'incision utérine pendant la césarienne prévue, nous recueillons des échantillons de sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta. En combinant conDes mesures de centration à partir d'échantillons de sang avec des mesures du débit sanguin, nous sommes en mesure de quantifier l'absorption du placenta et du fœtus et la libération de tout composé. En outre, les échantillons de tissus placentaires provenant des mêmes paires mère-foetus peuvent fournir des mesures de la densité et de l'activité des transporteurs et d'autres aspects des fonctions placentaires in vivo . Grâce à cette utilisation intégrative de la méthode d'échantillonnage à 4 navires, nous sommes en mesure de tester certains des concepts actuels de transfert de nutriments placentaires et de métabolisme in vivo , à la fois chez les grossesses normales et pathologiques. En outre, cette méthode permet d'identifier les substances sécrétées par le placenta à la circulation maternelle, ce qui pourrait être une contribution importante à la recherche de biomarqueurs de dysfonctionnement du placenta.
Introduction
Selon le National Institutes of Health, aux États-Unis, le placenta est l'organe le moins compris dans le corps humain 1 , 2 , 3 . Il est difficile d'accéder et d'étudier le placenta humain in vivo sans imposer de contraintes éthiques sur la grossesse en cours. Les études de la fonction placentaire chez l'humain reposent en grande partie sur des modèles in vitro et ex vivo . La majorité des études antérieures in vivo sur le transport du placenta et le métabolisme ont été réalisées chez les animaux 4 , 5 , 6 . Cependant, comme la structure et les fonctions du placenta varient considérablement d'une espèce à l'autre, l'extrapolation des résultats des animaux aux humains doit être effectuée avec prudence. Seules quelques études humaines in vivo plus petites ont étudié l'absorption et le transport du placenta et du fœtus dans des conditions physiologiques normalesToutes les conditions, et aucun n'a exploré le transfert intégré de plusieurs composés 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Ces études fondamentales illustrent que les études in vivo du placenta humain sont réalisables et qu'elles peuvent servir à plusieurs fins. Tout d'abord, les concepts actuels de fonctions placentaires principalement dérivés d'études in vitro , ex vivo et animales peuvent être testés dans un milieu humain et fournir ainsi une vision nouvelle et plus spécifique du placenta humain. Deuxièmement, les propriétés du placenta dysfonctionnel associé à la croissance aberrante du foetus, la prééclampsie, le diabète maternel, le syndrome métabolique et d'autres troubles métaboliques maternels peuvent être mieux caractérisés. Troisièmement, les études humaines in vivo offrent l'occasion de développer le diagnosticTic et les outils prédictifs de la fonction placentaire.
Dans ce contexte, nous avons cherché à établir une collection complète de données physiologiques pour étudier la fonction placentaire humaine in vivo. Au cours d'une césarienne planifiée, nous exploitons l'accès intra-abdominal à la veine utérine pour recueillir des échantillons de sang provenant des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta (la méthode d'échantillonnage à 4 vaisseaux). Ces échantillons sont utilisés pour calculer les différences de concentration artérioveineuses appariées des nutriments et d'autres substances 14 . En outre, nous mesurons le débit sanguin du volume des deux côtés du placenta par ultrasons. Par conséquent, l'absorption placentaire et foetale de tout composé peut être quantifiée. En outre, il est possible de déterminer les substances libérées par le placenta aux circulations maternelle et fœtale 15 , 16 , 17 . Lorsqu'on combineD avec des paramètres cliniques de la mère et de l'enfant, et des analyses des tissus placentaires et d'autres tissus pertinents, cette méthode a le potentiel excitant d'intégrer de nombreux aspects des fonctions placentaires in vivo dans les mêmes paires mère-fœtus.
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Protocol
L'étude a été approuvée par les responsables de la protection des données à l'Hôpital universitaire d'Oslo et le Comité régional pour l'éthique de la recherche médicale et de la santé, Southern Norway 2419/2011. Tous les participants ont signé un consentement éclairé par écrit à l'inclusion.
1. Préparations
REMARQUE: une chronologie pour les procédures est décrite dans la figure 1 .
Figure 1 : diagramme décrivant le calendrier et le personnel impliqué dans la procédure d'échantillonnage à 4 navires.
Une seule couleur représente une personne. La description détaillée de la méthode est donnée dans le protocole. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Personnel
- Préparez l'équipement, 50 ml de solution salée tamponnée au phosphate 1 M (PBS), 25 ml de solution stabilisatrice d'ARN froide et 5 x 0,5 ml de composé de température de coupe optimal (OCT). Étiquetez les aspirateurs et les tubes. Voir la liste provisoire de l'équipement.
