Summary
Apresentamos um método detalhado para estudar a fisiologia placentária humana in vivo a termo. O método combina a amostragem de sangue dos vasos entrantes e de saída nos lados materno e fetal da placenta com medidas de ultra-som do fluxo sangüíneo do volume e amostragem do tecido placentário.
Abstract
A placenta humana é altamente inacessível à pesquisa enquanto ainda está no útero . A compreensão atual da fisiologia placentária humana in vivo é, portanto, baseada em grande parte em estudos com animais, apesar da alta diversidade entre espécies em anatomia placentária, hemodinâmica e duração da gravidez. A grande maioria dos estudos de placenta humana são estudos de perfusão ex vivo ou estudos de trofoblasto in vitro . Embora os estudos in vitro e os modelos animais sejam essenciais, a extrapolação dos resultados desses estudos para a placenta humana in vivo é incerta. Pretendemos estudar a fisiologia da placenta humana in vivo a termo e apresentar um protocolo detalhado do método. Explorando o acesso intraabdominal à veia uterina imediatamente antes da incisão uterina durante a cesariana planejada, recolhemos amostras de sangue dos vasos entrantes e de saída nos lados materno e fetal da placenta. Ao combinar conMedições de centragem a partir de amostras de sangue com medidas de fluxo sanguíneo volumétrico, podemos quantificar a absorção placentária e fetal e a liberação de qualquer composto. Além disso, amostras de tecido placentário dos mesmos pares mãe-feto podem fornecer medições da densidade e atividade do transportador e outros aspectos das funções placentárias in vivo . Através deste uso integrativo do método de amostragem de 4 embarcações, somos capazes de testar alguns dos conceitos atuais de transferência de nutrientes da placenta e metabolismo in vivo , tanto em gravidezes normais quanto patológicas. Além disso, este método permite a identificação de substâncias segregadas pela placenta para a circulação materna, o que pode ser um importante contributo para a busca de biomarcadores da disfunção placentária.
Introduction
De acordo com o National Institutes of Health, EUA, a placenta é o órgão menos entendido no corpo humano 1 , 2 , 3 . É difícil acessar e estudar a placenta humana in vivo sem impor riscos éticos na gravidez em curso. Os estudos da função placentária no ser humano são, portanto, amplamente baseados em modelos in vitro e ex vivo . A maioria dos estudos anteriores in vivo de transporte placentário e metabolismo foram realizados em animais 4 , 5 , 6 . No entanto, como a estrutura e as funções da placenta variam consideravelmente entre as espécies, a extrapolação dos resultados dos animais aos humanos deve ser feita com cautela. Apenas alguns estudos humanos menores in vivo investigaram a absorção placentária e fetal e o transporte sob condições fisiológicas normais.Todas as condições, e nenhuma explorou a transferência integrada de vários compostos 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Esses estudos fundamentais ilustram que os estudos in vivo da placenta humana são viáveis e que podem servir para vários propósitos. Em primeiro lugar, os conceitos atuais de funções placentárias derivadas principalmente de estudos in vitro , ex vivo e em animais podem ser testados em um ambiente humano e, portanto, fornecem uma visão nova e mais específica da placenta humana. Em segundo lugar, as propriedades da placenta disfuncional associada ao crescimento fetal aberrante, pré-eclâmpsia, diabetes materna, síndrome metabólica e outros distúrbios metabólicos maternos podem ser melhor caracterizados. Em terceiro lugar, os estudos humanos in vivo proporcionam uma oportunidade para desenvolver o diagnósticoFerramentas tic e preditivas de função placentária.
Neste contexto, buscamos estabelecer uma coleção abrangente de dados fisiológicos para investigar a função placentária humana in vivo. Durante uma cesariana planejada, exploramos o acesso intraabdominal à veia uterina para coletar amostras de sangue dos vasos entrantes e salientes nos lados materno e fetal da placenta (o método de amostragem de 4 vasos). Essas amostras são usadas para calcular as diferenças de concentração arteriovenosa pareadas de nutrientes e outras substâncias 14 . Além disso, medimos o fluxo sangüíneo de volume em ambos os lados da placenta por ultra-som. Conseqüentemente, a captação placentária e fetal de qualquer composto pode ser quantificada. Além disso, é possível determinar as substâncias liberadas pela placenta para as circulações materna e fetal 15 , 16 , 17 . Quando combinarD com parâmetros clínicos de mãe e filho e análises de tecidos placentários e outros tecidos relevantes, este método tem o potencial emocionante para integrar muitos aspectos das funções placentárias in vivo nos mesmos pares mãe-feto.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelos funcionários de proteção de dados do Hospital Universitário de Oslo e do Comitê Regional de Ética em Pesquisa Médica e de Saúde, no sul da Noruega 2419/2011. Todos os participantes assinaram um consentimento informado e esclarecido na inclusão.
