Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Summary

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Abstract

Neurotrauma ve nörodejeneratif hastalık genellikle neden kayıp nöronlar değiştirmek ve aksonal yolları yeniden oluşturmak için merkezi sinir sistemi (MSS) sınırlı kapasitesi nedeniyle nörolojik açıkları kalıcı. Ancak, sinir sistemi gelişimi, nöronal göç ve aksonal uzantısı sırasında sık sık "yaşam iskele" anılacaktır diğer hücreleri tarafından kurulan yollar boyunca oluşur. Bu mekanizmalar taklit etmek ve MSS inhibitör ortamının circumvents bir strateji tasarlamak için arayan, bu el yazması mühendislik doku imal etmek bir protokol sunar astrocyte tabanlı "yaşam iskele". Bu yapıları oluşturmak için kendi kendine bipolar somata boyuna hizalanmış ve süreçlerin yoğun üç boyutlu demetleri monte astrocytes ikna etmek için bir roman biomaterial mantolama düzeni çalıştırmaya başladık. İlk, içi boş hidrojel mikro-sütunları toplandı ve iç Lümen kollajen hücre dışı-matriks ile kaplanmış. Disosiye serebral kortikal astrocytes sonra silindirik mikro-sütun ve kritik iç çapı, Lümen içine teslim < kendiliğinden kendini hizalanmış ve yoğun demetleri oluşan uzun elyaf benzeri kabloları üretmek için sözleşmeli 350 µm astrocyte süreçleri ve kollajen liflerinde ölçme < çapı henüz birkaç cm uzunluğunda uzanan 150 µm. Bunlar yaşam iskele sergilenen Mühendislik > % 97'si hücre canlılığı ve neredeyse sadece edildi bir arada ara filaman proteinler fibrillary gliyal asidik protein (GFAP'nin), vimentin, ifade ve testin astrocytes oluşur. Bunlar ağlar için nöronal ek izin veren bir substrat sağlamak bulundu ve neurite uzantısı uyumlu astrocyte uyumlu. Ayrıca, bu yapıları korumak bütünlüğü ve CNS implantasyon için uygundur hidrojel mantolama üzerinden ayıklandığında hizalama. Bu ön şekillendirilmesi yapıları, yapısal olarak doğal olarak meydana gelen anahtar cytoarchitectural öğeleri taklit "iskele yaşayan" içinde vivogliyal tabanlı. Bu nedenle, bu mühendislik yaşam iskele nörogelişimsel mekanizmaları vitro çalışma veya neuroregeneration nöronal göç ve/veya CNS dejenerasyon içinde vivo takiben aksonal kılavuz yönlendirerek kolaylaştırmak için test-yatak olarak hizmet verebilir .

Introduction

Merkezi sinir sistemi (MSS) kaybı ve/veya nöronlar ve travmatik beyin hasarı (TBY), gibi koşullar eşlik aksonal yolları disfonksiyon karşı koymak için sınırlı bir kapasiteye sahip inme, omurilik yaralanma (SCI) ve nörodejeneratif hastalık^{1 ,2,3,4,5}. MSS neurogenesis beyin, kayıp nöronlar^6,7restorasyonu engelleyici alanda sınırlı sayıda sınırlıdır. Ayrıca, MSS kayıp aksonal yollar rejenerasyon yönlendirilmiş rehberlik eksikliği, akıbet inhibitörleri ve reaktif astrogliosis sinir dokusu^2,8' e^{hasar takip varlığı nedeniyle yetersiz olduğunu, 9,10}. Astrocytes genellikle nöronlar iyon Homeostazı, nörotransmitter gümrükleme, sinaps oluşumu ve¹¹kaplin nörovasküler yardımcı çeşitli işlevlere sahiptir. Yine de, onlar Hipertrofik devlet¹¹' e geçiş olarak sinir dokusu hatta hafif hasar, moleküler, yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri astrocytes meydana gelebilir. Şiddetli neurotrauma yanıt olarak, bu bir yara oluşumuna geçirme reaktif astrocytes ve parçalanmış kan - beyin bariyerini (BBB), microglia sızan lökosit içerir bir lezyon çekirdek içeren bir penumbra ile değiştirilmesinden, oligodendrocytes ve fibroblastlar^11,12,13. Bu reaktif astrocytes ipliksi, dağınık süreçlerin bir Morfoloji ulaşmak ve ara filaman proteinler ve nöral rejenerasyon¹²engel kondroitin sülfat Proteoglikanlar (CSPGs), artan ifadesi sergilemek. Gliyal yara başlangıçta BBB bütünlüğünün ve sağlıklı dokuyu çevreleyen inflamatuar yanıtın iletimini önlemek yardımcı olur olsa bile, bu axon rejenerasyon^{12,14 karşı fiziksel ve biyokimyasal bariyer olarak hizmet vermektedir ,15,16}. Örneğin, gliyal yara karşılaşma aksonlar soğanlı distrofik büyüme koniler görüntülemek ve büyüme¹²bodur. Ayrıca, astrositik süreçleri dağınıklığı yaralanma sonra aksonlar¹⁷Yenileyici uzantısı engellemektedir. Bu inhibitör özellikleri sonucu hastaların Tby ve bilimler de dahil olmak üzere ağır neurotrauma sonra acı kez kalıcı fiziksel ve nörolojik bozukluklar içinde kendini gösteriyor

MSS fonksiyonel rejenerasyon karşı karşıya dışsal sorunları ne olursa olsun, akson yeniden oluşturmak için içsel bir yeteneğine sahip gösterilmiştir. Örneğin, gliyal yara ile temas distrofik büyüme koniler dinamik doğası bu sonlar¹²genişletmek için kapasitelerini korur düşündürmektedir. Sonuç olarak, bu aksonlar yeniden büyüme için bir ana engel sonrası yaralanma CNS ve gliyal skarlasma ve/veya yara izi arasında rejeneratif köprüler olurdu sağlayan azaltılması yoluyla fazla izin veren bir ortam sağlayan inhibitör bir ortamdır inanılıyor avantajlı. Gerçekten de, önceki çalışmalarda CNS nöronlar aksonlar periferik sinir grefti axon rejenerasyon^{12,18için daha uygun bir ortam mevcut köprüler olarak kullanarak bir lezyon üzerinden uzanan yetenekli olduğunu göstermiştir, 19}. Çeşitli stratejiler tüylerinin bu rejeneratif kapasite yararlanma takip edilmiştir. Örneğin, hücre büyüme sinyal yolları çeşitli yaralanma modellerinde manipülasyon aksonal rejenerasyon ve gliyal yara izi azaltma^10,20,21sonuçlandı. Ayrıca, çalışmalar chondroitinase şeker zincirleri çoğunluğu CSPGs içinde cleaves, ABC ile tedavi CSPGs reaktif astrocytes²²tarafından salgılanan inhibitör etkisini azaltır göstermiştir. Rağmen cesaret verici sonuçlar, bu yaklaşımların potansiyel anormal rejenerasyon¹²' neden olabilir ve aynı zamanda nöronların kaybı için hesap yapmak büyüme koniler rehberliğinde yönetmen sağlamaz. Hücre tabanlı yaklaşımlar girişimleri gliyal yara etkilerini aşmak için ve kayıp hücreleri, özellikle sinir hücreleri doldurmak için kullanılmıştır. Diğerleri yaralanma alanı yeniden doldurmanız ve akson rejenerasyon^23,24, teşvik CNS lezyonları nöral progenitör hücre nakli sırasında bazı gruplar reaktif astrocytes nöronlar dediferansiye ²⁵. ancak, kök hücre transplantasyonu tek başına düşük sağkalım oranları, zavallı entegrasyon ve hasarlı doku⁵mütevazı saklama ile sınırlıdır. Ayrıca, hücre tabanlı strateji de uzun mesafe aksonal yolları, özellikle denetimli bir biçimde geri yüklemek başarısız. Bu nedenle, biyomalzemeler diğer yaklaşımlar ile birlikte teslim araçlar için çeşitli sinir incelenmiştir ve progenitor hücreler ve büyüme faktörleri²⁶. Biomaterial tabanlı yaklaşımlar tasarım denetimi belirli fiziksel, haptotaxic taklit yapıları üretmek için yüksek derecede özelliği ve hedef ana bilgisayar doku^{27üç boyutlu (3D) microenvironment içinde chemotaxic ipuçları sunmak, 28,29,30,31,32,33,34}. Bu çevre sinyalleri çoğaltılması yerli benzeri Morfoloji, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve, sinyal²⁹arasında diğer nörobiyolojik özellikleri sunmak nakledilen hücreler için her şeyden önemlidir. Bu avantajlı özellikleri rağmen geleneksel hücre tohumlari biomaterial iskele ötesinde gelişme aynı anda yönettiği uzun mesafe aksonal rejenerasyon teşvik ve kayıp nöronlar değiştirmek için gereklidir.

Alternatif bir yaklaşım sinir dokusu üzerinde dayanır umut verici bir "yaşam sinir hücreleri ile yerel Nöroanatomi öykünür bir ön şekillendirilmesi cytoarchitecture varlığı nedeniyle diğer hücre tabanlı yaklaşımlar farklıdır yaşam iskele", mühendislik ve/veya hedeflenen değiştirme, yeniden yapılanma ve yeniden nöro çevrim^4,35oluşturulmasını kolaylaştırmak için gelişimsel mekanizmaları. Yaşam iskele tasarımı için önemli noktalar fenotipleri ve sinir hücreleri gibi mekanik/fiziksel özellikleri kaynakları ve biyokimyasal sinyalleri herhangi bir eşlik eden Biyomalzeme³⁵kompozisyon tarafından dikte. İmalat vitrosonra bu yaşam iskele implante vivo içinde mevcut hücre adezyon molekülleri ve kemotaktik olabilir ve Nörotrofik sinyalleri aktif sinir hücre göç ve akson akıbet durumuna bağlı olarak düzenleyen ve rejeneratif ilerlemesini³⁵işler. Bu hücreler çeşitli gelişimsel mekanizmaları vivo içindearacılık beri gliyal hücreler yaşam iskele mühendislik cytoarchitecture için bir temel olarak hizmet verebilir. Beyin gelişimi sırasında Bazal süreçleri yaşayan iskele yönlendirilmiş geçiş^36,37için olarak gelişmekte olan kortikal plaka doğru ventrikül bölgeden Radyal glia tarafından genişletilmiş yeni nöronlar güveniyor. Ayrıca, kendilerini çekici ve itici sinyalleri gliyal Işaret hücreleri tarafından elde edildi algılama tarafından yönlendirmek için gösterilen ve sözde "aksonlar öncü" koniler büyüme uzanan önerilir boyunca önceden desenli gliyal genişleterek doğru hedeflere ulaşmak için ^35,38,39iskele. Böylece, gliyal hücreler daha sonra olarak axon tabanlı hizmet aksonlar öncülük etmek için sağlanan bilgilerde açıklanan gerekli olan "yaşam iskele" projeksiyon "takipçisi" akson ve yönlendirmek için. Ayrıca, büyüme glia aracılıklı mekanizmalar olarak rostral göçmen akışı (RMS) bölgesinden subventricular (SVZ), bir yetişkin beyninin neurogenesis birkaç diğer alanlarında gezinmek için neuroblasts takip postnatally, kalıcı olması için gösterilmiştir olfaktör ampul (OB)⁴⁰. Bu neuroblasts RMS boyuna hizalanmış astrositik oluşum, doğrudan hücre-hücre yapışıklıklar yolu ile oluşan ve çözünür faktörler^37, lokalize gliyal tüp içinde (şekil 1A-1), göç ⁴¹. memeliler nedenleri CNS hasar fiziksel olarak aksonal rejenerasyon¹⁷engellemektedir gliyal bir yara izi oluşturan astrositik işlem düzenleme kesintiye iken, son olarak, birçok memeli sistemi zararlı gliyal yara oluşumu eksikliği. Daha doğrusu, Sigara memeli türlerinin gliyal hücreler daha organize, yaralı bölge^17,42,43kılavuzları olarak kullanılan desenler hizalı korumak. Örneğin, memeli SCI modellerinde, gliyal köprüler yüzeylerde aksonal rejenerasyon ve fonksiyonel iyileşme (kolaylaştırıcı olarak organize gliyal iskele için önemli bir rol düşündüren lezyon, geçiş ile yakın ilişki içinde büyümeye aksonlar gösterilir Şekil 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. tekrarlama nöroanatomik özellikleri ve yukarıda açıklanan gelişimsel/rejeneratif mekanizmaları aynı anda olgunlaşmamış nöronal göç sürebilirim mühendislik gliyal tabanlı yaşam iskele yeni bir sınıf verim ve aksonal Bunun aksi halde keyfi ortamlar, böylece potansiyel olarak nöronal etkilerini Azaltıcı aracılığıyla ve akson yolu dejenerasyonu CNS yaralanma ve hastalık ile ilgili.

