Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

Summary

Мы витрина развития собственн-собранные, трехмерные связки продольно соответствие Астроцитарная somata и процессов в рамках Роман биоматериала оболочки. Эти инженерии «живые леса», экспонируется микрон шкала диаметр еще расширение сантиметров в длину, могут служить в качестве тест кровать изучения механизмов психомоторного развития или облегчить neuroregeneration направляющие нейронной миграции и/или аксональное Поиск пути.

Abstract

Нейротравма и нейродегенеративные заболевания часто приводят к прочному неврологического дефицита из-за ограниченных возможностей центральной нервной системы (ЦНС) для замены потерянных нейронов и регенерировать аксональное пути. Однако во время развития нервной системы, нейронной миграции и аксональной расширение часто происходят вдоль путей, образованный другие клетки, называют «живые леса». Стремясь подражать Эти механизмы и разработать стратегию, которая обходит среды ингибирующих ЦНС, эта рукопись представляет протокол для изготовления тканей спроектированы на основе экзоцитоз «живые леса». Для создания этих конструкций, мы используем схему оболочки Роман биоматериала, чтобы побудить астроциты самостоятельно собрать в плотной трехмерные жгуты биполярного продольно по краю somata и процессов. Во-первых, полые гидрогеля микро столбцы были собраны, и внутренний просвет был покрыт коллагена внеклеточного матрицы. Диссоциированных мозговой коры астроциты затем были доставлены в просвете цилиндрических микро колонки и в критических внутренний диаметр < 350 мкм, спонтанно самостоятельно выровнены и контракт производить долго волоконно как кабели, состоящий из плотных пучков экзоцитоз процессов и фибрилл коллагена измерения < 150 мкм в диаметре, но расширение несколько см в длину. Эти инженерии жизни леса выставлены > 97% клеток жизнеспособность и были практически исключительно состоит из астроцитов, выражая сочетание промежуточного накаливания белки глиальных фибриллово кислой белка (СВМС), виментин и Нестин. Это соответствие экзоцитоз сетей были найдены для предоставления разрешительной субстрата для нейронов вложения и по краю neurite расширение. Кроме того эти конструкции сохранять целостность и выравнивание при извлечении из гидрогеля оболочки, что делает их пригодными для имплантации ЦНС. Эти предварительно конструкции структурно подражать cytoarchitectural ключевые элементы естественным глиальных на основе «живые леса» в естественных условиях. Таким образом эти инженерии жизни леса могут служить в качестве тест кровать учиться психомоторного развития механизмов в пробирке или облегчить neuroregeneration, направляя нейронной миграции и/или аксональное пути после ЦНС дегенерации в естественных условиях .

Introduction

Центральной нервной системы (ЦНС) имеет ограниченные возможности противодействовать потери и/или дисфункции нейронов и аксональной пути, которые сопровождают условий, таких как черепно-мозговой травмы (ЧМТ), инсульт, травме (ТСТ) и нейродегенеративных заболеваний спинного^{1 ,}-^2,-^3,-^4,-⁵. Нейрогенез в ЦНС ограничивается ограниченное количество областей в мозге, препятствует восстановлению утраченных нейронов^6,7. Кроме того восстановление утраченных аксональное путей в ЦНС недостаточно из-за отсутствия направленного указаний, присутствие ингибиторов нарост и реактивной astrogliosis после повреждения нервной ткани^{2,8, 9,10}. Астроциты, как правило, имеют различные функции в деле оказания помощи нейронов с ионного гомеостаза, Распродажа нейромедиатора, формирования синапсов и нервно-сосудистых муфты¹¹. Тем не менее после даже умеренные повреждения нервной ткани, астроциты могут пройти молекулярные, структурные и функциональные изменения, как они переход к гипертрофических состояние¹¹. В ответ на серьезные нейротравма эти изменения приводят к формированию шрам с полутень, содержащие перенос реактивной астроциты и поражения ядро, которое включает в себя лейкоциты, утечка из расколовшегося гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), микроглии, Олигодендроциты и фибробласты^11,12,13. Эти реактивные астроциты достичь морфология нитевидные, неорганизованное процессов и демонстрируют увеличение выражение промежуточного накаливания белков и протеогликаны хондроитин сульфат (CSPGs), которые препятствуют нейронная регенерация¹². Несмотря на то, что глиальный рубец первоначально помогает восстановить целостность BBB и избежать передачи воспалительной реакции на окружающие здоровые ткани, он служит физических и биохимических барьер против регенерации аксона^{12,14 ,,1516}. Например аксоны которых сталкиваются глиальный рубец отображения луковичных дистрофические роста шишки и сдерживали рост¹². Кроме того дезорганизация Астроцитарная процессов после травмы препятствует расширение регенерировать аксоны¹⁷. Итоги этих характеристик тормозной проявляется в часто постоянного физические и неврологические расстройства, которые пациенты страдают после тяжелой нейротравма, включая ЧМТ и SCI.

Независимо от того, внешние задачи, стоящие перед функциональным регенерации в ЦНС аксоны было показано, обладают внутреннюю способность к регенерации. Например динамический характер дистрофические роста конусов при контакте с глиальный рубец свидетельствует о том, что эти окончаний сохраняют свою способность расширять¹². Следовательно считается, что основным препятствием для аксональное re рост является среды ингибирующих после травмы ЦНС и что предоставление более питательную среду через сокращение глиальных рубцов и/или предоставление восстановительной мосты через шрам будет выгодно. Действительно предыдущие исследования показали, что нейронов ЦНС способны расширения аксоны через поражения с помощью периферических нервов графтов как мосты, которые создают более благоприятные условия для axon регенерации^{12,18, 19}. Ряд других стратегий предпринимались эксплуатировать этот рудиментарный регенеративной способностью. К примеру манипуляции клеток роста сигнальных путей в различных моделях травмы привело к аксональное регенерации и глиальных Шрам сокращения^10,,2021. Кроме того исследования показали, что лечение с chondroitinase ABC, который расщепляет большинство цепочки сахара в CSPGs, уменьшает эффект CSPGs, выделяемый реактивной астроциты²². Несмотря на обнадеживающие результаты, эти подходы не дают направлен руководством конусы роста, которые потенциально может приводить к аномальным регенерации¹², а также не учитывают потери нейронов. Подходы на основе клеток были использованы в попытках преодолеть последствия глиальный рубец и пополнить потерянные клеток, особенно нейронов. Некоторые группы Дедифференцированная реактивной астроциты в нейроны, в то время как другие пересажены нейронных прогениторных клеток в поражениях ЦНС населить области травмы и поощрять аксона регенерации^{23,24, 25}. Однако, трансплантация стволовых клеток только ограничивается низкой выживаемости, плохое интеграции и скромный удержания в поврежденной ткани⁵. Кроме того эти стратегии на основе клеток удастся восстановить междугородной аксональное участки, особенно в контролируемым образом. Таким образом биоматериалов в сочетании с другими подходами в настоящее время изучаются как средства доставки для различных нейронных и клеток-предшественников и роста факторы²⁶. Подходы на основе биоматериала имеют высокую степень управления дизайн для производства конструкций, которые имитируют конкретные физические, haptotaxic, и chemotaxic сигналы в трехмерной (3D) микроокружения целевого узла ткани^{27, 28,29,30,,3132,,3334}. Воспроизведение этих экологических сигналов имеет первостепенное значение для пересаженные клетки представить родной как морфология, распространения, миграции и сигнализации, среди других нейробиологических характеристики²⁹. Несмотря на эти выгодные свойства улучшению за пределами традиционных клеток посеян биоматериала подмостей требуется одновременно направлены междугородной аксональное регенерации и заменить потерянные нейронов.

Обещая альтернативный подход основан на нервной ткани инженерии «живые леса», которые отличаются от других подходов, основанных на ячейки, из-за присутствия живых нервных клеток с предварительно cytoarchitecture, что эмулирует родной нейроанатомия и/или развития механизмов для облегчения целевых замена, восстановление и регенерация нейронной схемы^4,35. Соображения по проектированию жизни леса включают фенотипы и источники нервные клетки, а также механические/физические свойства и биохимические сигналы продиктовано состав любых сопровождающих биоматериалов³⁵. После изготовления в пробирке, эти живые леса может быть имплантирован в естественных условиях настоящего молекул клеточной адгезии и эозинофилов и нейротрофическими сигналы активно регулировать миграцию нервных клеток и аксон нарост в зависимости от государства и прогрессирование регенераторные процессы³⁵. Глиальные клетки может служить основой для инженерных cytoarchitecture жизни леса, так как эти клетки посредником различные механизмы развития в естественных условиях. Во время развития мозга новые нейроны полагаются на базальную процессы, продлен на радиальной глии из желудочков зоны к развивающихся корковых пластины как живые леса для миграции направлены^36,37. Кроме того расширение роста шишки показано ориентироваться по зондирования привлекательным и репелленты сигналы с ориентиром глиальных клеток и так называемые «первопроходца» аксоны предлагается достичь правильной цели, расширяя вдоль заранее узорной глиальных помостами^35,,3839. Таким образом, глиальные клетки необходимы для руководства первопроходца аксонов, которые впоследствии служат как на основе аксон «живые леса» в прямой проекции «последователь» аксоны. Кроме того, механизмы роста глии опосредованной было показано постнатально, сохраняются как нейробласты следовать ростральной миграционных потока (RMS) для перехода из субвентрикулярной зоны (SVZ), один из немногих оставшихся областей нейрогенез взрослого мозга, обонятельные луковицы (OB)⁴⁰. Эти нейробласты в RMS мигрируют в глиальных трубки (рис. 1а-1), который состоит из продольно в соответствие Астроцитарная процессов, через прямой ячеек спаек и локализованные растворимых факторов^{37, 41}. Наконец, хотя повреждения ЦНС в млекопитающих причин нарушается механизм Астроцитарная процесса формирования глиальных шрам, который физически препятствует аксональное регенерации¹⁷, многие системы не млекопитающих не хватает формирования глиальных наносит шрам. Скорее глиальные клетки не млекопитающих видов поддерживать более организованной, соответствие шаблонов, которые используются в качестве руководства через пострадавшего региона^17,42,43. Например в моделях SCI не млекопитающих, аксоны показываются расти в тесном сотрудничестве с глиальных мосты, пересекая поражения, предлагая важную роль для организованных глиальных леса как субстратов, содействия аксональное регенерации и восстановления функций ( Рисунок 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. перепросмотре нейроанатомический функций и развития/восстановительных механизмов, описанных выше может принести новый класс инженерии глиальных основе жизни леса, которые могут одновременно управлять незрелых нейронной миграции и аксональной Поиск пути через иначе либеральной среды, тем самым потенциально смягчения последствий нейронов и аксон тракта дегенерации, связанные с ЦНС травмы и болезни.