1. Preparações
NOTA: Uma linha de tempo para os procedimentos está descrita na Figura 1 .
Figura 1 : Diagrama de fluxo descrevendo o tempo e o pessoal envolvido no procedimento de amostragem de 4 embarcações.
Uma cor representa uma pessoa. A descrição detalhada do método é dada no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Funcionários
- Prepare o equipamento, 50 mL de solução salina tamponada com fosfato 1 M (PBS), 25 mL de solução estabilizadora de ARN frio e 5 x 0,5 mL de composto de temperatura de corte ideal (OCT). Rotule os aspiradores e tubos. Consulte a lista provisória de equipamentos.
2. Características maternas
- Registre as características clínicas e não clínicas maternas na inclusão e repita as questões relevantes e euAsurações, incluindo peso, no momento da entrega. Registre a duração do período de jejum antes da cesariana e quaisquer episódios hipotensivos que ocorram durante a cirurgia.
Nota: Inclua o conjunto de dados clínicos materno mínimo relatado em uma publicação recente do Laboratório Global de Gravidez (COLAB). Este artigo também inclui alguns aspectos muito importantes na escolha das populações estudadas e deve ser abordado ao planejar o estudo 18 . - Considere registrar características paternas, incluindo etnia, idade e índice de massa corporal (IMC).
3. Ultrassom
- Execute o exame de ultra-som Doppler no dia da entrega, com as mulheres em estado de jejum. Realizar o exame durante um período de quiescência fetal, com a mulher em posição semi-supina, inclinada ligeiramente lateralmente oposta à região de interesse, a fim de evitar a compressão da aorta e veia cava. Monitorar a saída emTensão pelos índices mecânico e térmico na tela.
- Veia umbilical
- Visualize a veia umbilical em uma transição sagital ou oblíqua do abdômen fetal. Meça o diâmetro interno do vaso na porção reta da veia umbilical intra-abdominal, antes de qualquer ramo visível. Use o modo B regular e visualize o vaso em um ângulo de insônia perpendicular para medições de diâmetro e mantenha vários quadros ótimos para medições posteriores para minimizar o efeito de mudanças de diâmetro pulsátil.
- Repita as medidas de cinco a dez vezes 19 .
- No mesmo local, use o ultra-som Doppler e ajuste a sonda para obter um ângulo de insonção tão baixo quanto possível (sempre <30 °) para medir a velocidade máxima calculada no tempo (TAMX). Obtenha a velocidade durante um período de 3 a 5 s (fluxo não pulsante).
- Visualize a veia umbilical em uma transição sagital ou oblíqua do abdômen fetal. Meça o diâmetro interno do vaso na porção reta da veia umbilical intra-abdominal, antes de qualquer ramo visível. Use o modo B regular e visualize o vaso em um ângulo de insônia perpendicular para medições de diâmetro e mantenha vários quadros ótimos para medições posteriores para minimizar o efeito de mudanças de diâmetro pulsátil.
- Artéria uterina
- Use DopplerUltra-som para visualizar a artéria uterina à medida que atravessa a artéria ilíaca externa, imediatamente depois dele se ramifica da artéria ilíaca interna. Ajuste a sonda neste site para obter um ângulo de insonação baixo (sempre <30 °) e medir TAMX. Obtenha a velocidade como a velocidade média de três ciclos de coração.
- Como é improvável que tenha um ângulo perpendicular no mesmo local que o TAMX é medido, siga o vaso distalmente para obter um ângulo correto para medições de diâmetro tão próximas dos locais de medidas de diâmetro quanto possível. Exclua as medidas do diâmetro se qualquer vaso visível se afastar antes deste site, conforme avaliado pelo ultra-som Doppler colorido.
- Use o modo B regular e visualize o vaso em um ângulo de insônia perpendicular para medições de diâmetro e mantenha vários quadros ótimos para medições posteriores para minimizar o efeito de mudanças de diâmetro pulsátil.
- Repita as medidas de cinco a dez vezes 19 .
- Observe a posição da placenta.
