Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Summary

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Abstract

Neurotrauma y neurodegenerative de la enfermedad a menudo resultan en duradero déficit neurológico debido a la limitada capacidad del sistema nervioso central (SNC) para reemplazar las neuronas perdidas y regenerar caminos axonales. Sin embargo, durante el desarrollo del sistema nervioso, la migración neuronal y la extensión axonal ocurren a menudo por caminos formados por otras células, conocido como "andamios de vida". Buscando emular estos mecanismos y diseñar una estrategia que evita el entorno inhibidor del SNC, este manuscrito presenta un protocolo para fabricar ingeniería tisular basada en astrositos "andamios de vida". Para crear estas construcciones, se empleó un esquema protector de nuevo biomaterial inducir astrocitos uno mismo-montar en densos paquetes tridimensionales de somata bipolar alineados longitudinalmente y procesos. Hidrogel en primer lugar, hueco micro-columnas estaban reunidos, y la luz interior estaba recubierta con matriz extracelular colágeno. Astrocitos corticales cerebrales disociados luego fueron entregados en el lumen de la micro-columna cilíndrica y un diámetro interior crítico de < 350 μm, espontáneamente auto alineado y contratado para producir largas de fibra como cables consisten en paquetes densos de los procesos de astrositos y fibrillas de colágeno de medición < 150 μm de diámetro pero que se extiende varios centímetros de longitud. Estos diseñado andamios vida exhibió > 97% viabilidad celular y eran casi exclusivamente compuesta por astrocitos expresan una combinación del filamento intermedio proteínas glial fibrilar proteína ácida (GFAP), vimentina y nestin. Estos alinean astrositos redes fueron encontradas para proporcionar un substrato permisivo para conexión neuronal y alineación la extensión del neurite. Por otra parte, estas construcciones mantienen integridad y alineación cuando extrae del protector de hidrogel, haciéndolas adecuadas para la implantación de la CNS. Estas construcciones preformadas estructuralmente emulan citoarquitectónica clave elementos de origen natural basada en glial "andamios de vida" en vivo. Como tal, estos andamios de ingeniería de la vida pueden servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico en vitro o facilitar la Neurorregeneración dirigiendo la migración neuronal y axonal pathfinding tras degeneración CNS en vivo .

Introduction

Sistema nervioso central (SNC) tiene una capacidad limitada para contrarrestar la pérdida o disfunción de las neuronas y vías axonales que acompañan las condiciones tales como lesión cerebral traumática (TBI), movimiento, médula espinal lesión (SCI) y neurodegenerative enfermedad^{1 ,2,3,4,5}. Neurogénesis en el SNC se limita a un número limitado de áreas en el cerebro, dificultando la restauración de las neuronas perdidas^6,7. Además, la regeneración de caminos perdidas axonales en el SNC es insuficiente debido a la falta de orientación dirigida, la presencia de inhibidores de la consecuencia y astrogliosis reactiva después de daño al tejido neural^{2,8, 9,10}. Los astrocitos tienen diversas funciones para ayudar a las neuronas con la homeostasis de iones, separación de neurotransmisores, formación de sinapsis y neurovasculares acoplamiento¹¹. Sin embargo, siguiendo incluso leves daños de tejido neural, astrocytes pueden sufrir cambios moleculares, estructurales y funcionales en su transición a un estado hipertrófico¹¹. En respuesta al neurotrauma grave, estos cambios resultan en la formación de una cicatriz con una penumbra que contienen astrocitos reactivos migrando y un núcleo de la lesión que incluye leucocitos se filtró desde el rota barrera blood - brain (BBB), microglia, oligodendrocitos y fibroblastos^11,12,13. Estos astrocitos reactivos logran una morfología de procesos filamentosos, desorganizados y presentan aumento de la expresión de proteínas de filamentos intermediarios y proteoglicanos de sulfato del chondroitin (CSPGs), que impiden la regeneración de los nervios¹². A pesar de la cicatriz glial inicialmente ayuda a restaurar la integridad de la BBB y evitar la transmisión de la respuesta inflamatoria al tejido sano circundante, sirve como una barrera física y bioquímica contra axon regeneración^{12,14 ,15,16}. Por ejemplo, axones que encuentran la cicatriz glial mostrar los conos de crecimiento distrófico con bulbo y retraso de crecimiento¹². Además, la desorganización de los procesos astrocytic después de la lesión impide la extensión de regenerar axones¹⁷. El resultado de estas características inhibitorias se manifiesta en las debilitaciones físicas y neurológicas a menudo permanente que los pacientes sufren después de neurotrauma grave, incluyendo TBI y la médula espinal.

Independientemente de los retos extrínsecos de regeneración funcional en el SNC, axones han demostrado poseer una capacidad intrínseca de regeneración. Por ejemplo, la naturaleza dinámica de los conos de crecimiento distrófico en contacto con la cicatriz glial sugiere que estas terminaciones conservan su capacidad para ampliar a¹². En consecuencia, se cree que un obstáculo principal para el crecimiento axonal es el entorno inhibidor del SNC después de la lesión y proporciona un ambiente más permisivo a través de reducción de la cicatrización glial o proporcionar puentes regenerativas a través de la cicatriz sería ventajoso. De hecho, estudios anteriores han demostrado que las neuronas de la CNS fueron capaces de extender axones a través de una lesión mediante injertos de nervios periféricos como puentes, que presentan un entorno más favorable para la regeneración de axón^{12,18, 19}. Varias otras estrategias han sido llevadas a cabo para explotar esta capacidad regenerativa vestigial. Por ejemplo, manipulación de vías de señalización de crecimiento celular en varios modelos de lesión ha dado lugar a la regeneración axonal y disminución de cicatriz glial^10,20,21. Además, los estudios han demostrado que el tratamiento con Condroitinasa ABC, que hiende la mayoría de las cadenas de azúcar en CSPGs, disminuye el efecto inhibitorio de CSPGs segregada por los astrocitos reactivos²². A pesar de alentador resultados, estos métodos no proporcionan dirigida orientación de conos de crecimiento, que potencialmente puede resultar en la regeneración aberrante¹²y también no tienen en cuenta para la pérdida de neuronas. Enfoques basados en la célula se han utilizado en tentativas de superar los efectos de la cicatriz glial y para reponer las células perdidas, particularmente de las neuronas. Algunos grupos han dedifferentiated astrocitos reactivos en las neuronas, mientras que otros han trasplantado células progenitoras neurales en lesiones CNS para repoblar la zona de lesión y promover axon regeneración^{23,24, 25}. sin embargo, la célula de vástago trasplante solo está limitado por las tasas de supervivencia bajas, pobre integración y retención modesta en el tejido dañado⁵. Además, estas estrategias basadas en células incapaces de restaurar zonas interurbana axonal, especialmente en forma controlada. Por lo tanto, biomateriales en combinación con otros enfoques se están estudiando como vectores para varios nervios y factores de crecimiento y células progenitoras²⁶. Enfoques basados en el biomaterial cuentan con un alto grado de control del diseño para producir construcciones que imitan a la haptotaxic física, específica, y chemotaxic señales presentan en el microambiente (3D) tridimensional del destino anfitrión tejido^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproducción de estas señales ambientales es de suma importancia para las células trasplantadas presentar nativo-como morfología, proliferación, migración y señalización, entre otras características neurobiológicas²⁹. A pesar de estas propiedades ventajosas, avance más allá de la tradicional células sembradas biomaterial andamios es necesario simultáneamente promover la regeneración axonal larga distancia dirigida y reemplazar las neuronas perdidas.

Un prometedor enfoque alternativo se basa en el tejido neural ingeniería "andamios de vida", que son distintos de otros enfoques basados en la célula debido a la presencia de células neuronales vivas con una Citoarquitectura preformado que emula neuroanatomía nativa o desarrollo mecanismos que faciliten la sustitución específica, reconstrucción y regeneración de los circuitos neuronales^4,35. Consideraciones para el diseño de matrices de soporte de vida incluyen los fenotipos y las fuentes de las células neuronales, así como las propiedades físico mecánicas y las señales bioquímicas dictaron por la composición de cualquier adjunto de biomateriales³⁵. Después de la fabricación en vitro, estos andamios de vida pueden ser implantados en vivo quimiotácticos y moléculas de adhesión celular presentes y neurotróficos señales para regular activamente migración de células neuronales y consecuencia del axón dependiendo del estado y progresión de procesos regenerativos³⁵. Las células gliales pueden servir como base para la ingeniería Citoarquitectura de andamios de la vida ya que estas células median varios mecanismos del desarrollo en vivo. Durante el desarrollo del cerebro, las neuronas nuevas dependen de procesos basals extendidos por glia radial desde la zona ventricular hacia la placa cortical en vías de desarrollo como andamios de vida migración dirigida^36,37. Además, extender crecimiento conos son muestra a orientarse detectando señales atractivas y repulsivo provocadas por las células gliales hito y supuesto "pioneras" axones son sugeridas para alcanzar los objetivos correctos por que se extiende a lo largo de los estampados glial Andamios de^38,35,39. Así, las células gliales son necesarias para la dirección del pionero axons, que luego sirven como base de axon "andamios de vida" para dirigir la proyección de axones "seguidor". Por otra parte, mecanismos de crecimiento mediada por la glía han demostrado persistencia postnatal, como neuroblastos siguen la corriente migratoria rostral (RMS) para poder navegar desde la zona subventricular (SVZ), una de las pocas áreas restantes de la neurogénesis en el cerebro adulto, la bulbo olfatorio (OB)⁴⁰. Estos neuroblastos en el RMS migran dentro del tubo de glial (figura 1A-1), que se compone de procesos astrocytic alineadas longitudinalmente, mediante adhesiones célula-célula directa y localizada de factores solubles^{37, 41}. por último, mientras que el daño del CNS en causas de mamíferos interrumpió arreglo astrocytic proceso formando una cicatriz glial que físicamente impide la regeneración axonal¹⁷, muchos sistemas no mamíferos carecen de la formación de una cicatriz glial perjudicial. Más bien, las células gliales de las especies de animales no mamíferos mantienen más organizado, alineados los patrones que se utilizan como guías a través de la región lesionada^17,42,43. Por ejemplo, en modelos de animales no mamíferos SCI, se muestran axones que crecen en estrecha asociación con puentes gliales cruzar la lesión, lo que sugiere un papel importante para andamios gliales organizados como sustratos facilitando la regeneración axonal y recuperación funcional ( Figura 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulación de las características neuroanatómicas y los mecanismos del desarrollo/regenerativa descritos anteriormente puede producir una nueva clase de andamios de ingeniería vida glial base que puede conducir al mismo tiempo la migración neuronal inmadura y axonal pathfinding a través de entornos no permisiva, de tal modo potencialmente mitigar los efectos de neuronal y degeneración de la zona de axón asociado a enfermedad y lesión del CNS.