2. Caractéristiques de la mère
- Notez les caractéristiques cliniques et non cliniques maternelles à l'inclusion et répétez les questions pertinentes et moiLes précautions, y compris le poids, au moment de la livraison. Notez la durée de la période de jeûne avant la césarienne et tous les épisodes hypotensifs se produisant pendant la chirurgie.
Note: Inclure l'ensemble minimal de données cliniques maternelles signalé dans une publication récente de CoLaboratory Global de Grossesse (COLAB). Cet article comprend également des aspects très importants dans le choix des populations étudiées et devrait être abordé lors de la planification de l'étude 18 . - Envisager d'enregistrer les caractéristiques paternelles, y compris l'appartenance ethnique, l'âge et l'indice de masse corporelle (IMC).
3. Echographie
- Effectuez l'échographie Doppler le jour de la livraison, avec les femmes en état de jeûne. Effectuer l'examen pendant une période de quiescence foetale, avec la femme en position semi-supine, incliné légèrement latéralement en face de la région d'intérêt afin d'éviter la compression de l'aorte et de la veine cave. Surveiller la sortie dansLa tension par les indices mécaniques et thermiques sur l'affichage.
- Veine ombilicale
- Visualiser la veine ombilicale dans une transitoire sagittale ou oblique de l'abdomen fœtal. Mesurer le diamètre interne du vaisseau dans la partie droite de la veine ombilicale intra-abdominale, avant toute branche visible. Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d'insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l'effet des changements de diamètre pulsatile.
- Répétez les mesures de cinq à dix fois 19 .
- Sur le même site, utilisez l'échographie Doppler et ajustez la sonde pour obtenir un angle d'insonance le plus bas possible (toujours <30 °) afin de mesurer la vitesse maximale moyenne en temps (TAMX). Obtenir la vitesse sur une période de 3 à 5 s (débit non pulsé).
- Visualiser la veine ombilicale dans une transitoire sagittale ou oblique de l'abdomen fœtal. Mesurer le diamètre interne du vaisseau dans la partie droite de la veine ombilicale intra-abdominale, avant toute branche visible. Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d'insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l'effet des changements de diamètre pulsatile.
- Artère utérine
- Utiliser DopplerÉchographie pour visualiser l'artère utérine alors qu'elle traverse l'artère iliaque externe, immédiatement après qu'elle se ramifie de l'artère iliaque interne. Réglez la sonde sur ce site pour obtenir un faible angle d'insonance (toujours <30 °) et mesurez TAMX. Obtenez la vitesse comme vitesse moyenne de trois cycles cardiaques.
- Étant donné qu'il est peu probable d'avoir un angle perpendiculaire au même endroit que le TAMX, il faut suivre le vaisseau distalement pour obtenir un angle correct pour des mesures de diamètre aussi proches des sites de mesures de diamètre que possible. Exclure les mesures du diamètre si des vaisseaux visibles s'écoulent avant ce site comme évalué par échographie Doppler couleur.
- Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d'insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l'effet des changements de diamètre pulsatile.
- Répétez les mesures de cinq à dix fois 19 .
- Notez la position du placenta.
4. Échantillonnage de sang à 4 vaisseaux
REMARQUE: la chronologie des procédures est décrite à la figure 1 et une vue d'ensemble des échantillons est illustrée à la figure 2 .
Figure 2 : Illustration schématique de la vasculature placentielle et des sites d'échantillonnage.
Dans la méthode d'échantillonnage à 4 vaisseaux, des échantillons de sang sont tirés de la veine utérine, de l'artère radiale (en tant que vecteur de l'artère utérine) et des artères et des veines ombilicales. Le flux sanguin dans l'artère utérine et la veine ombilicale est mesuré par ultrasons. Des échantillons de tissus provenant du placenta sont collectés. Illustration: Øystein H. Horgmo, Université d'Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Les procédures de sécurité
- Fournir tout le personnel dans l'opération théâtre avec des gants, des combinaisons chirurgicales, des masques et des couvre-chefs.
- Fournir aux chirurgiens et au personnel de recherche en contact avec le champ d'opération avec des combinaisons chirurgicales, des masques, des couvre-chefs, des robes et des gants doubles. Les lunettes sont facultatives.
- Fournir au personnel qui manipule les échantillons de sang avec des gants.
- Fournir au personnel qui manipule les échantillons de placenta avec des gants et un masque chirurgical. L'homogénéisation nécessite l'utilisation de hottes.