Bizim araştırma grubu daha önce yaşayan iskele yeniden inşası için birden çok türde Dizayn ve rejenerasyon aksonal yollarini MSS ve mikro-doku ile periferik sinir sistemi (PNS) sinir ağları (mikro-TENNs) ve doku Mühendisliği sinir grefti (TENGs), sırasıyla^27,46,47,48mühendislik. Hem stratejileri doğal olarak Biyomimikri üzerinde temel alır. Mikro-TENNs yapısal ve işlevsel olarak beynin farklı nöron popülasyonları bağlanma aksonal yolları değiştirmek için tasarlanmış anatomik olarak ilham yapılardır. TENGs gelişimsel mekanizması "takipçisi" axon büyüme hedeflenen ana bilgisayar aksonal rejenerasyon^35,46,48elde etmek için "öncü" akson boyunca örneği axon kolaylaştırdı aksonal rejenerasyon yararlanmak. Biz son zamanlarda yaşayan iskele çok yönlülük büyük harfle tekniği benzer bir encasement şeması mikro-TENNs ve glia tabanlı mekanizmaları ilham arayan mevcut geliştirme. Burada, kolajen Lümen hidrojel mikro-sütun⁴⁹kapsayan hizalanmış astrositik demetleri oluşan yapıları geliştirdik. Bu astrositik yaşam iskele çapları için karşılık gelen bir içi boş silindirik hidrojel bir dış çap (OD) ve iç çapı (ID) ile oluşturmak için bir kılcal tüp-akupunktur iğne derleme sıvı özel ile doldurarak geliştirilir tüp ve iğne, anılan sıraya göre. Özel jelleşme ve hidrojel mikro-sütun çıkarma kılcal tüp, içi boş iç kısmıdır kaplı türü ile ben astrocyte yapışma için izin veren bir ortam sağlamak için kollajen ve paket oluşumu (şekil 1B uyumlu -1). Daha sonra lumen postnatal fare pups (şekil 1B-2) izole serebral kortikal astrocytes ile seribaşı. Elektrik alanları, micropatterned oluklar ve hücre dışı matriks uygulanması (ECM) protein desenlendirme, itimat iki boyutlu (2D) hizalama teknikleri astrocyte uyum içinde yaşayan iskele aksine tekniği üzerinde kendinden montajlı dayanıyor substrat eğriliği (sütun Kımlığı), hücre yoğunluğu ve kollajen konsantrasyonu^50,51,52gibi kontrol değişkenleri göre. Astrocytes sözleşme ve kollajen yeni model ve iki kutuplu, boyuna hizalı Morfoloji vivo içinde (şekil 1B-3) gözlenen doğal iskele benzer elde etmek. Nitekim, biz aktif olarak bu kablo benzeri yapıların kullanımını hedeflenen rehberlik olgunlaşmamış nöronlar geçiş hem de özellikle bozuk MSS olumsuz ortamı üzerinden aksonal rejenerasyon kolaylaştırmak için fiziksel yüzeyler olarak devam ediyor memeli gliyal yara (şekil 1 c). Bu makalede, astrositik mikro-sütunlar için detaylı imalat yöntemi mevcut beklenen cytoarchitecture ve mevcut kısıtlamaları üzerinde kapsamlı bir tartışma kontrast ve ayirt görüntülerini ve gelecekteki yönleri faz tekniği.

Şekil 1: ilham, imalat Protokolü ve hizalanmış astrositik ağlar için Önerilen uygulamalar. (A)nörobiyolojik ilham: (1) Neuroblasts Nörojenik subventricular bölgesinden (SVZ) kaynaklı boyuna hizalanmış gliyal tüp rostral göçmen akışı (RMS) olfaktör ampul (OB); doğru yönlendirilmiş geçiş için kullanmak (2) sonra sinir dokusuna zarar kısmen-bir lezyon (örneğin kopuk spinal kord) ucuna bağlanan ve rehberlik için bir iskele olarak hizmet veren bir gliyal köprü oluşumu nedeniyle kurbağa ve balık gibi sigara-memeliler rejenerasyon ayakta olabilir akson yeniden oluşturuluyor. (B) imalat genel bakış: mikron büyüklüğünde, içi boş hidrojel mikro-sütun ECM ile kaplı Lümen ile inşaat (1) (2) postnatal fare pups (3) kendinden montajlı, boyuna yönelik izole birincil kortikal astrocytes, tohum Kültür ve paket (4) çekme--dan biomaterial mantolama gelecekteki implantasyon Etütler demetleri. (C) In vivo uygulamaları: (1) bu yaşam iskele mühendislik gliyal tüpler için yönlendirilmiş nöron göç--dan nöron eksikliği bölgeleri; yeniden oluşturulacaktır için Nörojenik merkezleri olarak hizmet verebilir (2) tekrarlama axon rehberlik öncülük etmek gelişimsel mekanizması ve sigara-memelilerde gliyal köprüler rejeneratif mekanizması ile axon rejenerasyon sigara-keyfi arasında yönlendirmek için kapasite astrositik bu iskele bağışlamak memeli gliyal yara ortamı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

Tüm yordamlar kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Pennsylvania Üniversitesi ve Michael J. Crescenz Gaziler işleri Tıp Merkezi tarafından onaylanmış ve NIH halk sağlığı hizmetleri ilkesine insana ilişkin olarak belirlenmiş kurallara uyulması Care and Use of Laboratory Animals (2015).

1. geliştirme özel hidrojel mikro-sütun

1. Özel 3 g ağırlığında ve Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 100 mL içeren steril bir ölçek aktarma tarafından bir özel %3 ağırlık/hacim (w/v) çözüm olun. Steril bir manyetik çubuk ölçek kabı için eklemek ve bir sıcak plaka/karıştırıcı bir yüzeye yerleştirin. Kabı içeriği sonraki adımda buharlaşma önlemek için kapalı tutun.
2. Özel ve DPBS 100 ° C ısıda ısı ve 60-120 rpm'de karıştırın. Bu ayarları gerektiği gibi ve çözüm başlangıçta opak özel tamamen çözülmüş ettiğinizi net bir görünüm için değişiklikleri gibi sürekli fesih işleminin ilerlemesini izlemek.
   Dikkat: Sıcak kabı ve çözüm sıcaktır!
3. Özel çözüm ısıtmalı ve karıştırılır, dört boş 10 cm Petri yemekler almak ve DPBS 20 mL iki tane ekleyin. Akupunktur iğneleri yerleştirin (çapı: 300 µm, uzunluk: 40 mm), cam microliter kılcal tüpler (çap: 701.04 µm, uzunluk: 65 mm, kapasite: 25,0 µL) ve bir ampul pınarı Biyogüvenlik kabini içinde. Sıvı özel çözüm dağıldığında, sürekli yaklaşık 50 ° C'de Isıtma ve özel jelleşme önlemek için karıştırma korumak.
4. Bir akupunktur iğnesi bir ampul pınarı alt açıklıklı içine tanıtmak. Dışarıya maruz iğne üzerinde bir kılcal tüp takın. Kılcal Boru parçası ampul dağıtıcı silindir kauçuk bölümüne girerek güvenli.
5. 1 mL sıvı özel bir micropipette ile boş bir Petri kabına yüzeye aktarma ve ampul dağıtıcı lastik kapağı içe boğumlu iken kılcal tüp bir ucunu (eklenen dikey olarak iğne ile) özel ile temas yerleştirin. Yavaş yavaş özel kılcal tüpe çizmek için ampul dağıtıcı kap üzerinde baskı serbest bırakın.
   Not: Sıvı özel transfer kılcal tüpler içine hızla gerçekleştirilmesi gerekir. Sıvı özel bırakılırsa Petri kabına yüzeyinde yeterli zaman soğutmak için (yaklaşık 60 s), jel uygun emme, kılcal boru boyunca özel önleme başlar.
6. Her ampul-tüp-iğne derleme bir ücretsiz Petri kabına ve izin özel jel kılcal tüpler içinde yer kuvvetlendirmek için ampul dağıtıcı silindir kılcal tüp senin elinde kauçuk tıpa ile 5 dk. dikkatlice çekin iğne bırakarak ve Özel jel tüp içinde bir yerde.
7. El ile akupunktur iğneyi yavaşça kılcal tüp dışarı çekerek özü; Yeni katılaşmış özel silindir da tüp hala iğne çevreleyen bu yordamdaki dışarı slaytlar. Yavaşça mikro-sütun boyunca akupunktur iğne ucunu sonuna kadar taşımak için steril Forseps ile sürükler. İğne üzerinde açık, DPBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve mikro-sütun Forseps ile DPBS itin.
   Not: özel mikro-sütun akupunktur iğnesi kaldırılması üzerine cam kılcal tüp içinde kalırsa, yavaş yavaş özel mikro-sütun kılcal tüp dışında 25 mm Ölçüm iğneyle ve DPBS ile çanak içine itin.
8. Microscalpels veya sıcak boncuk Sterilizatör kullanarak forseps sterilize. Özel 4 g ağırlığında ve DPBS için 100 mL transfer % 4 w/v özel olun. Isı ve net bir % 4 sıvı özel çözüm elde etmek için 1.2. adımda açıklandığı gibi ilave edin. Isıtma ve çözüm aşağıdaki adımları boyunca karıştırma korumak.
9. Mikro-bir diseksiyon başlık sütunları içeren Petri yemekler aktarmak ve mikro-sütun boş bir Petri kabına ince Forseps ile taşıma. Görsel rehberlik için stereoscope ve mikro-sütunlar için istenilen uzunluğa kesmek için bir microscalpel kullanmaktadır. Her iki ucu ECM ve hücre toplama sırasında mikro-sütunları işleme kolaylaştırmak için yatay gelen formu eğimli uçlarına 45^o açılarda kırpın.
10. Önceki adım üç için daha fazla mikro-sütunlarda aynı Petri kabına ve dört yapıları bir ayrılması ile paralel olarak hizalamak tekrar < 3 mm her bir silindir. 50 µL % 4 özel çözüm bir micropipette ile yük ve bağlanmak ve yapıları dörtlü gruplar halinde paket için mikro-sütun dizi çizgi/satır sıvı dökün (bundan sonra "mikro-sütun tekneler" olarak adlandırılır). % 4 özel mikro-sütunlar, iç yapıları arasındaki mesafe en aza indirilmesi ve özel hızlı bir şekilde ince bir çizgi ekleyerek yapışmasına neden kenarına hareketi önlemek.
    Not: "botlara" dört mikro-sütun grupları düzenleme astrositik iskele imal etmek gerekli değildir. Yine de, teknelere hizmet üretim sürecini hızlandırmak ve hareket ve mikro-sonraki adımlarında sütunlarda işlemek için daha güvenli bir yol sunar.
11. Jelleşme ekledi % 4 özel izin vermek 1-2 min için mikro-sütun tekne soğumaya bırakın. Mikro-sütun tekneyi iyi Forseps ile bağlantı % 4 özel tarafından almak ve diğer DPBS içeren Petri 1.1.3 adımda hazırlanan yemek için mikro-sütunları taşımak. İstediğiniz gibi kalan mikro sütunlarla daha fazla tekne imal.
12. Mikro-sütunları ve/veya bir biyogüvenlik kabin tekneler içeren Petri yemekler taşımak ve maruz kalma 30 dk için ultraviyole (UV) ışık ile sterilize.
    Dikkat: UV etkilenmemek için uygun koruma giymek.
13. ECM toplama ve hücre kaplama hemen gerçekleşmeyecek 4 ° C'de DPBS içinde mikro-sütun tekneler bulaşıkta saklamak daha sonra 1 hafta kadar. Yapıları bu süre kullanılmazsa mikro-sütun üretim adımları yineleyin.