Наша исследовательская группа ранее разработала несколько типов живых подмости для восстановления и регенерации аксональное участки в ЦНС и периферической нервной системы (ПНС) через микро ткани спроектирован нейронных сетей (микро TENNs) и ткани графтов инженерии нерва (TENGs), соответственно^27,46,47,48. Обе стратегии по существу основаны на biomimicry. Микро-TENNs являются анатомически вдохновил сооружения, предназначенные для структурно и функционально заменить аксональное участки, подключение различных нейрональных популяций головного мозга. TENGs использовать механизму развития аксон способствовали аксональное регенерации, подтверждается «последователь» аксон роста вдоль аксоны «Пионер», для достижения целевой хост аксональное регенерации^35,46,48. Мы недавно капитализируются на универсальность живых эшафот техника с использованием аналогичной схемы оболочки как микро TENNs и ищет вдохновение от механизмов на основе глии представить на протяжении развития. Здесь мы разработали конструкции, состоящей из унифицированных Астроцитарная связки, охватывающих коллагеновых люмен гидрогеля микро колонки⁴⁹. Эти леса Астроцитарная жизни, разработанные Первое заполнение сборку капиллярной трубки иглоукалывание иглы с жидким агарозы для создания полые цилиндрические гидрогеля с внешнего диаметра (OD) и внутренний диаметр (ID) соответствующих диаметров трубки и иглы, соответственно. После геля агарозы и извлечение микро столбце гидрогеля с капиллярной трубки, полые интерьер является покрытием с типом коллаген предоставлять среде разрешительных для экзоцитоз адгезии и соответствие комплекта формирования (рис. 1B -1). После этого просвет заполняется с мозговой коры астроциты, изолированы от послеродового крыса щенков (Рисунок 1B-2). Вопреки двухмерный (2D) выравнивания методы, которые полагаются на применение электрических полей, micropatterned канавки и внеклеточного матрикса (ECM) белка кучность, экзоцитоз выравнивания в жизни леса способ полагается на самостоятельной сборки по данным контролируемых переменных, таких как субстрат кривизны (столбец ID), плотность ячеек и коллаген концентрации^50,51,52. Астроциты контракт и перестроить коллагена и приобрести биполярный, продольно соответствие морфологии, аналог природных лесов, наблюдается в vivo (рис. 1B-3). Действительно мы активно осуществляем использование этих кабель подобных структур как физические субстратов для целенаправленного руководства миграции незрелых нейронах, а также содействия аксональное регенерации в неблагоприятной окружающей среде повреждения ЦНС, особенно млекопитающих глиальный рубец (рис. 1 c). Эта статья представит подробные изготовления для Астроцитарная микро колонки, фаза контраст и иммунофлюоресценции изображения ожидаемого cytoarchitecture и всеобъемлющее обсуждение текущих ограничений и будущие направления деятельности техника.

Рисунок 1: вдохновение, изготовление протокол и предлагаемых приложений для выровненного Астроцитарная сетей. (A) нейробиологических вдохновение: (1) нейробласты возникая от нейрогенный субвентрикулярной зоны (SVZ) использовать продольно унифицированных глиальных трубки в ростральной миграционных потока (RMS) для направленного миграции к обонятельной луковицы (OB); (2) Non млекопитающих, таких как амфибий и рыб могут поддерживать регенерации после нервной ткани ущерб отчасти за счет формирования глиальных мост, который соединяет заканчивается поражением (например пересекал спинного мозга) и служит леску для руководства регенерирующее аксоны. (B) Обзор изготовления: (1) строительство микро столбца микронного размера, полые гидрогеля с люмен, покрытые ECM, (2) заполнение первичной коры астроциты, изолированы от послеродового крыса детенышей, (3) самосборки продольно ориентированных связки в культуре и (4) добыча комплект из оболочки биоматериала для исследования будущей имплантации. (C) в естественных условиях применения: (1) эти живые леса могут служить инженерии глиальных трубы для направленного нейрон миграции из нейрогенный центров, чтобы населить нейрон недостаточным регионов; (2) резюме развития механизма новаторской руководство аксона и регенеративной механизм глиальных мостов в не млекопитающих может наделить эти Астроцитарная леса с способностью прямой регенерации аксона через не разрешительной окружающей среды млекопитающих глиальный рубец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Все процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование комитетами в университете штата Пенсильвания и Майкл J. Crescenz ветеранов медицинский центр управления по делам и придерживаться руководящих принципов, изложенных в политике службы общественного здравоохранения НИЗ на человека Уход и использование лабораторных животных (2015).

1. Разработка агарозы гидрогеля микро-колонок

1. Сделать 3% агарозном вес/объем (w/v) раствор, весом 3 g агарозы и передачи его в стерильных стакан, содержащие 100 мл Дульбекко фосфатный буфер (DPBS). Добавить стерильные магнитный бар в стакан и поместите его на поверхность горячей плиты/мешалкой. Держите стакан, накрыть, чтобы предотвратить испарение ее содержимое на следующем шаге.
2. Нагрейте агарозы и DPBS при температуре 100 ° C и перемешайте на 60-120 об/мин. Настроить эти параметры, как необходимо и постоянно контролировать прогрессирование процесса распада, как решение изменения первоначально от непрозрачного четкий вид, что означает, что агарозы полностью распущена.
   Внимание: Горячий стакан и решение горячие!
3. Как агарозы раствор нагревается и перемешивают, получить четыре пустые 10 см Петри и добавляют 20 мл DPBS в двух из них. Место иглы для акупунктуры (диаметр: 300 мкм, длина: 40 мм), стеклянные капиллярные трубки микролитр (диаметр: 701.04 мкм, длина: 65 мм, грузоподъёмность: 25,0 мкл) и диспенсером шарик внутри шкафа биобезопасности. Когда раствор жидкого агарозы очищает, поддерживать постоянное Отопление на приблизительно 50 ° C и помешивая, чтобы избежать геля агарозы.
4. Ввести акупунктурные иглы в отверстие нижней колбы распылителя. Вставьте капиллярную трубку через иглу, подвергается снаружи. Закрепите капиллярной трубки, введя часть его в раздел резиновые цилиндра распределитель колбы.
5. Передача 1 мл жидкого агарозы с микропипеткой на поверхности пустой чашке Петри и место один конец капиллярной трубки вертикально (с иглой вставлены) контакт с агарозы, в то время как резиновую крышку распределителя лампы является защемления внутрь. Медленно отпустите давление на крышку лампы распределитель рисовать агарозы в капиллярную трубку.
   Примечание: Передача жидких агарозы в капиллярной трубки должны выполняться быстро. Если остается жидкой агарозы для охлаждения на поверхности Петри достаточное время (примерно 60 s), он начинает гель, предотвращая подходит отсасывание агарозы вдоль капиллярной трубки.
6. Место каждой лампы труба иглы сборки в бесплатную чашку Петри и пусть агарозы гель внутри капиллярных трубок закрепить за 5 минут осторожно потяните капиллярную трубку с руками из резиновой пробкой в цилиндре распределитель колбы, оставляя иглу и гель агарозы в месте внутри трубки.
7. Вручную извлечь акупунктурные иглы, медленно потянув его из капиллярной трубки; также недавно затвердевших агарозы цилиндра слайды из трубки в этой процедуре, по-прежнему вокруг иглы. Нежно подталкивать микро колонки вдоль иглоукалывание иглы с кончика стерильный пинцет, чтобы переместить его в конец. Поместите иглу открытой, DPBS-содержащих Петри и вставьте DPBS микро колонки с щипцами.
   Примечание: Если агарозы микро столбец остается внутри стеклянной капиллярной трубки после удаления акупунктурные иглы, медленно толкать агарозы микро столбец из капиллярной трубки с 25-мм иглы и в блюдо с DPBS.
8. Стерилизуйте микроскальпели или щипцы с использованием горячей шарик стерилизатор. Сделайте 4% w/v агарозы, весом 4 g агарозы и передачи его в 100 мл DPBS. Тепло и движение как описано в шаге 1.2 для получения четких 4% раствора жидкого агарозы. Поддержания нагрева и перемешивания раствора на протяжении следующих шагов.
9. Передача Петри, содержащий микро столбцы, чтобы вскрытия капота и переместить микро столбец с тонкой щипцами пустой чашке Петри. Используют стереоскоп для визуальной ориентации и microscalpel сократить микро столбцы до желаемой длины. Трим обоих концах формы конические концы углом 45^o от горизонтали для облегчения обработки микро столбцов при добавление ECM и ячейки.
10. Повторите предыдущий шаг для трех более микро столбцы в том же Петри и выровняйте четыре конструкции параллельно с разделением < 3 мм между каждым из цилиндра. Загрузить 50 мкл раствора 4% агарозном с микропипеткой и залить микро столбца массива для подключения и комплект конструкций в группы по четыре подряд/линия жидкости (далее называется «микро колонка лодки»). Избегайте движения 4% агарозном к концам микро столбцов, которые могут засорить интерьер, сведения к минимуму расстояние между конструкциями и добавляя агарозы быстро в тонкой линией.
    Примечание: Организация групп четыре микро столбцов в «лодочки» не требуется для изготовления Астроцитарная леса. Тем не менее лодки служат для ускорения процесса изготовления и предложить более безопасный способ перемещения и обрабатывать микро столбцы в последующих шагах.
11. Пусть прохладно микро колонки лодка для 1-2 мин разрешить геля агарозы добавлен 4%. Подбирать лодка микро колонки с тонкой щипцами, соединительные агарозы 4% и переместить микро столбцы других DPBS-содержащих Петри блюдо, приготовленное в шаге 1.1.3. Изготовить больше лодки с оставшиеся микро столбцы нужным.
12. Переместить Петри, содержащий микро столбцы или лодки биобезопасности кабинета и стерилизации с воздействием ультрафиолетового (УФ) света за 30 мин.
    Предупреждение: Носить надлежащую защиту для предотвращения воздействия Ультрафиолета.
13. Хранить блюда с лодки микро колонка в DPBS на 4 ° C, если сложение ECM и ячейки покрытия не произойдет сразу же после этого, вплоть до 1 недели. Повторите шаги микро колонки изготовление, если в течение этого срока не используются конструкции.