- Préparation à l'opération Théâtre
- Donner un briefing et remettre l'équipement à tout le personnel qui aidera l'échantillonnage avant le début de la chirurgie.
- S'adresser à l'infirmière anesthésiologiste et anesthésiste qui aidera à l'accès artérielle et veineuse périphérique nécessaire et veillera à ce queAucun liquide n'est administré par voie intraveineuse avant l'échantillonnage.
- Donner trois seringues (10 mL) sans aiguilles à la personne aidant avec l'échantillon de veine antecubitale et deux seringues (une 20 mL et une 10 mL) et une seringue à sang (avec l'héparine) à l'aide de l'artère radiale.
- Préparez deux seringues stériles (20 mL), cinq seringues stériles (10 mL), trois "aiguilles papillons" et deux seringues à gaz pour le champ d'opération.
- Accès aux vaisseaux sanguins.
- Suivez la procédure standard avant la césarienne pour assurer l'accès intraveineux périphérique (iv).
NOTE: La veine antecubitale est préférable car il est plus facile de prélever des échantillons sur ce site. - Localiser l'artère radiale au poignet par ultrasons ou par palpation. Après 0,5 ml d'analgésie sous la lidocaïne sous-cutanée, placez une ligne artérielle dans l'artère radiale. Abandonnez l'échantillonnage de ce site en cas de trois insertions échouées, ouSi la femme éprouve de la douleur lors de l'insertion.
REMARQUE: effectuer la procédure chirurgicale de la césarienne selon la procédure standard. Seuls les ajustements nécessaires à la procédure d'échantillonnage sont soulignés ci-dessous.
- Suivez la procédure standard avant la césarienne pour assurer l'accès intraveineux périphérique (iv).
- Échantillons de sang maternel
NOTE: Obtenez les trois échantillons de sang maternel (veine utérine, artère radiale et veine antecubitale) simultanément avant l'incision utérine.- Pour la veine utérine, après avoir ouvert la cavité abdominale, utilisez un rétracteur pour soulever la paroi abdominale et exposez les branches principales des veines utérines sur les côtés antérolégéraux de l'utérus. Obtenir du sang dans les branches de la veine utérine du même côté que le placenta chaque fois que possible ou utiliser le plexus veineux le plus important si le placenta est situé dans la ligne médiane utérine.
- Insérez une aiguille de papillon sur une seringue de sang dans la veine utérine à un angle d'environ 30 degrés et collectez le sang par aspiration douce pour éviterL'hémolyse. Tout en garantissant soigneusement la position iv de l'aiguille papillon, remplacez la seringue à gaz remplie par une seringue de 20 mL et 10 mL consécutivement.
REMARQUE: L'accès optimal est mieux assuré lorsqu'il est debout sur le côté contralateral de la veine utérine choisie.
- Insérez une aiguille de papillon sur une seringue de sang dans la veine utérine à un angle d'environ 30 degrés et collectez le sang par aspiration douce pour éviterL'hémolyse. Tout en garantissant soigneusement la position iv de l'aiguille papillon, remplacez la seringue à gaz remplie par une seringue de 20 mL et 10 mL consécutivement.
- Pour l'artère radiale, aspirer à partir de la ligne intra-artérielle. Jeter les premiers 5 mL, puis aspirer 3 mL dans la seringue d'héparine pour les analyses de gaz sanguins, puis 3 mL dans deux seringues (20 + 10 mL).
- Pour la veine antecubitale, aspirer doucement du cathéter intraveineux. Jeter les premiers 5 mL, puis aspirer 30 mL dans trois seringues (10 mL).
- Effectuer une inspection finale du site d'échantillonnage sur la veine utérine avant de commencer à fermer l'abdomen.
- Pour la veine utérine, après avoir ouvert la cavité abdominale, utilisez un rétracteur pour soulever la paroi abdominale et exposez les branches principales des veines utérines sur les côtés antérolégéraux de l'utérus. Obtenir du sang dans les branches de la veine utérine du même côté que le placenta chaque fois que possible ou utiliser le plexus veineux le plus important si le placenta est situé dans la ligne médiane utérine.
- Échantillons de sang fœtal
- Lorsque l'enfant est né, aspirer immédiatement le sang de l'artère ombilicale, sans serrer le cordon ombilical ou administrer le placenta. Commencez l'espritH la seringue pour l'analyse des gaz sanguins et suivre avec trois seringues de 10 mL si possible.