Nuestro grupo de investigación previamente ha diseñado varios tipos de matrices de soporte de vida para la reconstrucción y regeneración del tracto axonal en el SNC y sistema nervioso periférico (SNP) a través de micro-tejido ingeniería de redes neuronales (micro-adolescentes) y tejido Ingeniería injertos del nervio (TENGs), respectivamente^27,46,47,48. Ambas estrategias están basados inherentemente en biomimética. Micro-adolescentes son estructuras anatómicamente inspiración estructural y funcionalmente sustituye extensiones axonales conectar distintas poblaciones neuronales del cerebro. TENGs explotan el mecanismo del desarrollo de la regeneración axonal facilitado por axon, ejemplificado por el crecimiento del axon de "seguidor" a lo largo de axones de "pionero", para lograr la regeneración axonal de host destino^35,46,48. Nos recientemente aprovechó la versatilidad de la matriz de soporte de vida técnica mediante un esquema similar de protector como micro-adolescentes y buscando inspiración en los mecanismos basados en la glia presentes en todo el desarrollo. Aquí, hemos desarrollado construcciones consisten en paquetes astrocytic alineados que atraviesan el lumen colagenoso de una micro columna de hidrogel⁴⁹. Estos andamios vida astrocíticos son desarrollados por el primer llenado de un conjunto de agujas de acupuntura de tubo capilar con agarosa líquida para crear un hidrogel cilíndrico hueco con un diámetro exterior (OD) y diámetro interno (ID) correspondiente a los diámetros de la tubo y aguja, respectivamente. Gelificación de agarosa y extracción de la hidrogel micro-columna de tubo capilar, el hueco interior es revestido con tipo y colágeno para suministrar un entorno permisivo para la adherencia de astrositos y alineado paquete formación (figura 1B -1). Luego, la luz es sembrada con astrocitos corticales cerebrales aislados de crías de rata postnatal (figura 1B-2). Contrariamente a las técnicas bidimensionales (2D) alineación que se basan en la aplicación de campos eléctricos, micropatterned surcos y matriz extracelular proteína (ECM) patrones, alineación de astrositos en el andamio de la vida técnica depende de uno mismo-Asamblea de acuerdo a las variables controlables como curvatura de sustrato (columna ID), la densidad celular y la concentración de colágeno^50,51,52. Los astrocitos contratan y remodelan el colágeno y adquieran una morfología bipolar, alineados longitudinalmente análoga a las matrices de soporte naturales en vivo (figura 1B-3). De hecho, estamos persiguiendo activamente el uso de estas estructuras de cable como sustratos físicos específicos guía de migración de las neuronas inmaduras, así como facilitar la regeneración axonal a través del ambiente desfavorable del SNC dañado, particularmente la cicatriz glial mamífera (figura 1). Este artículo se presenta el método de fabricación detallado para las columnas de micro astrocytic, fase imágenes de contraste, inmunofluorescencia y de la Citoarquitectura esperado y una amplia discusión sobre las limitaciones actuales y direcciones futuras de la técnica.

Figura 1: inspiración, protocolo de fabricación y aplicaciones propuestos para las redes Astrocytic alineadas. (A) inspiración neurobiológica: neuroblastos (1) origina la neurogénica zona subventricular (SVZ) utilizan el tubo glial longitudinalmente alineado en la corriente migratoria rostral (RMS) para la migración dirigida hacia el bulbo olfatorio (OB); (2) no de mamíferos como peces y anfibios pueden sostener la regeneración después de tejido neural dañar en parte debido a la formación de un puente glial que conecta los extremos de una lesión (por ejemplo médula espinal transected) y sirve como un andamio para la dirección de regeneración de axones. (B) Resumen de fabricación: (1) construcción de una micro columna hidrogel de tamaño micrométrico, hueco con recubierta de ECM, la luz de la (2) siembra de astrocitos corticales primarios aislados de crías de rata postnatal, (3) uno mismo-Asamblea de longitudinalmente orientados paquetes en la cultura y (4) extracción del paquete del encasement del biomaterial para estudios de implantación futura. (C) In vivo usos: (1) estos andamios de vida pueden servir como tubos gliales ingeniería para la migración de la neurona dirigida de centros neurogénicas a repoblar las regiones deficientes en neurona; (2) Resumen del mecanismo del desarrollo de pioneras orientación axón y el mecanismo regenerativo de puentes gliales en los mamíferos no puede dotar a estos andamios astrocytic con capacidad de dirigir la regeneración del axón a través de la no-permisivo medio ambiente de la cicatriz glial mamífera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y comités de uso en la Universidad de Pennsylvania y el centro médico de Michael J. Crescenz veteranos asuntos y adheridos a las directrices establecidas en la Directiva de servicio de salud pública de NIH en humano Uso y cuidado de animales de laboratorio (2015).

1. desarrollo de las Micro hidrogel-columnas de agarosa

1. Pesar 3 g de agarosa y transferirla a un vaso de precipitados estéril que contiene 100 mL de solución salina amortiguadora de fosfatos de Dulbecco (DPBS) para hacer una solución de agarosa al 3% peso/volumen (p/v). Añadir una barra magnética estéril en el vaso y colóquelo en la superficie de una parrilla caliente/agitador. Mantener el recipiente cubierto para evitar la evaporación de su contenido en el siguiente paso.
2. La agarosa y la DPBS a una temperatura de 100 ° C de calor y revuelva en 60-120 rpm. Ajustar estas opciones según sea necesario y controlar permanentemente el avance del proceso de disolución como la solución inicialmente cambia de opaco a un claro aspecto que significa que la agarosa se ha disuelto completamente.
   PRECAUCIÓN: El vaso caliente y la solución están calientes!
3. Como la solución de agarosa se calienta y agita, recuperar cuatro placas de Petri vacías de 10 cm y añadir 20 mL de DPBS a dos de ellos. Colocar agujas de acupuntura (diámetro: 300 μm, longitud: 40 mm), microlitro tubos capilares de cristal (diámetro: 701,04 μm, longitud: 65 mm capacidad: 25.0 μL) y un dispensador de la bombilla dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología. Cuando la solución de agarosa líquida despeja hacia fuera, mantener la calefacción a aproximadamente 50 ° C constante y revolviendo para evitar la gelificación de la agarosa.
4. Introducir una aguja de acupuntura en la abertura de la parte inferior de un dispensador de bulbo. Inserte un tubo capilar sobre la aguja expuesta al exterior. Fije el tubo capilar introduciendo parte de ella en la sección de goma del cilindro dispensador de bulbo.
5. Transferir 1 mL de agarosa líquida con una micropipeta a la superficie de una placa de Petri vacía y coloque un extremo del tubo capilar verticalmente (con la aguja insertada) en contacto con agarosa, mientras que la tapa de goma del depósito del bulbo se pellizquen hacia adentro. Suelte lentamente la presión sobre la tapa del distribuidor de bombilla para dibujar la agarosa en el tubo capilar.
   Nota: La transferencia de agarosa líquida en los tubos capilares debe realizarse rápidamente. Si la agarosa líquida se deja enfriar en la superficie del plato de Petri durante suficiente tiempo (aproximadamente 60 s), comienza a gelificarse, prevención de aspiración adecuada de agarosa a lo largo del tubo capilar.
6. Lugar cada conjunto de lámpara tubo de aguja en una placa Petri libre y deje la agarosa del gel interior de los tubos capilares solidificar por 5 min con cuidado jale el tubo capilar con las manos fuera del tapón de goma en el cilindro dispensador de foco, dejando la aguja y el gel de agarosa en el interior del tubo.
7. Extraer manualmente la aguja de acupuntura tirando lentamente el tubo capilar; el cilindro de agarosa solidificada nuevamente también las diapositivas del tubo en este procedimiento, que todavía rodea la aguja. Suavemente empujar la micro columna a lo largo de la aguja de acupuntura con la punta de las pinzas estériles para pasar al final. Coloque la aguja sobre un plato de Petri que contiene la DPBS abierto y empuje la columna micro la DPBS con fórceps.
   Nota: Si el micro-columna de agarosa permanece dentro del tubo capilar de vidrio al retirar la aguja de acupuntura, Presione lentamente la agarosa micro-columna del tubo capilar con una aguja de calibre 25 mm y en el plato con DPBS.
8. Esterilizar microscalpels o pinzas utilizando un esterilizador de grano caliente. Hacer 4% w/v agarosa pesar 4 g de agarosa y transfiriendo a 100 mL de DPBS. Calentar y remover como se explica en el paso 1.2 para obtener una solución de agarosa líquida clara de 4%. Mantener el calentamiento y la agitación de la solución a lo largo de los siguientes pasos.
9. Transferencia de las cajas Petri que contienen el micro-columnas a una campana de disección y mover una columna micro con unas pinzas finas para una placa de Petri vacía. Utilizar el Estereoscopio para la orientación visual y una microscalpel para cortar las columnas de micro a la longitud deseada. Recortar ambos extremos extremos forma biselado 45^o ángulos respecto a la horizontal para facilitar el manejo del micro-columnas durante la adición de ECM y de la célula.
10. Repite el anterior paso durante tres más micro-columnas en el mismo plato de Petri y alinee las cuatro construcciones en paralelo con una separación de < 3 mm entre cada uno de los cilindros. Carga 50 μl de solución de agarosa al 4% con una micropipeta y vierta una raya/línea de líquido en la matriz columna de micro para conectar y agrupar las construcciones en grupos de cuatro (en adelante llamado "micro-columna barcos"). Evitar el movimiento de agarosa al 4% en los extremos de las columnas de micro que pueden obstruir el interior, minimizando la distancia entre las construcciones y agregando la agarosa rápidamente en una delgada línea.
    Nota: Organizar grupos de cuatro columnas de micro en "barcos" no es necesario para la fabricación de los andamios astrocytic. Sin embargo, los barcos sirven para acelerar el proceso de fabricación y ofrecer un camino más seguro para moverse y manejar micro-columnas en pasos posteriores.
11. Deje que el micro columna barco se enfríe durante 1-2 minutos permitir la congelación de la agarosa de 4% adicional. Coge el barco columna de micro con pinzas finas por la conexión 4% agarosa y mover las columnas de micro a la otra que contiene DPBS Petri preparada en el paso 1.1.3. Fabricar barcos más con las restantes columnas de micro como se desee.
12. Mueva las cajas Petri que contienen el micro-columnas y botes a un gabinete de bioseguridad y esterilización con exposición a luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos.
    PRECAUCIÓN: Use protección adecuada para evitar la exposición a los rayos UV.
13. Almacenar los platos con los barcos de micro columnas de DPBS a 4 ° C, si además de ECM y galjanoplastia del celular no se producirán inmediatamente después, hasta 1 semana. Repita los pasos de fabricación de micro columnas si las construcciones no se utilizan durante este tiempo.