2. изоляции и культуры главной ячейки

1. Корковых экзоцитоз изоляции от крыс щенков
   1. В рамках подготовки следующих шагов добавьте 20 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS) для четырех Петри 10 см, которые будут служить в качестве резервуаров для расчлененных тканей. Держите все блюда на льду. Стерилизуйте чистой хирургические ножницы, щипцы, микро шпатель и микро Скальпели в стерилизаторе горячей шарик.
   2. Prewarm трипсин 0.25% с 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 0,15 мг/мл дезоксирибонуклеаза (DNase) я в HBSS при 37 ° C. Кроме того prewarm экзоцитоз питательной среды при 37 ° C, которая состоит из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с ветчиной и F-12 питательной смеси и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).
   3. Анестезировать послеродовой день 0 или 1 день Sprague-Dawley крыса щенков, подвергая их гипотермического условий и усыпить путем обезглавливания. Контактный голову в сцену с помощью 19 мм манометра в морду впереди глаз.
   4. Сделайте надрез с помощью скальпеля посередине кзади передний, от основания шеи до позади глаз. Осуществляют еще один разрез сбоку идя от непосредственно за глаза вниз, образуя Т-образных. Использование тонкой щипцы стащить черепной кожи/черепа в сторону.
   5. Держите голову морду (вверх), поместив один зубец щипцы в рот животного и другой на внешней поверхности. Удаление мозга с стерильных микро шпателем и поместите его в одном из Петри, наполнен охлажденным HBSS. Место это Петри блюдо на льду сразу же после этого и вообще раза за исключением когда в использовании.
   6. Расположить блока гранита, ранее сохраненные при-20 ° C ниже стереоскоп внутри рассечение Худ. Место на поверхности гранита блок для сохранения своей низкой температуре во время процедуры вскрытия Петри с ткани мозга. Используйте стереоскоп как визуального руководство на протяжении следующих шагов.
   7. Если обонятельные луковицы остаются нетронутыми, извлечь их путем резки с щипцами или микроскальпели. Кроме того используйте microscalpel для удаления мозжечка и сделать разрез средней линии, разделяющей две полушарий. Трансфер полушарий с щипцами в чашку Петри, содержащий свежие, охлажденные HBSS.
   8. Вскрыть структур мозга изнутри с microscalpel для получения только раздельный коре полушарий. Использование тонкой щипцы слезает мозговых оболочек, лист как структура, из кортикального слоя ткани и передать новым Петри с холодной HBSS изолированных коре. Используйте microscalpel, чтобы фарш ткани для того, чтобы увеличить площадь поверхности для действий трипсина в следующем шаге.
   9. Использование пипетки Пастера передать 15 мл пластиковых пробирок, содержащий 4 мл подогретую трипсина-ЭДТА (8 коре в каждой тюбике) коре. Разоблачить кортикального слоя ткани трипсина ЭДТА для 5-7 минут при 37 ° C.
   10. С пипетка Пастера, тщательно удалить трипсина ЭДТА и 400 мкл 0,15 мг/мл DNAse I решение для пластиковых пробирок. Агитируйте трубки или вихрь, до тех пор, пока все ткани в отрыве и есть нет оставшихся кусков ткани в жидкости. Если это не возможно полностью раствориться в ткани, удалите оставшиеся фрагменты с кончика пипетки Пастера.
   11. Центрифуга трубка, содержащая решение диссоциированных ячейки на 200 g x 3 мин удалить супернатант с пипетка Пастера не нарушая клетки. Добавьте 1 mL экзоцитоз питательной среды (определенных в шаге 2.1.2) на трубу с микропипеткой и агитировать Ресуспензируйте и создать однородное решение.
   12. Передавать T-75 флакон 10 мл экзоцитоз питательной среды с Серологические Пипетки. Добавьте 250 мкл раствора 1 мл клеток (подготовленных на шаге 2.1.11) с микропипеткой Фляга для пластины одного щенка мозга стоит клеток за флакон. Равномерно распределите разряженные ячейки решения питательной среды и аккуратно агитировать Фляга для дальнейшего содействия равномерное распределение.
   13. Культура покрытием колбы в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO₂. После достижения 24 и 72 h в культуре, механически агитируйте настой отделить типы non сторонник клеток, нейронов и олигодендроциты.
   14. Впоследствии на каждой из этих timepoints, выполните изменение средств массовой информации. Держите флакон вертикально так СМИ культуры лежит на дне колбы, покрывающие не придерживался клетки. Аспирационная питательной среды с пипетка Пастера, нажатие кончиком пипетки против в нижнем углу Колб, чтобы избежать извлечения клетки. Фляга в исходное горизонтальное положение и аккуратно добавить 10 мл экзоцитоз среды над клетки с Серологические Пипетки.
   15. Возвращение колбы в инкубатор после каждого изменения средств массовой информации. После того, как достичь 90% confluency, механически агитируйте настой еще раз, чтобы удалить любые оставшиеся без соблюдения клетки.
   16. Проход астроциты, беря питательной среды с вакуумом и пипетки Пастера. Добавьте 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА с серологические пипетки над придерживался клетки. Аккуратно агитировать Фляга для обеспечения что трипсин охватывает все клетки и инкубировать Фляга для 5-7 минут при 37 ° C и 5% CO₂.
   17. Утолите трипсина, добавив 1 мл среды экзоцитоз клетки с Серологические Пипетки. Извлечение клеток решение из колбу с Серологические Пипетки и перенести его на стерильную 15 мл пластиковых пробирок. Центрифуга трубки на 200 g x 3 мин.
   18. Удалить супернатант с Серологические Пипетки и Ресуспензируйте в 1 мл экзоцитоз питательной среды. Агитируйте трубки, чтобы убедиться, что клетки решение однородной. Подсчитать количество ячеек в растворе с Горяева или счетчик автоматический клеток.
       Примечание: Настой, который обычно составляет 90% притока дает около 3 миллионов астроциты.
   19. Добавьте 10 мл экзоцитоз питательной среды в T-75 колбу. Выполните разбавления 1:4, передав 250 мкл раствора клеток (шаг 2.1.18) с микропипеткой T-75 колбу, уже содержащий питательной среды. Аккуратно агитируйте обеспечить распределение однородной ячейки по всей поверхности колбы.
   20. Повторите шаги 2.1.16-2.1.19 каждый раз, когда 90% confluency достигается для прохода клетки.
2. Корковых нейронов изоляции от плодов крысы
   1. Выполните аналогичные препараты как шаги 2.1.1 и 2.1.2, за исключением, что подогретую СМИ является сопредседатель культуры средств массовой информации, состоящей из Neurobasal средний + дополнение B-27 2% (для нейронов) + 1% G-5 сыворотки бесплатные дополнения (для астроциты) + 0,25% L-глютамина.
   2. Усыпить приурочен беременных эмбриональных день 18 Sprague-Dawley крыс с двуокиси углерода удушья и подтвердить смерть, обезглавливание.
   3. Экстракт плодов крысы и вскрыть коре от остальной части мозговой ткани в чашках Петри, содержащий HBSS на поверхности блока охлажденные гранита, используя стереоскоп для визуальной ориентации и стерилизовать ножницы, microscalpel и щипцы⁵³ . После последовательных рассечение головы мозга, полушарий и коре, передачи каждой ткани в новой заполнены HBSS Петри блюдо.
   4. Фарш кортикального слоя ткани на более мелкие фрагменты увеличить площадь поверхности для трипсина. Передача 4-6 коре с Пастер Пипетка в трубку с 5 мл подогретую трипсина-ЭДТА и поддерживать при 37 ° C, чтобы отделить ткани. В 5-7 мин вручную агитируйте трубки смешивать и предотвращения слипания ткани.
   5. Снять трубку от 37 ° C после 10 мин. Как описано ранее в шаге 2.1, экстракт трипсина ЭДТА и заменить с 1.8 мл 0,15 мг/мл раствора DNAse. Впоследствии вихревой ткани до решения появляется однородной, без фрагментов тканей, плавающие в жидкости.
   6. Центрифуга диссоциированных ткани решение на 200 g x 3 мин. После удаления супернатанта, Ресуспензируйте в 2 мл Сопредседатель питательной среды. Подсчитать количество ячеек в этом растворе с Горяева или счетчик автоматический клеток.
      Примечание: Обычно урожайность-3.0-5.0 x 10⁶ клеток/коры полушария.
   7. Подготовьте новое решение ячейки с плотностью 2.0-4.0 x 10⁵ клеток/мл в средствах массовой информации Сопредседатель культуры, определенных выше.