- Lorsque les échantillons artériels sont sécurisés, serrer le cordon et remettre l'enfant à la sage-femme avant l'échantillonnage de la veine ombilicale (gaz de sang et 20 + 10 mL de seringues).
REMARQUE: Obtenez tous les échantillons ombilicaux en quelques secondes de l'accouchement et avec le placenta in situ à moins qu'il ne soit détaché spontanément. - Suivez les recommandations norvégiennes sur le serrage du cordon tardif. Dans le cas d'un enfant en difficulté, serrez et coupez le cordon immédiatement et laissez l'enfant à la sage-femme et au néonatologue.
- Manipulation des échantillons de sang
- Mettez les seringues de gaz sanguins sur de la glace tout en préparant le reste des échantillons de sang et analysez-les dans un analyseur de gaz sanguin dans les 5 minutes.
- Transférer immédiatement les échantillons de sang aux vacutainers et placer les tubes de plasma sur un rocker pendant 1 à 2 minutes avant de les mettre sur de la glace. Laissez les tubes de sérum sur le travailUn banc de règlement pour s'établir pendant 30 minutes.
REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique dans la procédure qui nécessite une attention particulière car les échantillons des cinq sites doivent être préparés simultanément pour assurer une bonne qualité. - Centrifuger les échantillons de plasma dès que possible et dans les 30 minutes, à 6 ° C, 2 500 xg pendant 20 min.
- Après 30 min, centrifuger les échantillons de sérum à température ambiante pendant 10 min à 2 500 x g.
- Aliquotez les surnageants avec soin dans 2 mL de tubes cryo, en laissant 0,5 mL du surnageant au-dessus de la pastille pour assurer un plasma exempt de plaquettes.
- Conservez les échantillons à -80 ° C.
5. Collecte de tissu plaquettaire
- Placez le placenta à plat vers le bas sur un plateau de dissipation refroidi par glace dès que possible après avoir été livré. Photographiez et mesurez le plus long diamètre et le diamètre à 90 degrés.
- Peser le placenta.
- Notez le poids, les deux diamètres, tout gLa pathologie de Ross, le nombre de vaisseaux dans le cordon et l'intervalle de temps entre la livraison et le moment où le placenta a été placé sur de la glace.
REMARQUE: Envoyer le placenta à l'examen pathologique s'il est indiqué cliniquement. - Placez le placenta avec la surface maternelle vers le haut et identifiez 4 à 5 sites d'échantillonnage situés au hasard dans chaque quadrant du placenta, en évitant les zones de pathologie franche. Retirez la décidua à l'aide de ciseaux pour couper 3 à 5 mm de la surface maternelle. Recueillir un morceau de tissu vilain de 1 à 2 cm 3 de chaque site.
- Lavez doucement le tissu récolté dans 50 ml de PBS froid 1 M. Diviser en plusieurs pièces de chaque site d'échantillonnage et une aliquote.
Remarque: La taille des pièces du placenta dépend des analyses planifiées. - Ajouter des aliquotes de 0,1 à 0,5 cm 3 échantillons de tissus à 5 tubes cryo et congélation instantanée dans de l'azote liquide.
- Ajouter de petits morceaux de 0,1 à 0,2 cm 3 au tube avec 25 ml de solution de stabilisation d'ARN. Magasin à 46; C pendant 24 h, jeter la solution de stabilisation d'ARN et la remplacer. Gel.
- Ajouter des morceaux de 0,5 cm 3 aux 5 tubes cryo avec 0,5 ml d'OCT, compléter avec OCT, mélanger et congeler.
- Conservez les échantillons à -80 ° C jusqu'à l'analyse.
NOTE: Burton et al. Fournit un excellent aperçu des aspects pratiques de l'échantillonnage du placenta en fonction des analyses prévues. 20 Considérez préparer le tissu restant pour l'isolement des membranes microvillées et basales, et pour collecter le tissu décalé par technique d'aspiration sous vide. 21 , 22
6. Caractéristiques néonatales
- Enregistrez les caractéristiques néonatales, y compris le score Apgar (1, 5 et 10 min), le sexe, le poids, la longueur, l'âge gestationnel et l'admission à l'Unité de soins intensifs du nouveau-né (durée et résultat du séjour).
- Envisager de mesurer la composition du corps néonatal par des mesures anthropométriques, déplacer l'airPléthysmographe ou double absorptiométrie des rayons X. 23 , 24
7. Calculs
- Supposons une composition sanguine similaire dans l'artère radiale et utérine et calculez la différence de concentration artérioveineuse uteroplacentale.