2. aislamiento y cultivo celular de primaria de

1. Aislamiento de astrositos cortical de crías de rata
   1. En preparación para los siguientes pasos, agregar 20 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) para cuatro platos de Petri de 10 cm que servirán como depósitos de los tejidos disecados. Mantener todos los platos de hielo. Esterilizar tijeras quirúrgicas limpias, pinzas, espátula de micro y micro bisturís en un esterilizador de grano caliente.
   2. Precaliente la tripsina 0.25% con ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA) y desoxirribonucleasa (DNasa) de 0,15 mg/mL en HBSS a 37 ° C. Además, precaliente astrositos medio de cultivo a 37 ° C, que consta de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con mezcla de nutrientes del jamón F-12 y 10% suero bovino fetal (FBS).
   3. Anestesiar el día postnatal 0 o crías de rata Sprague-Dawley día 1 por exponerlos a condiciones hipotérmicas y eutanasia por decapitación. Perno de la cabeza en un escenario con un 19 mm calibre de aguja en el hocico anterior a los ojos.
   4. Hacer una incisión con un bisturí por la mitad posterior a la anterior, desde la base del cuello hasta sólo detrás de los ojos. Realizar otra incisión pasando lateralmente de directamente detrás de los ojos hacia abajo, formando una forma de T. Usar pinzas finas para retirar el piel craneal, el cráneo al lado.
   5. Mantenga la cabeza por el hocico (hacia arriba) mediante la colocación de uno de los dientes de las pinzas en la boca del animal y el otro en la superficie exterior. Quitar el cerebro con una micro-espátula estéril y colocar en uno de los platos de Petri con HBSS refrigerados. Lugar este plato de Petri en el hielo inmediatamente después y en todo momento excepto cuando esté en uso.
   6. Coloque un bloque de granito previamente almacenado a-20 ° C por debajo de un estereoscopio dentro de una campana de disección. Coloque la placa de Petri con el tejido cerebral en la superficie del bloque de granito para preservar su temperatura baja durante el procedimiento de disección. Uso del estereoscopio como orientación visual a lo largo de los siguientes pasos.
   7. Si los bulbos olfativos se mantienen intactos, extraerlos por corte con pinzas o microscalpels. Además, utilice un microscalpel para eliminar el cerebelo y haga una incisión de línea media que separa los dos hemisferios cerebrales. Transferencia de los hemisferios con pinzas a una placa Petri conteniendo HBSS frescos, refrigerados.
   8. Disecar las estructuras del cerebro medio desde el interior de los hemisferios con un microscalpel para obtener sólo las cortezas separadas. Usar pinzas finas de pelar las meninges, una estructura de hoja-como, desde el tejido cortical y las cortezas aisladas una nueva placa de Petri con HBSS frío. Utilice el microscalpel para picar el tejido con el fin de aumentar la superficie de acción de la tripsina en el paso siguiente.
   9. Utilice una pipeta Pasteur transferir las cortezas a un tubo de centrífuga de 15 mL que contiene 4 mL de tripsina-EDTA precalentado (8 cortezas en cada tubo). Exponer el tejido cortical de tripsina-EDTA para 5-7 min a 37 ° C.
   10. Con una pipeta Pasteur, retirar cuidadosamente el tripsina-EDTA y añadir 400 μL de 0,15 mg/mL DNasa I solución al tubo de centrífuga. Agitar el tubo o el vortex hasta que el tejido está disociado y no hay piezas de tejido restante en el líquido. Si no es posible disolver completamente el tejido, retirar los fragmentos restantes con la punta de una pipeta Pasteur.
   11. Centrifugar el tubo que contiene la solución de células disociadas a 200 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur sin molestar a las células. Añadir 1 mL de medio de cultivo de astrositos (definido en el paso 2.1.2) al tubo con una micropipeta y agitar para resuspender y crear una solución homogénea.
   12. Transferir 10 mL de medio de cultivo de astrositos con una pipeta serológica a un matraz de T-75. Añadir 250 μl de la solución de la célula de 1 mL (preparada en el paso 2.1.11) con una micropipeta en el matraz de la placa de un cerebro de cachorro digno de células por frasco. Distribuir uniformemente la solución descargada de la célula en el medio de cultivo y agitar suavemente el frasco para promover una distribución uniforme.
   13. La cultura los frascos plateados en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO₂. Después de llegar a 24 y 72 h en cultura, mecánicamente agitar el frasco para separar tipos de celulares no adherente, como neuronas y oligodendrocitos.
   14. Luego, en cada uno de estos puntos de tiempo, realizar un cambio de los medios de comunicación. Sostenga el frasco verticalmente por lo que los medios de cultivo se encuentra en la parte inferior del frasco, no cubriendo las células adheridas. Aspire el medio de cultivo con una pipeta Pasteur, presionando la punta de la pipeta contra la parte inferior del frasco para evitar la extracción de las células. Colocar el matraz en posición horizontal original y suavemente agregue 10 mL de medio de astrositos sobre las células con una pipeta serológica.
   15. Devolver los frascos a la incubadora después de cada cambio de los medios de comunicación. Después de 90% de confluencia, mecánicamente agita el frasco una vez más para eliminar cualquier célula restante no adherentes.
   16. Paso los astrocitos por sacar el medio de cultivo con un vacío y una pipeta Pasteur. Añadir 5 mL de 0.25% tripsina-EDTA con una pipeta serológica sobre las células adheridas. Agite suavemente el frasco para asegurar que la tripsina cubre todas las células e Incube el frasco por 5-7 min a 37 ° C y 5% CO₂.
   17. Quench tripsina añadiendo 1 mL de medio de astrositos a las células con una pipeta serológica. Extraer la solución de células del frasco con una pipeta serológica y transferirlo a un tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 3 minutos.
   18. Quite el sobrenadante con una pipeta serológica y resuspender en 1 mL de medio de cultivo de astrositos. Agitar el tubo para asegurar que la solución celular es homogénea. Contar el número de células en la solución con un hemocitómetro o un contador celular automático.
       Nota: Un frasco que es típicamente 90% confluente rinde aproximadamente 3 millones astrocitos.
   19. Añadir 10 mL de medio de cultivo de astrositos en un matraz de T-75. Realizar una dilución de 1:4 por transferir 250 μl de la solución (paso 2.1.18) del celular con una micropipeta en el matraz de T-75 ya que contiene medio de cultivo. Frote suavemente para asegurar una distribución homogénea de la célula a través de la superficie del frasco.
   20. Repita los pasos 2.1.16-2.1.19 cada vez que se logra el 90% de confluencia para las células de paso.
2. Aislamiento de neuronas corticales de fetos de rata
   1. Siguen preparativos similares como pasos 2.1.1 y 2.1.2, con la excepción de que los medios precalentado son medios de co-cultivo, de Neurobasal medio + 2% B-27 suplemento (neuronas) + 1% G-5 libre de suero suplemento (astrocitos) + 0.25% L-glutamina.
   2. Eutanasia a día embrionario embarazo programado 18 ratas Sprague-Dawley con asfixia dióxido de carbono y confirmar la muerte por decapitación.
   3. Extraer los fetos de rata y diseccionar las cortezas del resto del tejido cerebral en cajas Petri que contienen HBSS en la superficie del bloque de granito frío, utilizando un estereoscopio para la orientación visual y tijeras estériles, microscalpel y pinzas⁵³ . Después de la disección sucesivos de la cabeza, cerebro, hemisferios cerebrales y cortezas, transferir cada tejido para un nuevo plato de Petri llenas de HBSS.
   4. Pique el tejido cortical en fragmentos más pequeños para aumentar el área superficial para la tripsina. Transferencia de 4-6 cortezas con un Pasteur pipeta en un tubo con 5 mL de tripsina-EDTA precalentada y mantienen a 37 ° C para disociar el tejido. A los 5-7 min manualmente agitar el tubo para mezclar y evitar la aglutinación de los tejidos.
   5. Retire el tubo de 37 ° C después de 10 min. Como se explicó previamente en el paso 2.1, extracto de tripsina-EDTA y sustituir con 1,8 mL de 0,15 mg/mL solución ADNasa. Luego, vórtice el tejido hasta que la solución aparece homogéneo, no fragmentos de tejido flotando en el líquido.
   6. Centrifugue la solución disociada tejido a 200 x g durante 3 minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspender en 2 mL de medio de cocultivo. Contar el número de células en esta solución con un hemocitómetro o un contador celular automático.
      Nota: El rendimiento generalmente es de 3.0-5.0 x 10⁶ células corteza hemisferio.
   7. Preparar una nueva solución de celular con una densidad de 2.0-4.0 x 10⁵ células/mL en los medios de cultivo Co definidos anteriormente.