4. Amostragem de sangue de 4 vasos
NOTA: A linha de tempo para os procedimentos está descrita na Figura 1 e uma visão geral das amostras é ilustrada na Figura 2 .
Figura 2 : Ilustração esquemática da Vasculatura Placentária e dos Sites de Amostragem.
No método de amostragem de 4 embarcações amostras de sangue são extraídas da veia uterina, a artéria radial (como um proxy para a artéria uterina) e as artérias e veias umbilicais. O fluxo sanguíneo na artéria uterina e a veia umbilical são medidos por ultra-som. As amostras de tecido da placenta são coletadas. Ilustração: Øystein H. Horgmo, Universidade de Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Procedimentos de segurança
- Forneça todo o pessoal na operação teatro com luvas, roupas cirúrgicas, máscaras e maquiagem.
- Fornecer aos cirurgiões e ao pessoal de pesquisa em contato com o campo de operação com trajes, máscaras, chapelaria, vestidos e luvas duplas cirúrgicas. Os óculos são opcionais.
- Forneça pessoal que manipule as amostras de sangue com luvas.
- Forneça pessoal que manipule as amostras de placenta com luvas e máscara cirúrgica. A homogeneização requer o uso de capuzes.
- Preparação no teatro de operações
- Dê um briefing e entregue o equipamento a todo o pessoal que ajudará a amostragem antes do início da cirurgia.
- Dirija-se ao enfermeiro de anestesiologista e anestesiologista que irá auxiliar no acesso arterial e venoso periférico necessário e assegurará queNenhum líquido é administrado por via intravenosa antes da amostragem.
- Dê três seringas (10 mL) sem agulhas para a pessoa que assiste com a amostra de veia antecubital e duas seringas (uma 20 mL e uma 10 mL) e uma seringa de sangue (com heparina) para a pessoa que auxilia na artéria radial.
- Prepare duas seringas estéreis (20 mL), cinco seringas estéreis (10 mL), três "agulhas de borboleta" e duas seringas de gás de sangue para o campo de operação.
- Acesso a vasos sanguíneos.
- Siga o procedimento padrão antes da cesariana para assegurar o acesso periférico intravenoso (iv).
NOTA: A veia antecubital é preferível porque é mais fácil extrair amostras deste site. - Localize a artéria radial no pulso por ultra-som ou por palpação. Após 0,5 mL de analgesia subcutânea de lidocaína, coloque uma linha arterial na artéria radial. Abandone a amostragem deste site em caso de três inserções com falha, ouSe a mulher experimentar dor durante a inserção.
NOTA: Realize o procedimento cirúrgico da cesariana de acordo com o procedimento padrão. Somente os ajustes necessários para o processo de amostragem são sublinhados abaixo.
- Siga o procedimento padrão antes da cesariana para assegurar o acesso periférico intravenoso (iv).
- Amostras de sangue materno
NOTA: Obtenha as três amostras de sangue materno (veia uterina, artéria radial e veia antecubital) simultaneamente antes da incisão uterina.- Para a veia uterina, depois de abrir a cavidade abdominal, use um retractor para levantar a parede abdominal e exponha os ramos principais das veias uterinas nos lados ântero-laterais do útero. Obtenha sangue dos ramos da veia uterina no mesmo lado da placenta sempre que possível ou use o plexo da veia mais proeminente se a placenta estiver localizada na linha média uterina.
- Insira uma agulha de borboleta em uma seringa de gás no sangue na veia uterina com um ângulo de aproximadamente 30 graus e coleça o sangue através de uma aspiração suave para evitarHemólise. Ao assegurar cuidadosamente a posição iv da agulha de borboleta, substitua a seringa de gás cheia de sangue por uma seringa de 20 mL e 10 mL consecutivamente.
NOTA: O melhor acesso é melhor assegurado quando se posiciona no lado contralateral da veia uterina escolhida.
- Insira uma agulha de borboleta em uma seringa de gás no sangue na veia uterina com um ângulo de aproximadamente 30 graus e coleça o sangue através de uma aspiração suave para evitarHemólise. Ao assegurar cuidadosamente a posição iv da agulha de borboleta, substitua a seringa de gás cheia de sangue por uma seringa de 20 mL e 10 mL consecutivamente.
- Para a artéria radial, aspirar da linha intra-arterial. Descarte os primeiros 5 mL e, em seguida, aspirar 3 mL em seringa de heparina para análises de gases no sangue, seguido de 3 mL em duas seringas (20 + 10 mL).