Différence de concentration artérioveineuse uteroplacentaire = C A - C V
Différence de concentration artérielle veineuse - artérielle = C v - C a
Lorsque C est la concentration avec les indices: A, l'artère radiale; V, la veine utérine; V la veine ombilicale et a, l'artère ombilicale. - Calculer le débit sanguin du volume, mL / min (Q):
Lorsque D est le diamètre du navire (cm), TAMX est la vitesse maximale moyenne en temps et h est le coefficient pour le profil spatial de la vitesse du sang. Utilisez 0,5 comme coefficient pour la veine ombilicale et0,6 pour l'artère utérine 25 , 26 . - Calculez l'absorption et la libération du placenta selon le principe de Fick:
Capture uteroplacentale = ( C A - C V ) x Qm
Absorption fœtale = ( C v - C a ) X Q f
Sous-rubriques: m, maternelle et f, foetale.
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Representative Results
La méthode d'échantillonnage à 4 navires s'applique à la pratique clinique et nous avons réussi à obtenir des prélèvements sanguins provenant de 209 couples mère / nourrissons. Dans 128 d'entre eux, nous avons également réalisé pour mesurer le débit sanguin du volume. L'échantillonnage complet de 4 navires et les mesures de débit de qualité des vaisseaux maternels et fœtaux ont été obtenus dans 70 paires mère-foetus ( figure 3 ). De plus, nous avons recueilli jusqu'à présent des échantillons de sang et de placenta chez 30 patients pré-éjactiques. Nous avons précédemment publié des articles sur le transfert placentaire humain de nutriments, ainsi que la libération placentaire de facteurs vasoactifs, démontrant deux applications de la méthode 14 , 15 , 16 .
Exemple de la façon dont la méthode à 4 navires est utilisée pour étudier le transfert du placenta
Il existe une artérielle significativeDes différences de glucose au four des deux côtés du placenta démontrant une absorption uteroplacentaire et fébrile in vivo du glucose ( tableau 1 ). Le transfert placentaire du glucose dépend du gradient de glucose maternel-foetal, et donc du taux de glucose maternel. Cependant, nous avons déjà démontré que ce gradient, et donc le transfert de glucose, sont également fortement influencés par les taux d'insuline fœtale et la consommation de glucose. C'est un exemple de la façon dont cette méthode illustre un important jeu inter-maternel-fœtal 14 .
| Navire | Glucose mmol / L | Valeur p * |
| Artère radiale | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Veine utérine | 4.23 [3.94, 4.53] | |
| Veine ombilicale | 3,78 [3,52, 4,06] | |
| Artère ombilicale | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Différences jumelées | ||
| Artérie radiale - veine utérine | 0,29 [0,13, 0,41] | <0,001 |
| Arme ombilicale - veine ombilicale | 0,54 [0,29, 0,76] | <0,001 |
| Artère radiale - artère ombilicale | 1,25 [1,03, 1,51] | <0,001 |
Tableau 1: Concentrations médianes [Q1, Q3] et différences artérioveineuses de glucose
* Wilcoxon Signed-Rank test
L'absorption de glucose foetal de (libération du placenta à) la circulation ombilicale est censée dépendre non seulement deN le gradient maternel-foetal, mais sur le flux sanguin placentaire 5 . De même, il peut être pertinent d'étudier l'absorption du glucose foetal en fonction du poids du placenta ou du poids à la naissance. Dans n = 128, nous avons trouvé un flux veineux ombilical total médian [Q1, Q3] de 196,2 [158,3, 232,2] ml / min, et calculé une absorption de glucose fœtal médiane [Q1, Q3] de (libération placentaire) de la circulation ombilicale de 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normalisé pour le poids à la naissance, cela équivaut à 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. Le placenta libère 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) par kg de placenta.
Exemple de la façon dont la méthode à 4 vaisseaux est utilisée pour étudier l'absorption du placenta
Les études sur les animaux suggèrent que l'acide glutamique est important à la fois dans l'interconversion des acides aminés dans le placenta et le foie foetal et comme combustible oxydant dans d'autres voies métaboliques 27 . À l'aide de la méthode d'échantillonnage à 4 navires placenta, nous avons étudié leLes différences artérioveineuses teroplacentales et ombilicales de l'acide glutamique chez l'homme ( tableau 2 ). Nous avons trouvé une absorption placentaire (donc une libération foetale) d'acide glutamique de la circulation ombilicale. En outre, nous avons trouvé une absorption placentaire de l'acide glutamique de la circulation maternelle. Cette absorption du placenta à partir des deux circulations est un exemple de la manière dont la méthode à 4 vaisseaux peut être utilisée pour démontrer in vivo chez l'humain que le métabolisme placentaire des éléments nutritifs fait partie de la régulation du transfert transplacentaire.