3. desarrollo de los Cables Astrocytic dentro de las columnas de Micro

1. Fabricación de núcleo de ECM
   Nota: El ECM debe añadirse al interior de las micro-columnas de hidrogel en el mismo día en que se realizará siembra celular.
   1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, preparar un 1 mg/mL solución de cola de rata colágeno tipo I Co medio de cultivo en un tubo de microcentrífuga estéril. Mantener el tubo de microcentrífuga con la solución de ECM en el hielo en todo momento excepto cuando esté en uso.
   2. Transferencia de 1-2 μl de la solución de ECM con una micropipeta en una tira de papel de tornasol para calcular su pH. Añadir 1 μl de 1 N hidróxido de sodio (NaOH) o de ácido clorhídrico (HCl) con una micropipeta para aumentar o disminuir el pH de la solución de ECM, respectivamente y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar. Verificar el pH nuevo con una tira de papel de tornasol y agregar más ácido o base, según sea necesario, hasta que el pH es estable en el rango de 7.2-7.4.
   3. Mueva las cajas Petri de paso 1.2 a una campana de disección y transferencia 4-5 micro-columnas o un barco con pinzas finas estériles a un vacío y estéril 35 o 60 mm plato de Petri. Usando el Estereoscopio para la dirección, coloque la punta de 10 μl de una micropipeta en un extremo de cada columna de micro y succión para vaciar el lumen de DPBS y aire burbujas. Confirmar la ausencia de burbujas de aire con el Estereoscopio para asegurar que el ECM ha añadido en el paso siguiente puede fluir libremente a través de la luz.
   4. Cargar una micropipeta P10 con solución de ECM, lugar 10 μl Punta contra uno de los extremos de las columnas de micro hidrogel y suficiente solución para llenar el lumen (aproximadamente 3-5 μl), observando la entrada de ECM con el estereoscopio. Pipeta un pequeño reservorio (2-4 μL) de solución de ECM en cualquiera de los extremos de la columna de micro.
      Nota: Siempre administrar 4-5 micro-columnas o un barco a la vez para evitar la prolongada sequedad de las construcciones, ya que puede producir en el plegamiento de la estructura micro-columna. Micro-columnas totalmente secos se adhiera firmemente a la superficie de los platos de Petri, que impide su utilización para la siembra de células. Cantidades excesivas de medios de cultivo Co (medida de hidratación) no se puede Agregar a las columnas de micro porque esto puede causar el ECM a salir durante el período de incubación que se describe a continuación.
   5. Medios de cultivo Co de la pipeta en un anillo alrededor de la caja Petri para proporcionar una humedad del fregadero para evitar que las columnas se seque durante la incubación. Incubar la placa de Petri que contiene el micro-columnas que contienen el ECM a 37 ° C y 5% de CO₂ por 1 h para promover la polimerización de colágeno antes de añadir las neuronas o astrocitos.
      Nota: El ECM debe formar una capa cubriendo la superficie interna del lumen del hueco, en lugar de un núcleo sólido de ECM que abarca el interior, que pueden ser observados mediante el estereoscopio. Si el ECM forma una base, continuar la incubación hasta que quede sólo la capa. Con esta capa formada, la solución de la célula de astrositos puede llenar el interior de la columna de micro en los pasos de la galjanoplastia.
   6. Durante el período de incubación, preparar la solución de la célula de astrositos (como se describe a continuación).
2. Astrositos y sembrador de la neurona en las columnas de Micro
   1. Paso los astrocitos plateados (entre el cuarto y duodécimo paso) como se explica en pasos 2.1.16-2.1.19. Después de contar el número de células en el matraz, preparar la solución de células a una densidad de 9.0-12.0 x 10⁵ células/mL de solución en medios de cultivo celular.
   2. Utilizando un estereoscopio, coloque la punta de una micropipeta P10 en uno de los extremos de las columnas de micro y transferir suficiente solución celular (~ 5 μl) en el lumen para llenarlo completamente. Como hecho por encima con el ECM, añadir pequeños embalses de solución celular a ambos extremos de cada columna de micro.
   3. Incubar las columnas de micro plateadas en las cajas Petri a 37 ° C y 5% de CO₂ por 1 h para promover la fijación de los astrocitos al ECM. Si las neuronas no se añadirán a las micro-columnas, proceda al paso 3.2.5.
   4. Después del período inicial de incubación, añadir 1-2 μl de la solución de neurona cortical obtenida en el paso 2.2.7 en ambos extremos de las columnas de micro con una micropipeta, observando bajo el estereoscopio. Asegúrese de que los medios suficiente está presente en los platos para evitar que se sequen y otra vez incubar durante 40 min a 37 ° C y 5% CO₂ para permitir la adherencia de las neuronas.
      Nota: Solución de neurona Cortical también se puede añadir 1-2 días después de la formación del paquete, realizar paso 3.2.4 después de retirar cuidadosamente los medios de cultivo de la placa de Petri con una micropipeta.
   5. Después de la incubación, cuidadosamente llenar los platos de Petri que contiene las columnas de micro plateadas con 3 ó 6 mL de medio de cocultivo de 35 o 60 mm placas de Petri, respectivamente. Mantener las columnas de micro plateadas en cultivo a 37 ° C y 5% CO₂ para promover la uno mismo-montaje de los paquetes astrocytic alineados, que forman una estructura incluida, cable-como después de 6-10 h.
3. Estabilización de astrositos Cable arquitectura
   Nota: Después de la formación de paquetes, aproximadamente 6-12 h de cultivo de las construcciones, realice los pasos siguientes para evitar el colapso de la estructura alineada de los andamios astrocytic.
   1. En un tubo de microcentrífuga estéril, prepare un colágeno de cola de rata de 3 mg/mL solución en medios de cultivo conjunto. Ajustar el pH de la solución de 7.2-7.4 siguiendo el procedimiento descrito en el paso 3.1.2. Mantener los medios de acción y cultura Co colágeno en el hielo cuando no esté en uso y coloque la solución de colágeno dispuestos en hielo en todo momento.
   2. Retire los medios de comunicación de las cajas Petri que contienen los andamios astrocytic con una micropipeta, dejando algunos medios de los lados del plato para crear un disipador de humedad que asegure la hidratación de las micro-columnas. Coloque el plato bajo un estereoscopio para ayudar en la visualización.
   3. Con una micropipeta, tomar 2-3 μl de solución de colágeno y descarga en cada extremo de las micro-columnas, usando el Estereoscopio para la orientación visual. Asegúrese de que el plato tiene suficientes medios alrededor de los lados para actuar como un disipador de humedad alrededor de los bordes del plato. Incubar las cajas Petri con las columnas de micro de 30 min a 37 ° C y 5% de CO₂ en una incubadora humidificada para promover la gelificación del colágeno recién agregado.
   4. Agregar lentamente 3 ó 6 mL de medio de cocultivo (35 o 60 mm Petri platos, respectivamente) para el Petri platos con una pipeta y la cultura de los platos en un incubador humedecido a 37 ^oC y 5% CO₂.

4. extracción de los paquetes Astrocytic desde el Interior del hidrogel

1. Cubreobjetos de vidrio en una autoclave de esterilización. Preparar un 20 μg/mL de solución de poli-l-lisina (PLL) en agua de grado de cultura de célula estéril.
2. Dentro de un gabinete de bioseguridad, manualmente transferir el cubreobjetos de vidrio esterilizada a un estéril 10 cm plato de Petri y añadir suficiente solución PLL para cubrir el cubreobjetos.
3. Incubar el cubreobjetos, cubierto con la solución PLL, durante 30 min a 37 ° C para cubrir la superficie. Retirar la solución PLL con una pipeta Pasteur después de 30 minutos enjuague tres veces, añadiendo agua de grado de cultura de célula para el cubreobjetos y quitando con una pipeta Pasteur.
4. Después de la formación del paquete glial alineado, transferir la columna micro delicadamente a una caja Petri estéril con pinzas finas estériles y añadir una pequeña piscina de 10 μl cooperación de medios de cultivo con una micropipeta para prevenir la deshidratación y asegurar salud de paquete. Extraiga el paquete astrocytic de la micro-columna de hidrogel tirando suavemente de un lado con pinzas quirúrgicas estériles, utilizando un estereoscopio para la orientación visual.
5. Sostiene el paquete astrocytic con fórceps, montarlo en un cubreobjetos recubierto de PLL. Fijar y teñir con el protocolo siguiente.

5. inmunocitoquímica para estudios In Vitro

Nota: Para este estudio, los anticuerpos primarios fueron proteína fibrilar ácida (GFAP) (1: 500), de anti-glial de conejo anti-β-tubulina III (1: 500) de ratón, conejo anti colágeno I (1: 500), ratón nestina anti (1: 200) y conejo anti-vimentina (1: 100). Los anticuerpos secundarios fueron burro anti-ratón 568, burro anti-conejo 568, anti-conejo burro 488 y burro anti-ratón 568 (1: 500 para todos). En todos los casos, agregar suficiente volumen de cada solución para cubrir completamente el micro-columnas.