- Para a veia antecubital, aspirar gentilmente do cateter intravenoso. Descarte os primeiros 5 mL, e depois aspirar 30 mL em três seringas (10 mL).
- Realize uma inspeção final do local de amostragem na veia uterina antes de começar a fechar o abdômen.
- Para a veia uterina, depois de abrir a cavidade abdominal, use um retractor para levantar a parede abdominal e exponha os ramos principais das veias uterinas nos lados ântero-laterais do útero. Obtenha sangue dos ramos da veia uterina no mesmo lado da placenta sempre que possível ou use o plexo da veia mais proeminente se a placenta estiver localizada na linha média uterina.
- Amostras de sangue fetal
- Quando a criança nasce, imediatamente aspirar sangue da artéria umbilical, sem apertar o cordão umbilical ou entregar a placenta. Comece o conhecimentoH, a seringa para análises de gases sanguíneos, e siga com três seringas de 10 mL, se possível.
- Quando as amostras arteriais estiverem seguras, prenda o cordão e entregue a criança à parteira antes da amostragem da veia umbilical (gás de sangue e 20 + 10 mL de seringas).
NOTA: Obtenha todas as amostras umbilicais dentro de segundos do parto e com a placenta in situ, a menos que tenha desprendido espontaneamente. - Siga as recomendações norueguesas sobre o aperto do cordão tardio. Em caso de criança com dificuldades, abrace e corte o cordão imediatamente e entregue a criança à parteira e ao neonatologista.
- Manuseio de amostras de sangue
- Coloque as seringas de sangue no gelo enquanto prepara o resto das amostras de sangue e analise-as em um analisador de gases no sangue dentro de 5 min.
- Transfira as amostras de sangue imediatamente para vacutainers e coloque os tubos de plasma em um balancim por 1 a 2 minutos antes de colocá-los no gelo. Deixe os tubos de soro no trabalhoBanco de torres para se instalar por 30 minutos.
NOTA: Este é um passo crítico no procedimento que precisa de atenção extra porque amostras de todos os cinco sites devem ser preparadas simultaneamente para garantir boa qualidade. - Centrifugar as amostras de plasma o mais rápido possível e dentro de 30 min, a 6 ° C, 2.500 xg por 20 min.
- Após 30 min, centrifugar as amostras de soro à temperatura ambiente durante 10 min a 2.500 x g.
- Alíquota os sobrenadantes cuidadosamente para 2 mL de tubos de cryo, deixando 0,5 mL do sobrenadante acima do grânulo para garantir plasma livre de plaquetas.
- Armazene as amostras a -80 ° C.
5. Coleção de tecido placentário
- Coloque a placenta plana na bandeja de dissecação gelada o mais rápido possível após a entrega. Fotografar e medir o diâmetro mais longo e o diâmetro a 90 graus.
- Pesar a placenta.
- Registre o peso, os dois diâmetros, qualquer gPatologia ross, número de vasos no cordão e o intervalo de tempo desde a entrega até quando a placenta foi colocada no gelo.
NOTA: envie a placenta para o exame patológico se for clinicamente indicado. - Coloque a placenta com a superfície materna voltada para cima e identifique 4 a 5 locais de amostragem localizados aleatoriamente em cada quadrante da placenta, evitando áreas de patologia franca. Remova a decidua usando uma tesoura para cortar 3 a 5 mm da superfície materna. Colecione um tecido vilão de 1 a 2 cm 3 de cada local.
- Lave o tecido recolhido suavemente em 50 mL de PBS 1M frio. Divida em várias peças de cada local de amostragem e uma alíquota.
Nota: O tamanho das peças da placenta dependerá das análises planejadas. - Adicione alíquotas de amostras de tecido de 0,1 - 0,5 cm 3 a 5 tubos de cryo e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
- Adicione pequenos pedaços de 0,1 - 0,2 cm 3 ao tubo com 25 mL de solução de estabilização de ARN. Loja às 46; C por 24 h, descarte a solução de estabilização de ARN e substitua-a. Congelar.
- Adicione pedaços de 0,5 cm 3 aos 5 tubos cryo com 0,5 mL de OCT, adicione-os com OCT, misture e congelem.
- Armazene as amostras a -80 ° C até a análise.
