Tredimensjonale vev utvikling justert astrocytter nettverk å Recapitulate utviklingsmessige mekanismer og tilrettelegge nervesystemet gjenfødelse

Summary

Vi presentere utviklingen av selv montert, tredimensjonal bunter av langs justert astrocytic somata og prosesser i en roman biomateriale encasement. Disse konstruert "levende stillaser", viser mikron skala diameter men utvide centimetere i lengde, kan tjene som test senger å studere neurodevelopmental mekanismer eller lette neuroregeneration av dirigere neuronal overføringen og/eller axonal pathfinding.

Abstract

Biografiske filmer og neurodegenerative sykdom ofte føre til varig nevrologiske underskudd på grunn av den begrensede kapasiteten på sentralnervesystemet (CNS) å erstatte tapt nevroner og regenerere axonal trasé. Men under nervesystemet utvikling, neuronal migrasjon og axonal forlengelsen ofte oppstå langs stier dannet av andre celler, referert til som "levende stillaser". Søker å etterligne disse mekanismene og å utforme en strategi som omgår hemmende miljøet i CNS, dette manuskriptet presenterer en protokoll for å dikte vev utvikling astrocytter-baserte "levende stillaser". For å opprette disse konstruksjoner, ansatt vi en roman biomateriale encasement ordningen å indusere astrocyttene selv sette sammen i tett tredimensjonale bunter av bipolar langs alliansefrie somata og prosesser. Første, hul hydrogel mikro-kolonner ble samlet, og den indre lumen var belagt med kollagen ekstracellulær matrix. Dissosiert cerebral kortikale astrocyttene leverte deretter inn lumen sylindriske mikro-kolonnen og ved kritiske indre diameter < 350 µm, spontant selv justert og å produsere lenge fiber-lignende kabler som består av tett bunter astrocytter prosesser og kollagen fibrils måle < 150 µm i diameter men utvide flere cm i lengde. Dette utviklet levende stillaser utstilt > 97% celle levedyktighet og var nesten utelukkende består av astrocyttene uttrykke en kombinasjon av intermediære proteiner glial-fibrillary Sure protein (GFAP), vimentin, og nestin. Dette justert astrocytter nettverk ble funnet for å gi en ettergivende substrat for neuronal vedlegg og justert neurite forlengelsen. Videre opprettholde disse konstruerer integritet og justering når utvunnet fra hydrogel encasement, gjør dem egnede til CNS implantasjon. Disse preformed konstruerer strukturelt etterligne nøkkel cytoarchitectural elementer av naturlig forekommende glial-baserte "levende stillaser" i vivo. Som sådan, kan disse utviklet levende stillaser tjene som test senger å studere neurodevelopmental mekanismer i vitro eller rette neuroregeneration leder neuronal overføring og/eller axonal pathfinding etter CNS degenerasjon i vivo .

Introduction

Sentralnervesystemet (CNS) har begrenset kapasitet å motvirke tap og/eller dysfunksjon av nevroner og axonal trasé som følger forhold som traumatisk hjerneskade (TBI), hjerneslag, ryggmarg skade (SCI) og nevrodegenerative sykdommer^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenesis i CNS er begrenset til et begrenset antall områder i hjernen, hindrer restaurering av tapt neurons^6,7. I tillegg er regenerering av tapt axonal stier i CNS utilstrekkelig mangel på regissert veiledning, utvekst hemmere, og reaktive astrogliosis etter skaden til nevrale vev^{2,8, 9,10}. Astrocyttene vanligvis har forskjellige funksjoner i å hjelpe neurons med ion homeostase, nevrotransmitter klaring, synapse dannelse og nevrovaskulære kopling¹¹. Likevel etter selv mild skade på neural vev, kan astrocyttene gjennomgå molekylær strukturelle og funksjonelle endringer som de overgang til en hypertrofisk stat¹¹. I respons til alvorlige Biografiske filmer føre disse endringene til dannelsen av et arr med en penumbra som inneholder migrere reaktive astrocyttene og en lesjon kjerne som inneholder leukocytter lekkasje fra den sprukket blod - hjerne barrieren (BBB), microglia, oligodendrocytes og fibroblaster^11,12,13. Disse reaktive astrocyttene oppnå en morfologi av trådformede, uorganisert prosesser og utstillingen økt uttrykk for intermediære proteiner og chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs), som hindrer nevronal regenerasjon¹². Selv om glial arret hjelper først gjenopprette BBB integriteten og unngå overføring av inflammatorisk reaksjon på omkringliggende sunt vev, fungerer det som en fysisk og biokjemiske barriere mot axon gjenfødelse^{12,14 ,15,16}. For eksempel axons støte glial arret vise oppsvulmede dystrophic veksten kjeglene og forkrøplet vekst¹². Videre hindrer disorganization av astrocytic prosesser etter skade utvidelse av regenererende axons¹⁷. Utfallet av disse inhibitoriske egenskaper er manifestert i de ofte permanente fysiske og nevrologiske impairments at pasienter lider etter alvorlig Biografiske filmer, inkludert TBI og SCI.

Uansett ytre utfordringer funksjonelle gjenfødelse CNS, vist axons seg å ha en iboende evne til å regenerere. For eksempel antyder dynamikken i dystrophic veksten kjeglene i kontakt med den glial arr at disse avslutninger beholde evnen til å utvide¹². Derfor er det antatt at en viktigste hindring axonal re-veksten er hemmende miljøet etter skade CNS og det gir en mer ettergivende miljøet via redusere glial arrdannelse og/eller gir regenerativ broer over arret ville være fordelaktig. Faktisk har tidligere studier vist at CNS neurons var i stand til å utvide axons gjennom en leksjonen bruker eksterne nerve grafts som broer, som viser et gunstigere miljø for axon gjenfødelse^{12,18, 19}. Flere andre strategier har vært forfulgt for å utnytte denne vestigial regenerativ kapasiteten. For eksempel har manipulering av celle vekst signalveier i ulike skader modeller resultert i axonal regenerasjon og glial arr reduksjon^10,20,21. I tillegg har studier vist at behandling med chondroitinase ABC, som innstiftet flertallet av sukker kjedene i CSPGs, reduserer den hemmende effekten av CSPGs skilles ut av reaktive astrocyttene²². Til tross for oppmuntrende resultater, disse gir ikke rettet veiledning av veksten kjeglene, som kan føre avvikende gjenfødelse¹², og også ikke gjøre rede for tap av neurons. Celle-baserte tilnærminger har vært benyttet i forsøk på å overvinne effekten av glial arret og fylle tapt celler, spesielt neurons. Noen grupper har dedifferentiated reaktive astrocyttene i neurons, mens andre har transplantert nevrale stamceller i CNS lesjoner å gjenbefolke skade området og fremme axon gjenfødelse^{23,24, 25}. imidlertid stamcelletransplantasjon alene er begrenset av lav overlevelse, dårlig integrering og beskjeden oppbevaring i skadet vev⁵. Videre disse cellebasert strategiene ikke gjenopprette langdistanseløpet axonal traktater, spesielt på en kontrollert måte. Derfor biologisk materiale i kombinasjon med andre tilnærminger blir vurdert som levering biler for ulike nevrale og stamfar celler og vekst faktorer²⁶. Biomateriale tilnærminger har en høy grad av kontroll for skjemautforming å produsere konstruksjoner som etterligner den bestemte fysiske, haptotaxic og chemotaxic signaler til stede i den tredimensjonale (3D) microenvironment målet vert vev^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduksjon av disse Miljøsignaler er avgjørende for transplantert celler presentere native-lignende morfologi, spredning, migrasjon og signalnettverk, blant andre nevrobiologiske egenskaper²⁹. Til tross for disse fordelaktige egenskaper kreves fremme utover tradisjonelle celle seeded biomateriale stillaser samtidig fremme regissert langdistanseløpet axonal foryngelse og erstatte tapt neurons.

En lovende alternativ tilnærming er basert på neural vev utvikling "levende stillaser", som er atskilt fra andre celle-baserte tilnærminger av levende neural celler med en preformed cytoarchitecture som emulerer innfødt nevroanatomi og/eller utviklingsmessige mekanismer for å lette målrettet erstatning, rekonstruksjon og regenerering av nevrale kretser^4,35. Betraktninger for design av levende stillaser inkluderer fenotyper og kilder av neural celler, i tillegg til egenskapene mekanisk/fysisk og biokjemiske signalene diktert av sammensetningen av eventuelle medfølgende biologisk materiale³⁵. Etter fabrikasjon i vitro, disse levende stillaser kan være implantert i vivo til stede celle adhesjon molekyler og chemotactic og nevrotropisk signaler å aktivt regulere nevrale celle migrasjon og axon utvekst avhengig tilstand og progresjon av regenererende behandler³⁵. Gliacellene kan tjene som grunnlag for den foretatt cytoarchitecture av levende stillaser siden disse cellene megle ulike utviklingsmessige mekanismer i vivo. Under hjernens utvikling stole nye nerveceller på basale prosesser forlenget med radial glia fra sonen ventrikkel mot utvikle kortikale platen som levende stillaser for rettet migrasjon^36,37. Videre utvide veksten kjeglene er vist å orientere seg ved sensing attraktive og frastøtende signaler brakt frem av glial guidepost celler og såkalte "banebrytende" axons foreslås for å nå de riktige målene ved å utvide langs pre mønstret glial stillaser^35,38,39. Dermed gliacellene er nødvendig for veiledning av banebrytende axons, som senere tjene som axon-baserte "levende stillaser" til direkte projeksjon av "følger" axons. Videre glia-mediert vekst mekanismer har vist å vedvare fødselen, som neuroblasts følger rostral trekkfugler (RMS) å navigere fra de subventricular sonen (SVZ), en av de få gjenværende områdene av neurogenesis i voksen hjernen, den Luktelappen (SR)⁴⁰. Disse neuroblasts i RMS overføre innen glial røret (figur 1A-1), som består av langs alliansefrie astrocytic prosesser, via direkte celle-celle adhesjon og lokalisert løselig faktorer^{37, 41}. til slutt, mens CNS skade i pattedyr årsaker forstyrret astrocytic prosess ordning danner et glial arr som fysisk hindrer axonal gjenfødelse¹⁷, mange ikke-pattedyr systemer mangler dannelsen av et ødeleggende glial arr. Snarere opprettholde gliacellene av ikke-pattedyr mer organisert, justert mønstre som brukes som støttelinjer gjennom skadet område^17,42,43. I ikke-pattedyr SCI modeller vises for eksempel axons å vokse i nært samarbeid med glial broer krysser lesjonen, antyder en viktig rolle for organisert glial stillaser som underlag tilrettelegge axonal regenerasjon og funksjonelle utvinning ( Figur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulation av funksjonene nevroanatomi og utviklingsmessige/regenerativ mekanismene beskrevet ovenfor kan gi en ny klasse av utviklet glial-baserte levende stillaser som kan samtidig kjøre umodne neuronal migrasjon og axonal pathfinding gjennom ellers uten tillatelse miljøer, og dermed potensielt begrensende effekten av neuronal og axon tarmkanalen degenerasjon knyttet til CNS skader og sykdom.