2. birincil hücre kültürü ve yalıtım

1. Fare pups kortikal astrocyte izolasyonu
   1. Aşağıdaki adımlar için hazırlık olarak, Hank'in 20 mL dengeli tuz solüsyonu (HBSS) disseke dokular için rezervuar görevi görecek dört 10 cm Petri yemekler için ekleyin. Tüm yemekler buz üzerinde tutun. Temiz Cerrahi makas, pens, mikro-spatula ve mikro-neşter sıcak boncuk Sterilizatör içinde sterilize.
   2. % 0.25 tripsin 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve 0.15 mg/mL deoksiribonükleaz (Dnaz) ile prewarm ı 37 ° C'de HBSS Buna ek olarak, astrocyte kültür orta 37 ° c, hangi oluşmak-in Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) Ham'ın F-12 besin karışımı ve % 10 fetal sığır serum (FBS) ile prewarm.
   3. Doğum sonrası gün 0 veya 1 gün Sprague-Dawley rat pups hipotermik koşullarına açarak anestezi ve işten çıkarma tarafından ötenazi. PIN 19 mm kullanarak bir sahne içimizi iğne gözleri anterior burun yerleştirilen ölçer.
   4. Bir kesik bir neşter ile orta yere için ön, arka kadar boyun hemen arkasında gözleri tabanından olun. Başka bir kesi yanal üzerinden T şekli oluşturan doğrudan gözlerinin aşağıya doğru gidiş yerine getirir. İyi forseps tarafına kafatası cilt/kafatası yapmak için kullanın.
   5. Hayvan ve diğer dış yüzeyi ağız burun (forseps, bir sivri uç yerleştirerek yukarı bakacak şekilde) tarafından kafa tutun. Steril bir mikro spatula ile beyin çıkarın ve bir Petri yemekler ile soğutulmuş HBSS dolu yerleştirin. Yer bu Petri kabına buz üzerinde hemen sonra ve hiç kullanmadığınız dışında kez.
   6. Daha önce bir stereoscope içinde bir diseksiyon başlık altında-20 ° C'de depolanan bir granit blok yerleştirmek. Düşük sıcaklık diseksiyon işlem sırasında korumak için granit blok yüzeyinde beyin dokusu ile Petri kabına yerleştirin. Stereoscope aşağıdaki adımları boyunca görsel kılavuz olarak kullanın.
   7. Olfaktör ampuller sağlam kalırsa, onları forseps veya microscalpels ile kesim tarafından ayıklayın. Buna ek olarak, bir microscalpel iki serebral hemisferlerin ayıran bir ensizyon yapmak ve beyincik kaldırmak için kullanın. Hemisferlerin Forseps ile taze, soğutulmuş HBSS içeren bir Petri kabına aktarın.
   8. Yalnızca ayrılmış cortices elde etmek için bir microscalpel ile hemisferlerin içinden orta yapıları incelemek. İyi forseps kortikal dokudan meninkslerde, bir sayfa benzeri yapıda soyulmak ve soğuk HBSS ile yeni bir petri izole cortices aktarmak için kullanın. Bir sonraki adımda tripsin eylem için yüzey alanını artırmak için doku kıyma için microscalpel kullanın.
   9. Pasteur pipet prewarmed tripsin-EDTA (her tüpün içinde 8 cortices) 4 mL içeren 15 mL santrifüj tüpü cortices aktarmak için kullanın. Kortikal dokusu tripsin-EDTA 37 ° C'de 5-7 dk ile maruz
   10. Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde tripsin-EDTA kaldırın ve 400 µl 0.15 mg/ml Dnaz ekleyin ben çözüm santrifüj tüpü için. Tüp veya girdap tüm doku ayrışmış ve sıvı içinde kalan hiçbir doku parçaları kadar tahrik. Doku tamamen erimesi mümkün değildir, Pasteur pipet ucu ile kalan parçaları kaldırın.
   11. Santrifüj Disosiye hücre çözümü 200 x g 3 dakika süreyle de içeren tüp süpernatant Pasteur pipet ile kaldırmak hücreleri bozmadan. Astrocyte kültür (2.1.2. adımda tanımlanan) orta 1 mL tüp ile bir micropipette ekleyin ve resuspend ve homojen bir çözüm oluşturmak için tahrik.
   12. Astrocyte kültür orta serolojik pipet ile 10 mL T-75 şişesi aktarın. 1 mL hücre çözümü (2.1.11 adımda hazırlanan) bir micropipette ile 250 µl şişesi şişe başına hücre değer bir yavru beyin plaka ekleyin. Ordudan terhis edilen hücre çözümü kültür orta arasında eşit olarak dağıtabilmenizi ve yavaşça şişeye daha fazla bile bir dağıtım desteklemek için tahrik.
   13. Oksijen kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂kaplama şişeler kültür. 24 ve 72 kültür s ulaştıktan sonra mekanik şişeye yapışık olmayan hücre tipleri, sinir hücreleri ve oligodendrocytes gibi ayırmak için tahrik.
   14. Daha sonra her bu timepoints de, bir medya değişiklik yapmak. Kültür medya yapıştırılır hücreleri kapsayan şişeye dibinde yatıyor şişeye dikey olarak tut. Pipet karşı hücreleri ayıklama önlemek için balonun alt köşesinde bastırıp bir Pasteur pipet ile Kültür orta Aspire edin. Şişeye özgün yatay pozisyonda yerleştirin ve hafifçe serolojik pipet içeren hücreleri üzerinde astrocyte orta 10 mL ekleyin.
   15. Şişeler için kuluçka makinesi her medya değişiklikten sonra dönün. % 90 confluency elde sonra mekanik olarak bir kez daha kalan herhangi bir uygun olmayan hücreleri kaldırmak için balonun kışkırtmak.
   16. Astrocytes bir vakum ve Pasteur pipet ile Kültür orta yaptırmayı geçiş. 5 mL % 0.25 tripsin-EDTA serolojik pipet ile yapıştırılan hücrenin üzerine ekleyin. Yavaşça şişeye tripsin tüm hücreleri kapsar emin olmak için kışkırtmak ve 5-7 dk 37 ° C ve %5 CO₂şişeye kuluçkaya.
   17. Tripsin serolojik pipet ile hücrelere astrocyte orta 1 mL ekleyerek gidermek. Şişeye serolojik pipet ile hücre çözümü ayıklamak ve steril 15 mL santrifüj tüpü aktar. Santrifüj tüpü 200 x g 3 dk de kapasitesi.
   18. Süpernatant serolojik pipet ile kaldırın ve 1 mL astrocyte kültür orta resuspend. Hücre çözümü homojen olduğundan emin olmak için tüp kışkırtmak. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayacı ile çözümde hücreleri saydırmak.
       Not: % 90 birleşmesi genellikle olan bir şişesi yaklaşık 3 milyon astrocytes verir.
   19. Astrocyte kültür orta 10 mL T-75 şişesi için ekleyin. 1:4 seyreltme zaten kültür ortamı içeren T-75 şişeye bir micropipette ile hücre çözümü (Adım 2.1.18) 250 µl aktararak gerçekleştirin. Şişeye bir homojen hücre dağılımı yüzey boyunca emin olmak için yavaşça kışkırtmak.
   20. Adımları %2.1.16-2.1.19 90 confluency hücreleri geçiş için elde her zaman tekrar.
2. Sıçan fetusa kortikal nöron izolasyon
   1. Adım 2.1.1 ve 2.1.2, ortak kültür medya, oluşan Neurobasal orta + (nöron için) % 2 B-27 eki + %1 G-5 serum ücretsiz ek (astrocytes) + %0.25 prewarmed ortamdır özel durum olarak benzer ürünleri takip L-glutamin.
   2. Zaman aşımına uğradı-hamile embriyonik gün 18 Sprague-Dawley Rat ile karbon dioksit boğulma ötenazi ve ölüm tarafından işten çıkarma onaylayın.
   3. Sıçan fetusa ayıklamak ve Petri yemekler görsel rehberlik ve steril makas, microscalpel ve forseps⁵³ için bir stereoscope kullanarak soğutulmuş granit blok yüzeyinde HBSS içeren beyin dokusunda kalanından cortices incelemek . Sonra art arda diseksiyon başkanları, beyin, serebral hemisferlerin ve cortices her doku için yeni HBSS dolu bir Petri kabına aktarın.
   4. Tripsin için yüzey alanını artırmak için daha küçük parçalara kortikal doku kıyma. 4-6 cortices bir Pasteur ile bir tüp ile 5 mL prewarmed tripsin-EDTA de pipet ve 37 ° C doku ayırmak için korumak transfer. 5-7 dk az el ile karıştırın ve doku topaklanma önlemek için tüp kışkırtmak.
   5. Tüp 37 ° C 10 dakika sonra kaldırın. Adım 2.1 daha önce açıklandığı gibi tripsin-EDTA ayıklamak ve 0.15 mg/mL Dnaz çözüm 1,8 mL ile yerine. Daha sonra girdap çözüm kadar doku doku parçaları sıvı içinde yüzen yok ile homojen, görünür.
   6. Disosiye doku çözüm vasıl 200 x g 3 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırdıktan sonra ortak kültür orta 2 mL resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayacı ile Bu çözümde hücreleri saydırmak.
      Not: 3.0-5.0 x 10⁶ hücreler/kortikal Yarımküre her zamanki verimidir.
   7. Yeni bir hücre çözümü 2.0-4.0 x 10⁵ hücre/mL yukarıda tanımlanan ortak kültür medya yoğunluğu ile hazırlayın.