NOTA: Burton et al. Fornece uma excelente visão geral dos aspectos práticos da amostragem da placenta de acordo com as análises planejadas. 20 Considere preparar o tecido remanescente para o isolamento das membranas microvilas e basais e coletar o tecido decidual por técnica de sucção de vácuo. 21 , 22
6. Características neonatais
- Registre as características neonatais, incluindo Apgar-score (1, 5 e 10 min), sexo, peso, comprimento, idade gestacional e admissão na Unidade de Terapia Intensiva do Recém-Nascido (comprimento e resultado da estadia).
- Considere medir a composição do corpo neonatal por medidas antropométricas, deslocar o arPletismografia ou dupla absorciometria de raios-X. 23 , 24
7. Cálculos
- Assuma composição sanguínea semelhante na artéria radial e uterina e calcula a diferença de concentração arteriovenosa uteroplacentária.
Diferença de concentração arteriovenosa uteroplacentária = C A - C V
Diferença de concentração venosa-arterial umbilical - arterial = C v -C a
Onde C é concentração com subscritos: A, a artéria radial; V, a veia uterina; V a veia umbilical e a, a artéria umbilical. - Calcule o fluxo sanguíneo do volume, mL / min (Q):
Onde D é o diâmetro do vaso (cm), TAMX é a velocidade máxima calculada no tempo e h é o coeficiente para o perfil espacial da velocidade do sangue. Use 0.5 como o coeficiente para a veia umbilical e0,6 para a artéria uterina 25 , 26 . - Calcule a aceitação e liberação da placenta de acordo com o princípio de Fick:
Captação uteroplacental = ( C A - C V ) x Qm
Captação fetal = ( C v - C a ) X Q f
Subscritos: m, materno e f, fetal.
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Representative Results
O método de amostragem de 4 vasos é aplicável na prática clínica e obtivemos amostras de sangue com sucesso de 209 pares de mãe / bebê. Em 128 destes, também conseguimos medir o fluxo sanguíneo do volume. A amostragem completa de 4 vasos e as medidas de fluxo de boa qualidade de vasos maternos e fetais foram obtidas em 70 pares mãe-feto ( Figura 3 ). Além disso, até agora, colhemos amostras de sangue e placenta de 30 pacientes pré-eclâmicos. Nós já publicamos artigos sobre transferência de nutrientes da placenta humana, bem como liberação placentária de fatores vasoativos, demonstrando duas aplicações do método 14 , 15 , 16 .
Exemplo de como o método de 4 vasos é usado para estudar transferência de placenta
Existem arteríades significativasDiferenças hormonais de glicose em ambos os lados da placenta demonstrando uma absorção uteroplacentária e fetal in vivo de glicose ( Tabela 1 ). A transferência placentária de glicose depende do gradiente de glicose materno-fetal e, portanto, nos níveis de glicose materna. No entanto, anteriormente demonstramos que este gradiente e, portanto, a transferência de glicose, são significativamente influenciados também pelos níveis de insulina fetal e pelo consumo de glicose. Este é um exemplo de como esse método ilustra importantes interações materno-fetal 14 .
| Embarcação | Glucose mmol / L | Valor p * |
| Artéria radial | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Veia uterina | 4.23 [3.94, 4.53] | |
| Veia umbilical | 3,78 [3,52, 4,06] | |
| Artéria umbilical | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Diferenças pareadas | ||
| Artéria radial - veia uterina | 0,29 [0,13, 0,41] | <0,001 |
| Artéria umbilical - veia umbilical | 0,54 [0,29, 0,76] | <0,001 |
| Artéria radial - artéria umbilical | 1,25 [1,03, 1,51] | <0,001 |
Tabela 1: Médias [Q1, Q3] Concentrações e Diferenças Arteriovenosas de Glicose
* Teste de classificação assinada por Wilcoxon
A absorção fetal de glicose de (liberação da placenta para) a circulação umbilical é considerada dependente não apenas oN o gradiente materno-fetal, mas no fluxo sanguíneo placentário 5 . Da mesma forma, pode ser relevante estudar a absorção fetal de glicose em função do peso da placenta ou do peso ao nascer. Em n = 128, encontramos um fluxo venoso umbilical total mediano [Q1, Q3] de 196,2 [158,3, 232,2] mL / min, e calculou uma absorção de glicemia fetal mediana [Q1, Q3] de (liberação placentária para) a circulação umbilical de 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normalizado para o peso ao nascer, isso equivale a 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. A placenta libera 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) por kg de placenta.