Vår forskningsgruppe har tidligere utviklet flere typer levende stillaser gjenoppbygging og regenerering av axonal landområder i CNS og det perifere nervesystemet (PNS) via micro-vev konstruert neural nettverk (mikro-TNS) og vev konstruert nerve grafts (TENGs), henholdsvis^27,46,47,48. Begge strategier er iboende basert på biomimicry. Mikro-TNS er anatomisk-inspirerte strukturer for strukturelt og funksjonelt erstatte axonal områder kobler forskjellige neuronal bestander av hjernen. TENGs utnytte utviklingsmessige mekanisme axon-tilrettelagt axonal gjenfødelse, eksemplifisert ved "følger" axon vekst langs "pioneer" axons, å oppnå målrettet vert axonal gjenfødelse^35,46,48. Vi nylig kapitalisert på allsidigheten av levende stillaset teknikken bruker en lignende encasement ordningen som mikro-TNS og søker inspirasjon fra glia-basert mekanismer tilstede gjennom utvikling. Her utviklet vi konstruksjoner bestående av justert astrocytic pakker som dekker den collagenous lumen av en hydrogel mikro-kolonne⁴⁹. Disse astrocytic levende stillaser utvikles ved først å fylle en kapillær tube-akupunktur nål montering med flytende agarose for å opprette en hul sylindriske hydrogel med ytre diameter (OD) og indre diameter (ID) tilsvarer diameter på den rør og nål, henholdsvis. Etter agarose gelation og utvinning av hydrogel mikro-kolonnen fra kapillarrør, hul interiøret er belagt med type jeg kollagen å levere et miljø ettergivende for astrocytter vedheft og justert bunt dannelse (figur 1B -1). Etterpå er lumen plantet med cerebral kortikale astrocyttene isolert fra postnatal rotte unger (figur 1B-2). I motsetning til todimensjonal (2D) justering teknikker som stoler på bruk av elektrisk felt, micropatterned spor og ekstracellulær matrix (EFM) protein mønstre, astrocytter justering i levende stillaset bygger teknikken på selvstendig montering Ifølge kontrollerbar variabler som substrat kurvatur (kolonnen ID), cellen tetthet og kollagen konsentrasjon^50,51,52. Astrocyttene kontrakt og renovere kollagen, og skaffe en bipolar, langs alliansefrie morfologi analoge til naturlige stillasene observert i vivo (figur 1B-3). Ja, vi aktivt arbeider bruk av disse kabel-lignende strukturer som fysisk substrater for målrettet veiledning av migrere umodne nerveceller som axonal gjenfødelse gjennom ugunstige miljøet av skadde CNS spesielt pattedyr glial arret (figur 1 c). Denne artikkelen vil presentere metoden detaljert fabrikasjon for astrocytic mikro-kolonnene, fase kontrast og immunofluorescence bilder av den forventede cytoarchitecture og en omfattende diskusjon om de nåværende begrensningene og fremtidige retninger av den teknikk.

Figur 1: inspirasjon, fabrikasjon protokollen og foreslåtte programmer for justert Astrocytic nettverkene. (A) nevrobiologiske inspirasjon: (1) Neuroblasts fra neurogenic subventricular sonen (SVZ) bruker glial langs linje røret i rostral vandrende stream (RMS) for regisserte migrering mot olfactory pære (SR); (2) ikke-pattedyr som amfibier og fisk kan opprettholde regenerering etter nevrale vev skade delvis på grunn av dannelsen av en glial bro som kobler endene av en leksjonen (f.eks transected ryggmargen), og fungerer som et stillas for veiledning av regenererer axons. (B) fabrikasjon Oversikt: (1) bygging av en mikron-størrelse, hul hydrogel mikro-kolonne med lumen belagt med ECM, (2) såing av primære kortikale astrocyttene isolert fra postnatal rotte unger, (3) selvstendig montering av langs-orientert pakker i kultur, og (4) utvinning av bunt fra biomateriale encasement for fremtidige implantasjon studier. (C) i vivo programmer: (1) disse levende stillaser kan tjene som utviklet glial rør rettet Nevron overføring fra neurogenic sentre å gjenbefolke Nevron dårlig regioner. (2) recapitulation av utviklingsmessige mekanisme banebrytende axon veiledning og regenererende mekanisme glial broer i ikke-pattedyr kan gi gave disse astrocytic stillaser kapasitet til å direkte axon gjenfødelse over den uten tillatelse miljøet i pattedyr glial arret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer på University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center og overholder retningslinjene i policyen NIH Public Health Service på Human Omsorg og bruk av forsøksdyr (2015).

1. utviklingen av Agarose Hydrogel mikro-kolonnene

1. Gjøre en agarose 3% vekt/volum (w/v) løsning ved veiing 3 g av agarose og overføre den til et sterilt beaker som inneholder 100 mL Dulbeccos fosfat bufret saltvann (DPBS). Legge til en steril magnetiske bar begeret, og plasser den på overflaten av en kokeplate/rørestang. Holde begeret dekket for å hindre fordampning innholdet i neste trinn.
2. Agarose og DPBS ved en temperatur på 100 ° C og rør på 60-120 rpm. Justere disse innstillingene etter behov, og overvåker konstant utviklingen av oppløsning prosessen løsningen skifter opprinnelig fra ugjennomsiktig til en klar utseende som betyr at agarose har blitt fullstendig oppløst.
   Forsiktig: Hot begeret og løsningen er hot!
3. Som den agarose løsningen er oppvarmet og rørt, hente fire tomme 10 cm Petri retter og legge til 20 mL DPBS to av dem. Plassere Akupunkturnåler (diameter: 300 µm, lengde: 40 mm), glass mikroliter kapillær rør (diameter: 701.04 µm, lengde: 65 mm, kapasitet: 25.0 µL), og en pære dispenser inne biosikkerhet kabinett. Når flytende agarose løsningen forsvinner ut, opprettholde konstant varme på ca 50 ° C og stirring for å unngå gelation av agarose.
4. Innføre en akupunkturnål i bunnen åpningen av en pære dispenser. Sett inn en kapillær rør over nålen eksponert på utsiden. Sikre kapillarrør ved å skrive inn deler av den til delen gummi pære dispenser sylinderen.
5. Overføre 1 mL av flytende agarose med brønnene på overflaten av en tom Petriskål og plasser den ene enden av kapillær røret vertikalt (med nålen settes inn) i kontakt med agarose, mens gummi hetten pære dispenseren er å være klemt innover. Langsomt slippe ut trykket på pære dispenser cap å trekke agarose i kapillarrør.
   Merk: Overføring av flytende agarose i kapillær rør må utføres raskt. Hvis den flytende agarose står avkjøles på Petriskål overflaten for tilstrekkelig tid (ca. 60 s), det begynner å gel, forebygge egnet utsuging av agarose langs kapillarrør.
6. Sted hver pære-tube-nål montering i en gratis Petriskål, og la agarose gel i kapillær rørene stivner for 5 min. trekk forsiktig kapillær røret med hendene ut av gummipropp i pære dispenser sylinderen, forlater nålen og agarose gel på plass inne i røret.
7. Pakke ut akupunktur nålen manuelt ved å trekke det sakte ut av kapillær slangen; nylig befestet agarose sylinderen også glir ut av røret i denne prosedyren, fortsatt rundt nålen. Forsiktig skyve mikro-kolonnen langs akupunktur nålen med spissen av sterile tang flytte det til slutten. Plasser nålen over et åpent, DPBS inneholder Petriskål og presse mikro-kolonnen i DPBS med tang.
   Merk: Hvis agarose mikro-kolonnen forblir i kapillær glassrør på fjerning av akupunktur nålen, sakte skyve agarose mikro-kolonnen av kapillær røret med en 25 mm gauge nål og inn parabolen med DPBS.
8. Sterilisere microscalpels eller benytter en hot perle sterilisere tang. Gjør 4% w/v agarose ved veiing 4 g av agarose og overføre det til 100 mL DPBS. Varmen og rør som forklart i trinn 1.2 å få en klar 4% flytende agarose løsning. Opprettholde oppvarming og omrøring løsningen gjennom følgende trinn.
9. Overføre Petri retter som inneholder micro-kolonnene til disseksjon hette og flytte en mikro-kolonne med fine tang til en tom Petriskål. Bruk stereoscope for visuell veiledning og en microscalpel å kutte mikro-kolonnene til ønsket lengde. Trim begge ender til skjemaet skrå ender på 45^o vinkler fra horisontal å lette håndteringen av mikro-kolonnene under ECM og celle tillegg.
10. Gjenta forrige trinn for tre mikro-kolonner i samme Petriskål og linje opp fire sammensetningene parallelt med en separasjon av < 3 mm mellom hver av sylindere. Laste 50 µL av 4% agarose løsning med brønnene og hell en strek/linje av væske over mikro-kolonne matrisen koble og pakke konstruksjoner i grupper på fire (heretter kalt "mikro-kolonne båter"). Unngå bevegelse av 4% agarose til endene av mikro-kolonnene, som kan tette interiøret, ved å minimere avstanden mellom konstruerer og legge agarose raskt i en tynn linje.
    Merk: Ordne grupper med fire mikro-kolonner i "båter" er ikke nødvendig å dikte astrocytic stillasene. Likevel tjene båtene å fremskynde fabrikasjon prosessen og tilby en tryggere måte å flytte og håndtere mikro-kolonner i senere trinn.
11. Avkjøl mikro-kolonne båt i 1-2 min til å tillate gelation av den ekstra 4% agarose. Plukke opp mikro-kolonne båten med fine tang ved koble 4% agarose, og flytte mikro-kolonnene til andre DPBS inneholder Petriskål forberedt i trinn 1.1.3. Dikte mer båter med de gjenværende mikro-kolonnene som ønsket.
12. Flytt Petri retter som inneholder micro-kolonnene eller båter en biosafety skap og sterilisere med eksponering for ultrafiolett (UV) lys i 30 min.
    Forsiktig: Bruk passende beskyttelse for å hindre eksponering for UV.
13. Lagre retter med mikro-kolonne båtene i DPBS på 4 ° C, hvis ECM tillegg og celle plating ikke vil skje umiddelbart etterpå til 1 uke. Gjenta mikro-kolonne fabrikasjon trinnene hvis sammensetningene ikke brukes i løpet av dette tidsrommet.