| Navire | Acide glutamique μmol / L | Valeur p * |
| Artère radiale | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Veine utérine | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Veine ombilicale | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Artère ombilicale | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Différences jumelées | ||
| Artérite radiale - veine utérine | 10,4 [1,6, 21,2] | <0,001 |
| Arme ombilicale - veine unifilaire | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0,001 |
Tableau 2: Médiane [Q1, Q3] Concentrations et différences artérioveineuses de l'acide glutamique
* Wilcoxon Signed-Rank test
Exemple de la façon dont la méthode à 4 vaisseaux est utilisée pour étudier la libération du placenta
Il est établi que le placenta sécrète la progestérone et afin de valider notre méthode à 4 vaisseaux sur le côté maternel du placenta, nous avons mesuré la libération in vivo de la progestérone au teRm 28 . Nous avons trouvé une libération placentaire significative de la progestérone dans la circulation maternelle ( tableau 3 ). La différence artérioveineuse observée démontre comment la méthode d'échantillonnage 4-vaisseaux placentaire peut être utilisée pour détecter les substances libérées par le placenta et est très pertinente lors de l'étude des grossesses pathologiques.
| Navire | Progestérone nmol / L | Valeur p * |
| Artère radiale | 678 [514, 971] | |
| Veine utérine | 1852 [1059, 2786] | |
| Différences jumelées | ||
| Artérite radiale - veine utérine | -1187 [-1855, -404] | P <0,001 |
Tableau 3: concentrations médianes [Q1, Q3] et différence artérioveineuse uteroplacentale de la progestérone
* Wilcoxon Signed-Rank test
Figure 3 : Diagrammes de flux et illustration des participants inclus et perdus.
A. Indique l'inclusion des participants, démontrant que les participants ont été perdus principalement en raison du début du travail avant la césarienne ou du manque de personnel suffisant pour mener l'étude. B. Sur les 179 femmes atteintes de grossesses normales (bleu), des échantillons de sang de 4 vaisseaux ont été obtenus en 162 (91%) (échantillons de sang foetus incomplets: échantillons de sang maternel incomplets, noirs, gris). Cinquante et un (28%) des participants n'ont pas été inclus pour les mesures par ultrasons en raison de limitations logistiques. Sur les 128 participants (72%) soumis à des ultrasons, des mesures du débit sanguin sur le côté foetal du placenta ont été obtenues chez tous les participants (vert clair), alors que les mesures complètes du débit sanguin à la fois du côté maternel et du fœtus ont été obtenues chez 77 (60%) (vert foncé). Illustration: Øystein H. Horgmo, Université d'Oslo. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La méthode d'échantillonnage du placenta à 4 navires est pertinente pour trois objectifs principaux. Tout d'abord, il peut être utilisé pour étudier comment des substances spécifiques sont absorbées par le placenta du côté maternel et éventuellement transférées à la circulation ombilicale et au foetus, comme en témoignent nos études sur le glucose et les acides aminés. Deuxièmement, la méthode est très pertinente pour étudier les substances produites par le placenta et libérées dans les circulations maternelles ou fœtales, comme l'ont démontré les résultats de la progestérone. Troisièmement, il peut être utile d'étudier comment le fœtus in vivo élimine les déchets pendant la croissance rapide et le remodelage des tissus.