3. mikro-sütunların içine astrositik kabloları gelişimi

1. ECM çekirdek imalat
   Not: ECM hidrojel mikro-sütunları iç için aynı gün içinde hücre tohum gerçekleştirilecek eklenmesi gerekir.
   1. İçinde bir biyogüvenlik kabini, 1 mg/mL hazırlamak çözüm sıçan kuyruk tip ı kollajen bir steril microcentrifuge tüp ortak kültür ortamında. Microcentrifuge tüp buz ECM çözümü ile kullanımda ne zaman dışında her zaman korumak.
   2. 1-2 µL turnusol kağıdı onun pH tahmin etmek için bir şerit üzerine bir micropipette ile ECM çözümünün aktarın. 1 N sodyum hidroksit (NaOH) veya hidroklorik asit (HCl) sırasıyla ECM çözüm pH azaltmak veya artırmak için bir micropipette ile 1 µL ekleyin ve homojenize için yukarı ve aşağı pipet. Bir turnusol kağıdı şeridi ile yeni pH doğrulayın ve daha fazla asit veya baz, pH 7.2 7.4 aralığında stabil kadar gerektiği gibi ekleyin.
   3. Petri yemekler 1.2 adımından diseksiyon kukuIeta hareket ve 4-5 mikro-sütunları veya bir tekne bir boş, steril 35-60 mm Petri kabına için steril iyi Forseps ile aktarın. Stereoscope rehberlik için kullanarak, her mikro-sütun ve emme DPBS ve hava kabarcıkları Lümen boş bir ucundaki micropipette 10 µL ucu yerleştirmek. Sonraki adımda eklediğiniz ECM serbestçe Lümen karşıdan karşıya akış sağlamak için stereoscope ile hava kabarcıkları yokluğu onaylayın.
   4. P10 micropipette ECM çözümü, 10 µL hidrojel mikro-sütunları bir ucunu karşı uç ve ECM giriş stereoscope ile gözlemleyerek Lümen (yaklaşık 3-5 µL), doldurmak için yeterli bir çözüm sunmak yer ile şarj edin. Küçük bir rezervuar (2-4 µL) mikro-sütun, her iki ucunda ECM çözümünün pipette.
      Not: Her zaman 4-5 mikro-sütunları yönetmek veya bu mikro-sütun yapısını görevlisinideponun neden olabileceğinden yapıları, kurutma önlemek için bir seferde bir tekne uzun süreli. Tamamen kurutulmuş mikro-sütunları sıkıca hücre tohum için onların kullanımı engelleyen Petri yemekler yüzeyine takın. Bu aşağıda açıklanan kuluçka dönemi sırasında dışarı akmasını ECM neden olabilir çünkü ortak kültür ortamı (olarak hidrasyon ölçümü) aşırı miktarda mikro-sütunlar eklenemez.
   5. Ortak kültür medya bir halka etrafında sütunları kuluçka sırasında kurumasını önlemek için bir nem lavabo sunmak Petri kabına pipet. ECM içeren mikro-37 ° C ve % 5 CO₂ polimerizasyon kollajen nöronlar ve/veya astrocytes eklemeden önce tanıtmak 1 h için içeren sütunları Petri kabına kuluçkaya.
      Not: ECM içi boş Lümen iç yüzey kaplama bir tabaka oluşturması gerektiğini yerine sağlam bir ECM çekirdek iç kapsayan, ikisi de stereoscope kullanarak görülebilir. ECM bir çekirdek oluşturur, sadece layer terk edene kadar kuluçka dönemi devam. Oluşan bu katman ile astrocyte hücre çözümü iç kaplama adımları mikro sütununda doldurabilirsiniz.
   6. Kuluçka döneminde astrocyte hücre çözümü (aşağıda açıklandığı gibi) hazırlayın.
2. Astrocyte ve mikro sütunlarda nöron tohumlama
   1. (Arasında dördüncü ve on ikinci geçit) kaplama astrocytes adımları 2.1.16-2.1.19 içinde açıklandığı gibi geçiş. Şişeye hücre sayısı sayım sonra hücre çözümü 9.0-12,0 x 10⁵ hücre/mL solüsyon hücre kültürü medyada askıya yoğunluğu, hazır olun.
   2. Bir stereoscope kullanarak, mikro-sütunları bir ucunda bir P10 micropipette ucu yerleştirin ve yeterli hücre çözümü (~ 5 µL) tamamen doldurmak için Lümen aktarın. Aynı derecede yukarıda ECM ile bitmiş, hücre çözümü küçük rezervuarlar mikro sütunların her iki ucuna ekleyin.
   3. Petri yemekler 37 ° C ve % 5 CO₂ astrocytes eki ECM tanıtmak 1 h için kaplama mikro sütunlarda kuluçkaya. Nöronlar mikro-sütunlar için ekli değil, 3.2.5 adıma devam edin.
   4. İlk kuluçka süresi 1-2 µL kesilmediğini gözleyerek stereoscope altında her iki ucunda da bir micropipette, mikro sütunlarla içine adım 2.2.7 elde kortikal nöron çözüm ekleyin. Bu yeterli miktarda ortam bulaşıkları kurutma önlemek ve tekrar nöronlar yapışma için izin vermek için 37 ° C ve % 5 CO₂ 40 min için kuluçkaya mevcut olduğundan emin olun.
      Not: Kortikal nöron çözüm de 1-2 gün sonra paket oluşumu, adımı 3.2.4 dikkatle kültür medya üzerinden bir micropipette ile Petri kabına çıkardıktan sonra gerçekleştirmek eklenebilir.
   5. Sonra kuluçka dönemi, dikkatlice 3 veya 6 mL 35-60 mm Petri yemekler için ortak kültür ortamının kaplama mikro sütunlarla sırasıyla içeren Petri yemekler doldurun. Kültür tanıtmak için 37 ° C ve % 5 CO₂ kaplama mikro sütunlarda korumak demetleri 6-10 h sonra birlikte, kablo gibi bir yapı oluşturan kendinden montajlı hizalanmış astrositik,.
3. Astrocyte kablo mimarisinin sabitleme
   Not: sonra oluşumu demetleri, yaklaşık 6-12 h yapıları, kültür, astrositik iskele hizalanmış yapısını çöküşü önlemek için aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. 3 mg/mL sıçan kuyruk kollajen bir steril microcentrifuge tüp hazırlamak ben çözüm ortak kültür medya. 7.2-7,4 takip adım 3.1.2 özetlenen yordamı için çözüm pH ayarlayın. Buz kullanılmadığı zaman kolajen stok ve ortak kültür medyada Bakımı ve hazırlanan kollajen çözüm her zaman buz üzerinde yerleştirin.
   2. Medya bazı medya mikro sütunların nemlendirme sağlar nem lavabo oluşturmak için çanak iki tarafında bırakarak bir micropipette ile astrositik iskele içeren Petri yemekler kaldırın. Görsel öğeyi yardım etmek için bir stereoscope altında tabak yerleştirin.
   3. Bir micropipette ile mikro-stereoscope için görsel kılavuzu kullanarak sütunları, her iki ucuna 2-3 µL kollajen çözüm ve deşarj almak. Çanak etrafındaki çanak kenarlarında bir nem lavabo olarak hareket için yeterli miktarda ortam olduğundan emin olun. Petri yemekler 30 dk 37 ° C ve % 5 CO₂ yeni eklenen kollajen jelleşme tanıtmak için oksijen bir kuluçka için mikro sütunlarla kuluçkaya.
   4. Yavaş yavaş ortak kültür medya 3 veya 6 mL ekleyin (35 ya da 60 mm Petri, sırasıyla yemekleri) için Petri yemekleri bir pipet ile ve bulaşıkları 37 ^oC ve %5 CO₂oksijen bir kuluçka kültür.

4. çıkarma astrositik demetleri hidrojel iç

1. Cam coverslips bir otoklav içinde sterilize. Poli-L-lizin (PLL) 20 µg/mL çözeltisi steril hücre kültür sınıf suda hazırlayın.
2. Bir biyogüvenlik kabini içinde el ile steril cam coverslips bir steril 10 cm Petri kabına aktarın ve coverslips karşılamak için yeterli PLL çözüm ekleyin.
3. PLL üçün 37 ° C'de yüzey kat için 30 dk ile kaplı coverslips, kuluçkaya. PLL çözüm Pasteur pipet ile 30 dk. sonra durulama üç kez coverslip için hücre kültür sınıf su ekleyip Pasteur pipet ile kaldırarak çıkarın.
4. Hizalanmış gliyal paket oluşturulması sonra mikro-sütun ince steril Petri kabına için steril iyi Forseps ile transfer. ve su kaybı önlemek ve paket Sağlık sağlamak için bir micropipette ile ortak kültür ortamının 10 µL küçük bir havuz ekleyin. Astrositik paket hidrojel mikro sütundan bir stereoscope için görsel kılavuzu kullanarak steril cerrahi Forseps ile hafifçe bir ucundan çekerek çıkarın.
5. Astrositik paket Forseps ile tutarak, bir PLL kaplı coverslip monte edin. Tamir edip protokolü ile leke.

5. Vitro çalışmalar için Immunocytochemistry

Not: Bu çalışma için birincil antikorlar tavşan anti-gliyal asidik fibrillary protein (GFAP'nin) (1:500), edildi anti-β-tübülin III (1:500) fare, tavşan Anti-kollajen ben (1:500), anti-testin fare (1: 200) ve tavşan anti-vimentin (1: 100). İkincil antikorlar Anti-fare 568 eşek, eşek Anti-tavşan 568, eşek Anti-tavşan 488 ve eşek Anti-fare 568 (tüm 1:500) idi. Tüm durumlarda, tamamen mikro-sütunları kapsayacak şekilde her çözüm yeterli hacmi ekleyin.