2. primære celle kultur og isolering

1. Kortikale astrocytter isolasjon fra rotte unger
   1. I forberedelsene til følgende, kan du legge til 20 mL Hanks balansert salt løsning (HBSS) til fire 10 cm Petri retter som skal fungere som reservoarer for dissekert vev. Holde alle rettene på is. Sterilisere ren kirurgisk saks, pinsett, mikro-spatel og mikro-skalpeller i en varm perle sterilisere.
   2. Prewarm 0,25% trypsin med 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og 0,15 mg/mL deoxyribonuclease (DNase) I HBSS på 37 ° C. I tillegg prewarm astrocytter kultur medium ved 37 ° C, som består av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med Ham F-12 næringsstoff blanding og 10% fosterets bovin serum (FBS).
   3. Bedøve postnatal dag 0 eller dag 1 Sprague-Dawley rotte unger ved å utsette dem til hypothermic forhold, og euthanize ved halshogging. PIN hodet i en scene med en 19 mm måle pinne i snuten anterior øynene.
   4. Lage et snitt med skalpell ned midten bakenfor fremre, fra bunnen av halsen opp til like bak øynene. Utføre en annen snitt går lateralt fra direkte bak øynene nedover, danner en T-Form. Bruk fine tang til å trekke skallen hud/skallen av til siden.
   5. Hold hodet snuten (vender) ved å plassere en spissen av tang i munnen på dyret og den andre på overflaten. Fjern hjernen med et sterilt mikro-spatel og plasserer den i en av Petri retter fylt med avkjølt HBSS. Sted denne Petriskål på is ganger umiddelbart etterpå og hele bortsett fra når du er i bruk.
   6. Plassere en granitt blokk tidligere lagret på 20 ° C under en stereoscope i disseksjon hette. Plass Petriskål med hjernevev på overflaten av granitt blokken beholde sin lave temperaturer under disseksjon prosedyren. Bruk av stereoscope som visuell veiledning gjennom følgende trinn.
   7. Hvis olfactory pærene forblir intakt, trekke dem ved å skjære tang eller microscalpels. I tillegg bruk en microscalpel å fjerne lillehjernen og gjøre en midtlinjen snitt skille de to cerebrale hemisfærene. Overføre halvkuler med tang til en Petriskål med friskt, kaldt HBSS.
   8. Dissekere mellomhjernen strukturer fra innsiden av halvkuler med en microscalpel å få bare de separerte halvdelene. Bruke fine tang løsner meninges, en som struktur, fra kortikale vevet og overføre de isolerte halvdelene til en ny Petriskål med kaldt HBSS. Bruk microscalpel for å hakke vev for å øke arealet for trypsin handling i neste trinn.
   9. Bruke en Pasteur pipette for å overføre halvdelene slik 15 mL sentrifuge med 4 mL prewarmed trypsin-EDTA (8 halvdelene i hver retning). Utsette kortikale vevet til trypsin-EDTA i 5-7 min på 37 ° C.
   10. Med en Pasteur pipette, nøye fjerne trypsin-EDTA og legge til 400 µl 0,15 mg/ml DNAse jeg løsningen til sentrifuge røret. Agitere rør eller vortex til alle vev er atskilt og det er ingen gjenværende vev stykker i væsken. Hvis det ikke er mulig å løse vevet, fjerne de gjenværende fragmentene med spissen av en Pasteur pipette.
   11. Sentrifuger røret som inneholder dissosiert celle løsningen på 200 x g for 3 min. fjerne nedbryting med en Pasteur pipette uten å forstyrre cellene. Legg 1 mL av astrocytter kultur medium (definert i trinn 2.1.2) til røret med brønnene og agitere resuspend og opprette en homogen løsning.
   12. Overfør 10 mL av astrocytter kultur medium med en serologisk pipette til en T-75 kolbe. Legge til 250 µl av 1 mL celle løsningen (forberedt i trinn 2.1.11) brønnene med kolbe til plate én pup hjerne verdt celler per kolbe. Distribuere utladet celle løsningen jevnt over kultur medium og forsiktig agitere flasken for å fremme en jevn distribusjon.
   13. Kultur i belagt flasker i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO₂. Etter å ha nådd 24 og 72 h i kultur, mekanisk agitere flasken for å koble fra ikke-tilhenger celletyper, for eksempel neurons og oligodendrocytes.
   14. Etterpå på hver av disse timepoints, utføre en media-endring. Hold flasken loddrett så kultur media ligger på bunnen av flasken, ikke dekker adhered cellene. Sug opp kultur medium med en Pasteur pipette, trykke spissen av pipette mot nederst i kolbe å unngå utpakking cellene. Plasser kolbe i den opprinnelige vannrette posisjonen og forsiktig legge 10 mL av astrocytter medium over cellene med en serologisk pipette.
   15. Tilbake i flasker til inkubator etter hver media endring. Etter 90% confluency er oppnådd, mekanisk agitere kolbe igjen for å fjerne gjenværende ikke-følge celler.
   16. Passasje av astrocyttene ved å ta ut kultur medium med et vakuum og en Pasteur pipette. Legge til 5 mL av 0,25% trypsin-EDTA med en serologisk pipette over de adhered cellene. Forsiktig agitere flasken for å sikre trypsin dekker alle cellene, og ruge kolbe i 5-7 min på 37 ° C og 5% CO₂.
   17. Slukke trypsin ved å legge til 1 mL av astrocytter medium cellene med en serologisk pipette. Ekstra cellen løsningen fra flasken en serologisk pipette og overføre den til et sterilt 15 mL sentrifuge rør. Sentrifuge røret på 200 x g i 3 minutter.
   18. Fjern nedbryting med en serologisk pipette og resuspend det i 1 mL av astrocytter kultur medium. Agitere røret slik celle løsningen er homogen. Tell antall celler i løsningen med en hemocytometer eller en automatisk celle teller.
       Merk: En kolbe som er 90% confluent vanligvis gir ca 3 millioner astrocyttene.
   19. Legge til 10 mL astrocytter kultur medium i en T-75 kolbe. Utføre en 1:4 fortynning ved å overføre 250 µl av cellen løsningen (trinn 2.1.18) brønnene med til T-75 kolbe allerede inneholder kultur medium. Forsiktig Kaishek for å sikre en homogen celle distribusjon over hele overflaten av flasken.
   20. Gjenta trinn 2.1.16-2.1.19 hver gang 90% confluency er oppnådd for å passasje cellene.
2. Kortikale Nevron isolasjon fra rotte fostre
   1. Følg lignende preparater som trinn 2.1.1 og 2.1.2, med unntak av at prewarmed media er co kultur medier, bestående av Neurobasal medium + 2% B-27 supplement (for nevroner) + 1% G-5 serum uten tillegg (for astrocyttene) + 0,25% L-glutamin.
   2. Euthanize tidsbestemte-gravide embryonale dag 18 Sprague-Dawley rotter med karbondioksid kvelning og Bekreft døden ved halshogging.
   3. Ekstra rotte fostre og dissekere halvdelene fra resten av cerebral vev i Petri retter som inneholder HBSS på overflaten av kjølt granitt blokken, bruker en stereoscope for visuell veiledning og sterilisert saks, microscalpel og tang⁵³ . Etter den påfølgende Disseksjon av hodene overføre hjerner og cerebrale hemisfærer halvdelene, hvert vev til en ny HBSS-fylt Petriskål.
   4. Hakke kortikale vevet i mindre fragmenter å øke arealet for trypsin. Overføring 4-6 halvdelene med en Pasteur Pipetter slik med 5 mL prewarmed trypsin-EDTA og vedlikeholde på 37 ° C til å distansere vevet. 5-7 minutter manuelt agitere røret for å mikse og hindre clumping av vev.
   5. Fjerne røret fra 37 ° C etter 10 min. Som forklart tidligere i trinn 2.1, ekstra trypsin-EDTA og erstatte med 1,8 mL 0,15 mg/mL DNAse løsning. Etterpå vortex vevet til løsningen vises homogen, med noen vev fragmenter flyter i væske.
   6. Sentrifuge dissosiert vev løsningen på 200 x g i 3 minutter. Etter fjerner nedbryting, resuspend i 2 mL co kultur medium. Tell antall celler i denne løsningen med en hemocytometer eller en automatisk celle teller.
      Merk: Vanlige avkastningen er 3.0-5.0 x 10⁶ celler/kortikale halvkule.
   7. Forberede en ny cellen løsning med en tetthet av 2.0-4.0 x 10⁵ celler/mL i co kultur media definert ovenfor.