3. Разработка Астроцитарная кабели внутри микро столбцы

1. Изготовление основных ECM
   Примечание: ECM должен быть добавлен к интерьеру гидрогеля микро колонки в тот же день, в котором будет выполняться заполнение ячейки.
   1. Внутри шкафа биобезопасности, подготовить 1 мг/мл решение крысы хвост типа I коллагена в среде совместно культуры в стерильных microcentrifuge трубку. Поддерживать пробки microcentrifuge с решения ECM на льду все время, за исключением тех случаев, когда в использовании.
   2. Передача 1-2 мкл раствора ECM с микропипеткой на полосе лакмусовой бумаги для оценки ее рН. 1 мкл 1 N гидроокиси натрия (NaOH) или соляной кислоты (HCl) с микропипеткой для увеличения или уменьшения рН раствора ECM, соответственно и Пипетка вверх и вниз для гомогенизации. Проверьте новый pH с полосой лакмусовая бумага и добавить больше кислоты или основания, при необходимости, до тех пор, пока pH стабилен в пределах 7,2-7,4.
   3. Переместить Петри с шагом 1,2 рассечение капот и передачи 4-5 микро столбцы или лодку пинцетом стерильную тонкой пустой, стерильные 35 или 60 мм Петри. С помощью стереоскоп для руководства, расположить 10 мкл кончик микропипеткой на одном конце каждой микро колонки и всасывания очистить Люмене DPBS и воздушные пузырьки. Подтвердите отсутствие воздушных пузырьков с стереоскоп обеспечить что ECM, добавлен в следующем шаге может свободно течь через просвет.
   4. Обвинение P10 микропипеткой решение ECM, место 10 мкл наконечник против один конец гидрогеля микро колонки и доставить достаточно раствор для заполнения люмен (примерно 3-5 мкл), наблюдения за вступление ECM с стереоскоп. Пипетка небольшое водохранилище (2-4 мкл) решения ECM на любом конце микро колонки.
      Примечание: Всегда управлять 4-5 микро столбцы или одна лодка, в то время для предотвращения длительной сушки конструкции, как это может привести к комкая микро столбец структуры. Полностью высохшей микро столбцы прочно прикрепить к поверхности чашки Петри, которая предотвращает их использование для заполнения ячейки. Чрезмерное количество совместно культуры средств массовой информации (как мера гидратации) нельзя добавить в микро столбцы, потому, что это может привести к ECM стеканию во время инкубационного периода, описанные ниже.
   5. Пипетка Сопредседатель культуры средств массовой информации в кольцо вокруг Петри для обеспечения влажности раковина для предотвращения столбцы от пересыхания во время инкубации. Инкубируйте Петри, содержащие ECM-содержащих микро столбцы при 37 ° C и 5% CO₂ для 1 h способствовать полимеризации коллагена перед добавлением нейронов и/или астроциты.
      Примечание: ECM должны образуют слой покрытия внутренней поверхности полой люмен, вместо твердого сердечника ECM, охватывающих интерьер, оба из которых можно наблюдать с помощью стереоскоп. Если ECM формирует ядро, продолжайте инкубационный период до тех пор, пока остается только слой. С этого слоя сформированные экзоцитоз клеток решение может заполнить интерьер микро-в столбце действия покрытия.
   6. Инкубационный период Подготовьте решение клеток экзоцитоз (как описано ниже).
2. Экзоцитоз и нейрон посева в микро столбцы
   1. Проход покрытием астроциты (между четвертой и двенадцатой проход), как описано в шагах 2.1.16-2.1.19. После подсчета количества ячеек в колбу, приготовляют раствор клеток на плотности 9,0-12,0 x 10⁵ клеток/мл раствора в культуре клеток СМИ приостановлена.
   2. С помощью стереоскоп, поместите кончик микропипеткой P10 на одном конце микро-столбцов и передачи достаточно клеток решение (~ 5 мкл) в Люмене полностью заполнить его. Как это сделано выше с ECM, добавьте небольшие водоемы ячейки решения к обоим концам каждого микро столбца.
   3. Инкубируйте покрытием микро столбцы на чашки Петри при 37 ° C и 5% CO₂ за 1 ч до поощрения приверженности астроциты ECM. Если нейроны не будут добавляться к микро столбцы, переходите к шагу 3.2.5.
   4. После первоначального инкубационный период, добавить 1-2 мкл раствора корковых нейронов, полученный на шаге 2.2.7 в обоих концах микро колонок с микропипеткой, отметив под стереоскоп. Убедитесь, что достаточные средства в блюда, чтобы избежать высыхания и снова Инкубируйте 40 минут при 37 ° C и 5% CO₂ для адгезии нейронов.
      Примечание: Корковых нейронов решения также могут быть добавлены 1-2 дней после формирования комплекта, выполняя шаг 3.2.4 после тщательно удаление Петри с микропипеткой культуры средств массовой информации.
   5. После инкубационного периода, тщательно заполните Петри, содержащие покрытием микро колонок с 3 или 6 мл Сопредседатель культуры средств массовой информации для 35 или 60 мм Петри, соответственно. Поддержание позолоченный микро столбцы в культуре при 37 ° C и 5% CO₂ для содействия самостоятельной сборки из унифицированных Астроцитарная связки, которые должны стать комплекте, кабель как структура после 6-10 ч.
3. Стабилизация экзоцитоз кабель архитектуры
   Примечание: После формирования пачек, приблизительно 6-12 ч культивирования конструкции, выполните следующие действия для предотвращения распада унифицированной структуры Астроцитарная леса.
   1. В стерильные microcentrifuge трубку, подготовить коллагена хвост крысы 3 мг/мл я решение в сотрудничестве культуры средств массовой информации. Отрегулируйте рН раствора до 7,2-7.4 следуя указаниям, приведенным в шаге 3.1.2. Поддерживать коллагена фондовых и Сопредседатель культуры средств массовой информации на льду когда не в пользе и место подготовленные коллагена раствор на льду во все времена.
   2. Удалите средства массовой информации из Петри, содержащие Астроцитарная леса с микропипеткой, оставляя некоторые средства массовой информации по бокам блюдо для создания влажности приемника, который обеспечивает увлажнение микро столбцы. Поместите блюдо под стереоскоп для оказания помощи в визуализации.
   3. С микропипеткой принимать 2-3 мкл раствора коллагена и разгрузки для каждого конца микро столбцов, используя стереоскоп для визуальной ориентации. Убедитесь, что блюдо имеет достаточные средства массовой информации вокруг сторон действовать в качестве поглотителя влаги по краям блюдо. Проинкубируйте чашки Петри с микро столбцы для 30 минут при 37 ° C и 5% CO₂ в увлажненные инкубатор для содействия гелеобразования добавленный коллагена.
   4. Медленно добавьте 3 или 6 мл Сопредседатель культуры средств массовой информации (для 35 или 60 мм Петри блюда, соответственно) для Петри блюда с пипеткой и культура блюда в увлажненные инкубатор на 37 ^oC и 5% CO₂.

4. Добыча Астроцитарная пучки из гидрогеля интерьер

1. Стерилизуйте coverslips стекла в автоклаве. Подготовьте 20 мкг/мл раствора поли L-лизин (PLL) в стерильных клетки культуры класс воды.
2. Внутри шкафа биобезопасности вручную передать стерильные 10 см Петри coverslips стерилизованные стеклянные и добавить достаточно PLL решение для покрытия coverslips.
3. Инкубируйте coverslips, покрытые PLL решением, для 30 минут при 37 ° C для покрытия поверхности. Удаление решения PLL с пипетка Пастера после 30 минут промыть три раза путем добавления воды класса культуры клеток в coverslip и его удаления с пипетка Пастера.
4. После формирования унифицированных глиальных расслоение тонко передать микро колонки стерильных Петри пинцетом стерильную тонкой и добавить небольшой бассейн 10 мкл СМИ культуры совместно с микропипеткой для предотвращения обезвоживания и обеспечения здоровья расслоение. Экстракт Астроцитарная пучок из гидрогеля микро колонки, осторожно потянув от одного конца пинцетом стерильные хирургические, используя стереоскоп для визуальной ориентации.
5. Проведение Астроцитарная расслоение с щипцами, смонтируйте его на coverslip PLL-покрытием. Исправить и пятна с протоколом ниже.

5. Immunocytochemistry для исследования In Vitro

Примечание: Для этого исследования, первичного антитела были кролик анти глиальных кислой фибриллово белка (СВМС) (1: 500), мышь анти β-тубулина III (1: 500), кролик анти коллаген I (1: 500), анти Нестин мыши (1: 200) и кролик анти виментин (1: 100). Вторичные антитела были осла анти мыши 568, осел анти кролик 568, осел анти кролик 488 и осел анти мышь 568 (1: 500 для всех). Во всех случаях добавьте достаточный объем каждого решения, чтобы полностью покрыть микро столбцы.