1. Preparar una solución de formaldehído 4% volumen/volumen (v/v) en 1 x DPBS dentro de una campana de humos químicos.
   PRECAUCIÓN: formaldehído es un compuesto tóxico conocido cancerígeno y debe desecharse en un contenedor separado. Siempre manipular este compuesto dentro de una campana de humos químicos y utilizar equipo de protección personal (EPP) como capa de laboratorio, gafas de seguridad y guantes.
2. En el caso de las micro-columnas, desechar los medios de cultivo de los platos de Petri que contiene las construcciones con una pipeta Pasteur sin aspirar accidentalmente los cilindros de hidrogel. Añadir suficiente solución de formaldehído para cubrir el micro-columnas o el cubreobjetos montado (que permanecen en las cajas Petri) e incubar por 35 min a 18-24 ° C.
3. Extraer la solución de formaldehído de 4.0% de las micro-columnas fijas o el cubreobjetos con una pipeta serológica. Enjuague las micro-columnas fijadas tres veces con PBS rápidamente añadiendo y quitando PBS dos veces y luego dejar que se remoje por 10 minutos una tercera vez.
4. Suero de caballo normal (NHS) se disuelven en PBS a una concentración de 4% v / v. preparar una solución con detergente no iónico a una concentración de 0.3% v/v usando la solución de NHS como el solvente.
5. Retire el PBS de las cajas Petri que contienen el micro-columnas o el cubreobjetos con una pipeta. Añadir suficiente solución de detergente de 0.3% para cubrir el micro-columnas/cubreobjetos por 60 min a 18-24 ° C para permeabilizar las células.
6. Sacar la solución de detergente y enjuague rápidamente dos veces con PBS y tres veces sumergiéndolos durante 5 minutos, calcular el volumen requerido del NHS de 4% y cada uno de los anticuerpos primarios para preparar una solución con las concentraciones de anticuerpo deseado.
7. Retirar el PBS de las cajas Petri y añadir suficiente anticuerpo primario (diluido en 4% NHS DPBS) solución para cubrir las columnas micro o los paquetes extraídos astrocytic. Incubar durante la noche (12-16 h) a 4 ° C.
8. Sacar la solución del anticuerpo primario y rápido enjuague dos veces con PBS y tres veces por remojo de 5 minutos cada uno. Preparar la solución de anticuerpo secundario, en la oscuridad, con cada anticuerpo presente en una dilución de 1: 500 en solución de NHS de 4.0%.
9. Incubar las células con la solución de anticuerpo secundario por 2 h a 18-24 ° C. A lo largo de todo el tiempo de incubación, cubrir los platos de Petri que contiene el micro columnas con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
10. Retirar la solución de anticuerpo secundario y agregue solución de Hoechst (1:10, 000) por 10 min a 18-24 ° C para teñir los núcleos.
    PRECAUCIÓN: Hoechst es un mutágeno conocido que debe ser tratado como un carcinógeno. Por lo tanto, debe eliminarse en un recipiente separado y PPE debe usarse en todo momento al manipular este agente.
11. Lavar con PBS cinco veces, cada vez durante 5-10 minutos luego, almacenar las columnas manchadas de micro a 4 ° C en PBS y cubierta con papel de aluminio. En el caso de los paquetes astrocytic montados, añadir una gota de medio de montaje acuoso al paquete, coloque otro cubreobjetos de cristal sobre el paquete fijo y ambos cubreobjetos con esmalte de uñas para el almacenamiento a largo plazo y posterior proyección de imagen del sello.

6. viabilidad ensayo con vivo-muerto (homodímero de etidio-AM/calceína) tinción

1. Preparar la solución de reactivo al añadir 5 μl calceína AM (a 4 mM en anhidro dimetil sulfóxido (DMSO)) y 20 μl homodímero de etidio-1 (EthD-1) (a 2 mM en DMSO/H₂O 1:4 v/v) a 10 mL de 1 x DPBS. Cubrir la solución con papel de aluminio o almacenar en la oscuridad para proteger de la luz.
2. Aspire los medios de comunicación desde la placa de Petri que contiene las columnas de micro plateadas con una pipeta Pasteur y agregar suficiente solución (preparada anteriormente) para cubrir las construcciones. Incubar durante 30 min a 37 ° C y 5% CO₂, manteniendo la caja Petri cubierto para proteger la solución de la luz.
3. Retirar la solución con una micropipeta o pipeta Pasteur. Enjuague 2 ó 3 veces con DPBS como se explica en el paso 5.3. Las cajas Petri con DPBS de inundación según el tamaño del plato. Imagen células inmediatamente después con epifluorescencia o proyección de imagen confocal.
   Nota: Conversión de la membrana permeable calceína AM a calceína por células metabólicamente activas produce la fluorescencia verde de calceína. Las células muertas se marcan como células comprometidas de membrana, que permiten la entrada de EthD-1 en la célula y su unión a ácidos nucleicos, causando fluorescencia roja.

Representative Results

Inicialmente, fase-pone en contraste microscopia fue utilizada para supervisar la progresión de astrositos adherencia y paquete de formación y la estabilidad general de la Citoarquitectura en función del tiempo. A 1 h después de la galjanoplastia, los astrocytes fueron encontrados a lo largo del lumen de las columnas de micro con una morfología esférica (figura 2A). En 5 h, astrocitos comenzaron ampliar procesos y contratación, mientras que 8 h células exhibieron una morfología de rodamiento de proceso completada y forman de cable-como las estructuras orientadas a lo largo del eje longitudinal de la columna de micro (figura 2A). En particular, frente a la presencia inicialmente dispersa de células a través de las columnas de micro, astrocitos parecen han contratado a formar una red de paquetes densos a lo largo del interior (figura 2B). Después de la alineación inicial de la célula, las redes de astrositos a menudo reunidas a lo largo del eje longitudinal, que se asemeja a una cremallera de cierre, para formar un conjunto denso en el centro de la micro-columna (figura 2). La formación de esta arquitectura incluida fue debida a un montaje propio proceso, dictado en parte por la elección de densidad de ID y celular micro-columna. Astrocitos alineado y adquirieron una morfología bipolar cuando siembran en micro-columnas con un ID de menos de 350 μm (figura 3B, superior y medio y 3D-3F)⁴⁹. Por el contrario, estas células demuestran direccionalidad al azar cuando se utiliza un ID de 1 mm (figura 3B, parte inferior), que es similar a la aparición de astrositos 2D cultivos expuestos a la libre de suero, co medio (Figura 3A, derecha) de la cultura. Además, aunque astrocitos todavía Mostrar la alineación en las densidades de siembra bajas (2.0-3.0 x 10² células/mm³o 2.0-3.0 x 10⁵ células/mL) (figura 3), redes densas se forman solamente en las altas densidades (9.0-12.0 x 10⁵ células/mL o² de 9.0-12.0 x 10 células/mm³) dentro de micro-columnas cilíndricas de similares dimensiones (visto en la figura 3B, superior), como sugiere en el protocolo⁴⁹. Viabilidad en los paquetes astrocíticos se cuantificó, usando el análisis vivo o muertos, como la relación entre el área de células fluorescentes verde (calceína AM) en relación con el área total de células fluorescentes verde (calceína AM) y rojo (EthD-1). La viabilidad de los paquetes astrocytic fue de 97,4%, que es similar a la viabilidad de 98.2% de los controles de cultura astrositos 2D (Figura 4A-4B), demostrando que el ambiente dentro de las micro-columnas es conveniente para la vitalidad de astrositos ( Figura 4E). Las reconstrucciones 3D de las células vivas y muertas en los andamios astrocytic también demuestran la total alineación celular dentro de las construcciones (figura 4-4 D). Además, ultra largos astrocytic micro-columnas fueron desarrollados para investigar la estabilidad de los paquetes de astrositos con longitud considerable. Incluso en la distancia extraordinaria de 3,5 cm, la Citoarquitectura de alineado, densa y contratados paquetes astrocytic fue sostenido constantemente a lo largo de la longitud de la columna micro (figura 5A), como claramente se ve en el zoom en regiones de la micro-columnas (figura 5B-5C).

Una vez formado, los paquetes fueron fijados y teñidos por técnicas de inmunocitoquímica de proteínas de filamentos intermedios características de las células gliales, como GFAP, nestina y el vimentin. Las imágenes confocales confirman la morfología del proceso-rodamiento de astrocitos y alineación longitudinal de procesos (figura 6 y figura 7). Expresión de las proteínas de filamentos intermediarios puede verse en las culturas de astrositos 2D (Figura 7A) así como los paquetes de astrositos dentro de la micro-columna (figura 6, figura 7B-7 D). Además, colágeno manchas corroboran la presencia de esta proteína de ECM en las columnas de micro. Los astrocitos no formó una estructura continua con el colágeno cuando cultivadas en un entorno 2D (figura 8A), mientras que los astrocitos se adhieren a y remodelar el colágeno presente en la luz cuando cultivadas en las micro-columnas, permitiendo que para la formación de la célula bulto y contracción (figura 8B). Recubrimiento de los canales de GFAP y colágeno demostró que los cables de astrositos consistió en procesos estrechamente asociados con las fibras de colágeno longitudinales (figura 8B). Por lo tanto, además de ofrecer anclaje, fibrillas de colágeno pueden también han proporcionado pautas direccionales adicionales para astrocitos a formar densos paquetes después de una contracción. En algunos casos, la contracción del colágeno astrositos persistió, resultando en un colapso del paquete alineado durante 12-24 h después de la formación (Figura 9A). Para estabilizar la arquitectura astrositos de cable-como dentro de las micro-columnas de hidrogel, la matriz de colágeno adicional fue agregada a los extremos de un paquete completamente formado para inhibir la contracción y el colapso. Esta técnica de refuerzo permitió la supervivencia de la arquitectura de cable deseada durante al menos 4 días, con una ventana más larga de estabilidad espera (figura 9B). Por otra parte, representante paquetes astrocytic fueron extraídos de la columna micro de hidrogel montadas y fijados con formaldehído al 4% en vidrio cubreobjetos para evaluar su robustez cuando se expone a fuerzas de tensión y el ambiente externo. Incluso después de extracción y manipulación física en diversas formas (figura 10A, 10B), somata astrocytic y procesos mantenidos una alineación incluye morfología micro escala (figura 10), destacando la resistencia del andamio astrocytic Tecnology, una vez formado, aunque el soporte estructural de la columna de micro hidrogel está ausente.