Exemplo de como o método de 4 vasos é usado para estudar a absorção da placenta
Estudos em animais sugerem que o ácido glutâmico é importante tanto na interconversão de aminoácidos na placenta quanto no fígado fetal e como combustível oxidativo em outras vias metabólicas 27 . Usando o método de amostragem de 4 vasos da placenta estudamos o uDiferenças arteriovenosas teroplacentárias e umbilicais do ácido glutâmico em seres humanos ( Tabela 2 ). Encontramos uma absorção placentária (assim, uma liberação fetal) de ácido glutâmico da circulação umbilical. Além disso, encontramos uma absorção placentária do ácido glutâmico da circulação materna. Esta absorção placentária de ambas as circulações é um exemplo de como o método de 4 vasos pode ser usado para demonstrar in vivo no humano que o metabolismo placentário dos nutrientes faz parte da regulação da transferência transplacentária.
| Embarcação | Ácido glutâmico μmol / L | Valor p * |
| Artéria radial | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Veia uterina | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Veia umbilical | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Artéria umbilical | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Diferenças pareadas | ||
| Artéria radial - veia uterina | 10,4 [1,6, 21,2] | <0,001 |
| Artéria umbilical - veia artificial | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0,001 |
Tabela 2: Concentrações medianas [Q1, Q3] e diferenças arteriovenosas de ácido glutâmico
* Teste de classificação assinada por Wilcoxon
Exemplo de como o método de 4 vasos é usado para estudar a liberação placentária
Está estabelecido que a placenta secreta progesterona e, para validar nosso método de 4 vasos no lado materno da placenta, medimos a liberação in vivo de progesterona no teRm 28 . Encontramos uma significativa liberação placentária de progesterona para a circulação materna ( Tabela 3 ). A diferença arteriovenosa observada demonstra como o método de amostragem placentária de 4 vasos pode ser usado para detectar substâncias liberadas pela placenta e é altamente relevante ao estudar gravidezes patológicas.
| Embarcação | Protonsterona nmol / L | Valor p * |
| Artéria radial | 678 [514, 971] | |
| Veia uterina | 1852 [1059, 2786] | |
| Diferenças pareadas | ||
| Artéria radial - veia uterina | -1187 [-1855, -404] | P <0,001 |
Tabela 3: concentrações medianas [Q1, Q3] e diferença arteriovenosa uteroplacentária da progesterona
* Teste de classificação assinada por Wilcoxon
Figura 3 : fluxogramas e ilustração de participantes incluídos e perdidos.
A. Mostra a inclusão dos participantes, demonstrando que os participantes foram perdidos principalmente devido ao início do parto antes da cesariana ou falta de pessoal suficiente para realizar o estudo. B. Das 179 mulheres com gravidez normal (azul), foram obtidas amostras de sangue de 4 vasos em 162 (91%) (amostras de sangue fetal incompletas: amostras de sangue materno preto e incompleto: cinza). Cinquenta e um (28%) participantes não foram incluídos nas medidas de ultra-som devido a limitações logísticas. Dos 12Foram obtidos 8 participantes (72%) submetidos a ultra-som, medições de fluxo sanguíneo no lado fetal da placenta em todos os participantes (verde claro), enquanto que as medidas completas do fluxo sanguíneo no lado materno e fetal foram obtidas em 77 (60%) (verde escuro). Ilustração: Øystein H. Horgmo, Universidade de Oslo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de amostragem de 4 vasos da placenta é relevante para três propósitos principais. Primeiro, pode ser usado para estudar como substâncias específicas são absorvidas pela placenta do lado materno e, possivelmente, transferidas para a circulação umbilical e para o feto, conforme demonstrado pelos estudos de glicose e aminoácidos. Em segundo lugar, o método é altamente relevante para estudar substâncias produzidas pela placenta e liberadas para a circulação materna ou fetal, conforme demonstrado pelos resultados da progesterona. Em terceiro lugar, pode ser útil estudar como o feto in vivo elimina produtos de lixo durante o rápido crescimento e remodelação de tecidos.