Les étapes critiques et les problèmes logistiques de la méthode à 4 navires
L'échantillonnage Placenta 4-vessel a déjà été utilisé pour déterminer le transfert placentaire des macronutriments in vivo dans les grossesses physiologiques normales 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, mais avec un nombre limité de sujets d'étude. L'utilisation limitée de l'échantillonnage à 4 navires est probablement due à la logique exigeante de la procédure. Une coordination réussie entre le patient, les chercheurs et le personnel des départements de la médecine foetale, de l'obstétrique et de l'anesthésie est essentielle pour utiliser cette méthode. Nous croyons qu'il a été un grand avantage que plusieurs des principaux enquêteurs soient des obstétriciens, connaissant les routines cliniques et le personnel clé. Les procédures d'étude ont donc été mises en œuvre parallèlement à la pratique clinique quotidienne. En coordonnant et en sécurisant chaque étape de la procédure, nous avons obtenu des échantillons provenant de plus de 200 paires mère / nouveau-née. En outre, notre stratégie a consisté à maintenir la procédure d'échantillonnage à quelques mains, car il existe des défis techniques dans la procédure qui sont décisifs pour l'issue réussie de l'échantillonnage et de nombreux échantillonneurs peuvent introduire des sources inutiles de variation des données. ConséquenceNous recommandons que tous les examens échographiques soient effectués par le même examinateur avec la même machine à ultrasons. L'équipement doit être choisi avec précaution car la résolution du mur du vaisseau est cruciale. Les artères utérines au troisième trimestre sont particulièrement difficiles à mesurer car la taille et le contenu de l'utérus rend difficile l'obtention à la fois de l'angle d'insonction perpendiculaire utilisé pour les mesures du diamètre et du faible angle d'insonation pour les mesures de la vitesse d'écoulement au même endroit. En outre, l'échantillonnage sanguin réussi exige l'identification d'un site d'échantillonnage approprié de la veine utérine et une aspiration douce. Sur le côté ombilical, la fragilité des érythrocytes fœtaux exige une attention particulière à la force d'aspiration. Il est de notre expérience que l'accouchement tardif ou le stress mineur pour le nourrisson a été associé à une rétrécissement précoce de l'artère ombilicale, ce qui a entraîné une réduction du volume d'échantillon artériel.
Questions méthodologiques / analytiques de la méthode à 4 navires
Il est important de traiter plusieurs problèmes méthodologiques dans l'interprétation des résultats d'une étude sur le placenta à 4 vaisseaux. Tout d'abord, si l'on veut calculer la masse d'une substance absorbée ou libérée par le placenta, il est important de considérer le volume de passage du sang. Il faut garder à l'esprit que la veine utérine non seulement draine le placenta, mais égoutte également le muscle utérin, et que la vascularité utérine en divers degrés anastomose avec le système vasculaire ovarien et vaginal. Ensuite, il est important de considérer que l'échange d'eau à travers le placenta peut influencer le concentréLes rations mesurées, et affectent ainsi les différences de concentration artérioveineuses calculées. Idéalement, cela est mieux adapté en ajustant les différences de concentration pour l'eau perdue ou acquise dans chaque paire mère-fœtus. Cela peut être réalisé en mesurant une substance qui n'est pas absorbée ou libérée par le placenta ou l'utérus. Les concentrations d'hémoglobine ou les pourcentages calculés d'érythrocytes (hématocrite) peuvent servir de facteurs de correction pour l'échange d'eau. En outre, lors de l'interprétation de l'absorption ou de la libération de composés sur le côté maternel du placenta, il peut être intéressant d'obtenir des différences artérioveineuses dans d'autres tissus à des fins de comparaison. Nous avons donc inclus un échantillon de sang de la veine antecubitale pour caractériser les caractéristiques spécifiques du placenta en comparant les différences artérioveineuses par rapport au placenta avec celles du lit capillaire de l'avant-bras. Nous avons trouvé cette comparaison particulièrement intéressante lorsque nous avons testé la libération placentaire de sFlt-1 et de croissance placentaire faParce que les cellules endothéliales systémiques pourraient être une source potentielle de ces composés 14 . Selon la question de recherche, il pourrait être important de relier les différences artérioveineuses au poids du placenta pour calculer l'efficacité du placenta, c'est- à- dire en termes de (mmol / L) / kg ou (mmol / min) / kg de placenta.
