Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Summary

Vi fremvise udviklingen af selvsamlede, tre-dimensionelle bundter langs justeret astrocytic somata og processer inden for en roman biomateriale encasement. Disse manipuleret "levende stilladser", udstiller micron-skala diameter, endnu udvide centimeter i længden, kan tjene som prøvestande til at studere udviklingsforstyrrelser mekanismer eller lette neuroregeneration ved at lede neuronal migration og/eller cytoskeletale pathfinding.

Abstract

Neurotrauma og neurodegenerative sygdomme ofte resulterer i varige neurologiske underskud på grund af den begrænsede kapacitet på det centrale nervesystem (CNS) til at erstatte tabte neuroner og regenerere cytoskeletale veje. Dog under udvikling af nervesystem, neuronal migration og cytoskeletale udvidelse ofte opstå langs veje udgøres af andre celler, betegnes som "levende stilladser". Søger at efterligne disse mekanismer og for at udforme en strategi, der omgår de hæmmende miljø af CNS, dette manuskript præsenterer en protokol til at fremstille væv manipuleret astrocyte-baserede "levende stilladser". Hvis du vil oprette disse konstruktioner, ansat vi en roman biomateriale encasement ordningen til at fremkalde astrocytter selv samle i tætte tredimensionale bundter af bipolar langs justeret somata og processer. Første, hule hydrogel mikro-kolonner var samlet, og den indre lumen var belagt med ekstracellulære kollagen matrix. Dissocierede cerebral kortikale astrocytter blev derefter leveret i lumen af cylindrisk mikro-kolonnen, og på en kritisk indre diameter på < 350 µm, spontant selvstændig justeret og ansat til at producere lange fiber-lignende kabler består af tætte bundter astrocyte processer og kollagen fibriller måling < 150 µm i diameter endnu udvide flere cm i længden. Disse manipuleret levende stilladser udstillet > 97% cellernes levedygtighed og var næsten udelukkende består af astrocytter udtrykker en kombination af de mellemliggende glødetrådens proteiner glial-fibrillære sure protein (GFAP), vimentin, og nestin. Disse justeret astrocyte netværk fandtes for at give en eftergivende substrat for neuronal vedhæftet fil og justeret neurite forlængelse. Desuden, disse konstruktioner bevare integritet og justering når udvundet fra hydrogel encasement, hvilket gør dem egnede til CNS implantation. Disse præfabrikerede konstruktioner strukturelt emulere centrale cytoarchitectural elementer af naturligt forekommende glial-baserede "living stilladser" in vivo. Som sådan, kan disse manipuleret levende stilladser tjene som prøvestande til at studere udviklingsforstyrrelser mekanismer i in vitro eller lette neuroregeneration ved at dirigere neuronal migration og/eller cytoskeletale pathfinding efter CNS degeneration in vivo .

Introduction

Det centrale nervesystem (CNS) har en begrænset kapacitet til at modvirke tab og/eller dysfunktion af neuroner og cytoskeletale veje, der ledsager betingelser såsom traumatisk hjerneskade (TBI), slagtilfælde, rygmarv skade (SCI), og neurodegenerative sygdomme^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenese i CNS er begrænset til et begrænset antal områder i hjernen, hæmmer genoprettelse af tabte neuroner^6,7. Derudover er regenerering af tabt cytoskeletale veje i CNS utilstrækkelig på grund af manglen på styret vejledning, tilstedeværelsen af udvækst hæmmere og reaktive astrogliosis efter skader til neurale væv^{2,8, 9,10}. Astrocytter har typisk forskellige funktioner i bistå neuroner med ion homøostase, neurotransmitter clearance, synapse dannelse og neurovaskulært kobling¹¹. Ikke desto mindre kan astrocytter efter endda milde skader på neurale væv underkastes Molekylær, strukturelle og funktionelle ændringer som de overgang til en hypertrofisk stat¹¹. Reaktion på svær neurotrauma resultere disse ændringer i dannelsen af et ar med en penumbra indeholdende overflytter reaktive astrocytter og en læsion kerne, der omfatter leukocytter lækket fra bristet blod - hjerne barrieren (BBB), mikroglia, oligodendrocytes, og fibroblaster^11,12,13. Disse reaktive astrocytter nå en morfologi af fintrådede, uorganiseret processer og udviser øget udtryk for mellemliggende glødetrådens proteiner og chondroitin sulfat proteoglycaner (CSPGs), hvilket hindrer neurale regenerering¹². Selvom glial arret oprindeligt hjælper genindføre BBB integritet og undgå overførsel af den inflammatoriske reaktion på omkringliggende raske væv, tjener det som en fysisk og biokemisk barriere mod axon regenerering^{12,14 ,15,16}. For eksempel, axoner, der støder glial arret vise løgformet dystrofe vækst kegler og hæmmet vækst¹². Derudover hindrer uorganiseret astrocytic processer efter skade udvidelsen af regenererende axoner¹⁷. Resultatet af disse hæmmende egenskaber er manifesteret i de ofte-permanent fysiske og neurologiske handicap, at patienter lider efter alvorlige neurotrauma, herunder TBI og SCI.

Uanset de ydre udfordringer funktionelle regenerering i CNS, har axoner vist sig at besidde en iboende evne til at regenerere. For eksempel, tyder den dynamiske karakter af dystrofe vækst kegler i kontakt med glial arret på, at disse endelser bevarer deres evne til at udvide¹². Derfor, det menes, at en vigtigste hindring for cytoskeletale re-vækst er den hæmmende miljø efter skade CNS og det giver en mere eftergivende miljø via nedsætte glial ardannelse og/eller leverer regenerativ broer på tværs af arret vil være fordelagtig. Faktisk, tidligere undersøgelser har vist at CNS neuroner var i stand til at udvide axoner via en læsion ved hjælp af perifere nerve grafts som broer, som udgør et gunstigere miljø for axon regenerering^{12,18, 19}. Flere andre strategier har været forfulgt for at udnytte denne rudimentære regenerationsevne. For eksempel, har manipulation af celle vækst signaling veje i forskellige skade modeller resulteret i cytoskeletale regenerering og glial ar reduktion^10,20,21. Desuden, har undersøgelser vist, at behandling med chondroitinase ABC, som kløver fleste for sukker kæderne i CSPGs, mindsker den hæmmende effekt af CSPGs udskilles af reaktive astrocytter²². Trods opmuntrende resultater, disse tilgange giver ikke instrueret vejledning af vækst kegler, som kan potentielt resultere i afvigende regenerering¹², og også ikke højde for tab af neuroner. Celle-baserede tilgange har været udnyttet i forsøg på at overvinde virkningerne af glial arret og genopbygge tabt celler, især neuroner. Nogle grupper har dedifferentiated reaktiv astrocytter til neuroner, mens andre har transplanterede neurale stamceller i CNS læsioner til repopulate området skade og fremme axon regenerering^{23,24, 25}. dog stamcelletransplantation alene er begrænset af lav overlevelsesrate, dårlig integration og beskedne fastholdelse i beskadiget væv⁵. Derudover undlader disse celle-baserede strategier at gendannelse langdistance cytoskeletale skrifter, især på en kontrolleret måde. Derfor, biomaterialer i kombination med andre tilgange er ved at blive undersøgt som levering køretøjer til forskellige neurale og stamceller og vækst faktorer²⁶. Biomateriale-baserede tilgange har en høj grad af kontrol til at producere konstruktioner, der efterligner den specifikke fysiske, haptotaxic, og chemotaxic stikord til stede i de tre-dimensionelle (3D) mikromiljø target host væv^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduktion af disse miljømæssige signaler er altafgørende for transplanterede celler præsentere native-lignende morfologi, spredning, migration og signalering, blandt andre neurobiologiske karakteristika²⁹. Trods disse fordelagtige egenskaber er avancement ud over traditionelle celle seedede biomateriale stilladser påkrævet samtidig fremme styret langdistance cytoskeletale regenerering og erstatte tabte neuroner.

En lovende alternativ tilgang er baseret på neurale væv manipuleret "levende stilladser", som adskiller sig fra andre celle-baserede tilgange på grund af tilstedeværelsen af levende neurale celler med en præfabrikerede cytoarchitecture, der emulerer indfødte Neuroanatomi og/eller udviklingsmæssige mekanismer til fremme af målrettet udskiftning, genopbygning og genrejsning af neurale kredsløb^4,35. Overvejelser ved design af levende stilladser omfatter fænotyper og kilder af neurale celler samt de mekaniske/fysiske egenskaber og de biokemiske signaler dikteret af sammensætningen af eventuelle ledsagende biomaterialer³⁵. Efter fabrikation i vitro, disse levende stilladser kan være implanteret i vivo til stede celle-adhæsionsmolekyler og kemotaktisk og neurotrope signaler til aktivt regulere neurale celle migration og axon udvækst afhængigt af staten og progression af regenerative processer³⁵. Gliaceller kan tjene som grundlag for de manipuleret cytoarchitecture af levende stilladser, da disse celler mægle forskellige udviklingsmæssige mekanismer i vivo. I løbet af hjernens udvikling stole nye neuroner på basal processer udvidet af radial glia fra zonen ventrikulær mod udvikle kortikale pladen som levende stilladser for styret migration^36,37. Desuden udvide vækst kegler er vist at orientere sig ved sensing tiltrækkende og frastødende signaler fremkaldes ved glial guidepost celler, og såkaldte "banebrydende" axoner er foreslået at nå frem til de korrekte mål ved at udvide langs pre mønstrede glial scaffolds^35,38,39. Gliaceller er således nødvendige for vejledning af banebrydende axoner, som senere tjene som axon-baserede "levende stilladser" for direkte projektion af "follower" axoner. Derudover glia-medieret vækst mekanismer har vist at fremture efter fødslen, som neuroblasts følger den rostralt vandrende strøm (RMS) til at navigere fra den subventricular zone (SVZ), en af de få tilbageværende områder af neurogenese i den voksne hjerne, at den olfaktoriske pære (OB)⁴⁰. Disse neuroblasts i RMS migrere i glial røret (figur 1A-1), som består af langs justeret astrocytic processer, via direkte celle-celle sammenvoksninger og lokaliseret opløselige faktorer^{37, 41}. Endelig, mens CNS skader i pattedyr årsager afbrudt astrocytic proces arrangement danner et glial ar, der fysisk hindrer cytoskeletale regenerering¹⁷, mange ikke-pattedyr systemer mangler dannelsen af en skadelig glial ar. Tværtimod opretholde glial celler af ikke-pattedyr arter mere organiseret, justeret mønstre, der anvendes som guider gennem sårede region^17,42,43. For eksempel, i ikke-pattedyr SCI modeller, er axoner vist at vokse i tæt tilknytning til glial broer krydser læsion, tyder på en vigtig rolle for organiseret glial stilladser som substrater lette cytoskeletale regenerering og funktionel genopretning ( Figur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. Sammenfatning af de neuroanatomical funktioner og udviklingsmæssige/regenerativ mekanismer beskrevet ovenfor kan give en ny klasse af manipuleret glial-baserede levende stilladser, der samtidigt kan drive umodne neuronal migration og cytoskeletale pathfinding gennem ellers ikke-eftergivende miljøer, dermed potentielt afdæmpe virkningerne af neuronal og axon tarmkanalen degeneration tilknyttet CNS skade og sygdom.