3. utvikling av Astrocytic kabler i mikro-spaltene

1. ECM kjernen fabrikasjon
   Merk: ECM har legges til indre av hydrogel mikro-kolonnene på samme dag som cellen seeding utføres.
   1. Inne en biosafety skap, forberede en 1 mg/mL løsningen av rotte hale skriver jeg kollagen i co kultur medium i et sterilt microcentrifuge rør. Opprettholde microcentrifuge røret med ECM løsning på is hele tiden unntatt når i bruk.
   2. Overføre 1-2 µL av ECM løsningen med brønnene på en stripe av lakmus papir å beregne sine pH. Legg 1 µL 1 N natriumhydroksid (NaOH) eller saltsyre (HCl) med brønnene å øke eller redusere pH av ECM løsningen, henholdsvis, og Pipetter opp og ned for å homogenize. Bekrefte ny pH med en lakmus papir stripe og legge mer syre eller base, behov til pH er stabil i området 7.2-7.4.
   3. Flytt Petri retter fra trinn 1.2 til disseksjon hette, og overføre 4-5 mikro-kolonner eller båt med sterilt fine tang til en tom, sterile 35 eller 60 mm Petriskål. Bruker stereoscope for veiledning, plassere 10 µL spissen av brønnene i enden av hver mikro-kolonne og sug tømme lumen DPBS og air bobler. Bekreft fravær av luftbobler med stereoscope å sikre at ECM lagt i neste trinn kan flyte fritt over lumen.
   4. Belaste P10 brønnene med ECM løsning, det 10 µL tips mot en ende av hydrogel mikro-kolonnene og levere nok løsning for å fylle lumen (ca 3-5 µL), observere oppføringen av ECM med stereoscope. Pipetter et lite reservoar (2-4 µL) av ECM løsning på hver ende av mikro-kolonnen.
      Merk: Behandle alltid 4-5 mikro-kolonner eller en båt for å hindre langvarig tørke av sammensetningene, da dette kan føre til crumpling av mikro-kolonne. Helt tørket mikro-kolonner feste på overflaten av Petri retter, som forhindrer utnyttelse for cellen seeding. Store mengder av co kultur medier (som hydrering mål) kan ikke legges til mikro-kolonnene fordi dette medfører ECM å strømme ut under inkubasjonstiden beskrevet nedenfor.
   5. Pipetter co kultur medier i en ring rundt Petriskål å gi fuktighet vask for å hindre kolonnene tørker ut under inkubasjon. Inkuber Petriskål inneholder ECM inneholder mikro-kolonnene på 37 ° C og 5% CO₂ 1t å fremme polymerisering av kollagen før du legger til neurons og/eller astrocyttene.
      Merk: ECM bør danne et lag belegg indre overflaten av den hule lumen, snarere enn en solid ECM kjerne omfatter interiøret, begge kan observeres ved hjelp av stereoscope. Hvis ECM danner en kjerne, Fortsett inkubasjonstiden til bare laget er igjen. Med dette laget dannet, kan astrocytter cell løsningen fylle innsiden av mikro-kolonnen i punktene plating.
   6. Under inkubasjonstiden, forberede astrocytter cell løsningen (som beskrevet nedenfor).
2. Astrocytter og Nevron Seeding i mikro-kolonnene
   1. Passasje belagt astrocyttene (mellom fjerde og tolvte passering) som forklart i fremgangsmåten 2.1.16-2.1.19. Etter å telle antall celler i flasken, forberede cell løsningen på en tetthet 9.0-12,0 x 10⁵ celler/mL løsning suspendert i celle-kultur medier.
   2. Bruker en stereoscope, plassere P10 brønnene i enden av mikro-kolonnene, og overføre tilstrekkelig celle løsning (~ 5 µL) til lumen til å fylle den. Som ferdig over med ECM, legge liten reservoarer av cell løsningen til begge ender av hver mikro-kolonne.
   3. Inkuber belagt mikro-kolonnene i Petri retter på 37 ° C og 5% CO₂ 1t å fremme feste astrocyttene til ECM. Hvis neurons ikke legges til mikro-kolonner, fortsetter du til trinn 3.2.5.
   4. Etter innledende inkubasjonstiden, legge til 1-2 µL kortikale Nevron løsning oppnås i trinn 2.2.7 i begge ender av mikro-kolonnene med brønnene, mens observere under stereoscope. Kontroller at tilstrekkelig media finnes i retter å unngå tørking, og ruge igjen for 40 min på 37 ° C og 5% CO₂ å tillate vedheft av neurons.
      Merk: Kortikale Nevron løsning kan også legges 1-2 dager etter bunt formasjon, grepet 3.2.4 etter nøye fjerne kultur media fra Petriskål brønnene med.
   5. Etter inkubering periode, nøye fylle Petri retter som inneholder belagt mikro-kolonnene med 3 eller 6 mL co kultur medier for 35 eller 60 mm Petri retter, henholdsvis. Opprettholde belagt mikro-kolonnene i kultur på 37 ° C og 5% CO₂ å fremme den selv-montering av justert astrocytic bunter, som bør danne en samlet, kabel-lignende struktur etter 6-10 h.
3. Stabilisering av astrocytter kabel arkitektur
   Merk: Etter dannelsen av pakker, ca 6-12 h dyrking konstruerer, følger du denne fremgangsmåten for å hindre kollaps av justert astrocytic stillasene.
   1. I et sterilt microcentrifuge rør, forbereder en 3 mg/mL rotte hale kollagen jeg løsningen i co kultur medier. Justere pH av løsningen på 7,2-7.4 følge fremgangsmåten i trinn 3.1.2. Opprettholde kollagen lager og co kultur media på is når den ikke er i bruk, og plasser forberedt kollagen løsningen på is til alle tider.
   2. Fjern utskriftsmaterialet fra Petri retter som inneholder astrocytic stillasene brønnene, etterlot noen medier på sidene av retten til å opprette en fuktighet vask som sikrer hydrering av mikro-kolonnene med. Plass rett under en stereoscope å hjelpe til med visualisering.
   3. Brønnene, med ta 2-3 µL av kollagen løsning og utslipp i hver ende av mikro-kolonnene, bruker stereoscope for visuell veiledning. Kontroller at retten har tilstrekkelig antall medier rundt på sidene som fuktighet vask rundt kantene av retten. Inkuber Petri retter med mikro-kolonnene i 30 min på 37 ° C og 5% CO₂ i en fuktet inkubator å fremme gelation av kollagen som nylig er lagt til.
   4. Sakte legge 3 eller 6 mL av co kultur medier (35 eller 60 mm Petri retter, henholdsvis) til Petri retter med en pipette, og kultur retter i en fuktet inkubator på 37 ^oC og 5% CO₂.

4. utvinning av Astrocytic pakker fra Hydrogel interiøret

1. Sterilisere glass coverslips i en autoklav. Forberede en 20 µg/mL løsning av poly-L-lysine (PLL) i sterilt celle kultur klasse vann.
2. Inne en biosafety skap, manuelt overføre steriliserte glass coverslips til en steril 10 cm Petriskål, og legge tilstrekkelig PLL løsning for å dekke coverslips.
3. Inkuber coverslips, dekket med PLL løsningen, i 30 min på 37 ° C til coat overflaten. Fjerne PLL løsningen med en Pasteur pipette etter 30 min. skyll tre ganger ved å legge til celle kultur klasse vann dekkglassvæske og fjerne den med en Pasteur pipette.
4. Etter dannelsen av justert glial bunt, overføre mikro-kolonnen delikat til et sterilt Petriskål med sterilt fine tang, og legge et lite basseng med 10 µL av co kultur media med brønnene å hindre dehydrering og sikre bunt helse. Pakk ut astrocytic bunt hydrogel mikro-kolonnen ved å trekke forsiktig fra den ene enden med sterilt kirurgisk tang, bruker en stereoscope for visuell veiledning.
5. Holde astrocytic bunt med tang, montere den på en PLL-belagt dekkglassvæske. Fastsette og flekker med protokollen nedenfor.

5. Immunocytochemistry for In Vitro studier

Merk: For denne studien var primære antistoffer kanin anti-glial sur fibrillary protein (GFAP) (1:500), musa anti-β-tubulin III (1:500), kanin anti-kollagen jeg (1:500), musen anti-nestin (1:200) og kanin anti-vimentin (1: 100). Sekundær antistoffer var esel anti-musen 568, esel anti-kanin 568, esel anti-kanin 488 og esel anti-musen 568 (1:500 for alle). Legg nok volum av hver løsning å dekke helt mikro-kolonnene i alle tilfeller.