Limites et atouts de la méthode à 4 navires
Bien que la physiologie du placenta soit moins affectée par la césarienne que par le stress de l'accouchement vaginal, il existe plusieurs limites à cette méthode. L'accouchement vaginal est recommandé dans la plupart des cas de complications communes de la grossesse (comme la prééclampsie, le diabète, l'obésité et la macrosomie fœtale modérée), ce qui peut limiter et contraindre le recrutement. Même lors de l'optimisation de chaque étape de la méthode, il est difficile d'obtenir des mesures complètes et des échantillons dans chaque patient en raison des difficultés techniques dans la procédure d'échantillonnage du sang et de l'échographie volMesures du flux d'ume ( Figure 3 ). En outre, bien que les mesures par ultrasons soient effectuées le plus près possible de l'opération chirurgicale, elles sont menées de manière inhérente avant l'anesthésie rachidienne et l'échantillonnage du sang. De ce fait, le débit cardiaque maternel (CO) peut changer et peut-être affecter le flux sanguin uteroplacentale (et même le feto-placentaire). La modification éventuelle du CO causée par l'anesthésiase médullaire est compensée par la phényléphrine qui a été utilisée dans la présente étude. Les données préliminaires d'un sous-ensemble de nos participants (n = 23) ne montrent aucune altération significative du CO avant l'anesthésie rachidienne et au moment de l'échantillonnage (données non publiées). L'utilisation de la méthode d'échantillonnage à 4 vaisseaux chez l'homme, par opposition à chez les animaux, limite à la fois la possibilité d'introduire une variable temporelle et de manipuler le contenu sanguin 5 , 29 , 30 . De ces considérations, il s'ensuit que les 4 navires La méthode d'échantillonnage est transversale et largement observatoire par nature, et les données obtenues doivent être analysées en conséquence. D'autre part, la méthode d'échantillonnage à 4 navires offre une possibilité unique d'étudier la physiologie du placenta humain et la pathophysiologie in vivo , avec tous les facteurs d'interaction en jeu, situation qui ne peut jamais être reproduite in vitro . Il offre une excellente occasion de tester les hypothèses issues d'études animales ou autres expérimentales. De même, il peut générer de nouvelles hypothèses qui doivent être testées mécaniquement in vitro et dans des études sur les animaux.
Applications potentielles de la méthode à 4 navires
Dans les grossesses pathologiques, les différences de concentration artérioveineuse maternelle et fœtale ont jusqu'à présent été étudiées séparément et ont permis de tester certaines des hypothèses existantes in vivo 15 , 16 ,Ass = "xref"> 31. La méthode d'échantillonnage à 4 navires offre l'occasion attrayante d'étudier l'unité maternelle, placentaire et fœtale ensemble plutôt que comme des entités distinctes dans les grossesses pathologiques et peut donner une nouvelle lumière sur les questions anciennes et nouvelles dans le cadre de l'interaction maternelle-fœtale. La méthode d'échantillonnage à 4 navires peut être appliquée à un large éventail de questions de recherche dans les grossesses normales et pathologiques selon les analyses ultérieures des échantillons. Le choix des vacutainers, le volume de sang, la gamme de placenta et d'autres échantillons de tissus devraient être décidés selon la question de recherche. Burton et al. Ont récemment publié un excellent document décrivant des procédures pour assurer des échantillons de tissus placentaires de bonne qualité et pour permettre la fusion de différents biobanques afin de résoudre certains casse-tête qui nécessitent une grande quantité d'échantillons à résoudre 20 . Les échantillons à 4 navires peuvent être analysés pour étudier la libération spécifique d'exosomes à la maternitéLa circulation, le transfert des médicaments, des métabolites et des toxines. Les analyses d'omiques à grande échelle (métabolomique, protéomique et lipidomie) ont le potentiel d'identifier les substances et les métabolites dans le plasma maternel qui sont sécrétées par le placenta. De ce fait, l'établissement de la méthode d'échantillonnage à 4 navires peut identifier les facteurs dérivés du placenta dans la circulation maternelle et permettre d'éliminer les biomarqueurs de la fonction placentaire. Combinés avec des techniques pour séparer les membranes plasmiques basales face au fœtus face maternelle du syncytiotrophoblaste, le transfert d'une substance peut être étudié avec l'activité et l'emplacement des protéines transporteuses pertinentes 21 . En outre, les mécanismes de régulation du transfert de nutriments in vivo peuvent être élucidés en analysant les niveaux de nutriments et de micronutriments dans les quatre vaisseaux et relient le transfert de nutriments aux mesures du nutriment et du système de détection d'énergie dans le placenta 32 33 . La perfusion de glucose avant l'accouchement est une autre approche possible. Le transfert placentaire pourrait être lié à des variables métaboliques maternelles comme l'IMC, les profils lipidiques et lipidiques plasmatiques et les résultats fœtaux comme le poids à la naissance et la composition corporelle 18 . Ensemble, ces approches permettront d'éclairer le rôle intégratif du placenta, étant situé au centre de l'interaction entre les conditions et besoins maternels et fœtaux.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
D'abord et avant tout, nous remercions sincèrement les mères qui ont participé à ce projet. Ensuite, nous reconnaissons tout le personnel qui a aidé et facilité la procédure d'échantillonnage, l'anesthésiste, l'infirmière anesthésiste et les infirmières chirurgicales. Le projet n'aurait pas été possible sans le financement de l'Autorité régionale de la santé du Sud-Est de la Norvège et de l'Unité consultative norvégienne sur la santé des femmes, de l'Université d'Oslo et du financement local fourni par l'Hôpital universitaire d'Oslo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
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