Passos críticos e questões logísticas do método de 4 embarcações
A amostragem Placenta 4-vessel já foi usada para determinar a transferência placentária de macronutrientes in vivo em gestações fisiológicas normais 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, mas com um número limitado de assuntos de estudo. O uso limitado da amostragem de 4 embarcações deve-se provavelmente à logística exigente do procedimento. Uma coordenação bem sucedida entre o paciente, os pesquisadores e o pessoal nos departamentos de medicina fetal, obstetrícia e anestesiologia é essencial para empregar este método. Acreditamos que tenha sido uma grande vantagem que vários dos principais pesquisadores sejam obstetras, conhecendo rotinas clínicas e pessoal-chave. Deste modo, os procedimentos de estudo foram implementados ao lado da prática clínica diária. Ao coordenar e garantir cada passo do procedimento, obtivemos amostras de mais de 200 pares mãe / recém-nascido. Além disso, nossa estratégia tem sido manter o processo de amostragem em poucas mãos porque há desafios técnicos no procedimento que são decisivos para o resultado bem-sucedido da amostragem, e muitos amostradores podem introduzir fontes desnecessárias de variação dos dados. ConsequRecomendamos que todos os exames ultra-sonográficos sejam realizados pelo mesmo examinador usando a mesma máquina de ultra-som. O equipamento deve ser escolhido com cuidado, pois a resolução da parede do vaso é crucial. As artérias uterinas no terceiro trimestre são especialmente tecnicamente desafiadoras para medir porque o tamanho e o conteúdo uterino dificultam o ângulo de insonação perpendicular utilizado para as medidas do diâmetro e o ângulo de baixa insonação para as medidas da velocidade do fluxo no mesmo local. Além disso, amostras de sangue bem-sucedidas exigem a identificação do local de amostragem apropriado da veia uterina e aspiração suave. No lado umbilical, a fragilidade dos eritrócitos fetais requer atenção especial à força de aspiração. É nossa experiência que o atraso na entrega ou menor estresse para o bebê foi associado à constrição precoce da artéria umbilical, resultando em um menor volume de amostra arterial.
Questões metodológicas / analíticas do método de 4 embarcações
É importante abordar várias questões metodológicas na interpretação dos resultados de um estudo de 4 vasos placentários. Primeiro, se o objetivo é calcular a massa de uma substância absorvida ou liberada pela placenta, é importante considerar o volume de passagem de sangue. Deve ter em mente que a veia uterina não só drena a placenta, mas também drena o músculo uterino e que a vasculatura uterina em vários graus anastomosa com vasculatura ovariana e vaginal. Em seguida, é importante considerar que a troca de água através da placenta pode influenciar o concentAs rações mediram e afetam as diferenças de concentração arteriovenosa calculadas. Idealmente, isso é melhor abordado ajustando as diferenças de concentração para a água perdida ou adquirida em cada par mãe-feto. Isto pode ser conseguido medindo uma substância que não é retomada ou liberada pela placenta ou pelo útero. As concentrações de hemoglobina ou as percentagens calculadas de eritrócitos (hematócrito) podem servir como fatores de correção para troca de água. Além disso, ao interpretar a absorção ou liberação de compostos no lado materno da placenta, pode ser interessante obter diferenças arteriovenosas em outros tecidos para comparação. Incluímos, portanto, uma amostra de sangue da veia antecubital para caracterizar características específicas da placenta comparando as diferenças arteriovenosas sobre a placenta com as do leito capilar do antebraço. Encontramos essa comparação particularmente interessante quando testávamos a liberação placentária do sFlt-1 e do crescimento placentárioPorque as células endoteliais sistêmicas podem ser uma fonte potencial desses compostos 14 . Dependendo da questão da pesquisa, pode ser importante relacionar as diferenças arteriovenosas com o peso da placenta para calcular a eficiência placentária, ou seja , em termos de (mmol / L) / kg ou (mmol / min) / kg de placenta.