1. Приготовляют раствор формальдегида 4% Объем/объем (v/v) в 1 x DPBS внутри химического зонта.
   Предупреждение: Формальдегид является токсичные соединения, известный канцерогенами и должны утилизироваться в отдельном контейнере. Всегда манипулировать это соединение внутри Химический вытяжной шкаф и использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ) как лаборатории пальто, защитные очки и перчатки.
2. В случае микро колонки отказаться от культуры СМИ от Петри, содержащие конструкции с пипетка Пастера без случайно отсасывание гидрогеля цилиндров. Добавьте достаточно раствора формальдегида для покрытия навесные coverslips (оба из которых остаются на чашки Петри) или микро столбцы и инкубировать в течение 35 минут при температуре 18-24 ° C.
3. Извлечь 4,0% формальдегида раствор из фиксированной микро столбцы или coverslips с Серологические Пипетки. Промойте фиксированной микро столбцы три раза с PBS, быстро добавляя и удаляя PBS дважды и затем давая им замочить на 10 мин в третий раз.
4. Растворяют нормальной лошадь сыворотки (NHS) в PBS для концентрации 4% v / v. подготовить раствор с неионных моющего средства в концентрации 0,3% v/v используя ГСЗ решение в качестве растворителя.
5. Удалите из Петри, содержащие микро столбцы или coverslips с пипеткой PBS. Добавьте достаточно 0,3% раствором моющего средства для покрытия микро столбцы/coverslips 60 мин при температуре 18-24 ° C для разрушения клеток.
6. Вывезти моющего раствора и промыть быстро два раза с PBS и три раза путем замачивания на 5 мин рассчитать необходимый объем 4% ГСЗ и каждой из первичных антител для приготовления раствора с концентрацией желаемого антитела.
7. Удаление PBS из чашки Петри и добавить достаточно основное антитело (разводят в 4% ГСЗ-DPBS) решение для покрытия микро столбцы или извлеченные Астроцитарная связки. Инкубируйте на ночь (12-16 ч) при 4 ° C.
8. Принять решение основное антитело и быстро промыть два раза с PBS и три раза путем замачивания за 5 мин. Приготовляют раствор вторичного антитела, в темноте, с каждого антитела присутствуют при разбавлении 1: 500 в 4,0% NHS решения.
9. Инкубировать клетки с решением вторичное антитело втечение 2 ч при температуре 18-24 ° C. На протяжении всего времени инкубации покрывают Петри, содержащий микро колонок с алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
10. Удаление решения вторичного антитела и добавьте Hoechst раствор (1:10, 000) для 10 мин на 18-24 ° C до пятно ядер.
    Предупреждение: "Хёхст" является известным мутаген, что должно рассматриваться как канцероген. Таким образом, его необходимо утилизировать в отдельном контейнере и СИЗ должны быть использованы в любое время при обработке этого агента.
11. Промойте с PBS пять раз, каждый раз на 5-10 минут, потом, хранить окрашенных микро столбцы при температуре 4 ° C в PBS и накрыть алюминиевой фольгой. В случае навесные Астроцитарная связки добавить каплю водный монтажа средних расслоение, место другой стекла coverslip над фиксированной расслоение и уплотнение обоих coverslips с Лак для длительного хранения и последующей обработки изображений.

6. жизнеспособность Assay с Live мертвых (Флуорексон-AM/ethidium Антуану) окрашивания

1. Подготовка раствора реагента, добавив 5 мкл Флуорексон AM (4 мм в безводный диметилсульфоксида (ДМСО)) и 20 мкл ethidium Антуану-1 (EthD-1) (2 мм в ДМСО/H₂O 1:4 v/v) до 10 мл 1 x DPBS. Охватывать решение с алюминиевой фольгой или хранить в темноте, чтобы защитить его от света.
2. Аспирационная СМИ от Петри, содержащие покрытием микро колонок с пипетка Пастера и добавить достаточно решение (подготовлен выше) для покрытия конструкций. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C и 5% CO₂, сохраняя Петри, покрыты для защиты от света решение.
3. Удаление решения с микропипеткой или пипетка Пастера. Промыть 2 - 3 раза с DPBS, как описано в шаге 5.3. Наводнение Петри с DPBS по размеру блюдо. Сразу же изображение клетки после этого с помощью эпифлуоресцентного или конфокальная томография.
   Примечание: Преобразование проницаемой мембраны Флуорексон утра чтобы Флуорексон метаболически активные клетки дает зеленый флуоресценции Флуорексон. Мертвые клетки, помечаются как под угрозой мембраны клеток, которые позволяют вход EthD-1 в ячейку и ее привязку к нуклеиновых кислот, вызывая красной флуоресценцией.

Representative Results

Первоначально, фазово контрастной микроскопии был использован для контролировать прогрессирование экзоцитоз адгезии и расслоение формирования и общей стабильности cytoarchitecture как функцию от времени. В 1 ч после покрытия астроциты были найдены во всем люмен микро колонок с сферически морфологии (рис. 2A). В 5 ч астроциты начал расширение процессов и контрактов, от 8 h клетки выставлены полный процесс подшипник морфологии и сформировали кабель подобных структур, ориентированных вдоль продольной оси микро колонки (рисунок 2A). В частности, по сравнению с первоначально разбросанных наличие клеток через микро колонки, астроциты появился заразились сформировать сеть плотные пучки вдоль внутренних (рис. 2B). После выравнивания начальной ячейки, экзоцитоз сетей, часто воедино вдоль продольной оси, напоминающие молния закрытия, чтобы сформировать густой расслоение в центре микро колонки (рис. 2 c). Формирование этой комплекте архитектуры объясняется самостоятельной сборки процесс, отчасти продиктован выбор плотности микро столбца ID и клеток. Астроциты выровнены и приобрела биполярной морфологией когда посеян в микро колонок с ID, менее чем в 350 мкм (рисунок 3B, топ и среднего и 3D-3F)⁴⁹. Напротив, эти клетки продемонстрировали случайных направленность, когда использовался идентификатор 1 мм (рис. 3Б, внизу), который похож на внешний вид 2D экзоцитоз культур подвергаются сыворотки бесплатно, совместно культуры среднего (рис. 3A, право). Кроме того, хотя астроциты еще отображения выравнивания в низкой плотности посева (2.0-3.0 x 10⁵ клеток/мл или 2,0-3,0 x 10 клеток/мм^{2 3}) (рис. 3 c), густой сети образуются только при высокой плотности (9,0-12,0 x 10⁵ клеток/мл или 9,0-12,0 x 10² клеток/мм³) в пределах цилиндрической микро колонок подобных размеров (показано на рисунке 3B, топ), как это предлагается в протокола⁴⁹. Жизнеспособность в Астроцитарная пучках была количественно оценена, используя assay жить/мертвые, как соотношение клеток флуоресцирующих зеленого (Флуорексон AM) по отношению к общей площади клеток флуоресцирующих зеленого (Флуорексон AM) и красный (EthD-1). Жизнеспособность Астроцитарная связки был 97,4%, который похож на жизнеспособность 98,2% 2D экзоцитоз культуры управления (рис. 4A-4B), доказав, что окружающей среде в рамках микро колонки подходит для жизнеспособности экзоцитоз ( Рисунок 4E). 3D реконструкций живых и мертвых клеток в Астроцитарная леса также демонстрируют общее выравнивание ячеек в пределах конструкции (рис. 4 c-4 D). Кроме того ультра-длинный Астроцитарная микро столбцы были разработаны для изучения стабильности экзоцитоз расслоений с существенной длины. Даже на внеочередной расстоянии 3,5 см, cytoarchitecture унифицированных, плотной и контракт Астроцитарная связки поддерживался постоянно по всей длине микро колонки (Рисунок 5A), как видно в масштабирования в регионах микро колонны (Рисунок 5B-5 C).

После того, как сформирована, пучки фиксировали и окрашенных методами immunocytochemistry для промежуточного накаливания белки характерные глиальных клеток, таких как СВМС, Нестин и виментин. Конфокальный изображения подтверждают процесс подшипник морфология астроциты и головке процессов (Рисунок 6 и рис. 7). Экспрессия белков промежуточного накаливания можно увидеть в 2D экзоцитоз культур (рис. 7A) а также экзоцитоз расслоений в столбце микро (рис. 6, Рисунок 7B-7 D). Кроме того коллаген пятнать подтверждается наличие этого белка ECM в микро столбцы. Астроциты не образуют структуру непрерывный с коллагеном, когда культивировали в среде 2D (рис. 8A), тогда как астроциты появился придерживаться и перестроить коллагена в Люмене когда культивировали в микро колонки, позволяя для формирования клеток сужением и расслоение, (Рисунок 8B). Наложение каналов СВМС и коллаген продемонстрировал, что экзоцитоз кабелей состоит из тесно связанных процессов с продольной коллагеновых волокон (Рисунок 8B). Таким образом помимо предлагая Анкоридж, фибрилл коллагена могут также предоставили дополнительные направленного подсказки для астроциты сформировать плотные пучки после сжатия. В некоторых случаях сокращение экзоцитоз коллаген сохраняются, приводит к крах соответствие комплекта свыше 12-24 ч после формирования (Рисунок 9A). Для того чтобы стабилизировать кабель как экзоцитоз архитектуры в рамках микро столбцы гидрогеля, дополнительные коллагеновой матрицы был добавлен в концах полностью сформированные пачки тормозить дальнейшее сокращение и свернуть. Это подкрепление техника позволили за выживание желаемого кабель архитектуры для по крайней мере 4 дней, с окном больше стабильности ожидается (рис. 9B). Кроме того представитель Астроцитарная связки были извлечены из микро столбце гидрогеля, установлены и фиксированной с 4% формальдегида на стекло coverslips для оценки их устойчивости при воздействии силы натяжения и внешней среды. Даже после того, как добыча и физические манипуляции в различные формы (Рисунок 10А, 10B), Астроцитарная somata и процессов поддерживается соответствие, в комплекте микро масштабе морфологии (рис. 10 c), подсветка отказоустойчивость самостоятельно соответствие Астроцитарная леску, однажды сформирована, даже если отсутствует структурной поддержки микро столбце гидрогеля.