Vores forskergruppe har tidligere udviklet flere typer af levende stilladser til genopbygning og genopretning af cytoskeletale skrifter i CNS og det perifere nervesystem (PNS) via mikro-væv manipuleret neurale netværk (micro-mine) og væv manipuleret nerve grafts (TENGs), henholdsvis^27,46,47,48. Begge strategier er baseret i sagens natur på Biomimetik. Mikro-mine er anatomisk inspireret strukturer designet til strukturelt og funktionelt erstatte cytoskeletale skrifter forbinder adskilte neuronal populationer af hjernen. TENGs udnytter den udviklingsmæssige mekanisme af axon-faciliteret cytoskeletale regenerering, eksemplificeret ved "follower" axon vækst langs "pioneer" axoner, at opnå målrettede vært cytoskeletale regenerering^35,46,48. Vi for nylig med store bogstaver på alsidigheden af levende stillads teknik ved hjælp af en lignende encasement ordningen som mikro-mine og søger inspiration fra de glia-baserede mekanismer til stede i hele udvikling. Her, udviklet vi konstruktioner bestående af justeret astrocytic bundter spanning kollagen lumen af en hydrogel mikro-kolonne⁴⁹. Disse astrocytic levende stilladser er udviklet af første udfylde en kapillær tube-akupunktur nål forsamling med flydende Agarosen for at oprette en hul cylindrisk hydrogel med en ydre diameter (OD) og indre diameter (ID) svarende til diameteren af den rør og nål, hhv. Efter Agarosen gellation, og udvindingen af hydrogel mikro-kolonnen fra den kapillarrør kraterets hule er belagt med type kollagen til at levere en eftergivende for astrocyte vedhæftning miljø og justeret bundt dannelse (figur 1B -1). Bagefter, lumen er seedet med cerebral kortikale astrocytter isoleret fra postnatal rotte unger (figur 1B-2). I modsætning til todimensionale (2D) justering teknikker, der er baseret på anvendelsen af elektriske felter, micropatterned riller og ekstracellulære matrix (ECM) protein mønster, astrocyte justering i levende stillads bygger teknik på samlesæt i henhold til kontrollerbare variabler som substrat krumning (kolonne-ID), celle tæthed og kollagen koncentration^50,51,52. Astrocytter kontrakt og remodel kollagen, og erhverve en bipolar, langs justeret morfologi analog til de naturligt stilladser observeret i vivo (figur 1B-3). Ja, vi aktivt forfølger brugen af disse kabel-lignende strukturer som fysiske substrater for målrettet vejledning af overflytning umodne neuroner samt lette cytoskeletale regenerering gennem den ugunstige miljø af den beskadigede CNS, især pattedyr glial arret (figur 1 c). Denne artikel vil fremlægge detaljerede fabrikation metode for astrocytic mikro-kolonnerne, fase kontrast og immunfluorescens billeder af de forventede cytoarchitecture, og en omfattende diskussion om de nuværende begrænsninger og fremtidige retninger af den teknik.

Figur 1: Inspiration, fabrikation protokol og foreslåede programmer for de justerede Astrocytic net. (A) neurobiologiske inspiration: (1) Neuroblasts stammer fra den neurogen subventricular zone (SVZ) udnytte langs justeret glial røret i den rostralt vandrende strøm (RMS) for styret migration hen imod de olfaktoriske pære (OB); (2) ikke-pattedyr padder og fisk kan opretholde regenerering efter neurale væv skade delvis på grund af dannelsen af en glial bro, der forbinder enderne af en læsion (f.eks. transected rygmarven) og tjener som et stillads til vejledning for Regenerating axoner. (B) fabrikation oversigt: (1) opbygningen af en micron mellemstore, hule hydrogel mikro-kolonne med lumen belagt med ECM, (2) såning af primære kortikale astrocytter isoleret fra postnatal rotte unger, (3) samlesæt af langs-orienterede bundter i kultur, og (4) udvinding af pakke fra biomateriale encasement for fremtidige implantation undersøgelser. (C) In vivo ansøgninger: (1) disse levende stilladser kan tjene som manipuleret glial rør til styret neuron migration fra neurogen centre til repopulate neuron-mangelfuld regioner; (2) sammenfatning af de udviklingsmæssige mekanisme af banebrydende axon vejledning og glial broer i ikke-pattedyr regenerativ mekanisme kan give disse astrocytic stilladser med kapacitet til direkte axon regeneration på tværs af de ikke-eftergivende miljø af pattedyr glial arret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz veteraner anliggender Medical Center og overholdt retningslinjerne i NIH Public Health Service politik på human Pleje og brugen af forsøgsdyr (2015).

1. udvikling af Agarosen Hydrogel mikro-kolonner

1. Gøre en Agarosen 3% vægt/volumen (w/v) opløsning af vejer 3 g af Agarosen og overføre den til et sterilt bæger indeholdende 100 mL Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS). Tilføje en steril magnetiske bar over i bægerglasset, og Placer den på overfladen af en varmeplade/omrører. Holde bægerglasset dækkes for at forhindre fordampning af indholdet i det næste trin.
2. Varme Agarosen og DPBS ved en temperatur på 100 ° C og omrøres på 60-120 rpm. Justere disse indstillinger efter behov, og hele tiden overvåge progression af opløsning proces som løsningen ændrer oprindeligt fra uigennemsigtige til et klart udseende, der betyder at Agarosen er fuldstændigt opløst.
   Forsigtig: Hot bægerglasset og løsningen er hot!
3. Agarosen løsning er opvarmet og omrøres, hente fire petriskåle med tomme 10 cm og tilsættes 20 mL DPBS til to af dem. Placer Akupunktur nåle (diameter: 300 µm, længde: 40 mm), glas microliter kapillarrør (diameter: 701.04 µm, længde: 65 mm, kapacitet: 25,0 µL), og en pære dispenser inde biosikkerhed kabinet. Når den flydende Agarosen løsning rydder, opretholde konstant opvarmning på ca. 50 ° C og omrøring for at undgå gellation af agarosegelelektroforese.
4. Indføre en akupunktur nål i bunden åbningen af en pære dispenser. Indsæt et kapillarrør over nålen udsat for ydersiden. Sikre den kapillarrør ved at indtaste en del af det i afsnittet gummi af pære dispenser cylinder.
5. Overføres 1 mL af flydende Agarosen med en mikropipette til overfladen af en tom petriskål, og placere ene ende af den kapillarrør vertikalt (med nål indsættes) kontakt med agarosegelelektroforese, mens gummihætte af pære dispenseren er ved at blive klemt indad. Langsomt frigive trykket på pære dispenser cap trække Agarosen i den kapillarrør.
   Bemærk: Overførsel af flydende Agarosen til de kapillarrør skal udføres hurtigt. Hvis den flydende Agarosen er overladt til afkøling på petriskål overflade i tilstrækkelig lang tid (ca. 60 s), det begynder at gel, forebyggelse af egnet sugning af Agarosen langs den kapillarrør.
6. Sted hver pære-tube-nål forsamling i et gratis petriskål, og lad Agarosen gel inde de kapillarrør størkne for 5 min. træk forsigtigt kapillarrør med dine hænder ud af gummiprop i pære dispenser cylinder, forlader nålen og den agarosegel på plads inde i røret.
7. Manuelt udpakke akupunktur nål ved langsomt at trække det ud af kapillarrør; den nyligt størknede Agarosen cylinder også glider ud af røret i denne procedure, stadig omkring nålen. Blidt skub micro-kolonne langs akupunktur nål med spidsen af steril pincet til at flytte det til ende. Placer nålen over en åben, DPBS-holdige petriskål og skubbe mikro-kolonnen i DPBS med pincet.
   Bemærk: Hvis Agarosen mikro-kolonnen forbliver inden for glas kapillarrør ved fjernelse af akupunktur nål, langsomt skubbe Agarosen mikro-kolonne ud af den kapillarrør med en 25 mm gauge kanyle og i skålen med DPBS.
8. Sterilisere microscalpels eller pincet ved hjælp af en varm perle sterilizer. Gøre 4% w/v Agarosen ved vejning 4 g af Agarosen og overføre det til 100 mL af DPBS. Varme og rør som forklaret i trin 1.2 at opnå en klar 4% flydende Agarosen løsning. Vedligeholde opvarmning og omrøring af løsningen i hele de følgende trin.
9. Overføre de petriskåle, der indeholder mikro-kolonner til en dissektion hætte, og flytte en mikro-kolonne med fine pincet til en tom petriskål. Udnyt Stereoskopet visuel vejledning og en microscalpel til at skære mikro-kolonnerne til den ønskede længde. Trim begge ender til form skrå ender på 45^o vinkler fra vandret til lette håndtering af mikro-kolonner under ECM og celle ud.
10. Gentag de forrige trin for tre flere mikro-kolonner i den samme petriskål og opstil de fire konstruktioner parallelt med en adskillelse af < 3 mm mellem hver af cylinderne. Indlæse 50 µL af 4% Agarosen løsning med en mikropipette og hæld en streak/linje af væske over mikro-kolonne array til at forbinde og bundt af konstruktioner i grupper af fire (herefter kaldet "mikro-kolonne både"). Undgå bevægelser af 4% Agarosen til enderne af mikro-kolonner, der kan tilstoppe interiør, ved at minimere afstanden mellem konstruktioner og tilføje Agarosen hurtigt i en tynd streg.
    Bemærk: At arrangere grupper af fire mikro-kolonner i "både" er ikke forpligtet til at fabrikere de astrocytic stilladser. Ikke desto mindre tjene bådene til at fremskynde fabrikationsproces og tilbyde en mere sikker måde at flytte og håndtere mikro-kolonner i senere trin.
11. Lad den mikro-kolonne båd cool for 1-2 min til at tillade gellation af den tilføjede 4% agarosegelelektroforese. Afhente mikro-kolonne båd med fine pincet ved at forbinde 4% agarosegelelektroforese, og flytte mikro-kolonner til andre DPBS-holdige petriskålen forberedt i trin 1.1.3. Fremstille flere både med de resterende mikro-kolonner som ønsket.
12. Flyt de petriskåle, der indeholder mikro-kolonnerne og/eller både til et kabinet biosikkerhed og sterilisere med eksponering for ultraviolet (UV) lys i 30 min.
    Forsigtig: Bær passende beskyttelse for at forhindre eksponering for UV.
13. Gemme retter med mikro-kolonne bådene i DPBS ved 4 ° C, hvis ECM tilsætning og celle plating ikke vil forekomme umiddelbart bagefter, op til 1 uge. Gentag trinene mikro-kolonne fabrikation, hvis konstruktioner ikke bruges i løbet af denne tidsramme.