1. 1 x DPBS bir kimyasal duman başlık içinde bir % 4 birim/birim (v/v) formaldehit çözümde hazırlayın.
   Dikkat: formaldehit toksik bir bileşik kanserojen olduğu bilinen ve ayrı bir kapta bertaraf gerekir. Her zaman bu bileşik bir kimyasal duman başlık içinde işlemek ve kişisel koruyucu ekipman (PPE) laboratuvar mont, koruyucu gözlük ve eldiven gibi kullanmaktadır.
2. Mikro sütunların söz konusu olduğunda, yanlışlıkla hidrojel silindir suctioning olmadan bir Pasteur pipet ile yapıları içeren Petri yemekler kültür ortamından atmak. Mikro-sütunları veya bağlı coverslips (ikisi de Petri yemekler üzerinde kalır) karşılamak için yeterli formaldehit çözüm ekleyin ve 18-24 ° C'de 35 dk için kuluçkaya
3. Sabit mikro-sütunları veya serolojik pipet ile coverslips %4.0 formaldehit çözüm ayıklamak. Sabit mikro-sütunlarla üç kez PBS hızlı bir şekilde ekleme ve iki kez PBS kaldırma ve sonra onları 10 dk üçüncü bir süre için emmek izin durulayın.
4. Normal at serum (NHS) bir konsantrasyon % 4 v / v. hazırla % 0,3 v/v NHS çözüm solvent kullanarak bir konsantrasyon, non-iyonik deterjan ile a eriyik için PBS içinde çözülür.
5. PBS mikro-sütunları veya bir pipet ile coverslips içeren Petri yemekler kaldırın. Mikro-sütun/coverslips hücreleri permeabilize 18-24 ° C'de 60 dk için karşılamak için yeterli % 0,3 deterjan çözüm ekleyin.
6. Deterjan solüsyonu ve durulama hızlı bir şekilde iki kez PBS ile üç kez 5 dk. hesapla % 4 NHS gerekli hacmi ve her birincil antikorların iliklerine kadar bir çözüm istenen antikor konsantrasyonları ile hazırlamak için almak ve.
7. PBS gelen Petri yemekler kaldırın ve birincil yeterli antikor ekleyin (%4 oranında sulandırılmış NHS-DPBS) mikro-sütunları veya ayıklanan astrositik demetleri kapsayacak şekilde çözüm. Kuluçkaya geceleme (12-16 h) 4 ° C'de
8. Birincil antikor çözüm almak ve hızlı bir şekilde iki kez PBS ile ve üç kez her 5 min için iliklerine tarafından durulayın. Karanlıkta, her antikor %4.0 NHS çözümde mevcut 1:500 bir seyreltme ikincil antikor çözüm hazırlamak.
9. 18-24 ° C'de 2 h için ikincil antikor çözüm hücrelerle kuluçkaya Kuluçka tüm süre boyunca, Petri yemekler ışığa maruz kalma önlemek için alüminyum folyo ile mikro sütunları içeren kapak.
10. İkincil antikor çözüm kaldırın ve çekirdekleri leke için 18-24 ° C'de 10 dakika Höchst çözümü (1:10, 000) ekleyin.
    Dikkat: Bir kanserojen değerlendirilmelidir bilinen bir alkil Höchst var. Bu nedenle, bu ayrı bir kapta bertaraf gerekir ve KKE kullanılması gerekir her zaman bu Ajan işlenirken.
11. PBS ile beş kez, daha sonra her zaman 5-10 dakika süreyle yıkayın, PBS ve alüminyum folyo ile kapatın lekeli mikro-sütun 4 ° C'de depolayın. Takılı astrositik demetleri, söz konusu olduğunda sulu montaj orta bir damla için bir paket eklemek, başka bir cam coverslip sabit paket yerleştirin ve her iki coverslips uzun süreli saklanması ve sonraki görüntüleme için tırnak cilası ile mühür.

6. canlılığı tahlil Live-ölü (Calcein-AM/etidyum Homodimer) Staining

1. Reaktif çözüm 5 μl calcein AM (susuz Dimetil sülfoksit (DMSO) 4 mM) ve 20 μl etidyum homodimer-1 (EthD-1) (2 mM DMSO/H₂O 1:4 v/v) 1 x DPBS 10 mL için ekleyerek hazırlayın. Alüminyum folyo ile çözüm kapak veya gelen ışık korumak için karanlıkta saklamak.
2. Pasteur pipet kaplama mikro sütunlarla içeren Petri kabına medyadan Aspire edin ve yeterli bir çözüm (yapıları kapsayacak şekilde yukarıda hazırlanan) ekleyin. Petri kabına çözüm gelen ışık korumak için kapalı tutmak 37 ° C ve % 5 CO₂, 30 dk için kuluçkaya.
3. Bir micropipette veya Pasteur pipet ile çözüm kaldırın. 2 - 3 kez DPBS ile adım 5.3 açıklandığı gibi yıkayın. Petri yemekler DPBS ile çanak büyüklüğüne göre sel. Görüntü hücre hemen sonra epifluorescence ya da confocal görüntüleme kullanıyor.
   Not: Membran geçirgen calcein AM calcein için metabolik olarak aktif hücreleri tarafından dönüşüm calcein yeşil Floresans verir. Ölü hücreleri hücre ve nükleik asitler, kırmızı Floresans neden onun bağlama içine EthD-1 giriş izni membran şaibeli hücreler olarak işaretlenir.

Representative Results

Başlangıçta, faz kontrast mikroskobu cytoarchitecture genel kararlılığını zamanın bir fonksiyonu olarak ve astrocyte adezyon ve paket oluşumu ilerlemesini izlemek için kullanılan. Kaplama sonra 1 h astrocytes küresel Morfoloji (şekil 2A) mikro sütunlarla Lümen çapında bulundu. 5 h, süreçleri uzanan astrocytes başladı ve 8 h iken tarafından taahhüt hücreleri tam bir işlem taşıyan Morfoloji sergilendi ve mikro-sütun (şekil 2A) boyuna ekseni boyunca yönelik kablo benzeri yapılar oluşur. Özellikle, hücreleri başlangıçta dağınık varlığı mikro-sütunlar arasında karşılaştırıldığında, astrocytes iç yoğun demetleri bir ağ oluşturmak üzere sözleşmeli ortaya çıktı (şekil 2B). İlk hücre hizalama, sık sık birlikte çekti boyuna ekseni boyunca astrocyte ağlar sonra kapanış, mikro-sütun (şekil 2C) merkezinde yoğun bir paket oluşturmak için bir fermuar benzeyen. Birlikte bu mimari oluşumu için kendinden montajlı süreç, son kısmen mikro-sütun kimliği ve hücre yoğunluğu seçim tarafından dikte. Astrocytes düzene sokmak ve iki kutuplu bir Morfoloji sütunlardaki mikro-350 µm (3B rakam, üst ve orta ve 3D-3F)'den küçük bir kimlik numaralı seribaşı zaman elde⁴⁹. Ne zaman bir Kımlığı 1 mm kullanılmıştır aksine, bu hücreler rasgele yön göstermiştir (şekil 3B, alt), görünüm olarak benzer olan serum ücretsiz maruz 2D astrocyte kültürleri orta (şekil 3A, sağ) ortak kültür. Ayrıca, düz-se bile astrocytes görüntülenmeye devam hizalama, düşük tohumlama yoğunluğunu (2.0-3.0 x 10⁵ hücre/mL veya 2.0-3.0 x 10² hücre/mm³) (şekil 3 c), yoğun ağlar sadece yüksek yoğunlukları (9.0-12,0 kurdu x 10⁵ hücre/mL veya 9.0-12,0 x 10² hücre/mm³) silindirik mikro-sütunlarda ile benzer boyutlardadır ( şekil 3B' gördün mü, top), protokolü⁴⁹yılında önerilen. Astrositik demetleri canlılığı, canlı/ölü tahlil alan yeşil (calcein AM) göre toplam alan yeşil (calcein AM) ve kırmızı (EthD-1) Floresanda hücre Floresanda hücrelerinin oranını kullanarak sayısal. Astrositik demetleri canlılığı %97,4 2B astrocyte kültür denetimleri (şekil 4A-4B) %98,2 canlılık benzer oldu mikro-sütunları ortamında astrocyte canlılık ( için uygun olduğunu kanıtlamak Rakam 4E). Astrositik iskele canlı ve ölü hücrelerin 3D rekonstrüksiyonlar da genel hücre hizalama (şekil 4 c-4 D) yapıları içinde göstermektedir. Ayrıca, olağanüstü uzun astrositik mikro-sütunları istikrar önemli uzunluğu ile astrocyte demetleri araştırmak için geliştirilmiştir. Bile olağanüstü mesafe 3.5 cm, cytoarchitecture hizalanmış, yoğun ve sözleşmeli astrositik demetleri sürekli kadar net, zoom-in bölgelerinde görülen mikro-sütun uzunluğu (5A rakam), boyunca sürekli yapıldı. mikro-sütunlar (şekil 5B-5 C).

Bir kez kurulan, desteleri sabit ve immunocytochemistry teknikleri için ara filaman proteinler gliyal hücreler, GFAP'nin gibi karakteristik tarafından lekeli testin ve vimentin. Confocal görüntüleri astrocytes işlemi taşıyan morfolojisi ve boyuna hizalama işlemleri (şekil 6 ve Şekil 7) onaylayın. İfade ara filaman proteinlerin hem 2D astrocyte kültürler (şekil 7A) yanı sıra astrocyte demetleri mikro-sütun (şekil 6, şekil 7B-7 D) içinde görülebilir. Ayrıca, kolajen boyama bu ECM protein mikro sütunlardaki varlığını doğruladı. Astrocytes değil formu ne zaman 2D bir ortamda (şekil 8A), kültürlü kollajen ile sürekli bir yapı ise astrocytes uygun ve kollajen mikro-izin sütunlarda, kültürlü zaman Lümen içinde mevcut yeni model ortaya çıktı hücre kasılması ve paket oluşumu için (8B rakam). Kaplama GFAP'nin ve kollajen kanal astrocyte kablolar boyuna kollajen lifleri (8B rakam) ile sıkı bir şekilde ilişkili işlemler oluşuyordu göstermiştir. Bu nedenle, anchorage sunan dışında kollajen liflerinde de yoğun demetleri daralma sonra formu astrocytes için ek yönlü ipuçlarını vermiş olabilirsiniz. Bazı durumlarda, astrocyte-kollajen daralma, hizalanmış paket üzerinde 12-24 h oluşumu (9A rakam) sonra çöküşü sonuçlanan kalıcı. Kablo gibi astrocyte mimari hidrojel mikro-sütunların içinde stabilize etmek amacıyla ek kollajen matris daha fazla kasılma inhibe ve daraltmak için tam olarak biçimlendirilmiş bir paket sonuna kadar eklendi. Bu beklenen istenen kablo mimari yaşam için en az 4 gün için takviye tekniği izin istikrar daha uzun bir pencere ile (şekil 9B). Ayrıca, temsilcisi astrositik demetleri hidrojel mikro sütundan çıkarılan, monte ve cam coverslips üzerinde % 4 formaldehit ile sabit gerilim kuvvetleri ve dış ortamda maruz zaman onların sağlamlık değerlendirmek için. Hatta ayıklama ve farklı şekiller (10A rakam, 10B) halinde fiziksel manipülasyon, astrositik somata ve hizalanmış bir tutulan işlemler paketlenmiş sonra mikro ölçekli Morfoloji (şekil 10C), vurgulama bir kez kurulan, hidrojel mikro sütunun yapısal destek yok olsa bile kendi kendini hizalanmış astrositik iskele esnekliğini.