Основная корковых нейронов были также совместно культивируемых с астроциты внутри микро столбцы для изучения ли экзоцитоз связки были способны разжигании нейрональных адгезии и neurite нарост. СВМС и белка микротрубочек β-тубулина III были используется как определенных маркеров для астроциты и нейронов, соответственно. Рисунок 11А показывает, что астроциты, совместно с семенами с корковых нейронов способны также экспонируется процессов и формирования унифицированных связки. Нейроны, как представляется, придерживаются преференциально экзоцитоз связки, поскольку все положительные β-тубулина III пятнать совместно локализованы с СВМС (оверлеев Рисунок 11б-11 C). Чтобы продемонстрировать восстановительных свойств Астроцитарная конструкций, корковых нейронов (Рисунок 12B) были покрытием в рамках микро столбце гидрогеля 2 дня после того, как были астроциты покрытием (Рисунок 12А). Нейроны придает экзоцитоз расслоение и продлил невритов прямо вдоль Астроцитарная участки. Дальнейшие инспекции показали neurite нарост, ориентированной в направлении Астроцитарная кабеля, тогда как в регионах, где не присутствовал в урочище экзоцитоз, невритов были замечены в неорганизованной манере (рис. 12 c). Эти наблюдения показывают, что протокол приводит в соответствие, жизнеспособный и надежный Астроцитарная сетей, которые могут выступать в качестве имплантируемые жизни путей содействия нейрон адгезии и neurite нарост.

Рисунок 2: Brightfield микроскопии показывает формирование экзоцитоз связки в пределах гидрогеля микро столбцы со временем. (A) экзоцитоз морфология как функцию от времени после покрытия: (1 h) астроциты сферическую форму и рассеянных по всей конструкции; Астроциты (5 h) инициировать процесс расширения и сжатия; Астроциты (8 h) выровнены и контракт. Масштаб баров = 100 µm. (B) Bundle формирования со временем в дополнительного представителя эшафот: (1 h) первоначально астроциты сферических и не демонстрируют процессы; образуется плотный пучок Астроцитарная процессов (24 ч). Масштаб баров = 300 мкм (слева) и 500 мкм (справа). (C) полностью сформирован Астроцитарная расслоение 24 ч после покрытия, показаны эффект «zippering», где концы кабеля придают различные концы стен люмен. Шкалы бар = 1000 мкм.

Рисунок 3: внутренний диаметр микро колонны и влияние плотности клетки самостоятельной сборки из унифицированных пучков биполярного астроциты. (A) 2D экзоцитоз культур с сыворотка содержащих средств массовой информации (слева) и Сопредседатель культуры, свободной от сыворотки (справа) показывают морфология-процесс и несколькими процессами подшипника, соответственно. Масштаб баров = 100 µm. (B) астроциты посеян на высокой плотности (9,0-12,0 x 10⁵ клеток/мл) в микро колонок с идентификатором 180 и 350 мкм пучков формы выровнены относительно продольной оси, а идентификатор 1 мм результатов в астроциты, отображение нескольких, Невыровненные процессов на протяжении всего диаметр просвета. Масштаб баров = 100 мкм (вверху, в середине) и 150 мкм (внизу). (C) астроциты, посеяна в микро столбец ID 350 мкм при низкой плотности (2.0-4.0 x 10⁵ клеток/мл) по краю, но не в комплекте. Шкалы бар = 100 µm. (D) когда покрытием в микро столбца ID 350 мкм плотность низких или средних клеток, астроциты приобрести биполярной морфологией. Масштаб баров = 300 µm. (E) поле D показаны зум в цепи двухполярного астроциты формы внутри гидрогеля микро столбцы. Шкалы бар = 300 µm. (F) пример индивидуального биполярного экзоцитоз. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: астроциты остаются жизнеспособными после формирования в рамках гидрогеля микро столбце Bundle. (A-B), (C-D) 3D конфокальных реконструкций, показаны жизнеспособность клеток Вселенский культур и соответствие Астроцитарная связки, соответственно, как assayed с Флуорексон AM/ethidium Антуану окрашивание (зеленый жить клетки; красный мертвые клетки). Количественной оценки (E) живых и мертвых клеток в результате аналогичный процент живут/мертвые астроциты когда культивированный на 2D поверхности и в микро столбцы. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: фазово контрастной образ представителя ультра-долгий Астроцитарная Bundle соответствие в пределах гидрогеля микро столбце. (A) Bundle образование на протяжении всей длины столбца микро 3,5 см. Шкалы бар = 1000 мкм. (B-C) выше увеличение масштаба ins показаны экзоцитоз выравнивание в различных регионах вдоль всей конструкции, соответствующие поля в A. Масштаб баров = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: Immunolabeling Астроцитарная подмостей демонстрирует головке Астроцитарная процессов. (A) конфокальный реконструкция Астроцитарная расслоение, показаны пятнать СВМС (красный; слева) и ядра (Hoechst; средний) и наложение обоих каналов (справа). (B) выше увеличение масштаба в Астроцитарная расслоение в регионе в штучной упаковке в разрешений визуализации cytoarchitecture астроциты в микро столбцы. Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: характеристика представитель Астроцитарная связки через иммуноцитохимии. (A-B) Астроциты, культивируемых на 2D поверхности и семенами в гидрогеля микро столбцы выразить аналогичные Астроцитарная маркеры СВМС (красный) и виментин (зеленый). (A) конфокальный реконструкция 2D Вселенский экзоцитоз культуры, показаны отдельно и Объединенные каналы. Шкалы бар = 100 µm. (B) конфокальный изображений Астроцитарная комплекта, подтверждающий выражение маркеров и демонстрации экзоцитоз выравнивание. Шкалы бар = 50 µm. (C-D) культивировали в течение микро столбцы Астроциты также выразить промежуточного накаливания белки Нестин (красный) и виментин (зеленый). (C) конфокальное изображение Астроцитарная расслоение. Шкалы бар = 100 µm. (D) выше увеличение масштаба в C. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: астроциты в соответствие связки тесно взаимодействуют с контракт, продольные коллагеновой матрицы, в отличие от неравномерное расположение коллагена в 2D культур. Клетки были полученных наблюдать астроциты (СВМС; красный), ядра (Hoechst; синий) и коллаген (зеленый). (A) 2D экзоцитоз культур с коллагеном в 1 мг/мл Показать невыровненных астроциты и случайно распределенными коллагена. Шкалы бар = 250 мкм. коллаген (B) снял из стен люмен микро колонки и контракт сформировать соответствие матрицу, которая является частью Астроцитарная расслоение. Шкалы бар = 150 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: дополнительные коллаген может использоваться для стабилизации структуры Астроцитарная кабели. (A) связки формируется примерно 6 ч после покрытия астроциты в коллагена покрытием гидрогеля микро столбцы. После того, как были сформированы связки, выше концентрация (3 мг/мл) коллагена был добавлен к концам микро столбце ингибируют сокращение Астроцитарная кабелей. В конструкции не стабилизировалась с дополнительным коллагена Астроцитарная коллагена расслоения начали сократится на 18 h, и экзоцитоз кабели полностью рухнула на 24 ч. Это сокращение не наблюдалось, когда связки были усилены с коллагеном 3 мг/мл. Шкалы бар = 1000 мкм. (B) масштаб в свернутых Астроцитарная пачки не армированные с коллагеном 3 мг/мл. Шкалы бар = 500 мкм. (C) зум в регионах из коллагена усиленный микро столбцов. Морфология расслоение экзоцитоз сохранялся во всем объеме микро колонки. Масштаб баров = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10: добыча Астроцитарная пучки из микро колонки и монтажа на стекло с покрытием поли L-лизин Coverslips свидетельствует о надежности техники. (A) Фазовый контраст изображения нескольких извлечено Астроцитарная связки, манипулировать в орфографии слово «Пенн». (B) конфокальный реконструкции одного и того же извлечены связки, окрашенных Астроцитарная маркер СВМС (красный) и клеточных ядер (Hoechst; синий). Шкалы бар = 100 µm. (C) увеличение в штучной упаковке региона в B показывает, что, даже когда обманным путем неправильной формы, Астроцитарная леса сохраняют выровненные, биполярной морфологией и комплекте cytoarchitecture. Шкалы бар = 200 µm. Обратите внимание, что любые структурные различия между фазы и конфокальный изображения скорее всего артефакт конструкции ветра благодаря промывка в ходе процедуры иммуноцитохимии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 11: нейроны придерживаться и расширить невритов вдоль унифицированных экзоцитоз связки в нейрон экзоцитоз совместно культивируемых подмостей. (A) фазово контрастной образ Астроцитарная расслоение, нейрон семенами. Шкалы бар = 300 µm. (B)-(C) нейронов наблюдались придерживаться Астроцитарная связки и расширить невритов вдоль оси кабеля (Хехст синий; СВМС зеленый; Β-тубулина III-красный). Масштаб баров = 200 и 100 мкм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 12: экзоцитоз кабели служат живущих леску для направленных нарост Neurite. Конфокальный реконструкций, показаны региона микро колонки, состоящий из нейронов посеян около 2 дней после формирования комплекта. (A) СВМС позитивных экзоцитоз связки, (B) β-тубулина III положительным нейронов и (C) слияние всех каналов, включая витражи HOECHST ядер (синий). Обратите внимание, что нейроны выставлены neurite выравнивания когда придерживаться регионы с выровненным экзоцитоз процессы (стрелки), тогда как нейроны не привязаны к выровненным астроциты, по-видимому, проявляют случайных (то есть Мульти направленная) neurite нарост (стрелки). (D) зум в регионе показывает направленность neurite нарост. Масштаб баров = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