2. primære cellekultur og Isolation

1. Kortikale astrocyte isolation fra rotte unger
   1. Forberedelse til de følgende trin, tilføje 20 mL af Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) til fire 10 cm petriskåle, der vil tjene som reservoirer for dissekeret væv. Holde alle retter på is. Sterilisere ren kirurgisk saks, pincet, mikro-spatel og mikro-skalpeller i en varm perle sterilizer.
   2. Prewarm 0,25% trypsin med 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) og 0,15 mg/mL deoxyribonuclease (DNase) I HBSS ved 37 ° C. Desuden prewarm astrocyte dyrkningsmediet ved 37 ° C, som består af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med Hams F-12 næringsstof blanding og 10% føtal bovint serum (FBS).
   3. Bedøver postnatal dag 0 eller dag 1 Sprague-Dawley rotte unger ved at udsætte dem til hypotermiske betingelser, og aflive ved halshugning. PIN head i en scene ved hjælp af en 19 mm gauge nålen placeres i snuden foran øjnene.
   4. Gøre et snit med en skalpel ned midt posteriort for forreste, fra bunden af halsen op til lige bag øjnene. Foretage et andet snit vil lateralt fra direkte bag øjnene nedad, danner en T-form. Brug fine pincet til at trække kraniel hud/kraniet ud til siden.
   5. Hold hovedet af snuden (opad) ved at placere en gren af pincet i munden på dyret og den anden på ydersiden. Fjerne hjernen med en steril mikro-spatel og placere det i en af petriskåle fyldt med kølet HBSS. Sted dette petriskål på is gange straks bagefter og på alle undtagen når i brug.
   6. Placere en granitblok tidligere opbevares ved-20 ° C under en Stereoskopet inde en dissektion hætte. Placer petriskål med hjernevæv på overfladen af granitblok at bevare dens lave temperatur under proceduren dissektion. Bruge Stereoskopet som visuel vejledning i hele de følgende trin.
   7. Hvis den olfaktoriske pære forbliver intakt, udpakke dem ved skæring med pincet eller microscalpels. Derudover bruge en microscalpel til at fjerne lillehjernen og gøre en midterlinjen indsnit adskiller de to hjernehalvdele. Overføre halvkugle med pincet til en petriskål, som indeholder friske, kølede HBSS.
   8. Dissekere midthjernen strukturer fra indersiden af hjernehalvdele med en microscalpel til at få kun de adskilte cortex. Brug fine pincet, at skrælle meninges, et ark-lignende struktur, fra det kortikale væv og overføre de isolerede cortex til en ny petriskål med kolde HBSS. Brug microscalpel til hakkekød væv for at øge overfladearealet trypsin indsats i det næste trin.
   9. Bruge en Pasteur pipette til at overføre cortex til en 15 mL centrifugeglas indeholdende 4 mL af forvarmet trypsin-EDTA (8 cortex i hver tube). Udsætte den kortikale væv til trypsin-EDTA i 5-7 min. ved 37 ° C.
   10. Med Pasteur pipette, forsigtigt fjerne trypsin-EDTA og tilføje 400 µl på 0,15 mg/mL DNAse jeg løsning til centrifugeglasset. Agitere tube eller vortex, indtil alle væv er taget og der er ingen resterende væv stykker i væsken. Hvis det ikke er muligt at opløses fuldstændigt i vævet, fjerne de resterende fragmenter med spidsen af Pasteur pipette.
   11. Centrifuge rør indeholdende dissocierede celle løsning på 200 x g i 3 min. Fjern supernatanten med Pasteur pipette uden at forstyrre cellerne. Der tilsættes 1 mL af astrocyte næringssubstratet (defineret i trin 2.1.2) at røret med en mikropipette og agitere resuspend og skabe en homogen opløsning.
   12. Overfør 10 mL af astrocyte dyrkningsmedium med en serologisk pipette til en T-75 kolbe. Kolben til plade en pup hjernen værd af celler pr. kolbe tilsættes 250 µl af en 1 mL celle opløsning (fremstillet i trin 2.1.11) med en mikropipette. Distribuere den udledte celle løsning jævnt på tværs af næringssubstratet og forsigtigt agitere kolbe for yderligere at fremme en jævn fordeling.
   13. Kultur forgyldt kolberne i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO₂. Efter at nå 24 og 72 h i kultur, mekanisk agitere kolben for at fjerne ikke-tilhænger celletyper, som neuroner og oligodendrocytes.
   14. Bagefter, på hver af disse timepoints, foretage en ændring af medier. Hold kolben lodret, så kultur medier ligger på bunden af kolben, der ikke dækker de overholdt celler. Opsug næringssubstratet med Pasteur pipette, trykke spidsen af pipetten mod nederste hjørne af kolben at undgå uddrager cellerne. Kolben anbringes i den oprindelige vandret position og forsigtigt tilsættes 10 mL af astrocyte medium over cellerne med en serologisk pipette.
   15. Returnere kolberne til rugemaskine efter hver ændring af medier. Efter 90% confluency er opnået, mekanisk agitere kolbe en gang mere for at fjerne enhver resterende ikke-vedhængende celler.
   16. Passage af astrocytter ved at tage ud af dyrkningsmediet med en vakuum og Pasteur pipette. Der tilsættes 5 mL af 0,25% trypsin-EDTA med en serologisk pipette over de overholdt celler. Forsigtigt agitere kolben for at sikre trypsin dækker alle cellerne, og Inkuber i kolben til 5-7 min. ved 37 ° C og 5% CO₂.
   17. Dæmpning trypsin ved at tilføje 1 mL af astrocyte medium til celler med en serologisk pipette. Uddrag den celle løsning fra kolben med en serologisk pipette og overføre det til en steril 15 mL centrifugeglas. Der centrifugeres rør ved 200 x g i 3 min.
   18. Fjern supernatanten med en serologisk pipette og resuspend det i 1 mL af astrocyte næringssubstratet. Agitere røret for at sikre den celle løsning er homogen. Tæl antallet af celler i løsning med et hemocytometer eller en automatisk celle counter.
       Bemærk: En kolbe, der er 90% sammenflydende typisk udbytter ca 3 millioner astrocytter.
   19. Der tilsættes 10 mL af astrocyte næringssubstrat til en T-75 kolbe. Udføre en 1:4 fortynding ved at overføre 250 µl af opløsningen celle (trin 2.1.18) med en mikropipette T-75 kolben allerede indeholdende næringssubstratet. Forsigtigt agitere for at sikre en homogen celle distribution over hele overfladen af kolben.
   20. Gentag trin 2.1.16-2.1.19 hver gang 90% confluency er opnået for at passage cellerne.
2. Kortikale Neuron Isolation fra rotte fostre
   1. Følg lignende præparater som trin 2.1.1 og 2.1.2, med den undtagelse, at de prewarmed medier er co dyrkningsmedier, bestående af Neurobasal medium + 2% B-27 tillæg (for neuroner) + 1% G-5 serumfrit supplement (for astrocytter) + 0,25% L-glutamin.
   2. Aflive timed-gravid embryonale dag 18 Sprague-Dawley rotter med kuldioxid kvælning og bekræfte døden ved halshugning.
   3. Uddrag de rotte fostre og dissekere cortex fra resten af den cerebrale væv i petriskåle, der indeholder HBSS på overfladen af den kølede granitblok, ved hjælp af en Stereoskopet for visuel vejledning og steriliseret saks, microscalpel og pincet⁵³ . Efter successive dissektion af hoveder overføre hjerner, cerebral hjernehalvdele og cortex, hver væv til en ny HBSS-fyldte petriskål.
   4. Hakkekød kortikale vævet ind i mindre fragmenter til at øge arealet for trypsin. Overførsel 4-6 cortex med en Pasteur afpipetteres til et rør med 5 mL af forvarmet trypsin-EDTA og vedligeholde ved 37 ° C at adskille væv. På 5-7 min manuelt agitere rør for at blande og forhindrer sammenklumpning af væv.
   5. Fjerne røret fra 37 ° C efter 10 min. Som forklaret tidligere i trin 2.1, udtrække trypsin-EDTA og erstatte med 1,8 mL på 0,15 mg/mL DNAse løsning. Bagefter, vortex væv indtil løsningen vises homogene, med ingen væv fragmenter flydende i væsken.
   6. Der centrifugeres dissocierede væv løsning på 200 x g i 3 min. Efter fjernelse af supernatanten, resuspend i 2 mL af co næringssubstratet. Tæl antallet af celler i denne løsning med en hemocytometer eller en automatisk celle counter.
      Bemærk: Den sædvanlige udbytte er 3,0-5,0 x 10⁶ celler/kortikale halvkugle.
   7. Forberede en ny celle løsning med en massefylde på 2,0-4,0 x 10⁵ celler/mL i fælles Kulturmedier defineret ovenfor.