Birincil kortikal nöronlar da astrocytes ister astrocyte demetleri nöronal yapışma ve neurite çıkıntı körükleyerek yetenekli olduğunu keşfetmek için mikro-sütunların içine ile birlikte kültürlü. GFAP'nin ve Mikrotubul protein β-tübülin III edildi belirli imleyicileri astrocytes ve nöronlar, sırasıyla kullanılır. Şekil 11A kortikal nöronlar ile birlikte tohumlari astrocytes da süreçleri sergilenmesi ve hizalanmış demetleri şekillendirme yeteneğine gösterir. Nöronlar tercihen astrocyte paketler için tüm olumlu β-tübülin III boyama GFAP'nin ( şekil 11B-11 Cbindirmeleri) ile birlikte lokalize beri yapıştırılır ortaya çıktı. Astrositik yapıları, rejeneratif özelliklerini göstermek için kortikal nöronlar (12B rakam) hidrojel mikro-sütun içinde kaplama 2 gün sonra astrocytes edildi (şekil 12A) kaplama. Nöronlar astrocyte paket bağlı ve neurites doğrudan astrositik yolları boyunca genişletilmiş. Nerede astrocyte yolu mevcut değildi bölgelerde dağınık bir şekilde (şekil 12 c) büyüyen neurites görüldü, ancak daha fazla denetim neurite çıkıntı astrositik kablo yönünde odaklı gösterdi. Bu gözlemler protokol nöron yapışma ve neurite yapılan teşvik implante edilebilir yaşam yolları hareket potansiyeline sahip hizalanmış, kalıcı ve güçlü astrositik ağlar sonuçları göstermektedir.

Şekil 2: aydınlık alan mikroskobu gösterir Astrocyte demetleri hidrojel mikro-sütunların içinde oluşumu zaman içinde. (A)Astrocyte Morfoloji kaplama sonra zamanın bir fonksiyonu olarak: (1 saat) astrocytes küresel şekli ve dağınık boyunca inşa etmek; (5 h) astrocytes başlatma işlemi uzantısı ve kasılma; (8 saat) astrocytes uyumlu ve sözleşmeli. Ölçek çubukları 100 µm. (B) paket oluşumu zaman içinde ek bir temsilcisi iskele =: (1 saat) başlangıçta astrocytes küresel ve süreçleri; sergi değil (24 saat) astrositik süreçlerin yoğun bir paket oluşur. Ölçek çubukları = 300 µm (solda) ve 500 µm (sağda). (C) tam olarak nerede kablosunun ucunu Lümen duvarlarını ayrı ucuna iliştirin bir "zippering" etkisi gösteren kaplama sonra astrositik paket 24 h kurdu. Ölçek çubuğu 1000 µm =.

Şekil 3: mikro-sütun iç çap ve hücre yoğunluğu etkisi manik depresif Astrocytes hizalanmış demetleri, kendinden montajlı. (A)2D astrocyte kültürleri serum içeren medya (solda) ve ortak kültür serum-Ücretsiz medya (sağda) ile göstermek bir işlem dışı ve çok proses taşıyan Morfoloji, sırasıyla. Ölçek çubukları 180 ve 350 µm uyumlu form demetleri uzunlamasına eksen, birden çok, görüntüleme astrocytes 1 mm sonuçlarında bir Kımlığı sırasında göre bir kimlikli mikro sütunlardaki yüksek yoğunluklu (9.0-12,0 x 10⁵ hücre/mL) numaralı seribaşı 100 µm. (B) Astrocytes = hizalanmamış süreçleri boyunca Lümen çapı. Ölçek çubukları = 100 µm (üst, orta) ve 150 µm (altta). (C) Astrocytes bir 350 µm kimlik sütunundaki mikro-düşük yoğunluklu (10⁵ hücre/mL x 2.0-4.0), seribaşı uyumlu ama değil birlikte. Ölçek çubuğu 100 µm. (D) = ne zaman bir 350 µm kimlik sütunundaki mikro-düşük veya Orta hücre yoğunluğu, kaplama, astrocytes İki kutuplu bir Morfoloji elde etmek. Ölçek çubukları 300 µm. (E) = D zoom-in iki kutuplu astrocytes zincirine bu form hidrojel mikro-sütunlar içinde gösterilen kutu. Ölçek çubuğu 300 µm. (F) = bireysel bir bipolar astrocyte örneği. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Astrocytes kalması uygun paket kuruluşundan hidrojel mikro-sütun içinde sonra. (A-B), (C-D) sırasıyla, calcein-AM/etidyum homodimer ile boyama (yeşil-live denetlesinler düzlemsel kültürler ve hizalanmış astrositik demetleri, boyunca hücre canlılığı gösterilen 3D confocal rekonstrüksiyon hücreleri; Kırmızı-ölü hücreleri). (E) miktar canlı ve ölü hücrelerin 2D yüzeylerde kültürlü zaman canlı/ölü astrocytes benzer bir yüzdesi ve mikro-sütunları sonuçlandı. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: faz kontrast görüntü temsilcisi olağanüstü uzun hizalanmış astrositik paket hidrojel mikro-sütun içinde. (A)paket oluşumu bir 3,5 cm mikro-sütun tüm uzunluğu boyunca. Ölçek çubuğu 1000 µm. (B-C) = yüksek büyütme zoom-ins gösteren astrocyte hizalamasını mahkumiyetiniz boyunca çeşitli bölgelerde kutuları akarşılık gelen yapı. Ölçek çubukları 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: astrositik iskele Immunolabeling astrositik süreçleri boyuna hizalamasını gösterir. (A)GFAP'nin (kırmızı; sol) ve çekirdek (Höchst; orta) ve her iki kanal bir bindirme için (sağ) Boyama gösterilen astrositik bir paket Confocal inşası. (B) daha yüksek büyütme zoom-in a kutulu bölgedeki astrositik paket görselleştirme astrocytes mikro-sütunların içinde cytoarchitecture izin verir. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: Immunocytochemistry aracılığıyla temsilcisi astrositik demetleri karakterizasyonu. (A-B) Astrocytes 2D yüzeylerde kültürlü ve içinde hidrojel numaralı seribaşı mikro-sütunlar benzer astrositik işaretleri GFAP'nin (kırmızı) ve vimentin (yeşil) ifade eder. (A)ayrı ve birleştirilmiş kanalları gösteren bir 2D düzlemsel astrocyte kültür Confocal inşası. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) Confocal ifade veri işaretleyicilerini onaylamak ve astrocyte hizalama vitrine bir astrositik paket = resimleri. Ölçek çubuğu = 50 µm. (C-D) Astrocytes mikro-sütunlar içinde kültürlü da hızlı testin ara filaman proteinler (kırmızı) ve vimentin (yeşil). (C) Confocal görüntü astrositik bir paket. Ölçek çubuğu 100 µm. (D) daha yüksek büyütme zoom-in c=. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: Astrocytes hizalanmış demetleri içinde yakından kollajen 2D kültürlerde düzensiz düzenlemenin aksine bir sözleşmeli, boyuna kollajen matris etkileşimde. Hücre immunolabeled astrocytes (GFAP'nin; kırmızı), çekirdek (Höchst; mavi) ve kollajen (yeşil) gözlemlemek için vardı. Hizalanmamış astrocytes ve rastgele dağıtılmış kollajen kollajen, 1 mg/mL(a)2D astrocyte kültürlerle göster. Ölçek çubuğu = 250 µm. (B) kolajen mikro-sütun Lümen duvarlarından çıkardı ve astrositik paket parçası hizalanmış bir matris oluşturmak için sözleşmeli. Ölçek çubuğu 150 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 9: ek kollajen astrositik kabloları yapısı stabilize etmek için kullanılabilir. (A)demetleri oluşan yaklaşık 6 h astrocytes kolajen kaplı hidrojel mikro-sütunların içinde kaplama sonra. Bir kez demetleri kuruldu, daha yüksek konsantrasyon (3 mg/mL) kolajen astrositik kabloları daralma etkisizleştirmek için mikro sütunun sonuna kadar eklendi. Yapıları ile ek kollajen stabilize değil, astrositik kolajen demetleri tarafından 18 h sözleşme başlamıştı ve astrocyte kabloları tamamen tarafından 24 h çökmüştü. Paketler 3 mg/mL kollajen ile takviye zaman bu daralma gözlenen değil. Ölçek çubuğu = 1000 mikron. (B) Zoom-in daraltılmış astrositik paket ile 3 mg/mL kolajen takviyeli değil. Ölçek çubuğu 500 mikron =. (C) Zoom-in kolajen takviyeli mikro-sütunları bölgelerden biri. Astrocyte paket Morfoloji mikro sütunun tamamı devam edildi. Ölçek çubukları 500 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 10: mikro-sütun ve Poly-L-lizin kaplamalı cam Coverslips üzerinde montaj astrositik demetleri ayıklama tekniği sağlamlık kanıtlamaktadır. (A)faz kontrast görüntü birkaç çıkarılan astrositik demetleri, "Penn" sözcüğün yazımını içine manipüle. (B) Confocal yeniden inşası aynı astrositik işaret GFAP'nin (kırmızı) ve hücre çekirdeği (Höchst; mavi) için lekeli demetleri ayıklanır. Ölçek çubuğu = 100 µm. (C) büyütme B kutulu bölgesi gösterir bile düzensiz şekillere manipüle edildiğinde astrositik iskele hizalanmış, bipolar morfoloji ve birlikte cytoarchitecture korur. Ölçek çubuğu = 200 µm. faz ve confocal görüntüleri arasındaki yapısal farklılıklar büyük olasılıkla immunocytochemistry işlem sırasında durulama nedeniyle değişen yapıları, bir obje olduğunu unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 11: nöronlar için uygun ve Neurites nöron-Astrocyte ortak kültürlü iskele hizalanmış Astrocyte demetleri boyunca uzatmak. (A)faz kontrast görüntü nöron numaralı seribaşı astrositik paket. Ölçek çubuğu 300 µm. (B) =-(C) nöronlar astrositik demetleri uygun ve neurites kablo (mavi-Höchst; yönünü boyunca genişletmek için gözlendi GFAP'nin-yeşil; β-tübülin III-kırmızı). Ölçek Bar = 200 ve 100 µm, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 12: Astrocyte kablolar hizmet yaşayan bir iskele yönetmen Neurite akıbet için. Confocal rekonstrüksiyon bir mikro-sütun nöronların oluşan bir bölgenin gösterilen numaralı seribaşı paket kuruluşundan sonra yaklaşık 2 gün. (A)GFAP'nin-pozitif astrocyte demetleri, (B) β-tübülin III-pozitif nöronlar ve (C) birleştirme HÖCHST lekeli çekirdeği (mavi) dahil olmak üzere tüm kanalları. Not nöronlar sergilenen bölgeleri hizalanmış astrocyte işlemleri (oklar) ile yapıştırılır zaman neurite hizalama, nöronlar için hizalanmış yapıştırılır değil, ancak astrocytes rasgele sergilemek ortaya çıktı (Yani çok yönlü) neurite çıkıntı (ok başları). (D) Zoom-in bölgesinin neurite çıkıntı yön gösterir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