1. Forberede en 4% volum/volum (v/v) formaldehyd løsning i 1 x DPBS innenfor kjemisk avtrekksvifte.
   FORSIKTIG: formaldehyd er et giftig stoff kjent være kreftfremkallende, og skal behandles i en egen beholder. Alltid manipulere denne forbindelsen i kjemisk avtrekksvifte og benytte personlig verneutstyr (PVU) som laboratoriet frakk, vernebriller og hansker.
2. I tilfelle av mikro-kolonnene, forkaste kultur media fra Petri retter som inneholder konstruksjoner med en Pasteur pipette uten uhell suctioning hydrogel sylindere. Legge til tilstrekkelig formaldehyd løsning å dekke mikro-kolonnene eller montert coverslips (begge forblir Petri retter) og Inkuber for 35 min på 18-24 ° C.
3. Pakk ut 4,0% formaldehyd løsningen fra fast mikro-kolonnene eller coverslips med en serologisk pipette. Skyll fast mikro-kolonnene tre ganger med PBS ved å raskt legge til og fjerne PBS to ganger og deretter la dem nyte for 10 min tredje gang.
4. Løses normal hest serum (NHS) i PBS for en konsentrasjon av 4% v / v. forberede en løsning med ikke-ioniske vaskemiddel i en konsentrasjon av 0,3% v/v bruker NHS løsningen som løsemiddelet.
5. Fjern PBS fra Petri retter som inneholder micro-kolonnene eller coverslips med en pipette. Legg nok 0,3% såpevann for å dekke den mikro-kolonner/coverslips for 60 min på 18-24 ° C til permeabilize cellene.
6. Ta ut de såpevann, og skyll raskt to ganger med PBS og tre ganger av soaking i 5 min. Beregn den nødvendige mengden 4% NHS, og hver av primære antistoffer å forberede en løsning med de ønskede antistoff konsentrasjonene.
7. Fjern PBS fra Petri retter og tilsett nok primære antistoff (fortynnet i 4% NHS-DPBS) løsning mikro-kolonnene eller utdraget astrocytic pakker. Ruge over natten (12-16 h) på 4 ° C.
8. Ta ut den primære antistoff løsningen og skyll raskt to ganger med PBS og tre ganger av soaking i 5 min. Forberede den sekundære antistoff løsningen, i mørket, med hver antistoff tilstede på en fortynning av 1:500 i 4,0% NHS løsning.
9. Inkuber celler med den sekundære antistoff løsningen for 2t på 18-24 ° C. Gjennom hele tiden med inkubering, dekk Petri retter som inneholder micro-kolonnene med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys.
10. Fjern sekundær antistoff løsningen og legge Hoechst løsning (1:10, 000) i 10 minutter ved 18-24 ° C stain kjerner.
    FORSIKTIG: Hoechst er en kjent mutagen som bør behandles som et kreftfremkallende stoff. Derfor det må avhendes i en egen beholder og PPE bør brukes til alle tider når manipulere Denne agenten.
11. Skyll med PBS fem ganger, hver gang i 5-10 min. etterpå, lagre farget mikro-kolonnene på 4 ° C i PBS og dekk med aluminiumsfolie. Hvis montert astrocytic pakker, legge en dråpe av vandig montering medium i gruppen, plasserer en annen glass dekkglassvæske over fast bunt og forsegle både coverslips med neglelakk for langtidslagring og påfølgende bildebehandling.

6. levedyktighet analysen med Live-død (Calcein-AM/ethidium Homodimer) Beising

1. Klargjør reagens løsningen ved å legge til 5 μl calcein AM (4 mM i vannfri dimethyl sulfoxide (DMSO)) og 20 μl ethidium homodimer-1 (EthD-1) (2 mM i DMSO/H₂O 1:4 v/v) 10 mL 1 x DPBS. Dekk løsningen med aluminiumsfolie eller lagre i mørket for å beskytte den mot lyset.
2. Sug opp medier fra Petriskål inneholder belagt mikro-kolonnene med en Pasteur pipette, og legge nok løsning (forberedt ovenfor) for å dekke konstruksjoner. Inkuber i 30 min på 37 ° C og 5% CO₂, holde Petriskål dekket for å beskytte løsningen fra lyset.
3. Fjern løsningen med brønnene eller Pasteur pipette. Skyll 2 - 3 ganger med DPBS som beskrevet i trinn 5.3. Flom Petri retter med DPBS avhengig av parabolen. Bildet celler umiddelbart etterpå med epifluorescence eller AC confocal imaging.
   Merk: Konvertering av den membran-permeable calcein AM til calcein av metabolsk aktive celler gir den grønne fluorescensen av calcein. Døde celler er merket som membran kompromittert celler, som tillater oppføring av EthD-1 i cellen og sin binding til nucleic syrer, forårsaker røde fluorescens.

Representative Results

I utgangspunktet kontrast mikroskopi ble brukt til å overvåke utviklingen av astrocytter vedheft og bundle dannelse og den totale stabiliteten av cytoarchitecture som en funksjon av tid. På 1 time etter plating fant astrocyttene gjennom lumen mikro-kolonnene med en sfærisk morfologi (figur 2A). 5 h, astrocyttene begynte utvide prosesser og entreprenørselskap, mens av 8t celler utstilt en komplett prosess-bærende morfologi og dannet kabel-lignende strukturer orientert langs den langsgående aksen av mikro-kolonnen (figur 2A). Spesielt i forhold til utgangspunktet spredt tilstedeværelsen av celler over mikro-kolonnene, astrocyttene syntes å har kontrakt å danne et nettverk av tett bunter langs interiøret (figur 2B). Etter den første cellejusteringen, astrocytter nettverk ofte trukket sammen med den langsgående aksen, ligner en glidelås lukking, for å danne en tett bunt i midten av mikro-kolonnen (figur 2C). Dannelsen av denne samlet arkitekturen skyldtes en selvstendig montering prosess, delvis diktert av mikro-kolonnen ID og celle tetthet. Astrocyttene justert og kjøpte en bipolar morfologi når seeded i mikro-kolonner med en ID mindre enn 350 µm (finne 3B, øverste og midterste, og 3D-3F)⁴⁹. Tvert imot, disse cellene demonstrert tilfeldig retningen da ID 1 mm ble benyttet (figur 3B, bunnen), som ligner på utseendet av 2D astrocytter kulturer utsatt for serum-free, co kultur medium (figur 3A, høyre). Videre, selv om astrocyttene fortsatt vise justering på lav seeding tettheter (2.0-3.0 x 10⁵ celler/mL eller 2.0-3.0 x 10² celler/mm³) (Figur 3 c), kompakt nettverk dannes bare på de høye tettheter (9.0-12,0 x 10⁵ celler/mL eller 9.0-12,0 x 10² celler/mm³) innenfor sylindriske mikro-kolonner med tilsvarende dimensjoner (sett i figur 3B, topp), som foreslått i protokollen⁴⁹. Levedyktighet i astrocytic pakker ble kvantifisert, med live/dead analysen, som forholdet mellom området med celler fluorescing green (calcein AM) i forhold til det totale området med celler fluorescing grønt (calcein AM) og rødt (EthD-1). Levedyktigheten til astrocytic pakker var 97.4%, som ligner på 98,2% levedyktigheten til 2D astrocytter kultur kontroller (figur 4A-4B), beviser at miljøet i mikro-kolonnene er egnet for astrocytter vitalitet ( Finne 4E). De 3D rekonstruksjoner av levende og døde cellene i astrocytic stillasene viser også de totale cellejusteringen i konstruksjoner (figur 4C-4 D). I tillegg ble svært lang astrocytic mikro-kolonner utviklet for å undersøke stabiliteten i astrocytter pakker med betydelig lengde. Selv i den ekstraordinære avstanden på 3,5 cm, cytoarchitecture av justert, tett og innleide astrocytic pakker var vedvarende konsekvent gjennom hele lengden av mikro-kolonnen (figur 5A), så tydelig i zoome inn regioner i den mikro-kolonner (figur 5B-5 C).

Når dannet, pakker var fast og farget av immunocytochemistry teknikker for intermediære proteiner karakteristisk for gliacellene, som GFAP, nestin og vimentin. AC confocal bildene bekrefter prosessen rentebærende morfologi av astrocyttene og langsgående justering av prosesser (figur 6 og figur 7). Uttrykk for intermediære proteinene kan sees i både 2D astrocytter kulturer (figur 7A) samt astrocytter pakker i mikro-kolonnen (figur 6, figur 7B-7 D). I tillegg bekreftet kollagen flekker tilstedeværelse av dette ECM proteinet i mikro-kolonnene. Astrocyttene ikke danne en sammenhengende struktur med kollagen når kultivert i et 2D-miljø (figur 8A), mens astrocyttene syntes å overholde og renovere kollagen stede i lumen når kultivert i mikro-kolonnene, slik at for celle kontraksjon og bundle formasjonen (figur 8B). Overlapping av GFAP og kollagen kanaler vist at astrocytter kablene besto av tett forbundet prosesser med langsgående kollagenfibre (figur 8B). Derfor, bortsett fra å tilby anchorage, kollagen fibrils kan ha gitt mer retningsbestemt signaler for astrocyttene å danne tett bunter etter sammentrekning. I noen tilfeller faste astrocytter-kollagen sammentrekning, resulterer i en kollaps av justert bunten over 12-24 h etter dannelse (figur 9A). For å stabilisere kabel-lignende astrocytter arkitektur løpet hydrogel mikro-kolonnene, ble ekstra kollagen matrix lagt til endene av en fullt dannet bunt hemme ytterligere sammentrekning og skjule. Dette forsterkning teknikk tillatt for overlevelsen av den ønskede kabel arkitekturen for minst 4 dager, en lengre vindu av stabilitet forventet (figur 9B). Videre var representant astrocytic bunter utvunnet fra hydrogel mikro-kolonnen, montert og fast med 4% formaldehyd på glass coverslips å vurdere sin robusthet utsettes strekk krefter og eksterne miljøet. Selv etter utvinning og fysiske manipulasjon i forskjellige former (figur 10A, 10B), astrocytic somata og prosesser opprettholdt en justert, samlet mikro-skala morfologi (figur 10C), fremhever den toleranse selv justert astrocytic stillaset, en gang var, selv om strukturell støtte av hydrogel mikro-kolonnen er fraværende.