3. udvikling af Astrocytic kablerne inde mikro-kolonner

1. ECM core fabrikation
   Bemærk: ECM har tilføjes til indre af hydrogel mikro-kolonner på den samme dag, som cellen såning vil blive udført.
   1. Inde i en biosikkerhed kabinet, forberede en 1 mg/mL opløsning af rotte hale Skriv jeg kollagen i co næringssubstratet i en steril microcentrifuge tube. Opretholde microcentrifuge tube med ECM-løsningen på is på alle gange undtagen når i brug.
   2. Overføre 1-2 µL af ECM-løsningen med en mikropipette på en stribe af lakmuspapir at vurdere dens pH-værdi. Tilføj 1 µL af 1 N natriumhydroxid (NaOH) eller saltsyre (HCl) med en mikropipette til at forøge eller formindske pH i ECM-løsningen, henholdsvis, og pipetteres op og ned for at homogenisere. Kontrollere den nye pH-værdi med et lakmuspapir strip og tilføje mere syre eller base, efter behov, indtil pH er stabilt i rækken 7.2-7.4.
   3. Flytte Petriskålene fra trin 1.2 til dissektion hætte, og overføre 4-5 mikro-kolonner eller en båd med steril fine pincet til en tom, sterile 35 eller 60 mm petriskål. Bruger Stereoskopet vejledning, placere 10 µL spidsen af en mikropipette i den ene ende af hver mikro-kolonne og suge til tomme lumen af DPBS og luft bobler. Bekræfte fravær af luftbobler med Stereoskopet at sikre at ECM tilføjet i de næste trin kan flyde frit på tværs af lumen.
   4. Opkræve en P10 mikropipette med ECM-løsningen, sted den 10 µL tip mod ene ende af hydrogel mikro-kolonner, og levere nok opløsning til at fylde lumen (ca 3-5 µL), observere posten i ECM med Stereoskopet. Med pipette udtages en lille reservoir (2-4 µL) af ECM-løsningen på begge ender af mikro-kolonne.
      Bemærk: Administrere altid 4-5 mikro-kolonner eller en båd ad gangen for at undgå langvarig tørring af konstruktioner, da dette kan resultere i crumpling af mikro-kolonnestruktur. Helt tørret mikro-kolonner Vedhæft fast petriskåle, overflade, som forhindrer deres udnyttelse for celle såning. Store mængder af co Kulturmedier (som en hydrering foranstaltning) kan ikke føjes til mikro-kolonner, fordi dette kan medføre ECM til at flyde ud under inkubationstiden beskrevet nedenfor.
   5. Pipette Co Kulturmedier i en ring omkring petriskål til at give en luftfugtighed vasken for at forhindre kolonnerne fra udtørring under inkubation. Inkuber petriskålen indeholdende de ECM-holdige mikro-kolonner ved 37 ° C og 5% CO₂ for 1 h at fremme polymerisering af kollagen før du tilføjer neuroner og/eller astrocytter.
      Bemærk: ECM bør danne et lag belægning indersiden af den hule lumen, snarere end en solid ECM kerne omfatter interiøret, kan begge overholdes, ved hjælp af Stereoskopet. Hvis ECM udgør en kerne, fortsætte inkubationstiden indtil kun lag er tilbage. Med dette lag dannet, kan astrocyte celle løsning fylde indre af mikro-kolonnen i plating trin.
   6. Under inkubationstiden, forberede astrocyte celle løsning (som beskrevet nedenfor).
2. Astrocyte og Neuron såning i mikro-kolonner
   1. Passage af forgyldt astrocytter (mellem den fjerde og tolvte passage) som forklaret i trin 2.1.16-2.1.19. Efter tælle antallet af celler i kolben, forberede celle løsning med en tæthed på 9,0 12,0 x 10⁵ celler/mL opløsning suspenderet i cellekultur medier.
   2. Bruger en Stereoskopet, placere en P10 mikropipette spids i den ene ende af mikro-kolonner, og overføre tilstrækkelig celle løsning (~ 5 µL) til lumen helt udfylde den. Som udført ovenfor med ECM, tilføje små reservoirer for celle løsning til begge ender af hver mikro-kolonne.
   3. Inkuber forgyldt mikro-kolonnerne på petriskåle ved 37 ° C og 5% CO₂ for 1 h at fremme astrocytter tilknytning til ECM. Hvis neuroner ikke føjes til mikro-kolonner, skal du gå videre til trin 3.2.5.
   4. Efter den første inkubationstiden, Tilføj 1-2 µL af den kortikale neuron løsning opnåede i trin 2.2.7 i begge ender af mikro-kolonner med en mikropipette, mens observere under Stereoskopet. Sikre, at tilstrækkelig medier er til stede i opvasken for at undgå udtørring, og Inkuber igen i 40 min. ved 37 ° C og 5% CO₂ at give mulighed for vedhæftning af neuroner.
      Bemærk: Kortikale neuron løsning kan også være tilføjet 1-2 dage efter bundt dannelse, udfører trin 3.2.4 efter omhyggeligt at fjerne kultur medier fra petriskål med en mikropipette.
   5. Efter inkubation periode, omhyggeligt udfylde de petriskåle, der indeholder de forgyldt mikro-kolonner med 3 eller 6 mL af co Kulturmedier til 35 eller 60 mm petriskåle, henholdsvis. Vedligeholde forgyldt mikro-kolonnerne i kultur på 37 ° C og 5% CO₂ til at fremme den samlesæt af justeret astrocytic bundter, som bør udgøre en samlet, kabel-lignende struktur efter 6-10 timer.
3. Stabilisering af Astrocyte kabel arkitektur
   Bemærk: Efter dannelsen af bundter, ca. 6-12 h af dyrkning konstruktioner, udføre følgende trin for at forhindre et sammenbrud i de astrocytic stilladser justeret struktur.
   1. I en steril microcentrifuge tube, forberede en 3 mg/mL rotte hale kollagen jeg løsning i co dyrkningsmedier. Justere pH af løsningen på 7.2-7.4 efter proceduren beskrevet taktfast 3.1.2. Vedligeholde kollagen lager og fælles kultur medier på is når den ikke er i brug, og Placer forberedt kollagen løsning på is på alle tidspunkter.
   2. Fjerne medierne fra de petriskåle, der indeholder de astrocytic stilladser med en mikropipette, forlader nogle medier på siderne af skålen til at oprette en luftfugtighed vask, der sikrer hydrering af mikro-kolonner. Placer fadet under et Stereoskopet til støtte i visualisering.
   3. Med en mikropipette, tage 2-3 µL af kollagen løsning og decharge til hver ende af mikro-kolonner, ved hjælp af Stereoskopet visuelle vejledning. Kontroller, at fadet har tilstrækkelig medier omkring siderne til at fungere som en luftfugtighed vask rundt i kanten af fadet. Inkuber petriskåle med mikro-kolonner til 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO₂ i en fugtig inkubator til at fremme gellation af den nyligt tilføjede kollagen.
   4. Langsomt tilføje 3 eller 6 mL af co Kulturmedier (til 35 eller 60 mm Petri retter, henholdsvis) til Petri retter med en pipette, og kultur retterne i en fugtig inkubator på 37 ^oC og 5% CO₂.

4. udvinding af Astrocytic bundter fra Hydrogel interiør

1. Sterilisere glas coverslips i en autoklave. Forberede en 20 µg/mL opløsning af poly-L-lysin (PLL) i sterilt celle kultur grade vand.
2. Inde i en biosikkerhed kabinet, manuelt overføre steriliseret glas coverslips til en steril 10 cm petriskål, og tilføje tilstrækkelig PLL løsning for at dække coverslips.
3. Inkubér coverslips, dækket med PLL-løsning til 30 minutter ved 37 ° C til pels overfladen. Fjerne PLL løsning med Pasteur pipette efter 30 min. Skyl tre gange ved tilsætning af celle kultur kvalitet vand til coverslip og fjerne det med Pasteur pipette.
4. Efter dannelsen af den justerede glial bundt, overføre mikro-kolonne fint til en steril petriskål med steril fine pincet, og tilføje en lille pulje af 10 µL af co Kulturmedier med en mikropipette at forhindre dehydrering og sikre bundt sundhed. Uddrag den astrocytic bundt fra hydrogel mikro-kolonnen ved forsigtigt at trække fra den ene ende med steril kirurgiske pincet, ved hjælp af en Stereoskopet visuelle vejledning.
5. Holding astrocytic bundtet med pincet, montere den på en PLL-belagt coverslip. Fix og plette med protokollen nedenfor.

5. immuncytokemi for In vitro- undersøgelser

Bemærk: For denne undersøgelse, de primære antistoffer var kanin anti-glial sure fibrillære proteiner (GFAP) (1: 500), musen anti-β-tubulin III (1: 500), kanin anti-kollagen jeg (1: 500), musen anti-nestin (1:200) og kanin anti-vimentin (1: 100). De sekundære antistoffer var æsel anti-mus 568, æsel anti-kanin 568, æsel anti-kanin 488 og æsel anti-mus 568 (1: 500 for alle). I alle tilfælde, tilføje nok volumen af hver løsning helt dække mikro-kolonner.