PNS daha destekleyici bir ortam için karşılaştırıldığında, MSS özellikle zararlı sonuçları neurotrauma ve ateş işleme sınırlıdır. Memeli CNS ciddi bir hakaret sonra gliyal bir yara izi oluşan bir çekirdek axon akıbet inhibe Proteoglikanlar¹⁴salgılar dağınık reaktif astrocytes yoğun bir meshwork tarafından çevrili fibrotik ve inflamatuar hücre oluşan. Bu yara izi akson uçları¹²rejenerasyon karşı fiziksel ve biyokimyasal tıkanıklığı gibi davranır. Ayrıca, Yetişkin memeli CNS kayıp hücreleri Nörojenik merkezleri SVZ, Hipokampal dentat gyrus ve potansiyel olarak diğer genellikle etkin olmayan sınırlı olduğundan travma veya ateş, aşağıdaki geri yüklemek için yeni nöronlar sınırlı kaynakları sahiptir alanları⁵⁴. İdeal bir strateji hem yönlerini güncel yaklaşımları adresine başarısız MSS sınırlı iyileştirici yeteneklerini aşmak. Bu nedenle, bizim araştırma grubu astrocyte tabanlı iskele yaşam yolları nöron-eksik alanları ve akson büyüme koniler Yenileyici rehberli uzantısı doğru sinirsel geçiş için sunmayı amaçlayan geliştirmiştir. Bir özel mikro-sütun İçişleri kollajen bulunan hizalanmış astrositik demetleri bu astrositik yaşam iskele oluşturmaktadır. Önemli bir ayrım üzerinden geleneksel hücre-biomaterial-CNS onarım ve yeniden oluşturma işlemi için kullanılan stratejileri bu yapıları cytoarchitecture tamamen olduğunu dayanır ve içinde vitro çeşitli vivo benzetimini yapmak için önceden oluşturulmuş glia tabanlı rehberlik ve İskele mimarileri. Örneğin, embriyonik gelişim sırasında Radyal glia yolları yaşam iskele yeni nöronlar yeni korteksimiz ve gliyal hücreler için geçiş için desenli yüzeyler ve/veya Işaret hücreleri^{35 olarak poz aksonlar öncülük etmek hedeflenen uzantısı aracılık hareket ,38,39}. Embriyonik Radyal glia subventricular bölgesinde de boyuna hizalanmış gliyal tüpler, üzerinde neuroblasts postnatally oluşumunda bir zincirleme-SVZ üzerinden⁴¹OB geçiş formu astrocytes üretmek. Ayrıca, bu göstermiştir bazı sigara-bu, CNS takip zarar, memelilerde rejenerasyon daha büyük bir ölçüde bir organize, hizalanmış astrositik düzenleme⁴⁴oluşumu nedeniyle mümkündür. Örneğin, Yetişkin Zebra balığı spinal lezyon sitesi, farklılaşma içine bir iki kutuplu morfoloji ve uzama gliyal süreçlerin bir yolu oluşturan lezyon, köprü için olgunlaşmamış gliyal hücreler göç aşağıdaki ses tellerini onların Yenileyici yeteneğine sahip bu Yenileyici aksonlar⁴⁵yönlendirir. Hizalanmış astrositik demetleri mühendislik yapıları bu mekanizmalar recapitulating ve nöronal göç glia aracılı ve akson rejenerasyon³⁵için gerekli yapısal ve çözünür sinyalleri sunma yeteneğine sahip olabilir. Ayrıca, oturma astrocytes dahil nedeniyle, bu yapıları aktif ana görüşlere göre gerekli çevre ipuçları sunabilir.

Bizim teknik astrocyte kendinden montajlı işlem hizalamasıdır fiziksel ipuçları ve hücre-hücre etkileşimleri mikro-sütun iç çapı, kollajen konsantrasyon ve tohum yoğunluğu tarafından terfi şarta. Bu yöntemin bir diğer çekici özelliği MSS hasarlı alanlarda minimal invasif implantasyonu için izin verebilir onun mikron çaplı boyutudur. Ayrıca, sonuçları bu el yazması sunulan protokolü ile elde edilen yapıları ve yüksek canlılık sahip ara filaman proteinler GFAP'nin, testin ve vimentin, geçit numarasına göre tanımlanan astrocyte yaşı ne olursa olsun hızlı göstermek . Hem GFAP'nin hem de vimentin olgun ve olgunlaşmamış astrocytes ifade edilir, testin farklılaşmamış veya olgunlaşmamış hücreleri glia etkinleşmiş GFAP'nin ifade ve^45, testin azalan üretim olgunlaşması ile esas olarak sınırlı iken ⁵⁵. tutarlı ifade de donatılacak ara filaman proteinlerin geçit numaraları (pasajlar 4-12)⁵⁶aralığında görülmüş ancak önceki çalışmalar davranış değişiklikleri ile yaş, o astrocyte göstermiştir. Astrositik İskele de olağanüstü uzun ulaşmak için gösterilen bu tekniği farklı yaralanma uzunlukları için uyarlanabilir ve geometriler karşılaştı vivo içindeöneriyor santimetre-ölçek uzunlukları vitro,. Ayrıca, kendi kablo gibi cytoarchitecture bile mikro-sütun çıkarma tabi sonra korunur gibi hizalanmış astrositik demetleri olağanüstü yapısal bütünlüğü ve istikrarı, sergi. Astrocyte tabanlı yaşam da CNS onarım için yönlendirilmiş nöron göç ve akson uzantısı tanıtmak için bu teknik potansiyelini takviye destek nöron yapışma ve neurite çıkıntı, iskele.

Hizalanmış astrositik demetleri bir koruyucu borulu hidrojel encasement kolajen iç içinde yer alır. Astrositik iskele imalatı bir akupunktur iğnesi kılcal tüpe ekleyerek ve içine sıvı özel emme mikro-sütun derleme ile başlar. Özel seçilen biomaterial onun hareketsiz özellikleri, Biyouyumluluk ve kolayca kontrollü mekanik, fiziksel ve biyokimyasal özellikleri⁴⁹yüzünden oldu. Özel konsantrasyon hidrojel önemli bir değişken hücrelerin beri anlamda mekanik uyaranlara kendi substrat (örneğin sertlik) dan olması ve hücre içi değişiklikler⁵⁷ile yanıt. Bu mikro-sütunlar için tasarım kriterleri yeterli toplu taşıma, ama küçük bir yanal işlemi sonucu yasaklamak yeterli gözenek boyutu izin vermek için yeterince yüksek bir gözeneklilik içerir; Bu kriterler nano ölçekli açık-gözeneklilik tarafından karşılanan özel, bu protokol için kullanılan toplama mevcut. Bu iletişim kuralı özel konsantrasyon Ayrıca onun istikrar, kolay kullanım ve benzerlik için beyin ortamı⁵⁸mekanik özellikleri nedeniyle seçildi. İğneyi kılcal tüp içinde merkezi yerleştirme önemli bir noktadır. Oftentimes, iğne biraz eğimli veya yerinden sürecinde bulunan merkezi kapalı göreceli olarak özel jelleşme ve mikro-sütun kaldırma tüp sizden aşağıdaki dış duvarları olmak Lümen neden olabilir. Bunu önlemek için iğne düz olmalıdır ve özel iğne Merkez ekseni boyunca korumak için alınırken dalgıç-tüp-iğne derleme dikey konumda saklanması gerekebilir. Lümen kesin merkezileşme özel duvar arasındaki hizalanmış astrocytes korur; Lümen silindir dış halka proksimal bulunsa parçalanma için daha yatkın. (İmplant mikro-sütun önceden astrositik yapıları kaldırılmaz sağlanan) Ayrıca, Lümen ve dış duvar arasında yeterli mesafe koruyucu ve transplantasyon sonrası avantajlar. İğne çapı seçimi kendinden montajlı uygun astrocyte soma/işlem hizalama ve kablo için çok önemli olduğu gibi bu ilk astrositik iskele imalat tekniği, başarısı için her şeyden aşamasıdır. Astrocyte hizalama ters hücre hizalama ve 180-350 µm (şekil 3) varlık güçlü astrocyte demetleri oluşumu için en uygun bir kimlik aralığı ile mikro-sütun Kımlığı bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Benzer şekilde, o daha önce nöronlar onların akıbet^59,60eğimli işlem azaltmak için en az substrat eğriliği yönünü boyunca doğrudan ve benzer mekanizmalar astrocyte etkilemeye çalışma büyük olasılıkla gösterilmiştir uyum içinde bizim sistem⁴⁹. Astrocyte hizalama etkileyen eğriliği ek olarak, bir iki kutuplu Morfoloji⁴⁹, KIMLIĞI 1 mm veya astrocytes içinde kültürlü gözlenen Yildiz Seklinde, çoklu kutup formu aksine edinme astrocytes µm kimlik aralığı sonuçlandı 350 bir 180 bulduk 2D (şekil 3). Bu derin morfolojik değişiklikler bipolar astrocyte Morfoloji için fizyolojik özellikleri de alter olasıdır; Örneğin, bu astrocytes alternatif secretable faktörler veya rejenerasyon için avantajlı olabilir hücre yüzey işaretleyicileri ifade edebilir, ama bu daha da karakterizasyonu garanti eder. Genel olarak, bizim bulgular uygun yüzey eğrilik gibi fiziksel yardımlar yelpazesi astrositik yaşam iskele yerli cytoarchitecture taklit için şart olduğunu göstermektedir.

Astrositik iskele inşaatı mikro sütunların içi boş iç içine sıralı kollajen ECM çözümü ve kortikal astrocytes dahil ile devam eder. Mikro-sütun iç Lümen astrocyte hayatta kalma, ek ve bağımsız olarak neurite çıkıntı⁶¹desteklemek için özel yetersizliği nedeniyle hizalanmış paket oluşumu desteklemek için kollajen ile kaplanır. Çünkü daha düşük ve daha yüksek konsantrasyonlarda yapışma eksikliği ve ECM, sırasıyla⁴⁹istikrarsızlık sonuçlanan önceki çalışmalarda belirlenen bir kollajen konsantrasyonu 1 mg/mL seçildi. Böylece, beklendiği gibi kollajen konsantrasyon bu tekniğin etkinliğini üzerinde dramatik etkileri vardır. Ayrıca, ECM çözümü oluşur sadece tip ı kollajen. Laminin ve Matrigel kaplı yüzeyler 2D astrositik kültürler için karşılaştırıldığında, astrocytes kaplama türüne ben gösterdi kollajen en iyi yapışma ve ağ oluşumu⁶². Tohum hücre önce kollajen polimerizasyon için kullanılan kuluçka zaman protokolündeki önemli bir adım da. Daha önce bulduğumuz nöronlar kullanılazlar özel mikro-sütunlara unpolymerized ECM ile teslim edildi zaman azaltılmış neurite çıkıntı ve aksonal fasciculation görülen⁴⁷idi ve bu bulgular astrocytes için uzanacak mümkündür de. Kollajen astrocyte adezyon ve paket oluşumu için gerekli olduğundan, ECM yapı boyunca varlığı ve hava kabarcıkları veya boş cepler olmalı görüntülenir ve mikroskobik teknikleri ile doğruladı.