Primære kortikale nevroner var også co kultivert med astrocyttene innenfor mikro-kolonnene å utforske om astrocytter buntene var i stand til å skape neuronal vedheft og neurite utvekst. GFAP og microtubule protein β-tubulin III ble brukt som spesifikke indikatorer for astrocyttene og neurons, henholdsvis. Figur 11A viser at astrocyttene co seeded med kortikale neurons var også viser prosesser og danner justert bunter. Neurons syntes å har overholdt fortrinnsvis astrocytter pakker, siden alle positiv β-tubulin III flekker Co lokalisert med GFAP (overlegg i figur 11B-11 C). For å demonstrere egenskapene regenerativ astrocytic konstruksjoner, kortikale nevroner (figur 12B) var belagt i hydrogel mikro-kolonnen 2 dager etter astrocyttene var belagt (figur 12A). Neurons knyttet til astrocytter bunt, og utvidet neurites langs de astrocytic landområder. Videre inspeksjon viste neurite utvekst orientert i retning av astrocytic kabelen, mens i områder der den astrocytter tarmkanalen ikke var tilstede, neurites ble sett vokser i en uorganisert måte (figur 12C). Disse observasjonene viser at protokollen resulterer i justert og levedyktig og robuste astrocytic nettverk som har potensial til å fungere som implanterbare levende trasé fremme Nevron vedheft og neurite utvekst.

Figur 2: Brightfield mikroskopi viser dannelsen av astrocytter buntene innen Hydrogel mikro-kolonnene over tid. (A) astrocytter morfologi som funksjon etter plating: (1 h) astrocyttene er sfærisk i form og spredt over hele konstruksjonen; (5 h) astrocyttene starte prosessen utvidelse og sammentrekning; (8 h) astrocyttene har justert og kontrakt. Skalere barer = 100 µm. (B) Bundle formasjon over tid i et mer representativt stillaset: (1 h) først i astrocyttene er sfærisk og ikke vise prosesser; (24 timer) tett masse astrocytic prosesser er dannet. Skalere barer = 300 µm (venstre) og 500 µm (høyre). (C) dannet fullt astrocytic bunt 24 timer etter plating, viser en "zippering" effekt, hvor endene av kabelen kobler til forskjellige endene på veggene i lumen. Skala bar = 1000 µm.

Figur 3: Micro-kolonne indre Diameter og celle tetthet innflytelse i selv-montering av justert bunter av Bipolar astrocyttene. (A) 2D astrocytter kulturer med serum inneholder medier (venstre) og serum-free co kultur medier (høyre) vise en ikke-prosessen og multi-prosess peiling morfologi, henholdsvis. Skalere barer = 100 µm. (B) astrocyttene seeded på høy tetthet (9.0-12,0 x 10⁵ celler/mL) i mikro-kolonner med ID 180 og 350 µm skjemaet justert pakker i forhold til den langsgående aksen, mens ID 1 mm resultater i astrocyttene og vise flere unaligned prosesser gjennom diameteren på lumen. Skalere barer = 100 µm (øverst, midten) og 150 µm (nederst). (C) astrocyttene seeded i en 350 µm ID mikro-kolonne på lav tetthet (2.0-4.0 x 10⁵ celler/mL) er justert, men ikke sammen. Skala bar = 100 µm. (D) når belagt i en 350 µm ID mikro-kolonne på lav eller middels tetthet, astrocyttene erverve en bipolar morfologi. Skalere barer = 300 µm. (E) boksen i D viser en zoom på kjeder av bipolar astrocyttene skjemaet i hydrogel mikro-spaltene. Skala bar = 300 µm. (F) eksempel på en individuell bipolar astrocytter. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: astrocyttene være levedyktig etter bunt formasjonen i Hydrogel mikro-kolonnen. (A-B), (C-D) 3D AC confocal rekonstruksjoner viser levedyktigheten til celler i hele plan kulturer og justert astrocytic pakker, henholdsvis som assayed med calcein-AM/ethidium homodimer flekker (grønn-live celler. rød-død celler). (E) kvantifisering av levende og døde celler resulterte i en tilsvarende prosentandel av live/dead astrocyttene når kultivert på 2D overflater og mikro-kolonnene. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: kontrast bilde av en representant svært lange justert Astrocytic bunt i Hydrogel mikro-kolonnen. (A) pakke formasjon gjennom hele lengden av en 3,5 cm mikro-kolonne. Skala bar = 1000 µm. (B-C) høyere forstørrelse zoom-ins vise astrocytter tekstjusteringen i ulike regioner langs hele Konstruer, tilsvarende boksene i. Skalere barer = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Immunolabeling av Astrocytic stillasene demonstrerer langsgående justeringen av Astrocytic prosesser. (A) AC Confocal rekonstruksjon av en astrocytic pakke viser flekker for GFAP (rød, venstre) og kjerner (Hoechst, midten) og en overlapping av begge kanaler (høyre). (B) høyere forstørrelse zoome inn av astrocytic bunt i regionen eske i tillater visualisering av cytoarchitecture av astrocyttene innenfor mikro-kolonner. Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: karakterisering av Representative Astrocytic pakker gjennom Immunocytochemistry. (A-B) Astrocyttene kultivert på 2D overflater og seeded i hydrogel mikro-kolonner uttrykke lignende astrocytic markører GFAP (rød) og vimentin (grønn). (A) AC Confocal rekonstruksjon av en 2D planar astrocytter kultur viser separate og flettede kanalene. Skala bar = 100 µm. (B) AC Confocal bilder av en astrocytic pakke, bekrefter uttrykk for markører og utstillingsvindu astrocytter justering. Skala bar = 50 µm. (C-D) astrocyttene kulturperler innenfor mikro-kolonner også uttrykke intermediære proteiner nestin (rød) og vimentin (grønn). (C) AC Confocal bilde av en astrocytic pakke. Skala bar = 100 µm. (D) høyere forstørrelse zoome inn c. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: astrocyttene i justert buntene nært samhandle med en kontrakt, langsgående kollagen matrise, i motsetning til den uregelmessig ordningen av kollagen i 2D kulturer. Celler var immunolabeled å observere astrocyttene (GFAP, rød), kjerner (Hoechst, blå) og kollagen (grønn). (A) 2D astrocytter kulturer med kollagen på 1 mg/mL Vis unaligned astrocyttene og tilfeldig fordelte kollagen. Skala bar = 250 µm. (B) kollagen er trukket fra veggene i mikro-kolonne lumen og er kontrahert til en justert matrisen som en del av astrocytic bunt. Skala bar = 150 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9: ekstra kollagen kan brukes til å stabilisere strukturen av Astrocytic kablene. (A) bunter dannet ca 6 h etter plating astrocyttene i kollagen-belagt hydrogel mikro-kolonner. Når pakker ble dannet, ble høyere konsentrasjon (3 mg/mL) kollagen lagt til endene av mikro-kolonnen å hemme sammentrekning av astrocytic kabler. I konstruksjoner ikke stabilisert med ekstra kollagen, astrocytic-kollagen buntene hadde begynt å kontrakten ved 18 h og astrocytter kablene hadde fullstendig kollapset av 24 timer. Denne sammentrekning ble ikke observert når pakker ble forsterket med 3 mg/mL kollagen. Skala bar = 1000 μm. (B) zoome inn av kollapset astrocytic pakke ikke forsterket med 3 mg/mL kollagen. Skala bar = 500 μm. (C) zoome inn regioner fra kollagen-forsterket mikro-kolonner. Astrocytter bunt morfologi ble opprettholdt gjennom hele mikro-kolonnen. Skalere barer = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10: utvinning av Astrocytic pakker fra mikro-kolonne og montering på Poly-L-lysine tonet Glass Coverslips bevis robust teknikken. (A) kontrast bilde av flere utdraget astrocytic pakker, manipulert til stave ordet "Penn". (B) AC Confocal rekonstruksjon av samme utdraget bunter farget for astrocytic markør GFAP (rød) og celle kjerner (Hoechst, blå). Skala bar = 100 µm. (C) forstørrelse av regionen eske i B viser at selv når manipulert til irregulær form, astrocytic stillasene beholde en justert, bipolar morfologi og en samlet cytoarchitecture. Skala bar = 200 µm. noen strukturelle forskjeller mellom fase og AC confocal bilder er trolig en gjenstand av konstruksjoner skiftende på grunn av skylling under immunocytochemistry prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 11: Neurons overholder og utvide Neurites langs justert astrocytter pakker i Neuron-astrocytter co kulturperler stillaser. (A) kontrast bilde av en Nevron-seeded astrocytic bunt. Skala bar = 300 µm. (B)-(C) Neurons ble observert å overholde astrocytic pakker og utvide neurites retning kabelen (Hoechst-blå; GFAP-grønne; Β-tubulin III-rød). Skalere barer = 200 og 100 µm, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 12: astrocytter kabler tjene som et levende stillas for regissert Neurite utvekst. AC confocal rekonstruksjoner viser en region av en mikro-kolonne bestående av neurons seeded ca 2 dager etter bunt formasjon. (A) GFAP-positive astrocytter bunter, (B) β-tubulin III-positive nevroner og (C) sammenslåing av alle kanaler, inkludert HOECHST-farget kjerner (blå). Merk at nervecellene utstilt neurite justering når overholdt regioner med justerte astrocytter prosesser (piler), mens neurons ikke overholdt til justert astrocyttene syntes å tilfeldig (dvs. flere retninger) neurite utvekst (pilspisser). Viser retningen av neurite utvekst (D) zoome inn i regionen. Skalere barer = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Sammenlignet med den mer støttende miljøet av PNS, er CNS spesielt begrenset i håndtering ødeleggende konsekvensene av Biografiske filmer og neurodegeneration. Etter en alvorlig fornærmelse til pattedyr CNS dannes en glial arr som består av en kjerne av fibrotiske og inflammatoriske celler som omgitt av et tett meshwork av uorganisert reaktive astrocyttene som skiller axon utvekst begrenser proteoglycans¹⁴. Denne arr fungerer som en fysisk og biokjemiske hindringer mot fornyelse av axon avslutninger¹². Videre har voksen pattedyr CNS begrensede kilder av nye nerveceller gjenopprette tapt celler etter traumer eller neurodegeneration, siden neurogenic sentre er begrenset til SVZ, hippocampus dentate gyrus og potensielt andre vanligvis inaktiv områder⁵⁴. En perfekt strategi vil omgå begge sider av begrenset recuperative egenskapene til CNS som gjeldende tilnærminger ikke adressen. Som sådan, har våre forskningsgruppe utviklet astrocytter-baserte stillaser rettet presentere levende trasé for neural migrering mot Nevron dårlig områder og guidede forlengelse av regenererende axon veksten kjeglene. Justert astrocytic pakker i kollagen interiøret en agarose mikro-kolonne utgjør disse astrocytic levende stillaser. En betydelig forskjell fra konvensjonelle celle - og biomateriale-baserte strategier brukes til CNS reparasjon og gjenfødelse er at cytoarchitecture i disse konstruerer er fullstendig utført i vitro for å simulere flere i vivo glia-baserte veiledning og stillas arkitekturer. For eksempel under embryonale utviklingen fungere radial glia veier som levende stillaser for nye nerveceller migrere til neocortex og gliacellene megle målrettet forlengelse av banebrytende axons posing som mønstret underlag eller guidepost celler^{35 ,38,39}. Embryonale radial glia i sonen subventricular produserer astrocyttene som danner langs justert glial rør, som neuroblasts overføre fødselen i en lenket-formasjon fra SVZ til OB⁴¹. Videre, det har blitt demonstrert i noen ikke-pattedyr som følge CNS skade, en større grad av gjenfødelse er det mulig dannelsen av en organisert, justert astrocytic ordningen⁴⁴. For eksempel voksen sebrafisk er i stand til å regenerere deres spinal snorer etter migrering av umodne gliacellene lesjon området, differensiering inn en bipolar morfologi og forlengelse av glial prosesser å bygge bro lesjonen, danner en bane som Angir regenerating axons⁴⁵. Det kan hende at utviklet konstruksjoner av justert astrocytic bunter recapitulating disse mekanismene og presentere de nødvendige strukturelle og løselig signalene for glia-mediert neuronal migrasjon og axon gjenfødelse³⁵. I tillegg på grunn av innbefattingen av astrocyttene og levende, kan disse konstruerer aktivt presentere de nødvendige miljømessige signaler basert på tilbakemelding fra verten.