1. Forberede en 4% volumen/bind (v/v) formaldehyd løsning i 1 x DPBS inde i en kemisk stinkskab.
   Forsigtig: formaldehyd er et giftigt stof kendt for at være kræftfremkaldende, og skal bortskaffes i en separat beholder. Altid manipulere denne sammensatte inde en kemisk stinkskab og anvende personlige værnemidler (PPE) såsom laboratoriekittel, beskyttelsesbriller og handsker.
2. I tilfælde af mikro-kolonner, kassere dyrkningsmedier fra de petriskåle, der indeholder konstruktioner med Pasteur pipette uden uheld sugning hydrogel cylindre. Tilføje tilstrækkelig formaldehyd løsning til at dække mikro-kolonnerne eller den monterede coverslips (som begge forbliver på Petriskålene) og Inkuber i 35 min ved 18-24 ° C.
3. Uddrag 4,0% formaldehyd løsning fra de faste mikro-kolonner eller coverslips med en serologisk pipette. Skyl fast mikro-kolonnerne tre gange med PBS ved hurtigt at tilføje og fjerne PBS to gange og derefter lade dem trække i 10 min en tredje gang.
4. Opløse normal hest serum (NHS) i PBS for en koncentration af 4% v / v. Forbered en løsning med nonionisk detergent i en koncentration på 0,3% v/v ved hjælp af NHS løsningen som opløsningsmiddel.
5. Fjerne PBS fra de petriskåle, der indeholder mikro-kolonner eller coverslips med en pipette. Tilføje tilstrækkelig 0,3% rengøringsmiddel til også at omfatte mikro-kolonner/coverslips for 60 min. ved 18-24 ° C til permeabilize celler.
6. Tag rengøringsmiddel, og skyl hurtigt to gange med PBS og tre gange ved opblødning i 5 min. Beregn den nødvendige mængde af 4% NHS og hver af de primære antistoffer til at forberede en løsning med de ønskede antistof koncentrationer.
7. Fjern PBS fra Petriskålene og tilføje nok primære antistof (fortyndet i 4% NHS-DPBS) løsning til at dække mikro-kolonnerne eller de udpakkede astrocytic bundter. Der inkuberes natten over (12-16 h) ved 4 ° C.
8. Tag den primære antistof løsning og hurtigt skylles to gange med PBS og tre gange ved opblødning i 5 min. Forberede sekundær antistof-løsning i mørke, med hver antistof stede ved en fortynding på 1: 500 i 4,0% NHS løsning.
9. Inkuber celler med sekundær antistof løsning for 2 h på 18-24 ° C. I hele den hele tid inkubation, dække de petriskåle, der indeholder mikro-kolonner med aluminiumsfolie at undgå udsættelse for lys.
10. Sekundær antistof-opløsning og tilføje Hoechst løsning (1:10, 000) i 10 minutter ved 18-24 ° C til at plette kerner.
    Forsigtig: Hoechst er en kendt mutagen, der bør behandles som et kræftfremkaldende stof. Derfor, det skal bortskaffes i en separat beholder og PPE bør anvendes på alle tidspunkter når manipulere denne agent.
11. Skyl med PBS fem gange, hver gang i 5-10 min. bagefter, gemme de farvede mikro-kolonner ved 4 ° C i PBS og tildækkes med aluminiumsfolie. For de monterede astrocytic bundter, tilsættes en dråbe af vandige montering medium til bundtet, placere en anden glas coverslip over den faste bundle og forsegle begge coverslips med neglelak til langtidslagring og efterfølgende billeddannelse.

6. bæredygtighed Assay med Live-døde (Calcein-AM/ethidium Homodimer) farvning

1. Forbered reagens løsning ved at tilføje 5 µl calcein AM (4 mM i vandfri dimethylsulfoxid (DMSO)) og 20 μl ethidium homodimer-1 (EthD-1) (2 mM i DMSO/H₂O 1:4 v/v) til 10 mL af 1 x DPBS. Dække løsning med aluminiumsfolie eller opbevares i mørke til at beskytte den mod lyset.
2. Opsug medier fra petriskålen indeholdende forgyldt mikro-kolonnerne med Pasteur pipette, og tilføje nok rengøringsopløsning (ovenfor) til at dække konstruktioner. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO₂, at holde petriskålen dækket for at beskytte løsningen fra lyset.
3. Fjerne løsningen med en mikropipette eller Pasteur pipette. Skyl 2 - 3 gange med DPBS som forklaret i trin 5.3. Oversvømmelse petriskåle med DPBS efter størrelsen af fadet. Billede celler bruge umiddelbart bagefter epifluorescensmikroskop eller Konfokal billeddannelse.
   Bemærk: Konvertering af membran-gennemtrængelige calcein AM til calcein af metabolisk aktive celler giver den grønne fluorescens af calcein. Døde celler er markeret som membran-kompromitteret celler, der tillader indførsel af EthD-1 i cellen og dets binding til nukleinsyrer, forårsager røde fluorescens.

Representative Results

I første omgang fasekontrast mikroskopi blev brugt til at overvåge udviklingen af astrocyte vedhæftning og bundt dannelse og den overordnede stabilitet af cytoarchitecture som funktion af tiden. På 1 time efter plating, blev astrocytter fundet i hele lumen af mikro-kolonner med en sfærisk morfologi (figur 2A). På 5 h, astrocytter begyndte at udvide processer og kontraherende, mens af 8 h celler udstillet en komplet proces-bærende morfologi og dannet kabel-lignende strukturer orienteret langs den langsgående akse af mikro-kolonne (figur 2A). Især i forhold til den oprindeligt spredte tilstedeværelse af celler på tværs af mikro-kolonner, astrocytter syntes at have kontrakt med danne et netværk af tætte bundter langs indvendigt (figur 2B). Efter den indledende cellejustering, astrocyte netværk ofte trukket sammen langs den langsgående akse, der minder om en lynlås lukning, til at danne en tæt bundt i midten af mikro-kolonne (figur 2 c). Dannelsen af denne bundtede arkitektur skyldtes, at et samlesæt proces, dels dikteret af valget af mikro-kolonne-ID og celle tæthed. Astrocytter justeret og erhvervet en bipolar morfologi når seedede i mikro-kolonner med en ID mindre end 350 µm (figur 3B, øverste og midterste, og 3D-3F)⁴⁹. Tværtimod, disse celler viste tilfældige direktionalitet når et ID på 1 mm blev udnyttet (figur 3B, nederst), som ligner udseendet af 2D astrocyte kulturer udsat for serum-fri, co kultur medium (figur 3A, højre). Desuden, selvom astrocytter stadig vise justering ved lav seeding tætheder (2,0-3,0 x 10⁵ celler/mL eller 2,0-3,0 x 10² celler/mm³) (figur 3 c), tætte netværk dannes kun på de høje tætheder (9,0-12,0 x 10⁵ celler/mL eller 9,0 12,0 x 10² celler/mm³) inden for cylindriske mikro-kolonner af tilsvarende dimensioner (ses i figur 3B, Forside), som foreslået i protokollen⁴⁹. Levedygtighed i de astrocytic bundter var kvantificeret, ved hjælp af live/døde assay, som forholdet mellem området af celler fluorescerende grøn (calcein AM) i forhold til det samlede areal af celler fluorescerende grøn (calcein AM) og rød (EthD-1). Levedygtighed af astrocytic bundter var 97,4%, hvilket svarer til 98,2% levedygtighed 2D astrocyte kultur kontrolelementer (figur 4A-4B), beviser, at miljøet inden for mikro-kolonner er egnet til astrocyte vitalitet ( Figur 4E). De 3D rekonstruktioner af de levende og døde celler i de astrocytic stilladser viser også den samlede cellejustering inden for konstruktioner (figur 4 c-4 D). Derudover blev ultralang astrocytic mikro-kolonner udviklet for at undersøge stabilitet af astrocyte bundter med betydelige længde. Selv i den ekstraordinære afstand af 3,5 cm, cytoarchitecture af justeret, tætte og aftalte astrocytic bundter blev fastholdt konsekvent over hele længden af mikro-kolonnen (figur 5A), som tydeligt ses i regionerne zoome ind i den mikro-kolonner (figur 5B-5 C).

Når dannet, bundterne var fast og plettet af immuncytokemi teknikker for mellemliggende glødetrådens proteiner karakteristiske glial celler, såsom GFAP, nestin og vimentin. Konfokal billederne bekræfte proces-bærende morfologi af astrocytter og langsgående tilpasning af processer (figur 6 og figur 7). Udtryk for de mellemliggende glødetrådens proteiner kan ses i både 2D astrocyte kulturer (figur 7A) samt astrocyte bundter inden for mikro-kolonne (figur 6og figur 7B-7 D). Derudover bekræftet kollagen farvning tilstedeværelsen af denne ECM proteiner i mikro-kolonner. Astrocytter ikke danne en kontinuerlig struktur med kollagen når kulturperler i et 2D-miljø (figur 8A), mens astrocytter syntes at overholde og ombygge kollagen findes i lumen når kulturperler i mikro-kolonner, så for celle sammentrækning og bundt dannelse (figur 8). Overlay GFAP og kollagen kanaler viste, at astrocyte kabler bestod af tæt tilknyttede processer med langsgående kollagen fibre (figur 8). Derfor, bortset fra tilbyde ankerplads, kollagen fibriller kan også har givet yderligere retningsbestemt stikord for astrocytter at danne tætte bundter efter sammentrækning. I nogle tilfælde varet astrocyte-kollagen sammentrækning, resulterende i et sammenbrud af den justerede bundt over 12-24 timer efter dannelsen (figur 9A). For at stabilisere den kabel-lignende astrocyte arkitektur inden for hydrogel mikro-kolonner, blev yderligere kollagen matrix føjet til enderne af en fuldt dannet bundle til at hæmme yderligere sammentrækning og sammenbrud. Denne styrkelse Teknik tilladt for overlevelse af den ønskede kabel arkitektur i mindst 4 dage, med en længere vindue stabilitet forventet (figur 9B). Derudover var repræsentative astrocytic bundter udvundet fra hydrogel mikro-kolonnen, monteret, og fast med 4% formaldehyd på glas coverslips at vurdere deres robusthed, når de udsættes for spænding kræfter og til det eksterne miljø. Selv efter udvinding og fysisk manipulation i forskellige former (figur 10A, 10B), astrocytic somata og processer opretholdt en justeret, bundtet mikro-skala morfologi (figur 10C), fremhæver den fleksibilitet af den selvstændig justeret astrocytic stillads, når dannet, selvom den strukturelle støtte af hydrogel mikro-kolonnen er fraværende.