Protokol ile kaplama, hücre adezyon kollajen ve hedef cytoarchitecture oluşumu için kısa vadeli kültür için emin olmak için bir kuluçka dönemi astrocyte adl. Astrocytes geçiş takım 4-12 arasında onlar sağlam astrositik donatılacak ve kollajen reformasyon sergilenen olarak kullanıldı. Bu astrocytes de oluşan bir olgun fenotip sunulan > az yok nöronal kirlenme ile % 95 saf kültürler^63,64 . Serum içeren orta (şekil 3A, sol) istihdam, sıradan astrocyte kültürler aksine bizim tekniği serum-Alerjik orta astrocytes bir işlemi taşıyan Morfoloji (şekil 3A, sağ benimsemeye izin vermek için kullanır. ) ve form hizalanmış somata ve süreçleri içinde mikro-sütunları^62,65,66demetleri. Konsantrasyon tohum hücre açısından astrocytes daha dağınık ise kollajen remodeling, eşlik eden ile sıkıca paketlenmiş demetleri oluşumu 9.0-12,0 x 10⁵ hücre/mL, aralığı bir kimliğine sahip 350 µm, daha yüksek konsantrasyonlarda sonuçlandı , ama yine de uyumlu, ne zaman düşük konsantrasyonlarda kullanılmıştır (şekil 3 c). Böylece, konsantrasyonu hücre-hücre etkileşimleri üzerinde tohum etkisini astrocyte hizalama ve gözlenen kablo benzeri yapıların oluşumu derecesini etkiler. Hücre çözümü enjeksiyon Lümen içine genellikle sürekli paket oluşumu için çok önemli olan mikro-sütun uzunluğu boyunca homojen teslim edilmesini sağlamak için bir stereoscope kullanarak görüntülenir. Tohum sonra kültür medya ile sel önce ön kuluçka süresi astrocytes ECM anchorage güvenliğini sağlamak için vazgeçilmezdir. Astrocytes yapıları, escape Eğer koşuluyla yapıları yeterince kurutma önlemek için nemlendirilmelidir süresi değiştirilebilir. S 8 tarafından kurulan sürecinde hizalanmış astrositik demetleri bir ağ olduğunu gösterdi zaman bir fonksiyonu olarak astrositik iskele faz kontrastlı görüntüler. Buna ek olarak, yapıları kollajen ve şekil 8' de gösterildiği gibi GFAP'nin için etiketli zaman ECM dekolmanı Lümen duvar, onun ardından gelen daralma ve hücreleri ve sözleşmeli kollajen arasındaki sıkı ilişkiyi gözlendi. Bu olay büyük olasılıkla kapasitesini esnek yüzeylerde ve matris remodeling deforme kuvvetler oluşturmak için fibroblast benzeri gliyal hücreler önceki raporlara dayanarak duvarlarından kollajen ayırma astrositik contractile kuvvetleri bir sonucudur Sadece astrocyte içinde astrocytes yeteneği ve nöron-astrocyte ortak kültürlerin^28,49,67,68. Özellikle, sonuçları astrocyte motilite ve kollajen liflerinde integrin aracılı etkileşim kuvvetleri liflerinde^17,69sözleşme için yeterli nesil biridir. Genel olarak, açıklanan protokolünü fiziksel yüzeyler çeşitli yaşlardaki CNS mevcut özetlemek yoğun, hizalanmış astrositik kablo benzeri yapıları kendi kendine monte ağların oluşan yaşam iskele üretecek.

Boyunca protokolünün ortaya çıkabilecek bireysel sorunlara ek olarak, astrositik iskele tekniği MSS onarmak için kapasitesini etkileyebilecek diğer engelleri sahip olur. Örneğin, bu tekniğin nihai başarı sinir sistemi plastisite ve fonksiyonel astrositik iskele ana bilgisayar devre ile entegrasyonunu şartlı olduğunu. Bu iskele implantasyonu ile ilgili astrositik demetleri pro rejeneratif özniteliklerini counter bir enflamatuar yanıt imkanı vardır. Tüm organ nakli tabanlı teknikleri kan - beyin bariyerini rüptürü ve nöronlar ve kılcal doku⁴⁷arasında yakınlık nedeniyle inflamatuar hücre infiltrasyonu neden kapasitesine sahiptir. Bu durumda, hidrojel mikro-sütun veya başka bir encasement düzeni astrositik iskele için inflamatuar yanıt azaltmak için anti-inflamatuar faktörlerin kontrol belgili tanımlık serbest bırakmak için bir araç olarak yararlı. Başlangıçta, hizalanmış astrositik paket hücre hizalama mecbur güçler olarak mikro-sütun içinde istikrarlı değildi ve matris remodeling sonuçta istenen cytoarchitecture çöküşü kültür 1-2 gün sonra yol açtı. Ancak, ek kasılma ve paket Daralt paket tutmak için daha yüksek konsantrasyon kollajen ekleyerek mikro-sütun ucunda paketler için ek takviye sağlayarak engelledi. Ek bir taktik mikro sütunlarından alınır gibi yeni bir hidrojel kaplama hizalanmış astrositik demetleri sayede uygulanan bir ikincil kapsülleme istihdam olabilir. Hizalanmış astrocyte ağlar teslim beyin içine Ayrıca tüm uzunluğu boyunca ev sahibi ve yapı hücreler arasında hücre-hücre yapışıklıklar nedeniyle yapıları stabilize etmek olası olsa da bu doğrudan gelecek çalışmalarda test edilmesi gerekmektedir.

Buna göre gelecekteki çabalar istikrar ve koruma astrositik paket sırasında ve nöronal geçişe izin vermek için in vivo teslim sonra onarmak, sağlar bir etkili nakli yöntemi geliştirmek amaçlı olacağını ve rejenerasyon yaralı CNS içinde. Daha önce ev sahibi ile hayatta kalma ve yapısal entegrasyon sonuçlanan başarılı nöronal/aksonal tabanlı mikro-corticothalamic yollar içinde astrositik yapıları, mantolama düzeni paylaşan TENNs, implantasyonu göstermiştir doku, 1 ay^46,47kadar en azından. Böylece, mikro-sütun çıkarma sonra kabloları sağlamlık yararlanılabilir. Bu durumda, özel hidrojel kendinden montajlı ikna etmek için ilk kültür yatak olarak hizmet verecek ve sonra astrositik kablo mantolama kaldırıldı ve doğrudan ince duvarlı iğne kullanarak beyne enjekte. Astrocyte deformasyon mekanik Kuvvetleri nedeniyle hidrojel mikro-sütun çıkarma sırasında değil gözlenmiştir ve değil bekleniyor. Önceki çalışma mekanik deformasyon astrocyte reaktivite üzerinde etkileri eğitim elde edilen herhangi bir deformasyon yeterince hızla GC veya işlem uzama^62,70ikna etmek için uygulanmasını değil göstermektedir. Beyin dokusu ve olası bir enflamatuar yanıt zarar en aza indirmek için paketler hidrojel içinde daha önce mikro-TENNs için geliştirilmiş iğnesiz teknolojisini kullanarak implante olması. Bu metodoloji hidrojel implantasyon⁴⁷yıkıcı ve inflamatuar ayak izi azaltmak olabilir beyin iğnesiz girdiği için sağlar Ġnsan ince bir tabaka ile kaplanır. Daha sonra nakli çalışmaları hayatta, ana bilgisayar doku ile tümleştirmek için bu iskele yeteneği değerlendirmek için gerçekleştirilebilir ve sinirsel geçiş ve akson Kılavuzu teşvik etmek. Özellikle, bu yapıları Nörojenik bölgedeki sinir kök hücreleri ve neuroblasts, RMS ve bir yaralanma siteye bağlı diğer ucunu potansiyel götürmek için doğrudan asla bilemeycek onun havuz için SVZ gibi yayılan bir ucu ile implante Sinirsel geçiş ve ölçülü bir moda alanında yeniden oluşturulacaktır.

Nakil protokol optimizasyon sonraki tekniği diğer alanlarda geliştirilebilir. Mikro-sütunları özellikle olgunlaşmamış astrocytes ile (örneğin Radyal glia, RMS-türü hücre) sahte olduğu veya daha sonra olgun fenotipleri bu yapıları⁴⁹rejeneratif inducing kapasitesini artırmak için dediferansiye. Gliyal yara vitro modellerinde olgun astrocytes yolları axon akıbet⁷¹için şekillendirme yeteneğine oldu. Buna ek olarak, olgunlaşmamış astrocytes neurite çıkıntı vitro ve ne zaman kullanılazlar chondroitinase CSPGs yüksek düzeyde gliyal yara⁷¹ içinde adrese ABC ile nakledilen aksonal yenilenme vivo tanıtmak için gösterilmiştir ^{, 72}. kişiselleştirilmiş tıp gelişine denk için Otolog astrositik mikro-sütunlar gibi indüklenen kaynakları pluripotent kök hücreler (iPSCs) ve insan sinir kök hücreleri (hNSCs) kök hücrelerden tohum tarafından geliştirilmiş olabilir. Bu değişiklik bu iskele için bireyselleştirilmiş kanalları çalışmaya ve belirli yolu tamir ve yeniden izin. Ayrıca, bu hücre kaynakların kullanılması mümkün olan aşmak bu astrocyte implantasyon immünojenik yanıt neden olabilir. İmmünojenisite IPSC hücre satırlarını göre farklı olsa bile, bu hücreler önlenmesi veya azalan bağışıklık yanıtı olarak zararlı yanıt sonra IPSC kaynaklı organ yokluğu tarafından önerilen nakli üzerine teorik olarak yeteneğine sahiptirler implantasyon fareler^73,74. Ayrıca, Otolog hNSCs ve astrositik türevleri allojeneik bağışıklık yanıtı⁷⁵bastırmak. Sonuç olarak, bunlar imalatı ağları Otolog kök hücre ile kritik bir geleceğe adım bu teknik klinik ortamda daha kolay uygulanabilir hale olabilir astrocyte uyumlu.

CNS onarım ve yenilenme için kanalların olarak uygulama dışında astrositik yaşam iskele vitro test-yataklar, veya belirli bir test paradigma hedeflerine göre hidrojel mantolama olmadan olarak kullanılabilir. Örneğin, bu astrositik yapıları nöron göç ve neurite uzantısı astrocytes, kontrol edilebilir özellikleri ve yaşam iskele 3D çevre modelleri olarak istismar tarafından aracılı gibi nörobiyolojik olayları araştırmak için kullanılan vivo koşulları. Bu el yazması tartışılan protokolü bir sütundaki hidrojel mikro-kolajen bir matris kendi kendine monte hizalanmış astrositik demetleri imalatı ayrıntılı. Şekil-in beyin Nöroanatomi, gelişimsel/rejeneratif mekanizmaları ve neuroblast geçiş yolu recapitulating tarafından implante edilebilir bu astrositik iskele sinirsel göç ve akson yönetmen destekleyici yolları sunmak için potansiyel var hasarlı CNS aksi takdirde inhibitör ortamında rehberlik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).