Neuronas corticales primarias también fueron cultivadas conjuntamente con astrocitos dentro de las micro-columnas para explorar si los paquetes de astrositos fueron capaces de fomentar la adhesión neuronal y consecuencia del neurite. GFAP y la proteína de los microtúbulos β-tubulina III fueron utilizados como marcadores específicos para los astrocitos y las neuronas, respectivamente. Figura 11A muestra que astrocitos sembrados conjuntamente con las neuronas corticales también eran capaces de exponer procesos y formando paquetes alineados. Las neuronas parecen han adherido preferentemente a los paquetes de astrositos, desde todos positivo β-tubulina III manchas localizadas junto con GFAP (superposiciones en la figura 11B-11C). Para demostrar las propiedades regenerativas de los constructos astrocytic, neuronas corticales (Figura 12B) fueron plateadas dentro del hidrogel micro-columna 2 días después de que los astrocitos eran plateado (figura 12A). Las neuronas adjunta al paquete de astrositos y extendido neurites directamente a lo largo de los tractos astrocytic. Nueva inspección demostró neurite consecuencia orientado en la dirección del cable astrocytic, mientras que en regiones donde no estaba presente el tracto de astrositos, neuritas fueron creciendo de manera desordenada (figura 12). Estas observaciones demuestran que el protocolo da lugar a redes astrocytic alineadas, viables y sólidas que tienen el potencial para actuar como caminos de vida implantable promoción consecuencia de adherencia y neurita de neurona.

Figura 2: microscopía Brightfield muestra formación de astrositos paquetes dentro del hidrogel Micro-columnas en el tiempo. (A) morfología de astrositos en función del tiempo después de la galjanoplastia: los astrocitos (1 h) son esféricos en forma y dispersos a lo largo de la construcción; astrocitos (5 h) inician el proceso de extensión y contracción; (8 h) astrocitos han alineado y contratado. Barras de escala = 100 μm. (B) paquete la formación en el tiempo en un andamio representante adicional: (1 h) inicialmente los astrocitos son esféricos y no exhiben procesos; está formado (24 h) un paquete denso de los procesos astrocytic. Barras de escala = 300 μm (izquierda) y 500 (derecha). (C) totalmente formado astrocytic paquete 24 h después de la galjanoplastia, mostrando un efecto de "cerrar", donde se fijan los extremos del cable a distintos extremos de las paredes de la luz. Barra de escala = 1000 μm.

Figura 3: diámetro interno Micro-columna y celda densidad influencia el uno mismo-montaje de los paquetes alineados de astrocitos Bipolar. Culturas de astrositos 2D (A) con los medios que contienen suero (izquierdos) y medios de cultivo Co libre de suero (derecha) muestran una morfología de rodamientos no proceso de múltiples procesos, respectivamente. Barras de escala = 100 μm. (B) astrocitos sembrados en alta densidad (9.0-12.0 x 10⁵ células/mL) en micro-columnas con un ID de 180 y 350 μm de forma alineada en relación con el eje longitudinal, mientras que una identificación de los resultados de 1 mm en los astrocitos mostrando múltiples, procesos no alineados a lo largo del diámetro del lumen. Barras de escala = 100 μm (superior, medio) y 150 (parte inferior). (C) astrocitos sembrados en una columna 350 μm ID micro a baja densidad (2.0-4.0 x 10⁵ células/mL) son alineados, pero no. Barra de escala = 100 μm. (D) cuando plateado de una 350 μm ID micro-columna de densidad baja o media de la célula, los astrocitos adquieren una morfología bipolar. Barras de escala = 300 μm. (E) la caja en D mostrando un zoom-in de las cadenas de astrocitos bipolares que se forman dentro de las micro-columnas de hidrogel. Barra de escala = 300 μm. (F) ejemplo de un individuo astrositos bipolares. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: astrocitos permanecen viables después de la formación del paquete dentro de la Micro-columna de hidrogel. (A-B), (C-D) reconstrucciones confocales 3D mostrando la viabilidad de las células a lo largo de culturas planares y paquetes astrocytic alineados, respectivamente, como ensayaron con calceína-AM/etidio homodímero coloración (verde vivo células; rojo muerto células). (E) la cuantificación de las células vivas y muertas resultó en un porcentaje similar de astrocitos vivo o muertos cuando cultivadas en superficies de la 2D y en las columnas de micro. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: imagen de contraste de fase de un paquete Astrocytic alineado ultra-larga representante dentro de la Micro-columna de hidrogel. (A) paquete de formación a lo largo de toda la longitud de una columna micro de 3.5 cm. Barra de escala = 1.000 μm. (B-C) mayor aumento zoom-ins mostrando astrositos alineación en varias regiones a lo largo de la totalidad de la construcción, correspondientes a las cajas en el A. Barras de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: inmunomarcación de los andamios Astrocytic demuestra el alineamiento Longitudinal de los procesos Astrocytic. (A) reconstrucción Confocal de un paquete astrocytic mostrando la coloración para GFAP (rojo, izquierda) y núcleos (Hoechst; media) y con una superposición de ambos canales (derecha). (B) mayor aumento zoom-in del paquete astrocytic en la región en caja a permite la visualización de la Citoarquitectura de los astrocitos en micro-columnas. Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: caracterización de conjuntos representativos Astrocytic mediante inmunocitoquímica. (A-B) Astrocitos cultivan en las superficies de la 2D y siembran en hidrogel micro columnas expresan marcadores similares astrocytic GFAP (rojo) y vimentina (verde). (A) reconstrucción Confocal de una cultura de astrositos planar 2D que muestra los canales separados y combinados. Barra de escala = 100 μm. (B) imágenes confocales de un paquete astrocytic, confirmando la expresión de los marcadores y lucimiento de alineación de los astrositos. Barra de escala = 50 μm. (C-D) astrocitos cultivados dentro de micro columnas también expresan las proteínas de filamentos intermediarios nestina (rojo) y vimentina (verde). (C) imagen Confocal de un paquete astrocytic. Barra de escala = 100 μm. (D) mayor aumento zoom en c. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: astrocitos en los paquetes alineados interactúan íntimamente con una matriz de colágeno longitudinales, contratados, en contraposición a la disposición Irregular de colágeno en cultivos 2D. Las células immunolabeled observar astrocitos (GFAP; rojo), núcleos (Hoechst; azul) y colágeno (verde). (A) culturas de astrositos 2D con colágeno 1 mg/ml muestran astrocitos no alineados y el colágeno al azar distribuido. Barra de escala = 250 μm. (B) colágeno es extraído las paredes de la luz de la columna de la micro y se contrae para formar una matriz alineada que forma parte del paquete astrocytic. Barra de escala = 150 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: colágeno adicionales pueden utilizarse para estabilizar la estructura de Cables Astrocytic. (A) paquetes forman aproximadamente 6 h después de astrocitos dentro de micro-columnas recubiertas de colágeno hidrogel de la galjanoplastia. Una vez que se formaron paquetes, más colágeno de concentración (3 mg/mL) fue añadido a los extremos de la columna de micro para inhibir la contracción de los cables astrocytic. En construcciones no estabilizadas con colágeno adicional, los paquetes del colágeno astrocytic habían empezado a contraer por 18 h, y los cables de astrositos se habían derrumbado totalmente por 24 h. Esta contracción no se observó cuando los paquetes se reforzaron con 3 mg/mL de colágeno. Barra de escala = 1.000 μm. (B) Zoom-in del paquete astrocytic colapsado no reforzada con 3 mg/mL de colágeno. Barra de escala = 500 μm. (C) Zoom en regiones de micro columnas reforzado con colágeno. Morfología del paquete de astrositos se mantuvo a lo largo de la totalidad de la columna de micro. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: extracción de los paquetes astrocíticos de la columna de Micro y montaje sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-l-lisina evidencia la robustez de la técnica de. (A) fase-ponga en contraste extraído de imagen de varios paquetes astrocytic, manipulados en ortografía de la palabra "Penn". Reconstrucción Confocal (B) de la misma extrae paquetes teñidos para el marcador astrocytic GFAP (rojo) y los núcleos de célula (Hoechst; azul). Barra de escala = 100 μm. (C) aumento de la región en caja B muestra que, incluso cuando en formas irregulares, los andamios astrocytic conservan una morfología bipolar, alineada y una Citoarquitectura incluido. Barra de escala = 200 μm. diferencias estructurales entre la fase y las imágenes confocales probablemente es un artefacto de construcciones cambio por lavado durante el procedimiento de la inmunocitoquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: las neuronas se adhieren a y extender Neurites a lo largo de los paquetes de astrositos alineados en andamios Co cultivadas neurona-astrositos. (A) imagen de contraste de fase de un paquete de semillas de neurona astrocytic. Barra de escala = 300 μm. (B)-(C) las neuronas se observaron que se adhieren a los paquetes astrocytic y extender neurites a lo largo de la dirección del cable (Hoechst-azul; GFAP-verde; Β-tubulina III-rojo). Barras de escala = 200 y 100 μm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: astrositos Cables sirven como andamio viven para dirigido Neurite consecuencia. Reconstrucciones confocales mostrando una región de una micro columna de neuronas sembradas aproximadamente 2 días después de la formación del paquete. (A) paquetes de astrositos GFAP positivas, las neuronas (B) β-tubulina III-positivas y (C) combinación de todos los canales, incluyendo núcleos teñidos de HOECHST (azul). Tenga en cuenta que las neuronas exhiben neurite alineación cuando se adhirió a las regiones, con procesos alineados astrositos (flechas), mientras que las neuronas no se adhirieron a alineado astrocitos parecen exhibir al azar (es decir multidireccional) consecuencia del neurite (flecha). (D) Zoom in de la región muestra la direccionalidad de la consecuencia del neurite. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En comparación con el entorno más propicio del PNS, el SNC se ve particularmente limitado en el manejo de las consecuencias perjudiciales de neurotrauma y neurodegeneración. Después de un grave insulto al SNC mamífero, se forma una cicatriz glial, consistente en un núcleo de células inflamatorias y fibróticas rodeado por una densa red de astrocitos reactivos desorganizados que secretan axón inhibidor consecuencia proteoglicanos¹⁴. Esta cicatriz actúa como una obstrucción física y bioquímica contra la regeneración del axón conclusiones¹². Además, el CNS mamífero adulto posee limitadas fuentes de nuevas neuronas para restaurar las células perdidas después de trauma o neurodegeneración, desde centros neurogénicos se restringen a la SVZ, la convolución del cerebro dentada hippocampal y potencialmente otros generalmente inactivo áreas de⁵⁴. Una estrategia ideal sería eludir ambos aspectos de las capacidades recuperativas limitadas del CNS, que enfoques actuales no dirección. Por lo tanto, nuestro grupo de investigación ha desarrollado basado en astrositos Andamios a presentar vida vías para la migración neuronal hacia las áreas deficientes de neurona y extensión guiada de regenerar los conos de crecimiento del axón. Paquetes astrocytic alineados contenidas en el interior del colágeno de un micro-columna de agarosa constituyen estos andamios vida astrocytic. Una considerable diferencia de convencional célula-biomaterial basados y estrategias utilizadas para la regeneración y reparación del CNS es que la Citoarquitectura de estas construcciones es totalmente preformado en vitro para simular varios en vivo orientación basada en la glia y las arquitecturas de andamios. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario, caminos de glia radial actúan como andamios de la vida de nuevas neuronas que migran al neocórtex y las células gliales median la extensión específica de pioneras axones haciéndose pasar por sustratos con dibujos o células de hito^{35 ,38,39}. Glia radial embrionario en la zona subventricular también producir astrocitos que forman tubos gliales longitudinalmente alineados, sobre el cual neuroblastos migran postnatal en una encadenado-formación de la SVZ para la OB⁴¹. Además, se ha demostrado en algunos no mamíferos que, CNS dañan, un mayor grado de regeneración es posible debido a la formación de un arreglo astrocytic organizado, alineada⁴⁴. Por ejemplo, pez cebra adulto son capaces de regenerar sus médulas espinales después de la migración de las células gliales inmaduras para el sitio de la lesión, la diferenciación en una morfología bipolar y alargamiento de procesos gliales para superar la lesión, formando un camino que dirige la regeneración de axones de⁴⁵. Ingeniería construcciones de paquetes astrocytic alineados pueden ser capaces de recapitular estos mecanismos y que presenta las señales estructurales y solubles necesarias para la migración neuronal mediada por la glia y de regeneración del axón³⁵. Además, debido a la inclusión de vida astrocitos, estas construcciones pueden presentar activamente las señales ambientales requiere basadas en los comentarios del anfitrión.