По сравнению с более благоприятной среды ПНС, ЦНС в обработке негативные последствия нейротравма и нейродегенеративные особенно ограничено. После серьезным оскорблением млекопитающих ЦНС глиальный рубец образуется, состоящий из основного фиброзных и воспалительных клеток, окруженный плотной сети дезорганизованы реактивной астроциты, которые выделяют аксона ингибирующих нарост протеогликаны¹⁴. Этот шрам действует как физических и биохимических непроходимость против регенерации аксона окончаний¹². Кроме того Взрослый центральной нервной системы млекопитающих обладает ограниченные источники новых нейронов для восстановления утраченных клеток после травмы или нейродегенеративные, так как неврогенный центры ограничены SVZ, зубчатой извилине гиппокампа и потенциально другие обычно неактивных районы⁵⁴. Идеальной стратегии обходило бы как аспекты ограниченные возможности рекуперативные ЦНС, что нынешние подходы не адрес. Таким образом Наша исследовательская группа разработала на основе экзоцитоз подмостей, направленные на представление пути жизни нейронной миграции нейрон недостаточным районы и управляемое расширение регенерации аксона конусы роста. Соответствие Астроцитарная связки, содержащиеся внутри коллагена агарозы микро-столбца представляют эти Астроцитарная жизни леса. Значительное различие от обычных клеток и биоматериал-на основе стратегий, используемых для ремонта ЦНС и регенерации, что является cytoarchitecture этих конструкций полностью предварительно отформованных в пробирке имитировать несколько в естественных условиях Руководство на основе глии и леса архитектуры. Например во время эмбрионального развития, радиальной глии пути действуют как живые леса для новых нейронов, миграции и коры головного мозга, глиальные клетки посредником целевых расширение новаторской аксонов, выдавая узорной субстратов и/или ориентиром клетки^{35 ,,3839}. Эмбриональных радиальной глии в Субвентрикулярная зона также производят астроциты, которые образуют продольно унифицированных глиальных трубы, над которыми нейробласты постнатально мигрируют в цепи образование от SVZ Обь⁴¹. Кроме того было продемонстрировано в некоторых не млекопитающих, которые, после ЦНС ущерб, в большей степени регенерации возможен за счет формирования организованной, соответствие Астроцитарная композиция⁴⁴. Например, Взрослый данио рерио способны регенерировать их шнуры спинного мозга после миграции незрелых глиальных клеток для поражения сайт, дифференцировку в биполярной морфологией и удлинение глиальных процессов для преодоления поражения, образуя путь, направляет восстанавливающий аксоны⁴⁵. Инженерных конструкций унифицированных Астроцитарная пучки могут быть способны изложив эти механизмы и представляя необходимые структурные и растворимых сигналов для ГЛИА опосредованной нейронной миграции и регенерации аксона³⁵. Кроме того за счет включения живых астроциты, эти конструкции может активно представлять необходимые экологические сигналы, основанные на обратной связи от узла.

В нашей технике, выравнивание экзоцитоз является самостоятельной сборки процесс зависит от физических сигналы и взаимодействия клеток внутренний диаметр микро колонны, коллаген концентрации и плотность посева. Еще одной привлекательной особенностью этого метода является его размер мкм шкала, которая может позволить для малоинвазивных имплантации в пострадавших районах центральной нервной системы. Кроме того результаты, представленные в этой рукописи показывают, что конструкции, полученные с протоколом обладают высокой жизнеспособности и выразить промежуточного накаливания белки СВМС, Нестин и виментин, независимо от возраста экзоцитоз, определенных по номеру прохода . Хотя как общего, так и виментин выражаются в зрелые и незрелые астроциты, Нестин ограничивается главным образом недифференцированная или незрелых клеток, с созревания глии upregulating выражение СВМС и снижение производства Нестин^{45, 55}. предыдущие исследования показали что экзоцитоз поведение изменения с возрастом, однако последовательное выражение промежуточного накаливания белков, а также планшеты был замечен в диапазоне проход чисел (проходы 4-12)⁵⁶. Астроцитарная леса также были продемонстрированы достижения ультра-долгий, сантиметр масштаб длин в пробирке, который свидетельствует о том, что этот метод может быть адаптирована к длины различные травмы и геометрия столкнулись в естественных условиях. Кроме того соответствие Астроцитарная связки демонстрируют замечательные структурной целостности и стабильности, как их cytoarchitecture кабель как сохраняется даже после подвергнуться извлечения из микро столбцы. На основе экзоцитоз жизни лесов также поддержку нейрон адгезии и neurite нарост, укрепить потенциал этой техники для содействия миграции и аксон расширение направлено нейрон для ремонта ЦНС.

Соответствие Астроцитарная связки, содержатся коллагеновых внутри оболочки Защитный трубчатый гидрогеля. Изготовление Астроцитарная леса начинается с микро колонки Ассамблеи, вставив акупунктурные иглы в капиллярную трубку и отсоса жидкости агарозы в него. Агарозы был выбранным биоматериала из-за его инертных свойств, биосовместимость и легко контролируемых механических, физических и биохимических свойств⁴⁹. Концентрация агарозы в гидрогеля может быть важной переменной, так как клетки чувство механических раздражителей от их подложки (например , жесткость) и реагировать с внутриклеточные изменения⁵⁷. Критерии проектирования для этих микро колонки включает в себя достаточно высокой пористости возможность для адекватного общественного транспорта, но небольшой достаточно поры запретить боковых процесс нарост; Эти критерии удовлетворяются с помощью нано открыть пористость в агарозы в концентрации, используемые в настоящем Протоколе. Агарозы концентрация в этот протокол также был выбран из-за его стабильность, простоту обработки и сходство в механических свойств в среде мозга⁵⁸. Следует отметить рассмотрение является Центральный размещение иглы в капиллярную трубку. Зачастую игла может быть слегка наклонные или перемещенных во время процесса, вызывая люмен будет расположен вне центра относительно внешних стен, после удаления геля и микро колонки агарозы из трубки. Чтобы избежать этого, игла должна быть прямой, и поршень труба иглы Ассамблее следует сохранить в вертикальном положении в то время как настоящее время обращается агарозы сохранить иглу вдоль центральной оси. Точные централизации просвета гарантирует соответствие астроциты между агарозы стены; люмен-более подвержены сверлении если расположен проксимальнее внешнего края цилиндра. Кроме того достаточное расстояние между просвета и внешняя стена может предложить защитные преимущества во время и после трансплантации (при условии Астроцитарная конструкции, не удаляются из предварительного микро колонки для имплантата). Этот начальной стадии изготовления Астроцитарная леску первостепенное значение для успеха этого метода, как выбор диаметра иглы имеет решающее значение для надлежащего экзоцитоз Сома/процесс выравнивания и кабель самостоятельной сборки. Мы обнаружили, что экзоцитоз выравнивание обратно зависимой от микро столбца ID, с оптимального диапазона идентификатор для выравнивание ячеек и формирование связки надежный экзоцитоз, будучи 180 до 350 мкм (рис. 3). Аналогичным образом ранее было продемонстрировано, что нейроны направлять их нарост вдоль направления кривизны минимальные субстрата для уменьшения процесса гибки^59,60, и аналогичные механизмы, вероятно, на работе, чтобы повлиять на экзоцитоз Выравнивание в нашей системе⁴⁹. В дополнение к кривизны затрагивающих экзоцитоз выравнивание мы обнаружили, что 180 до 350 мкм ID диапазона привели к астроциты, приобретения биполярной морфологией⁴⁹, вопреки севрюга, многополярный формы, наблюдается с идентификатором 1 мм или когда астроциты были культивировали в 2D (рис. 3). Вполне вероятно, что эти глубокие морфологические изменения морфологии биполярного экзоцитоз изменить их физиологических особенностей Например эти астроцитов может выразить альтернативные secretable факторов или ячейки поверхностных маркеров, которые могут быть выгодными для регенерации, но это заслуживает дальнейшего характеристика. В целом наши выводы продемонстрировать, что подходящий выбор физического подсказки, например кривизны поверхности, необходимо подражать родной cytoarchitecture в Астроцитарная жизни леса.

Строительство Астроцитарная леса продолжается с последовательным включением решение ECM коллагена и корковые астроциты в полые интерьер микро столбцов. Внутренний просвет микро колонки покрыта с коллагеном для поддержки экзоцитоз выживания, привязанности и формирование выровненных расслоение, вследствие неспособности агарозы самостоятельно поддерживать neurite нарост⁶¹. Коллаген концентрации 1 мг/мл был выбран потому, что предыдущие исследования установлено, что ниже и выше концентрации привели к отсутсвие адгезии и нестабильности ECM, соответственно⁴⁹. Таким образом как и ожидалось, концентрация коллаген имеет драматическое влияние на эффективность этой методики. Кроме того решение ECM состоит из только типа я коллагена. По сравнению с Ламинин и покрытием Matrigel субстраты для 2D Астроцитарная культур, астроциты покрытием типа я коллагена продемонстрировал оптимальной адгезии и формирование сети⁶². Время инкубации, используемых для полимеризации коллаген до заполнения ячейки является также важным шагом в протоколе. Ранее мы обнаружили, что когда нейроны были поставлены параллельно с unpolymerized ECM в агарозном микро-столбцы, снижение neurite нарост и аксональной подрагивание были замечены⁴⁷, и вполне возможно, что эти выводы будут распространяться на астроциты а также. Так как коллаген требуется для формирования адгезии и расслоение экзоцитоз, присутствие ECM всей конструкции и отсутствие воздушных пузырьков или пустые карманы следует визуализировать и подтвердил с микроскопическим методами.