I vår teknikk, astrocytter justering er en selvstendig montering prosess avhengig fysiske signaler og celle-celle interaksjoner fremmet av mikro-kolonne indre diameter, kollagen konsentrasjon og seeding tetthet. En annen attraktiv funksjon i denne metoden er dens mikron skala størrelse, hvilke tillate minimal invasiv implantasjon i skadede områder av CNS. Videre viser resultatene presentert i dette manuskriptet at sammensetningene med protokollen har høy levedyktighet og uttrykke intermediære proteiner GFAP, nestin og vimentin, uansett astrocytter alder som definert av passasje . Mens både GFAP og vimentin uttrykkes i umodne og modne astrocyttene, er nestin hovedsakelig begrenset til udifferensierte eller umodne celler, med modning glia upregulating uttrykket av GFAP og avtagende produksjon av nestin^{45, 55}. forrige studier har vist at astrocytter virkemåter endringer med alderen, men konsekvent uttrykk for intermediære proteiner, samt bunting ble sett over en rekke passasje tall (passasjer 4-12)⁵⁶. Astrocytic stillasene også ble vist å oppnå svært lange, centimeter skala lengder i vitro, som tyder på at denne teknikken er tilpasningsdyktig til ulike skade lengder og geometrier møtte i vivo. Videre utstilling justert astrocytic pakker bemerkelsesverdig strukturell integritet og stabilitet, som deres kabel-lignende cytoarchitecture opprettholdes selv etter å bli utsatt for utvinning fra mikro-kolonnene. Astrocytter-baserte levende stillaser også støtte Nevron vedheft og neurite utvekst, forsterke potensialet i denne teknikken å fremme regissert Nevron migrasjon og axon utvidelse for CNS reparasjon.

Justert astrocytic pakker er innenfor en beskyttende rørformede hydrogel encasement collagenous interiøret. Fabrikasjon av astrocytic stillasene starter med micro-forsamlingen ved å sette inn en akupunkturnål i en kapillarrør og utsuging flytende agarose i den. Agarose ble valgt biomateriale sin inert egenskaper og biocompatibility lettbetjente mekanisk, fysiske og biokjemiske egenskaper⁴⁹. Agarose konsentrasjon i hydrogel kan være en viktig variabel siden celler følelse mekanisk stimuli fra deres substrat (f.eks stivhet) og svar intracellulær endringer⁵⁷. Designkriterier for disse mikro-kolonnene inneholder en høy nok porøsitet å tillate tilstrekkelig masse transport, men en liten nok porestørrelse å forby lateral prosessen utvekst; disse kriteriene er oppfylt av nano-skala åpen-porøsitet i agarose på konsentrasjonen i denne protokollen. Agarose konsentrasjonen i denne protokollen ble også valgt dens stabilitet, enkel håndtering og likheten i mekaniske egenskaper til hjernen miljø⁵⁸. En bemerkelsesverdig vurdering er den sentrale plasseringen av nålen i kapillarrør. Ofte kan nålen være litt skråstilt eller fortrenges under prosessen forårsaker lumen skal ligger midtstilt i forhold til de ytre veggene etter agarose gelation og mikro-kolonne fra røret. Du kan unngå dette nålen bør være rett, og samlingen stempelet-tube-nål bør opprettholdes i vertikal posisjon mens agarose tegnes å beholde nålen langs sentrale akse. Presis sentralisering av lumen ivaretar de justerte astrocyttene mellom agarose veggene; lumen er mer utsatt for rupturing hvis proksimale til den ytre kanten av sylinderen. I tillegg kan tilstrekkelig avstanden mellom lumen og ytterveggen tilby beskyttende fordeler under og etter transplantasjon (forutsatt at de astrocytic konstruksjoner ikke fjernes fra mikro-kolonne forutgående til implantatet). Denne første fasen av astrocytic stillaset fabrikasjon er avgjørende for suksess for teknikken, som valg av nålen diameter er avgjørende for riktig astrocytter soma/prosess justering og kabel selvtillit forsamlingen. Vi fant at astrocytter justering var omvendt avhengig mikro-kolonnen ID, med en optimal ID-området for cellejustering og dannelse av robust astrocytter pakker blir 180 til 350 µm (Figur 3). På samme måte var det tidligere vist at neurons direkte deres utvekst retning minimum substrat kurvatur å redusere prosessen bøying^59,60og lignende mekanismer er trolig på jobb å påvirke astrocytter justering i vårt system⁴⁹. I tillegg til kurvatur påvirker astrocytter justering, fant vi at en 180 til 350 µm ID-området førte astrocyttene anskaffe en bipolar morfologi⁴⁹, i motsetning til skjemaet stellate, multi polar observert med en ID på 1 mm eller når astrocyttene ble kultivert i 2D (Figur 3). Det er sannsynlig at disse dyptgripende morfologiske endringer til en bipolar astrocytter morfologi endre deres fysiologiske egenskaper for eksempel disse astrocyttene kan uttrykke alternativ secretable faktorer eller cellen overflate markører som kan være fordelaktig for regenerering, men dette garanterer videre karakterisering. Samlet viser våre funn at passende utvalg av fysiske stikkord, for eksempel overflaten kurvatur, er viktig å simulere innfødt cytoarchitecture i astrocytic levende stillaser.

Bygging av astrocytic stillasene fortsetter med sekvensiell inkludering av kollagen ECM løsningen og kortikale astrocyttene inn i hul interiøret mikro-kolonnene. Den indre lumen for mikro-kolonnen er belagt med kollagen å støtte astrocytter overlevelse, vedlegg og justert bunt formasjon, på grunn av manglende evne til agarose uavhengig støtte neurite utvekst⁶¹. En kollagen konsentrasjon av 1 mg/mL ble valgt fordi tidligere undersøkelser fastslått at lavere og høyere konsentrasjoner resulterte i mangel av vedheft og ustabilitet av ECM, henholdsvis⁴⁹. Således, som forventet, kollagen konsentrasjon har dramatiske effekter på effektiviteten av denne teknikken. Videre består ECM løsningen av bare type I kollagen. I forhold til laminin og Matrigel-belagt substrater for 2D astrocytic kulturer, belagt astrocyttene på type jeg kollagen vist optimal vedheft og nettverk formasjon⁶². Inkubasjon tiden som kollagen polymerisasjon før cellen seeding er også et viktig skritt i protokollen. Vi fant tidligere at når neurons leverte samtidig med unpolymerized ECM agarose mikro-kolonner, redusert neurite utvekst og axonal fasciculation var sett⁴⁷, og det er mulig at disse funnene vil utvide til astrocyttene også. Siden kollagen kreves for astrocytter vedheft og bundle formasjon, bør tilstedeværelse av ECM gjennom Konstruer og fravær av luftbobler eller tomme lommer bli visualisert og bekreftet med mikroskopiske teknikker.