En nuestra técnica, alineación de astrositos es un montaje propio proceso contingente a las señales físicas y las interacciones célula-célula promovidas por el micro columnas de diámetro interno, la concentración de colágeno y densidad de siembra. Otra característica atractiva de este método es su tamaño de la microescala, que puede permitir la implantación mínimamente invasiva en áreas dañadas del SNC. Por otra parte, resultados presentados en este manuscrito demuestran que las construcciones obtenidas con el protocolo poseen alta viabilidad y expresan las proteínas de filamentos intermedios GFAP, nestina y vimentin, independientemente de la edad de astrositos según lo definido por el número de paso . Mientras que los astrocitos inmaduros y maduros expresan GFAP y vimentina, nestin está principalmente restringida a las células inmaduras o indiferenciadas, con maduración de la glía regulando la expresión de GFAP y la decreciente producción de nestina^{45, 55}. anterior los estudios han demostrado eso astrositos cambios de comportamiento con la edad, sin embargo fue vista coherente expresión de proteínas de filamentos intermediarios, así como liarse en una amplia gama de paso números (pasos 4-12)⁵⁶. Los andamios astrocytic también fueron demostrados para lograr ultra-larga, escala centímetro largos en vitro, que sugiere que esta técnica es adaptable a las longitudes distintas lesiones y geometrías en vivo. Además, los paquetes astrocytic alineados exhiben notable integridad estructural y la estabilidad, como su Citoarquitectura de cable-como se mantiene incluso después de ser sometido a la extracción de las columnas de micro. Estar basada en astrositos andamios también apoyo neurona adherencia y neurite consecuencia, reforzando el potencial de esta técnica para promover la extensión migración y axón neurona dirigida para la reparación de la CNS.

Los paquetes astrocytic alineados están contenidos en el interior colagenoso de un protector protector tubular del hidrogel. Fabricación de andamios astrocytic comienza Asamblea de micro columnas insertando una aguja de acupuntura en un tubo capilar y aspiración agarosa líquida en él. Agarosa es el biomaterial seleccionado debido a sus propiedades inertes, biocompatibilidad y fácilmente controlada mecánica, propiedades físicas y bioquímicas⁴⁹. Concentración de agarosa en el hidrogel puede ser una variable importante ya que las células estímulos mecánicos del sentido de su substrato (por ejemplo, rigidez) y responder con cambios intracelulares⁵⁷. Criterios de diseño para estas columnas micro incluye una porosidad suficiente para permitir un adecuado transporte masivo, pero un pequeño suficiente tamaño del poro prohibir la consecuencia del proceso lateral; Estos criterios están satisfechos por la porosidad abierta de nano-escala en agarosa en la concentración utilizada en el presente Protocolo. La concentración de agarosa en este protocolo también fue elegida debido a su estabilidad, facilidad de manejo y similitud de propiedades mecánicas en el cerebro medio ambiente⁵⁸. Una consideración destacable es la ubicación central de la aguja dentro del tubo capilar. A menudo, la aguja puede ser ligeramente inclinado o desplazadas durante el proceso, haciendo que la luz se encuentra fuera del centro en relación con las paredes externas después del retiro de gelificación y micro columna de agarosa del tubo. Para evitar esto, la aguja debe ser recta, y el conjunto de émbolo-tubo-aguja debe mantenerse en posición vertical mientras que la agarosa se va introduciendo para retener la aguja a lo largo del eje central. Centralización precisa de la luz protege a los astrocitos alineados entre las paredes de agarosa; la luz es más propensa a ruptura si situado próximo al borde exterior del cilindro. Además, una distancia suficiente entre el lumen y la pared exterior puede ofrecer protección beneficios durante y después del trasplante (siempre y cuando las construcciones astrocytic no se quitan desde el previo de micro columna para implantar). Esta etapa inicial de fabricación de andamio astrocytic es primordial para el éxito de la técnica, como la selección del diámetro de la aguja es crucial para cable y astrositos adecuada soma/proceso alineación uno mismo-Asamblea. Encontramos que la alineación de astrositos era inversamente dependiente de ID columna micro, con un rango óptimo de ID para la alineación de células y la formación de paquetes de astrositos robusto ser 180 a 350 μm (figura 3). Asimismo, previamente se demostró que neuronas dirigen su fruto a lo largo de la dirección de la curvatura del sustrato mínimo para disminuir el proceso de doblado^59,60, y mecanismos similares están probable que en el trabajo para afectar a astrositos alineamiento en nuestro sistema⁴⁹. Además la curvatura que afecta a la alineación de astrositos, encontramos que un 180 a 350 μm Rango de identificación resultó en astrocitos adquiriendo una morfología bipolar⁴⁹, contrario a la forma radiada, multipolar con un ID de 1 mm o cuando astrocitos fueron cultivados en 2D (figura 3). Es probable que estos cambios morfológicos profundos a una morfología de astrositos bipolares alteren sus características fisiológicas por ejemplo, los astrocitos pueden expresar alternativas secretable factores o marcadores de superficie celular que pueden ser ventajosos para la regeneración, pero esto requiere más caracterización. En general, nuestros resultados demuestran que selección conveniente de señales físicas, tales como curvatura de superficie, es imprescindible emulando cytoarchitecture nativo en vivo astrocytic andamios.

Construcción de los andamios astrocytic procede con la incorporación secuencial de la solución de ECM colágeno y astrocitos corticales en el hueco interior de las columnas de micro. La luz interna de la columna de micro está revestida con colágeno para apoyar la supervivencia de astrositos, apego y formación paquete alineados, debido a la incapacidad de agarosa neurite consecuencia⁶¹independientemente de la ayuda. Una concentración de 1 mg/mL de colágeno fue elegida porque estudios anteriores determinaron que las concentraciones inferiores y superiores dio lugar a una falta de adherencia e inestabilidad de la ECM, respectivamente⁴⁹. Así, como se esperaba, la concentración de colágeno tiene efectos dramáticos sobre la efectividad de esta técnica. Además, la solución ECM consta de sólo de tipo I colágeno. En comparación con la laminina y sustratos recubiertos de Matrigel 2D culturas astrocytic, astrocitos plateado tipo I colágeno demostró una adherencia óptima y formación de red⁶². El tiempo de incubación utilizado para la polimerización de colágeno antes de la siembra de la célula es también un paso esencial en el protocolo. Anteriormente se encontró que cuando las neuronas fueron entregadas concomitante con ECM no polimerizada a las micro-columnas de agarosa, reducido neurite consecuencia y fasciculación axonal fueron visto⁴⁷, y es posible que estos resultados se extiendan a astrocitos tan bien. Ya que el colágeno es necesario para la formación de adherencia y paquete de astrositos, la presencia de ECM a lo largo de la construcción y la ausencia de burbujas de aire o bolsillos vacíos deben visualizar y confirmados con técnicas microscópicas.