Primære kortikale neuroner var også co kulturperler med astrocytter inde mikro-kolonner til at undersøge, om astrocyte bundter var i stand til at anstifte neuronal vedhæftning og neurite udvækst. GFAP og mikrotubulus protein β-tubulin III blev brugt som specifikke markører for astrocytter og neuroner, henholdsvis. Fig. 11A viser, at astrocytter Co seedede med kortikale neuroner var også i stand til at udstille processer og danner justeret bundter. Neuroner syntes at have overholdt fortrinsvis astrocyte bundter, siden alle positive β-tubulin III farvning Co lokaliseret med GFAP (overlays i fig. 11B-11 C). For at demonstrere de astrocytic konstruktioner regenererende egenskaber, kortikal neuroner (figur 12B) blev forgyldt inden for hydrogel mikro-kolonne 2 dage efter astrocytter blev forgyldt (fig. 12A). Neuroner knyttet til astrocyte bundt, og udvidet neurites direkte langs de astrocytic skrifter. Yderligere inspektion viste neurite udvækst orienteret i retning af astrocytic kablet, mens i regioner hvor astrocyte tarmkanalen ikke var til stede, neurites var set vokser på en uorganiseret måde (figur 12C). Disse observationer viser, at protokollen resulterer i justeret, levedygtig og robust astrocytic netværk, der har potentiale til at fungere som implantabel levende veje at fremme neuron vedhæftning og neurite udvækst.

Figur 2: Brightfield mikroskopi viser dannelsen af Astrocyte bundter inden for Hydrogel mikro-kolonner over tid. (A) Astrocyte morfologi som funktion af tiden efter plating: (1 h) astrocytter er sfærisk form og spredt i hele konstruktionen; (5 h) astrocytter indlede processen udvidelse og sammentrækning; (8 h) astrocytter har justeret og kontrakt. Skalere barer = 100 µm. (B) bundt dannelse over tid i en yderligere repræsentant stillads: (1 h) i første omgang astrocytter er kugleformede og ikke udviser processer; (24 h) et tæt bundt af astrocytic processer er dannet. Skalere barer = 300 µm (venstre) og 500 µm (til højre). (C) dannet fuldt astrocytic bundt 24 h efter plating, viser en "zippering" effekt, hvor enderne af kablet tillægger forskellige ender af vægge af lumen. Skalalinjen = 1000 µm.

Figur 3: Micro-kolonne indre Diameter og celle tæthed indflydelse den samlesæt af justeret bundter af Bipolar astrocytter. (A) 2D astrocyte kulturer med serum-holdige medier (venstre) og serumfrit Co Kulturmedier (til højre) viser en ikke-processen og multi proces bærende morfologi, henholdsvis. Skalere barer = 100 µm. (B) astrocytter seedede med høj tæthed (9,0 12,0 x 10⁵ celler/mL) i mikro-kolonner med en ID af 180 og 350 µm form tilpasset bundter i forhold til den langsgående akse, mens en ID af 1 mm resultater i astrocytter fremvisningen af flere, unaligned processer i hele diameteren af lumen. Skalere barer = 100 µm (øverste, midterste) og 150 µm (nederst). (C) astrocytter seedede i en 350 µm ID mikro-kolonne med lav tæthed (2,0-4,0 x 10⁵ celler/mL) er justeret, men ikke bundtet. Skalalinjen = 100 µm. (D) når belagt i en 350 µm ID mikro-kolonne på lav eller middel celle tæthed, astrocytter erhverve en bipolar morfologi. Skalere barer = 300 µm. (E) boks i D viser et zoom-in på kæder af bipolar astrocytter der danner inde hydrogel mikro-kolonner. Skalalinjen = 300 µm. (F) eksempel på en individuel bipolar astrocyte. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: astrocytter forblive levedygtige efter bundt dannelse inden for Hydrogel mikro-kolonne. (A-B), (C-D) 3D Konfokal rekonstruktioner viser levedygtigheden af celler i hele planar kulturer og tilpasset astrocytic bundter, henholdsvis, som analyseres med calcein-AM/ethidium homodimer farvning (grøn-live celler; rød-døde celler). (E) kvantificering af levende og døde celler resulterede i en tilsvarende procentdel af live/døde astrocytter når kulturperler på 2D overflader og mikro-kolonner. Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: fase-kontrast billede af en repræsentativ ultralang justeret Astrocytic bundt inden for Hydrogel mikro-kolonne. (A) bundt dannelse gennem hele længden af en 3,5 cm mikro-kolonne. Skalalinjen = 1.000 µm. (B-C) højere forstørrelse zoom-ins viser astrocyte justering i forskellige regioner langs helhed af konstruktion, svarer til felterne i A. Skalere barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Immunolabeling af de Astrocytic stilladser viser den langsgående justering af Astrocytic processer. (A) Konfokal rekonstruktion af en astrocytic bundt viser farvning for GFAP (rød, venstre) og kerner (Hoechst, midten) og en overlay begge kanaler (til højre). (B) højere forstørrelse zoom-in af astrocytic bundle i boxed regionen i A tillader visualisering af cytoarchitecture af astrocytter inden for mikro-kolonner. Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: karakterisering af repræsentative Astrocytic bundter gennem immuncytokemi. (A-B) Astrocytter kulturperler på 2D overflader og seedet i hydrogel mikro-kolonner express lignende astrocytic markører GFAP (rød) og vimentin (grøn). (A) Konfokal rekonstruktion af en 2D planar astrocyte kultur viser de separate og flettede kanaler. Skalalinjen = 100 µm. (B) Konfokal billeder af en astrocytic bundt, bekræfter udtryk af markører og fremvisning af astrocyte justering. Skalalinjen = 50 µm. (C-D) astrocytter kulturperler inden for mikro-kolonner også udtrykke mellemliggende glødetrådens proteiner nestin (rød) og vimentin (grøn). (C) Konfokal billede af en astrocytic bundt. Skalalinjen = 100 µm. (D) højere forstørrelse zoom-in- c. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: astrocytter i de justerede bundter intimt interagere med en kontrakt, langsgående kollagen Matrix, i modsætning til den irregulære Arrangement af kollagen i 2D kulturer. Celler var immunolabeled at observere astrocytter (GFAP, red), kerner (Hoechst, blå) og kollagen (grøn). (A) 2D astrocyte kulturer med kollagen på 1 mg/mL Vis unaligned astrocytter og tilfældigt fordelte kollagen. Skalalinjen = 250 µm. (B) kollagen er hevet ned fra væggene i mikro-kolonne lumen og er ansat til at danne en justeret matrix, der er en del af den astrocytic bundt. Skalalinjen = 150 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9: yderligere kollagen kan bruges til at stabilisere strukturen af Astrocytic kabler. (A) bundter dannet ca 6 h efter plating astrocytter inden for kollagen-belagt hydrogel mikro-kolonner. Når bundter blev dannet, blev højere koncentration (3 mg/mL) kollagen føjet til enderne af mikro-kolonne til at hæmme sammentrækningen af astrocytic kablerne. I konstruktioner ikke stabiliseret med yderligere kollagen, astrocytic kollagen bundter var begyndt at blive reduceret med 18 h og astrocyte kabler var brudt fuldstændig sammen af 24 h. Denne sammentrækning blev ikke observeret, når bundterne blev forstærket med 3 mg/mL kollagen. Skalalinjen = 1.000 μm. (B) Zoom i af kollapsede astrocytic bundt ikke forstærket med 3 mg/mL kollagen. Skalalinjen = 500 μm. (C) Zoom i regioner fra kollagen-forstærket mikro-kolonner. Astrocyte bundt morfologi blev opretholdt i hele helhed af mikro-kolonne. Skalere barer = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10: udvinding af Astrocytic bundter fra mikro-kolonne og montering på Poly-L-lysin coatede glas Coverslips beviset interstatslig handelspraksis robustheden af teknikken. (A) fase-kontrast billede af flere udvundet astrocytic bundter, manipuleret til stave ordet "Penn". (B) Konfokal genopbygning af samme udvundet bundter farvet for astrocytic markør GFAP (rød) og cellekerner (Hoechst, blå). Skalalinjen = 100 µm. (C) forstørrelse af boxed regionen i B viser, at selv når manipuleret til uregelmæssige former, de astrocytic stilladser bevarer en justeret, bipolar morfologi og en medfølgende cytoarchitecture. Skalalinjen = 200 µm. Bemærk, at eventuelle strukturforskelle mellem fase og konfokal billeder er sandsynligvis en artefakt af konstruktioner skiftende på grund af skylning under immuncytokemi procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11: neuroner overholder og udvide Neurites langs justeret Astrocyte bundter i Neuron-Astrocyte Co kulturperler stilladser. (A) fase-kontrast billede af en neuron-seedede astrocytic bundt. Skalalinjen = 300 µm. (B)-(C) neuroner blev observeret at overholde de astrocytic bundter og udvide neurites langs retning af kabel (Hoechst-blå; GFAP-grøn; Β-tubulin III-rød). Skalere barer = 200 og 100 µm, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 12: Astrocyte kabler tjene som en levende stillads til instrueret Neurite udvækst. Konfokal rekonstruktioner viser en region i en mikro-kolonne består af neuroner seedede ca 2 dage efter bundt dannelse. (A) GFAP-positive astrocyte bundter, (B) β-tubulin III-positive neuroner, og (C) fletningen af alle kanaler, herunder HOECHST-farvede kerner (blå). Bemærk, at neuroner udstillet neurite justering når levet op til regioner med justeret astrocyte processer (pile), der henviser til, at neuroner ikke levet op til justeret astrocytter syntes at udstille tilfældige (dvs. multi-directional) neurite udvækst (pilespidser). Viser retningen af neurite udvækst (D) Zoom i regionen. Skalere barer = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Sammenlignet med de mere støttende miljø af PNS, forringes CNS især ved håndtering af de skadelige konsekvenser af neurotrauma og neurodegeneration. Efter en alvorlig fornærmelse til pattedyr CNS dannes en glial ar, bestående af en kerne af fibrotisk og inflammatoriske celler omgivet af en tæt meshwork af uorganiseret reaktive astrocytter, der udskiller axon udvækst-hæmmende proteoglycaner¹⁴. Dette ar fungerer som en fysiske og biokemiske obstruktion mod regenerering af axon endelser¹². Desuden, den voksne pattedyr CNS besidder begrænsede kilder af nye neuroner til at gendanne tabte celler efter traume eller neurodegeneration, da neurogen Centre er begrænset til SVZ, at hippocampus dentate gyrus og potentielt andre normalt inaktive områder⁵⁴. En ideel strategi ville omgå begge aspekter af de begrænsede rekuperativ kapaciteter af CNS, som nuværende strategier ikke adresse. Som sådan, har vores forskergruppe udviklet astrocyte-baserede stilladser til formål at præsentere levende veje for neurale overgangen til neuron-mangelfuld arealer og guidede udvidelse af regenererende axon vækst kegler. Justeret astrocytic bundter indeholdt i kraterets kollagen en Agarosen mikro-kolonne udgør disse astrocytic levende stilladser. En betydelig forskel fra konventionel celle - og biomateriale-baserede strategier, der anvendes til CNS reparation og regeneration er, at cytoarchitecture af disse konstruktioner er helt præfabrikerede in vitro for at simulere flere i vivo glia-baserede vejledning og stilladser arkitekturer. For eksempel, under fosterudviklingen fungere radial glia veje som levende stilladser for nye neuroner migrerer til neocortex og gliaceller mægle en målrettet udvidelse af banebrydende axoner forklædt som mønstrede underlag og/eller guidepost celler^{35 ,38,39}. Embryonale radial glia i den subventricular zone producerer også astrocytter, der danner langs justeret glial rør, hvorover neuroblasts vandrer efter fødslen i en lænket-dannelse fra SVZ til OB⁴¹. Derudover er det blevet påvist i nogle ikke-pattedyr, der efter CNS skade, en større grad af regenerering er muligt på grund af dannelsen af en organiseret, justeret astrocytic arrangement⁴⁴. For eksempel, voksen zebrafisk er i stand til at regenerere deres rygmarv efter migrationen af umodne glial celler til læsion site, differentiering af en bipolar morfologi og brudforlængelse glial processer til at slå bro over den læsion, danner en sti der dirigerer regenererende axoner⁴⁵. Manipuleret konstruktioner af justeret astrocytic bundter kan være i stand til recapitulating disse mekanismer og præsentere de nødvendige strukturelle og opløselige signaler om glia-medieret neuronal migration og axon regenerering³⁵. Hertil kommer, på grund af levende astrocytter, kan disse konstruktioner aktivt præsentere de nødvendige miljømæssige stikord baseret på feedback fra værten.