Limitações e pontos fortes do método de 4 embarcações
Embora a fisiologia da placenta seja menos afetada pela cesariana do que pelo estresse do parto vaginal, existem várias limitações para esse método. A administração vaginal é recomendada na maioria dos casos de complicações comuns da gravidez (como pré-eclâmpsia, diabetes, obesidade e macrosomia fetal moderada), o que pode limitar e prejudicar o recrutamento. Mesmo ao otimizar cada passo do método, é difícil obter medições e amostras completas em cada paciente devido às dificuldades técnicas no processo de amostragem de sangue e ultrassom volMedições de fluxo de ume ( Figura 3 ). Além disso, embora as medidas de ultra-som sejam conduzidas o mais próximo possível da cirurgia, elas são realizadas de forma inerente antes da anestesia espinhal e da amostragem de sangue. Daí segue-se que o débito cardíaco materno (CO) pode mudar e possivelmente afetar o fluxo sangüíneo uteroplacentário (e até mesmo feto-placentário). A possível alteração no CO causada pela anestesia espinhal é compensada pela fenilefrina que foi utilizada no presente estudo. Os dados preliminares de um subconjunto de nossos participantes (n = 23) não mostram alterações significativas no CO antes da anestesia espinhal e no momento da amostragem (dados não publicados). O uso do método de amostragem de 4 vasos em seres humanos, em oposição aos animais, limita a possibilidade de introduzir uma variável de tempo e manipular o conteúdo de sangue 5 , 29 , 30 . A partir dessas considerações, segue-se que o 4-navio O método de amostragem é transversal e, em grande parte, observacional por natureza e os dados obtidos devem ser analisados em conformidade. Por outro lado, o método de amostragem de 4 vasos oferece uma possibilidade única de estudar fisiologia placentária humana e fisiopatologia in vivo , com todos os fatores interagentes em jogo, uma situação que nunca pode ser reproduzida in vitro . Oferece uma excelente oportunidade para testar hipóteses que emergiram de estudos experimentais ou de outros animais. Da mesma forma, pode gerar novas hipóteses que precisam ser testadas mecanicamente in vitro e em estudos com animais.
Aplicações potenciais do método de 4 embarcações
Em gravidezes patológicas, as diferenças de concentração arteriovenosa materna e fetal, até agora, foram estudadas separadamente e permitiram testar algumas das hipóteses existentes in vivo 15 , 16 ,Ass = "xref"> 31. O método de amostragem de 4 vasos oferece a oportunidade atraente de estudar a unidade materna, placentária e fetal em conjunto, e não como entidades separadas em gravidezes patológicas e pode lançar nova luz sobre questões antigas e novas no âmbito da interação materno-fetal. O método de amostragem de 4 vasos pode ser aplicado a uma ampla gama de questões de pesquisa em gravidezes normais e patológicas, dependendo das análises futuras das amostras. A escolha dos vacutainers, o volume de sangue, o intervalo de placenta e outras amostras de tecido devem ser decididos de acordo com a questão da pesquisa. Burton et al. Publicou recentemente um excelente artigo descrevendo procedimentos para garantir amostras de boa qualidade de tecido placentário e para permitir a fusão de diferentes biobanques para resolver certos quebra-cabeças que precisam de uma grande quantidade de amostras a serem resolvidas 20 . As amostras de 4 vasos podem ser analisadas para estudar a liberação específica de exossomos para a maternidadeA circulação, a transferência de medicamentos, metabólitos e toxinas. As análises de omica em grande escala (metabolômica, proteômica e lipidômica) têm potencial para identificar substâncias e metabolitos no plasma materno que são segregados pela placenta. Assim, o estabelecimento do método de amostragem de 4 vasos pode identificar os fatores derivados da placenta na circulação materna e possíveis marcadores de biomarcadores da função placentária. Combinado com técnicas para separar as membranas plasmáticas basais voltadas para o rosto materno e o rosto fetal do sincitotrofoblasto, a transferência de uma substância pode ser estudada juntamente com a atividade e a localização das proteínas transportadoras relevantes 21 . Além disso, os mecanismos que regulam a transferência de nutrientes in vivo podem ser elucidados pela análise dos níveis de nutrientes e micronutrientes nos quatro vasos e relacionam a transferência de nutrientes para as medidas do sistema de detecção de nutrientes e energia na placenta 32 33 . A infusão de glicose antes da entrega é outra possível abordagem. A transferência placentária pode estar relacionada a variáveis metabólicas maternas, como o IMC, os níveis de lipídios e lipídios plasmáticos e os desfechos fetais como o peso ao nascer e a composição corporal 18 . Juntos, essas abordagens podem, possivelmente, iluminar o papel integrativo da placenta, situando-se no centro da interação entre condições e necessidades maternas e fetais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Em primeiro lugar, agradecemos sinceramente as mães que participaram deste projeto. Em seguida, reconhecemos todo o pessoal que auxiliou e facilitou o procedimento de amostragem, o Anestesista, o enfermeiro anestesista e os enfermeiros cirúrgicos. O projeto não teria sido possível sem o financiamento da Autoridade Regional de Saúde do Sudeste da Noruega e da Unidade Norueguesa de Assessoria em Saúde da Mulher, Universidade de Oslo e financiamento local fornecido pelo Hospital Universitário de Oslo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
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