El protocolo concluye con astrositos chapado, un período de incubación para asegurar la adhesión celular al colágeno y cultura a corto plazo para la formación de la Citoarquitectura del destino. Astrocitos entre número de paso 4-12 se utilizaron, como exhibieron robusta reforma astrocítico de liar y el colágeno. Estos astrocitos también presentaron un fenotipo maduro que consiste en > 95% cultivos puros^63,64 con poca o ninguna contaminación neuronal. En contraste con las culturas los astrositos, que emplean el medio que contenga suero (izquierda de laFigura 3A, ), nuestra técnica utiliza medio libre de suero para permitir que los astrocitos a adoptar una morfología de proceso-cojinete (Figura 3A, derecho ) y formar paquetes de somata alineado y procesos en la micro-columnas^62,65,66. En términos de célula siembra concentración, concentraciones más altas en el rango de 9.0-12.0 x 10⁵ células/mL, con un ID de 350 μm, resultaron en la formación de paquetes firmemente llenas con el acompañamiento de remodelación de colágeno, mientras que los astrocitos se dispersaron más , pero aún en línea, cuando se utilizaron concentraciones más bajas (figura 3). Así, el efecto de la concentración en las interacciones célula-célula de siembra influye en el grado de alineación de astrositos y la formación de las estructuras de cable-como observadas. La inyección de la solución de células en el lumen generalmente es visualizada utilizando un estereoscopio para asegurar una entrega homogénea a lo largo de la columna de micro, que es crucial para la formación continua del paquete. Después de la siembra, el tiempo de incubación preliminar antes de la inundación con medios de cultivo es indispensable para garantizar el anclaje de los astrocitos al ECM. La duración puede ser modificada si los astrocitos escapan de las construcciones, siempre que las construcciones son suficientemente humedecidas para evitar sequedad. Imágenes de contraste de fase de los andamios astrocytic en función del tiempo mostró que por 8 h, una red de paquetes astrocytic alineados en el proceso de formación. Además, la separación de ECM de la pared de luz, su contracción posterior y la estrecha asociación entre las células y el colágeno contratado se observó cuando las construcciones fueron etiquetadas para el colágeno y GFAP como se muestra en la figura 8. Este fenómeno es posiblemente una consecuencia de fuerzas contráctiles astrocytic extraer el colágeno de las paredes, basado en informes anteriores de la capacidad del fibroblasto-como de células gliales para generar las fuerzas que distorsionan substratos flexibles y la remodelación de la matriz capacidad de los astrocitos en sólo astrositos y neuronas-astrositos culturas Co^28,49,67,68. En concreto, una de las consecuencias de la interacción mediada por la integrina con fibrillas de colágeno y astrositos motilidad es la generación de fuerzas suficientes para contratar la fibrillas^17,69. En general, aplicación del protocolo descrito producirá andamios de estar conformados por uno mismo-montado redes densas, alineada astrocytic cable-como las estructuras que recapitular sustratos físicos presentes en varias etapas de desarrollo del CNS.

Además de las cuestiones individuales que puedan surgir a lo largo del Protocolo, la técnica de astrocytic andamio posee otros obstáculos que puedan afectar su capacidad para reparar el SNC. Por ejemplo, el éxito de esta técnica depende de plasticidad del sistema nervioso y la integración funcional del andamio astrocytic con los circuitos de host. Relacionadas con la implantación de estos andamios es la posibilidad de una respuesta inflamatoria que puede contrarrestar los atributos pro-regenerador de los paquetes astrocytic. Todas las técnicas basadas en el trasplante tienen la capacidad de ruptura de la barrera hematoencefálica y causar infiltración de células inflamatorias, debido a la proximidad entre las neuronas y los capilares en el tejido⁴⁷. En este caso, la micro-columna de hidrogel u otro esquema protector para andamios astrocytic puede ser utilizado como un vehículo para la liberación controlada de factores antiinflamatorios para disminuir la respuesta inflamatoria. Inicialmente, el paquete astrocytic alineado no era estable dentro de la columna de micro, como las fuerzas que obligan la alineación celular y remodelación de la matriz en última instancia condujo a un derrumbamiento de la Citoarquitectura deseada después de 1-2 días en la cultura. Sin embargo, colapso adicional de contracción y el paquete fue obstaculizado por proporcionar refuerzo adicional para los paquetes en los extremos de la columna micro mediante la adición de colágeno de concentración más alto con el fin de mantener el paquete en su lugar. Podría ser una táctica adicional emplear una encapsulación secundaria, por el que una nueva capa de hidrogel se aplica a los paquetes astrocytic alineados como se tiraron de las columnas de micro. Es probable que la entrega de las redes de astrositos alineada en el cerebro también estabilizaría las construcciones debido a adherencias de célula entre las células huésped y construcción a lo largo de toda la longitud, aunque esto tendrá que ser probado directamente en futuros estudios.

Por consiguiente, los esfuerzos futuros tendrá como objetivo desarrollar un método de trasplante eficaz que garantiza la estabilización y protección del paquete astrocytic durante y después de la entrega en vivo con el fin de permitir la migración neuronal, reparación, y regeneración en el SNC lesionado. Previamente hemos demostrado éxito de la implantación de neuronal/axonal basado en micro-adolescentes, que comparten el régimen protector de los constructos astrocytic, en vías de corticothalamic, dando por resultado la integración estructural y supervivencia con el host tejido en por lo menos hasta 1 mes^46,47. Así, la robustez de los cables después de la extracción de las columnas de micro puede ser explotada. En este caso, la agarosa hidrogel serviría como la cama de cultivo inicial para inducir la uno mismo-Asamblea y luego el cable astrocytic sería extraído del protector y directamente inyectado en el cerebro con una aguja de pared delgada. Astrositos deformación debido a fuerzas mecánicas durante la extracción de la micro-columna de hidrogel no se ha observado y no se espera. Trabajo previo estudio de los efectos de la deformación mecánica en la reactividad de astrositos sugiere que cualquier deformación resultante no se aplicaría lo suficientemente rápido para inducir el astrocytosis o proceso de alargamiento^62,70. Para minimizar el daño al tejido cerebral y la posible respuesta inflamatoria, los paquetes dentro del hidrogel podrían implantarse usando la tecnología de la aguja menos desarrollada anteriormente para micro-adolescentes. En esta metodología, el hidrogel está cubierta con una fina capa de carboximetilcelulosa que permite la entrada de la aguja-menos en el cerebro que puede disminuir la huella perturbadora e inflamatoria de implantación⁴⁷. Luego, estudios de trasplante se pueden realizar para evaluar la capacidad de estos andamios para sobrevivir, integración con el tejido del anfitrión y promoción la migración neuronal y la dirección del axon. Particularmente, estas construcciones se pueden implantar con un extremo que emana de una región neurogénica como la SVZ para acceder a su piscina de las células madre neurales y neuroblastos en la imitación directa de la RMS y el otro extremo conectado a un sitio de lesión potencialmente conducir a migración neuronal y repoblar la zona de manera dosificada.

Con posterioridad a la optimización del Protocolo de trasplante, la técnica se puede mejorar en otras áreas. Las columnas de micro pueden ser fabricadas específicamente con astrocitos inmaduros (e.g. glia radial, RMS-tipo células) o fenotipos maduros que son más adelante dedifferentiated para aumentar la capacidad regenerativa inducción de estas construcciones⁴⁹. En modelos en vitro de la cicatriz glial, astrocitos maduros no han tenido la capacidad de formación de vías por axon consecuencia⁷¹. Por el contrario, astrocitos inmaduros se han demostrado para promover neurite consecuencia en vitro y regeneración axonal en vivo cuando trasplantó concomitante con Condroitinasa ABC para tratar los altos niveles de CSPGs en la cicatriz glial^{71 , 72}. para coincidir con el advenimiento de la medicina personalizada, micro-columnas astrocytic autólogos pueden desarrollarse mediante la siembra de células madre provenientes de células de madre pluripotentes de fuentes tales como inducidas (iPSCs) y células madre neuronales humanas (hNSCs). Esta modificación permitirá que estos andamios para funcionar como conductos para individualizarse y reparación de la vía específica y regeneración. Además, el uso de estas fuentes de células puede eludir la posible respuesta inmunogénica puede causar que la implantación astrositos. A pesar de inmunogenicidad varía en función de líneas de células iPSC, estas células son teóricamente capaces de evitar o disminuir la respuesta inmune en trasplante, según lo sugerido por la ausencia de respuestas perjudiciales después de órgano derivado de iPSC implantación en ratones^73,74. Además, hNSCs autólogo y sus derivados astrocytic reprimen allogeneic inmunorespuestas⁷⁵. En consecuencia, fabricando estos alineados astrositos redes con células madre autólogas pueden ser un futuro crítico paso lo que esta técnica más fácilmente aplicable en el ajuste clínico.

Aparte del uso como conductos para la CNS reparación y regeneración, vida astrocytic andamios pueden utilizarse como en vitro bancos de pruebas, con o sin el encasement de hidrogel basado en los objetivos de un paradigma particular de la prueba. Por ejemplo, estas construcciones astrocytic pueden utilizarse para investigar fenómenos neurobiológicos como extensión de migración y neurita de neurona mediada por astrocitos, aprovechando las propiedades controlables y el medio ambiente 3D de andamios de vida como modelos de condiciones en vivo . El protocolo en este manuscrito detalla la fabricación de uno mismo-montado paquetes astrocytic alineados en una matriz colagenosa dentro de una micro-columna de hidrogel. Por recapitular de Neuroanatomía del cerebro, desarrollo/regenerativa mecanismos y vías de migración neuroblástica, estos andamios astrocytic implantables tienen el potencial para ofrecer vías de apoyo para dirigido axon y migración neuronal orientación en el entorno de otra manera inhibitorio del SNC dañado.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).