I vores teknik, astrocyte justering er et samlesæt proces betinget af de fysiske signaler og celle-celle interaktioner fremmes af mikro-kolonne indre diameter, kollagen koncentration og seeding tæthed. En anden attraktiv egenskab ved denne metode er dens mikro-skala størrelse, som kan give mulighed for minimalt invasiv implantation i beskadigede områder af CNS. Derudover påvise resultaterne præsenteres i dette manuskript, at konstruktioner fremstillet med protokollen besidder høje levedygtighed og express mellemliggende glødetrådens proteiner GFAP, nestin og vimentin, uanset astrocyte alder som defineret af passage antallet . Mens både GFAP og vimentin udtrykkes i umodne og modne astrocytter, er nestin hovedsagelig begrænset til udifferentierede eller umodne celler med modning glia upregulating udtryk for GFAP og faldende produktion af nestin^{45, 55}. tidligere undersøgelser har vist at astrocyte opførsel forandringer med alderen, men konsekvent udtryk for mellemliggende glødetrådens proteiner, samt bundling blev set på tværs af en vifte af passage numre (passager 4-12)⁵⁶. De astrocytic stilladser også blev vist at opnå ultra-lang, centimeter-skala længder i vitro, hvilket tyder på, at denne teknik er kan tilpasses til forskellige skade længder og geometrier stødt i vivo. Desuden udviser justeret astrocytic bundterne bemærkelsesværdige strukturelle integritet og stabilitet, som deres kabel-lignende cytoarchitecture opretholdes selv efter de underkastes ekstraktion fra mikro-kolonner. Astrocyte-baserede levende scaffolds også støtte neuron vedhæftning og neurite udvækst, styrke potentialet i denne teknik til at fremme styret neuron migration og axon udvidelse til CNS reparation.

De justerede astrocytic bundter er indeholdt i en beskyttende rørformede hydrogel encasement kollagen indre. Fabrikation af de astrocytic stilladser begynder med mikro-kolonne forsamling ved at indsætte en akupunktur nål ind et kapillarrør og sugning flydende Agarosen ind i den. Agarosen skyldtes dets inert egenskaber, biokompatibilitet og let kontrolleret mekaniske, fysiske og biokemiske egenskaber⁴⁹den valgte biomateriale. Agarosen koncentration i hydrogel kan være en vigtig variabel siden celler forstand mekaniske stimuli fra deres substrat (fx stivhed) og reagere med intracellulære ændringer⁵⁷. Design kriterier for disse mikro-kolonner indeholder en tilstrækkelig høj porøsitet at give mulighed for tilstrækkelig masse transport, men en lille nok porestørrelse at forbyde laterale proces udvækst; disse kriterier er opfyldt af nano-skala åben porøsitet i Agarosen på den koncentration til denne protokol. Agarosen koncentration i denne protokol blev også valgt på grund af dens stabilitet, nem håndtering og ligheden i mekaniske egenskaber til hjernen miljø⁵⁸. Et bemærkelsesværdigt aspekt er den centrale placering af nålen i den kapillarrør. Oftentimes, kan nålen være lidt skrå eller fordrevne under processen, forårsager lumen være placeret off-center i forhold til de ydre vægge efter Agarosen gellation og mikro-kolonne fjernelse fra røret. For at undgå dette, nålen skal være lige, og stemplet tube nål forsamling bør opretholdes i en lodret position, mens Agarosen er trækkes at fastholde nålen langs den centrale akse. Præcise centralisering af lumen beskytter de justeret astrocytter mellem Agarosen vægge; lumen er mere tilbøjelige til at sprænges hvis placeret proksimalt for den ydre rand af cylinderen. Derudover kan tilstrækkelig afstand mellem lumen og den ydre væg tilbyde beskyttende fordele under og efter transplantation (forudsat de astrocytic konstruktioner ikke er fjernet fra mikro-kolonne forudgående til implantatet). Denne indledende fase af astrocytic stillads fabrikation er altafgørende for succes af teknikken, som udvælgelsen af nålen diameter er afgørende for korrekt astrocyte soma-processen justering og kabel samlesæt. Vi fandt, at astrocyte justering var omvendt afhængig af mikro-kolonne-ID med en optimal ID interval for cellejustering og dannelsen af robuste astrocyte bundter er 180-350 µm (figur 3). Ligeledes blev det tidligere påvist, at neuroner direkte deres udvækst langs retning af minimum substrat krumning at mindske proces bøjning^59,60, og lignende mekanismer er sandsynligvis på arbejdspladsen til at påvirke astrocyte justering i vores system⁴⁹. Ud over krumning påvirker astrocyte justering, fandt vi, at en 180-350 µm ID vifte resulterede i astrocytter erhverve en bipolar morfologi⁴⁹, i modsætning til formen Stjernehus, multi-Polar observeret med et ID på 1 mm, eller når astrocytter var kulturperler i 2D (figur 3). Det er sandsynligt, at disse dybtgående morfologiske ændringer til en bipolar astrocyte morfologi ændre deres fysiologiske egenskaber samt; for eksempel, disse astrocytter kan udtrykke alternative secretable faktorer eller celle overflade markører, der kan være en fordel for regenerering, men dette berettiger yderligere karakterisering. Samlet set viser vores resultater, at passende udvalg af fysiske signaler, såsom overflade krumning, er bydende nødvendigt at efterligne indfødte cytoarchitecture i astrocytic levende stilladser.

Opførelsen af de astrocytic stilladser provenuet med sekventiel inddragelse af kollagen ECM-løsningen og kortikale astrocytter ind i hule af mikro-kolonner. Den indre lumen af mikro-kolonnen er belagt med kollagen til at støtte astrocyte overlevelse, vedhæftet fil og justeret bundt dannelse, på grund af manglende evne til Agarosen uafhængigt støtte neurite udvækst⁶¹. En kollagen koncentration på 1 mg/mL blev valgt fordi tidligere undersøgelser konstateret, at lavere og højere koncentrationer resulterede i manglende vedhæftning og ustabilitet af ECM, henholdsvis⁴⁹. Dermed, som forventet, kollagen koncentration har dramatiske konsekvenser for effektiviteten af denne teknik. Derudover består ECM-løsningen af kun type I kollagen. Sammenlignet med laminin og Matrigel-belagt substrater for 2D astrocytic kulturer, forgyldt astrocytter på type jeg kollagen demonstreret optimal vedhæftning og netværk dannelse⁶². Inkubationstiden bruges til kollagen polymerisering før celle såning er også et vigtigt skridt i protokollen. Vi har tidligere fundet at når neuroner blev leveret samtidig med Upolymeriseret ECM til Agarosen mikro-kolonner, reduceret neurite udvækst og cytoskeletale fasciculation var set⁴⁷, og det er muligt, at disse resultater ville udvide til astrocytter så godt. Da collagen er påkrævet for astrocyte vedhæftning og bundt dannelse, bør tilstedeværelsen af ECM hele konstruktionen og fraværet af luftbobler eller tomme lommer være visualiseret og bekræftet med mikroskopiske teknikker.