Протокол заключает с экзоцитоз, обшивка, инкубационный период для обеспечения адгезии клеток коллагена, и краткосрочных культуры для формирования целевой cytoarchitecture. Астроциты между проход номер 4-12 были использованы, как они выставлены надежные Астроцитарная планшеты и коллаген Реформации. Эти Астроциты также представил зрелых фенотип, состоящий из > 95% чистых культур^63,64 с практически нет нейронов загрязнения. В отличие от обычных экзоцитоз культур, которые используют сыворотки содержащих среднего (слевана рисунке 3A, ), наша техника использует сыворотки свободный среднего разрешить астроциты принять процесс подшипник морфологии (рис. 3A, право ) и формируют пучки соответствие somata и процессов в рамках микро столбцы^62,,6566. С точки зрения заполнения концентрации клеток более высокие концентрации в диапазоне 9,0-12,0 x 10⁵ кл/мл, с идентификатором 350 мкм, привели к формированию плотно упакованных пачек с сопутствующими коллагена Ремоделирование, в то время как более разогнали астроциты , но все еще совпадают, при более низкой концентрации использовались (рис. 3 c). Таким образом эффект заполнения концентрация на ячейке взаимодействия влияет на степень экзоцитоз выравнивание и формирование наблюдаемых кабель подобных структур. Инъекции раствора клеток в просвет обычно визуализируется с использованием стереоскоп для обеспечения однородной доставки по всей длине микро колонка, которая имеет решающее значение для формирования непрерывного расслоение. После посева, время предварительной инкубации до затопления с культуры средств массовой информации является необходимым условием обеспечения Анкоридж астроциты в ECM. Продолжительность может быть изменен, если астроциты побег из конструкций, при том условии, что конструкции достаточно увлажняется препятствует сушки. Этап контраст изображения Астроцитарная лесов как функция времени показал, что на 8 ч, сеть унифицированных Астроцитарная связки в настоящее время формируется. Кроме того отряд ECM от Люмене стены, ее последующего сокращения и жесткая связь между клетки и контракт коллагена наблюдалась при конструкции были помечены для коллагена и СВМС, как показано на рисунке 8. Это явление, возможно, является следствием Астроцитарная сократительной силы, отсоединение коллагена от стен, основанных на предыдущих докладах фибробластоподобных способность генерировать силы, которые искажают гибких подложках и матрицы Ремоделирование глиальных клеток способность астроциты в экзоцитоз только и нейрон экзоцитоз совместно культур^28,,4967,68. В частности одним из последствий экзоцитоз моторики и при посредничестве Интегрин взаимодействия с фибрилл коллагена это поколение сил, достаточную для контракта^17,фибрилл⁶⁹. В целом осуществление описанных протокола будет производить жизни леса состоят из собственн-собранные сетей плотные, выровненные Астроцитарная кабель подобных структур, которые пилки физической субстратов в несколько этапов развития ЦНС.

Помимо отдельных вопросов, которые могут возникнуть в течение протокол техника Астроцитарная лески обладает другие препятствия, которые могут повлиять на его способность к ремонту ЦНС. Например в конечном итоге успех этого метода зависит от пластичности нервной системы и функциональной интеграции Астроцитарная леску с узла схемы. Относящиеся к имплантации этих лесов является возможность воспалительной реакции, которая может противостоять про восстановительной атрибуты Астроцитарная связки. Все методы, основанные на трансплантации имеют способность к разрыву blood - brain барьер и вызвать проникновение воспалительных клеток, из-за близости между нейронами и капилляров в ткани⁴⁷. В этом случае микро столбце Гидрогель или другой оболочки схемы для Астроцитарная леса может использоваться как средство для контролируемого высвобождения противовоспалительных факторов для уменьшения воспалительной реакции. Первоначально соответствие Астроцитарная расслоение не была стабильной внутри микро колонка, как силы, которые заставляют выравнивание ячеек и матрица Ремоделирование в конечном итоге привело к краху желаемого cytoarchitecture после 1-2 дня в культуре. Однако дополнительные сокращения и расслоение коллапс был затруднен, предоставляя дополнительные подкрепления для связки на концах микро колонки, добавив более высокие концентрации коллагена для того чтобы держать пакет в место. Дополнительные тактика может быть использовать вторичные инкапсуляции, whereby нового гидрогеля покрытия применяется к соответствие Астроцитарная связки как они берутся из микро столбцы. Вполне вероятно, что доставки унифицированных экзоцитоз сетей в мозг также будет стабилизировать конструкций вследствие ячеек спайки между принимающей и конструкция клетки по всей длине, хотя это будет должна быть проверена непосредственно в будущих исследованиях.

Соответственно, будущие усилия будут направлены на разработку эффективной пересадки метод, который обеспечивает стабилизации и защиты Астроцитарная пучка во время и после родов в естественных условиях для миграции нейронов, ремонт, и Регенерация в потерпевшего ЦНС. Мы продемонстрировали ранее успешной имплантации нейрональных аксональное-на основе/микро TENNs, которые разделяют оболочки схемы конструкций Астроцитарная, в corticothalamic пути, что приводит к выживанию и структурной интеграции с принимающей ткани по крайней мере до 1 месяц^46,47. Таким образом надежность Кабели после извлечения из микро столбцы могут быть использованы. В этом случае гидрогеля агарозы послужит в качестве первоначальной культуры кровать для самостоятельной сборки и затем будет удален из оболочки и непосредственно впрыскивается в мозг с помощью иглы тонкостенных Астроцитарная кабель. Экзоцитоз деформации из-за механических сил во время извлечения из микро столбце гидрогеля не наблюдалось и не ожидается. Предыдущая работа, изучение воздействия механической деформации на реактивность экзоцитоз свидетельствует о том, что любые результирующие деформации не будет достаточно быстро применяться заставить astrocytosis или процесса удлинения^62,70. Чтобы свести к минимуму повреждения ткани мозга и возможных воспалительной реакции, связки в пределах гидрогеля может быть имплантированы с помощью иглы менее технологии, разработанной ранее для микро TENNs. В этой методологии гидрогеля покрыта тонким слоем карбоксиметилцеллюлоза, позволяющая иглы менее вступления в мозг, который может уменьшить подрывной и воспалительных след имплантации⁴⁷. Впоследствии трансплантации исследований могут быть выполнены для оценки способности этих лесов, чтобы выжить, интегрировать с ткани макроорганизма и поощрять нейронной миграции и аксон руководство. В частности эти конструкции могут быть имплантированы с одного конца, вытекающих из нейрогенный региона например SVZ для доступа к его бассейн нервных стволовых клеток и нейробласты, в прямой мимикрии RMS, и другой конец подключен к узлу травмы потенциально диск нейронной миграции и населить области в дозированных моды.

После пересадки протокола оптимизации техника может быть улучшена в других областях. Микро столбцы могут изготовлены специально с незрелыми астроциты (например радиальной глии, RMS-тип клеток) или Зрелые фенотипов, которые позже Дедифференцированная дополнить вызывая регенеративные способности этих конструкций⁴⁹. В модели в vitro глиальный рубец Зрелые астроциты не имел возможности формирования пути для axon нарост⁷¹. В отличие от незрелых астроциты было показано, содействовать neurite нарост в пробирке и аксональной регенерации в естественных условиях когда пересаженные одновременно с chondroitinase ABC для решения высокого уровня CSPGs в глиальный рубец^{71 , 72}. одновременно с появлением персонализированной медицины, аутологичные Астроцитарная микро столбцы могут быть разработаны посева стволовые клетки от источников таких как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) и нервных стволовых клеток (hNSCs). Это изменение позволит эти подмости функционировать в качестве трубопроводов для индивидуального и конкретные пути восстановления и регенерации. Кроме того, использование этих источников ячейки могут обойти возможные иммуногенность ответ что экзоцитоз имплантации может вызвать. Даже несмотря на то, что иммуногенности отличается согласно iPSC клеточных линий, эти клетки способны теоретически предотвращения или уменьшения иммунной реакции после трансплантации, как это было предложено отсутствие вредного ответы после iPSC производные орган Имплантация в мышей^73,-⁷⁴. Кроме того аутологичные hNSCs и их производные Астроцитарная подавлять аллогенной иммунных реакций⁷⁵. Следовательно изготовления этих соответствие экзоцитоз сетей с аутологичных стволовых клеток может быть критическим будущее шаг делает этот метод более легко применимым в клинических условиях.

Помимо приложения как трубы для ремонта ЦНС и регенерации Астроцитарная жизни леса может использоваться как в vitro тест кровать, с или без оболочки гидрогеля, на основе целей тестирования конкретной парадигмы. Например эти Астроцитарная конструкции может использоваться для изучения нейробиологических такие явления, как расширение миграции и neurite нейрон, посредничестве астроциты, используя управляемые свойства и 3D окружающей среды жизни леса как модели в естественных условиях условий. Протокол, обсуждается в этой рукописи подробно изготовление собственн-собранные соответствие Астроцитарная пучки коллагеновых матрицы в рамках микро столбец гидрогеля. При перечислении функций мозга нейроанатомия, развития/восстановительных механизмов и пути миграции neuroblast, эти имплантируемый Астроцитарная леса имеют потенциал предложить поддержку пути для нейронной миграции и аксон руководство в противном случае ингибирующее среде повреждения ЦНС.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).