Protokollen konkluderer med astrocytter plating, en inkubasjonsperiode slik celleadhesjon kollagen og kortsiktige kultur for dannelsen av målet cytoarchitecture. Astrocyttene mellom passasje 4-12 ble brukt, som de viser robust astrocytic bunting og kollagen reformasjonen. Disse astrocyttene også presentert en moden fenotypen bestående av > 95% ren kulturer^63,64 med liten eller ingen neuronal forurensning. I motsetning til vanlige astrocytter kulturer, som benytter serum inneholder middels (figur 3A, til venstre), bruker våre teknikken serum-free medium tillate astrocyttene å vedta en prosess-bærende morfologi (figur 3A, høyre ) og bunter av justert somata og prosesser i mikro-kolonner^62,65,66. I celle seeding konsentrasjon, resultert høyere konsentrasjoner i størrelsesorden 9.0-12,0 x 10⁵ celler/mL, med ID 350 µm, i dannelsen av tett pakket bunter med tilhørende kollagen remodeling, mens astrocyttene ble mer spredt , men likevel justert, når lave konsentrasjoner ble benyttet (Figur 3 c). Dermed påvirker effekten av seeding konsentrasjon på celle-celle interaksjoner graden av astrocytter justering og dannelsen av de observerte kabel-lignende strukturene. Injeksjon av cellen løsningen til lumen er generelt visualisert ved hjelp av en stereoscope å sikre at homogen levering over hvor mikro-kolonne, som er avgjørende for kontinuerlig bunt formasjon. Etter seeding, er foreløpig inkubasjon tiden før flom med kultur medier uunnværlig å sikre ankerplass av astrocyttene til ECM. Varigheten kan bli endret hvis astrocyttene flykte fra konstruerer, forutsatt at sammensetningene er tilstrekkelig fuktet for å utelukke tørking. Kontrast bilder av astrocytic stillasene som en funksjon av tid viste at av 8 h, et nettverk av justert astrocytic pakker var blir dannet. I tillegg ble brøkdel av ECM fra lumen veggen og dens påfølgende sammentrekning stramt tilknytningen mellom celler og innleide kollagen observert når konstruksjoner ble merket for kollagen og GFAP som vist i Figur 8. Dette fenomenet er muligens en konsekvens av astrocytic kontraktile styrker frakobling kollagen fra veggene, basert på tidligere rapporter om fibroblast som kapasiteten til gliacellene å generere styrker som forvrenger fleksibel underlag og matrix-remodeling evne til astrocyttene i astrocytter bare og Nevron-astrocytter co kulturer^28,49,67,68. Spesielt er en av konsekvensene av astrocytter motilitet og integrin-mediert samspillet med kollagen fibrils styrkegenerering tilstrekkelig kontrakt fibrils^17,69. Total, gjennomføring av beskrevet protokollen vil produsere levende stillaser består av selv montert nettverk av tett, justert astrocytic kabelen-lignende strukturer som recapitulate fysiske underlag i flere faser av CNS utvikling.

I tillegg til personlige problemer som kan oppstå i protokollen, besitter astrocytic stillaset teknikken andre hindringer som kan påvirke sin evne til å reparere CNS. For eksempel, er den ultimate suksessen denne teknikken betinget av nervesystemet plastisitet og funksjonell integrering av astrocytic stillaset vert kretser. Relatert til implantering av disse stillasene er muligheten for en betennelsesreaksjon som kan motvirke pro-regenerativ attributtene til astrocytic pakker. Alle transplantasjon-baserte teknikker har kapasitet til ruptur blod - hjerne barrieren og forårsake infiltrasjon av inflammatoriske celler, takket være nærheten mellom nerveceller og kapillærer vev⁴⁷. I dette tilfellet kan hydrogel mikro-kolonnen eller en annen encasement ordning for astrocytic stillasene benyttes som et redskap for kontrollert utgivelsen av anti-inflammatorisk faktorer å redusere inflammatorisk respons. I utgangspunktet justert astrocytic bunt var ikke stabilt i mikro-kolonnen, som styrkene som tvinger cellejustering og matrix ombygging til slutt førte til en kollaps av den ønskede cytoarchitecture etter 1-2 dager i kultur. Imidlertid ble flere sammentrekning og bundle kollaps hemmet av gi ekstra forsterkning for pakker i endene av mikro-kolonnen ved å legge til høyere konsentrasjon kollagen for å holde bunten på plass. En ekstra taktikk kunne ansette en sekundær innkapsling, der en ny hydrogel belegg brukes til justert astrocytic pakker som de er trukket fra mikro-kolonnene. Det er sannsynlig at levering av justert astrocytter nettverk inn i hjernen også vil stabilisere konstruksjoner på grunn av celle-celle adhesjon mellom vert og konstruere celler lengden, men dette må testes direkte i fremtidige studier.

Følgelig arbeidet vil være rettet mot å utvikle en effektiv transplantasjon metode som sikrer stabilisering og beskyttelse av astrocytic bunt under og etter i vivo levering for å tillate neuronal migrasjon, reparasjon, og gjenfødelse skadde CNS. Vi har tidligere vist vellykkede implantasjon av neuronal/axonal-baserte mikro-TNS, som deler encasement ordningen med de astrocytic konstruerer, i corticothalamic veier, noe som resulterer i overlevelse og strukturelle integrasjon med verten vev på minst inntil 1 måned^46,47. Dermed kan robusthet av kabler etter utvinning fra mikro-kolonnene utnyttes. I dette tilfellet agarose hydrogel ville tjene som første kultur sengen å indusere selvtillit forsamlingen og deretter astrocytic kabelen ville være fjernet fra encasement og direkte injisert inn i hjernen bruker en tynnvegget nål. Astrocytter deformasjon på grunn av mekaniske krefter ved utpakking av hydrogel mikro-kolonnen observert ikke og forventes ikke. Tidligere arbeid studerer effekten av mekanisk deformasjon på astrocytter reaktivitet antyder at eventuelle resulterende deformasjon ikke vil bli brukt raskt nok for å indusere astrocytosis eller prosess forlengelse^62,70. For å minimere skader på hjernevev og mulig inflammatorisk respons, kan buntene innen hydrogel bli implantert bruker p-mindre teknologi utviklet tidligere for mikro-TNS. Denne metoden, er hydrogel belagt med et tynt lag av carboxymethylcellulose det innrømmer for p-mindre oppføring i hjernen som kan avta forstyrrende og provoserende fotavtrykk av implantasjon⁴⁷. Etterpå transplantasjon studier kan utføres for å vurdere muligheten for disse stillaser å overleve, integrere med vert vev, og fremme nevrale migrasjon og axon veiledning. Spesielt kan disse konstruksjoner bli implantert ene enden kommer fra en neurogenic region som SVZ til dens pool av nevrale stamceller og neuroblasts, i direkte mimikk RMS, og den andre enden koblet til en skade området potensielt kjøre nevrale migrasjon og gjenbefolke området i et taksameter mote.

Etter transplantasjon protokollen optimalisering, kan teknikken forbedres i andre områder. Mikro-kolonnene kan fremstille med umodne astrocyttene (f.eks radial glia, RMS-type celler) eller eldre fenotyper senere dedifferentiated for å utvide regenerativ-inducing kapasiteten til disse konstruksjoner⁴⁹. I i vitro modeller av glial arret, har modne astrocyttene ikke hatt muligheten til å danne trasé for axon utvekst⁷¹. Derimot har umodne astrocyttene vist seg å fremme neurite utvekst i vitro og axonal gjenfødelse i vivo når transplantert samtidig med chondroitinase ABC å ta den høye nivået av CSPGs i den glial arr^{71 , 72}. for å sammenfalle med ankomsten av personlige medisin, autologous astrocytic mikro-kolonner kan utvikles av seeding stamceller fra kilder som indusert pluripotent stamceller (iPSCs) og menneskelige embryonale stamceller (hNSCs). Denne endringen vil tillate disse stillaser skal fungere som kanaler for individualisert og bestemt veien reparasjon og gjenfødelse. Videre bruk av kildene cellen kan omgå mulige immunogenic svar at astrocytter implantasjon føre. Selv om immunogenisitet varierer iPSC cellelinjer, er disse cellene teoretisk i stand til å avverge eller dempe immunreaksjoner på transplantasjon, som foreslått av fravær av skadelige svar etter iPSC-avledet orgel implantering i mus^73,74. Videre undertrykke autologous hNSCs og deres astrocytic derivater allogene immunreaksjoner⁷⁵. Følgelig justert fabrikere dette astrocytter nettverk med autologous stilk celler kan være en kritisk fremtid skritt i å gjøre denne teknikken mer aktuelt i klinisk setting.

Bortsett fra programmet som rør for CNS reparasjon og gjenfødelse, kan astrocytic levende stillaser brukes som i vitro test-senger, med eller uten hydrogel encasement basert på målene for et bestemt testing paradigme. For eksempel kan disse astrocytic konstruerer brukes til å undersøke nevrobiologiske fenomener som Nevron migrasjon og neurite utvidelse formidlet av astrocyttene, utnytte egenskapene kontrollerbar og 3D-miljø av levende stillaser som modeller av i vivo forhold. Protokollen diskutert i dette manuskriptet detaljert fabrikasjon av selv montert justert astrocytic pakker i en collagenous matrise innen en hydrogel mikro-kolonne. Recapitulating funksjoner hjernen nevroanatomi, utviklingsmessige/regenerativ mekanismer og neuroblast migrasjon stier, har disse implanterbare astrocytic stillaser potensial til å tilby støttende trasé nevrale migrasjon og axon veiledning i ellers inhibitoriske miljøet av skadde CNS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).