Protokollen afslutter hos astrocyte forkromning, en inkubationstid at sikre celle vedhæftning til kollagen og kortfristede kultur for dannelsen af målet cytoarchitecture. Astrocytter mellem passage nummer 4-12 blev brugt, da de udstillede robust astrocytic bundling og kollagen reformationen. Disse astrocytter også præsenteret en moden fænotype bestående af > 95% ren kulturer^63,64 med lidt at ingen neuronal forurening. I modsætning til almindelige astrocyte kulturer, der beskæftiger serum-holdige medium (figur 3A, venstre), anvender vores teknik serumfrit medium for at tillade astrocytter at vedtage en proces-bærende morfologi (figur 3A, ret ) og danne bundter af tilpasset somata og processer inden for mikro-kolonner^62,65,66. Med hensyn til celle såning koncentration, resulterede højere koncentrationer i rækken af 9,0 12,0 x 10⁵ celler/mL, med en ID af 350 µm, i dannelsen af tætpakkede bundter med tilhørende kollagen remodellering, mens astrocytter blev mere spredt , men stadig justeret, når lavere koncentrationer blev udnyttet (figur 3 c). Således er påvirker effekten af såning koncentration på celle-celle interaktioner graden af astrocyte justering og dannelsen af de observerede kabel-lignende strukturer. Indsprøjtning af celle løsning i lumen er generelt visualiseres ved hjælp af en Stereoskopet for at sikre ensartet levering på tværs af mikro-kolonnen længde, som er afgørende for kontinuerlig bundt dannelse. Efter såning, er det foreløbige inkubationstiden før oversvømmelser med kultur medier uundværlig til at sikre forankring af astrocytter til ECM. Varigheden kan ændres, hvis astrocytter flygte fra konstruktioner, forudsat at konstruktioner er tilstrækkelig fugtet for at udelukke tørring. Fasekontrast billeder af de astrocytic stilladser som funktion af tiden viste at 8 h, et netværk af justeret astrocytic bundter var ved at blive dannet. Derudover blev udstationering af ECM fra lumen væggen, dets efterfølgende sammentrækning og den stramme sammenslutning mellem celler og den aftalte kollagen observeret når konstruktioner blev mærket for kollagen og GFAP som vist i figur 8. Dette fænomen er muligvis en følge af astrocytic kontraktile styrker afmontering kollagen fra væggene, baseret på tidligere rapporter af fibroblast-lignende kapacitet glial celler til at generere styrker, som fordrejer fleksible substrater og matrix-remodeling evne til astrocytter i astrocyte-only og neuron-astrocyte Co kulturer^28,49,67,68. Specifikt, er en af konsekvenserne af astrocyte motilitet og den integrin-medieret interaktion med kollagen fibriller generation af styrker tilstrækkeligt til kontrakt fibriller^17,69. Samlet set vil beskrevet protokollens gennemførelse producere levende stilladser består af selvsamlede netværk af tætte, justeret astrocytic kabel-lignende strukturer, at sammenfatte fysiske substrater til stede på flere stadier af CNS udvikling.

Ud over individuelle problemer, der kunne opstå i hele protokollen, besidder astrocytic stillads teknik andre hindringer, der kan påvirke dets evne til at reparere CNS. For eksempel, er den ultimative succes af denne teknik betinget af nervesystemet plasticitet og funktionel integration af astrocytic skafottet med værten kredsløb. Relateret til implantation af disse stilladser er muligheden for en inflammatorisk reaktion, der kan imødegå de pro-regenererende attributter af astrocytic bundter. Alle transplantation-baserede teknikker har kapacitet til at briste blod - hjerne barrieren og forårsage infiltration af inflammatoriske celler, på grund af nærhed mellem neuroner og kapillærer i væv⁴⁷. I dette tilfælde kan hydrogel mikro-kolonne eller en anden encasement ordning for de astrocytic stilladser udnyttes som et redskab for kontrolleret frigivelse af anti-inflammatoriske faktorer til at mindske det inflammatoriske respons. I første omgang, den justeret astrocytic bundt var ikke stabil inde mikro-kolonne, som de kræfter, der tvinger cellejustering og matrix remodeling i sidste ende førte til et sammenbrud for den ønskede cytoarchitecture efter 1-2 dage i kultur. Imidlertid blev yderligere sammentrækning og bundt sammenbrud hæmmet ved at yde yderligere forstærkning for bundter i enderne af mikro-kolonne ved at tilføje højere koncentration kollagen for at holde bundtet på plads. En yderligere taktik kunne være at ansætte en sekundær indkapsling, hvorved en ny hydrogel coating til de justerede astrocytic bundter som de er trukket fra mikro-kolonner. Det er sandsynligt, at levering af justeret astrocyte netværk i hjernen også ville stabilisere konstruktioner på grund af celle-celle sammenvoksninger mellem vært og konstruere celler langs hele længden, selvom dette vil skulle testes direkte i fremtidige undersøgelser.

I overensstemmelse hermed, fremtidige bestræbelser vil være rettet mod at udvikle en effektiv transplantation metode, der sikrer stabilisering og beskyttelse af astrocytic bundle under og efter i vivo levering for at muliggøre neuronal migration, reparation, og regenerering i den skadede CNS. Vi har tidligere vist vellykket implantation af neuronal/cytoskeletale-baseret mikro-mine, som deler encasement ordningen af de astrocytic konstruktioner, i corticothalamic veje, hvilket resulterer i overlevelse og strukturel integration med værten væv på mindst indtil 1 måned^46,47. Således kan robustheden af kabler efter ekstraktion fra mikro-kolonner udnyttes. I dette tilfælde Agarosen hydrogel ville tjene som den oprindelige kultur seng til at fremkalde samlesæt og derefter astrocytic kablet ville være fjernet fra encasement og direkte sprøjtet ind i hjernen, ved hjælp af en tyndvægget nål. Astrocyte deformation på grund af mekaniske styrker under udvinding fra hydrogel mikro-kolonnen er ikke blevet overholdt, og forventes ikke. Tidligere arbejde at studere virkningerne af mekanisk deformation på astrocyte reaktivitet tyder på at nogen resulterende deformation ikke anvendes hurtigt nok til at fremkalde astrocytosis eller proces brudforlængelse^62,70. For at minimere skaden hjernevæv og den mulige inflammatorisk respons, kunne bundter inden for hydrogel implanteres ved hjælp af nål-mindre teknologi udviklet tidligere for mikro-mine. I denne metode, er hydrogel belagt med et tyndt lag af carboxymethylcellulose, der giver mulighed for nål-mindre post ind i hjernen, som kan mindske den forstyrrende og inflammatoriske fodaftryk af implantation⁴⁷. Bagefter, transplantation undersøgelser kan udføres for at vurdere muligheden for disse stilladser til at overleve, integreres med værten væv, og fremme neurale migration og axon vejledning. Især kan disse konstruktioner implanteres med ene ende fra en neurogen region som SVZ adgang til sin pulje af neurale stamceller og neuroblasts, i direkte mimicry RMS, og den anden ende tilsluttet en skade site til potentielt drive neurale migration og repopulate område på en afmålt måde.

Efter transplantation protokol optimering, kan teknikken forbedres i andre områder. Mikro-kolonner kan være fremstillet specifikt med umodne astrocytter (fx radial glia, RMS-type celler) eller modne fænotyper, der er senere dedifferentiated til at forøge disse konstruktioner⁴⁹regenerativ-inducerende kapacitet. I in vitro- modeller af glial arret, har modne astrocytter ikke haft mulighed for at danne stier, axon udvækst⁷¹. Derimod har umodne astrocytter vist sig at fremme neurite udvækst i vitro cytoskeletale regenerering og vivo når transplanterede samtidig med chondroitinase ABC til at imødegå de høje niveauer af CSPGs i glial ar^{71 , 72}. for at falde sammen med fremkomsten af personlig medicin, autolog astrocytic mikro-kolonner kan udvikles ved såning stamceller fra kilder såsom inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) og menneskelige neurale stamceller (hNSCs). Denne ændring vil tillade disse stilladser til at fungere som kanaler for individualiseret og specifikke pathway reparation og regeneration. Desuden brug af disse celle kilder kan omgå muligt immunogen svar at astrocyte implantation kunne forårsage. Selvom immunogenicitet afviger ifølge iPSC cellelinjer, er disse celler teoretisk set i stand til at afværge eller aftagende immunrespons ved transplantation, som foreslået af fraværet af skadelige svar efter iPSC-afledte orgel implantation i mus^73,74. Derudover undertrykke autologe hNSCs og derivater deraf astrocytic allogene immunrespons⁷⁵. Derfor justeret opdigte disse astrocyte netværk med autolog stamceller kan være en kritisk fremtid skridt at gøre denne teknik mere umiddelbart gældende i de kliniske omgivelser.

Bortset fra anvendelse som kanaler for CNS reparation og regeneration kan astrocytic levende stilladser bruges som in vitro- test-senge, med eller uden hydrogel encasement baseret på målene for et bestemt testning paradigme. For eksempel, kan disse astrocytic konstruktioner bruges til at undersøge neurobiologiske fænomener som neuron migration og neurite forlængelse medieret af astrocytter, at udnytte de kontrollerbare egenskaber og 3D-miljø af levende stilladser som modeller for i vivo betingelser. Protokollen drøftet i dette manuskript detaljerede fabrikation af selvsamlede justeret astrocytic bundter i en kollagen matrix i en hydrogel mikro-kolonne. Af recapitulating funktioner i hjernen Neuroanatomi, udviklingsmæssige/regenerativ mekanismer og neuroblast migration veje, har disse implantable astrocytic stilladser potentialet til at tilbyde støttende veje for instrueret neurale migration og axon vejledning i den ellers hæmmende miljø af den beskadigede CNS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).