Summary
यह प्रोटोकॉल अलग-अलग, छिद्रित चूहे के दिल से हृदय संबंधी द्रव्यों को एकत्रित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। कोरोनरी शिरापरक द्रवपदार्थ से इंटर्स्टिस्टिकल ट्रांसडेट को शारीरिक रूप से अलग करने के लिए, लैंगेंडॉरफ पेरफ्यूज दिल उलटा हुआ है, और कार्डियक सतह पर बनने वाले अंतर (अंतरालीय तरल पदार्थ) नरम लेटेक्स कैप का उपयोग करके एकत्र किया जाता है।
Abstract
वर्तमान प्रोटोकॉल एक अनूठी दृष्टिकोण का वर्णन करता है जो पृथक, खारा-छिद्रित चूहे दिल से कार्डियक ट्रांसयूडेट (सीटी) का संग्रह करने में सक्षम बनाता है Langendorff तकनीक के अनुसार दिल की अलगाव और प्रतिगामी छिड़काव के बाद, दिल को उल्टा स्थिति में उलटा जाता है और यंत्रवत् एक गुब्बारा कैथेटर द्वारा बाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है। फिर, एक पतली लेटेक्स टोपी - पहले चूहा दिल के औसत आकार से मिलान करने के लिए डाली - एपिकार्डियल सतह पर रखा गया है। लाटेकैप टोपी का आउटलेट सिलिकॉन टयूबिंग से जुड़ा है, दिल के आधार स्तर से 10 सेमी नीचे का उद्घाटन खोलने से, थोड़ा सक्शन बनाते हैं। आगे के विश्लेषण के लिए एपिकार्डियल सतह पर सीटी का लगातार उत्पादन बर्फ-ठंडा शीशियों में किया जाता है। सीटी के गठन की दर 17 से 147 μL / मिनट (एन = 14) के नियंत्रण और अवरुद्ध हृदय से होती है, जो कोरोनरी शिरापरक प्रवाहयुक्त छिद्र के 0.1-1% का प्रतिनिधित्व करती है। प्रोटीओमिक विश्लेषण और उच्च महत्वआरएमएसीएस तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) ने बताया कि एकत्रित सीटी में प्रोटीन और प्यूरिनर्जिक मेटाबोलाइट्स के एक व्यापक स्पेक्ट्रम होते हैं।
Introduction
दिल की विफलता (एचएफ) दुनिया भर में मनुष्यों में मौत का प्रमुख कारण 1 है । एचएफ अक्सर मायोकार्डिटिस के कारण होता है, मैकेर्डियम के लिए इस्कीमिक अपमान, और बाएं निलय रीमॉडेलिंग, जिससे हृदयात्मक संकेतात्मक कार्य की प्रगतिशील गिरावट और जीवन की रोगियों की गुणवत्ता बढ़ जाती है। हालांकि कार्डियोलॉजी और कार्डियाक सर्जरी की प्रगति में उल्लेखनीय रूप से एचएफ मृत्यु दर कम हो गई है, वे केवल अनिवार्य रूप से प्रगतिशील बीमारी प्रक्रिया के क्षणिक "विलम्ब" के रूप में काम करते हैं, जो कि सिग्नेचर कैंसर रोग का कारण है। इसलिए, प्रभावी उपचार की वर्तमान कमी ने उपन्यास आणविक लक्ष्य की पहचान करने की आवश्यकता को रेखांकित किया है जो एचएफ को रोका जा सकता है या रिवर्स भी कर सकता है। इसमें बाह्य मैट्रिक्स में परिवर्तन, अनियंत्रित कार्डियक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और कार्डियक और गैर-हृदय कोशिकाओं 2 के बीच बातचीत शामिल है
यह समझना जरूरी है कि हृदय कोशिकाओं को निचले स्तर से पता चला हैघायल दिल के प्रतिरक्षा और पुनर्योजी प्रतिक्रिया के आकार का आकार अलग-अलग, खारा-छिद्रित हृदय में सीटी हृदय की सतह पर छोटी बूंदों के रूप में उत्पन्न होती है जो इंटिस्टिकल तरल पदार्थ ( यानी, सूक्ष्मवाही) से निकाली जाती हैं, जो कि शारीरिक और पाथोफीसियोलॉजिकल स्थितियों 3 , 4 , 5 के तहत होती हैं। इसलिए, सीटी ( यानी, अंतरालीय तरल पदार्थ) का विश्लेषण हृदय के चयापचय और सिकुड़ाए कार्य 6 को नियंत्रित करने या घायल दिल में प्रवास के बाद प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों को प्रभावित करने वाले कारकों को पहचानने में मदद कर सकता है। संभवतः, यह एचएफ के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास की ओर ले सकता है।
कुरिने दिल से सीटी का संग्रह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। नियमित लैंगेंडॉरफ-पेर्फुटेड दिलों में, सीटी का अनन्य संग्रह मुश्किल है क्योंकि सीआर का कोरोनार का मिश्रणवाई श्लेष्म प्रवाह सुगंधित अंतःक्षिप्त अंतरिक्ष से जारी चयापचय / एंजाइमों की किसी भी एकाग्रता को अप्रत्याशित रूप से कम करता है। इस सीमा को दूर करने के लिए एक संभव रणनीति फुफ्फुसीय cannulating और एक साथ फुफ्फुसीय नस 7 ligating द्वारा शिरापरक प्रवाह को बाहर करने के लिए है। हालांकि, इस विधि में फुफ्फुसीय धमनी और शिरा के cannulation और ligation के साथ जुड़े कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, हृदय में transudate में शिरापरक प्रवाह के संभावित रिसाव के कारण। रिवर्स हार्ट मॉडल का इस्तेमाल करने की अवधारणा को पहली बार केम्मेरिएयर के समूह ने पेश किया था, जिसने एक पृथक, छिद्रित दिल को उल्टा स्थिति में उलटा दिया और एपिकार्डियल सतह पर पतली लेटेक्स कैप को निरंतर सीएनटी को शिरापरक प्रवाह के प्रदूषण के बिना रखा। 8 , 9 इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए सीटी को दिल 9 से जारी चयापचयों के एक बहुत ही संवेदनशील उपाय प्रदान करने के लिए दिखाया गया था,फैटी एसिड के केशिका स्थानांतरण 8 , और वायरल कण 10
हाल ही में, पैरासिरीन कारक जो स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को नियंत्रित कर सकते हैं और कार्डियक एंजियोजेनेस 11 बढ़ा सकते हैं, उन्हें दिल की बीमारी के लिए स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा के लाभकारी प्रभावों में शामिल किया गया है। उलट दिल में सीटी का विश्लेषण इन व्यक्तिगत पैरासिरेन कारकों को रासायनिक रूप से पहचानने में मदद कर सकता है। इसके अतिरिक्त, सीटी दिल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विवो सक्रियण में शामिल कारकों की पहचान करने में मदद कर सकता है।
यहां प्रदान की गई हृदय की सतह से सीटी संग्रह का विस्तृत विवरण, संपूर्ण कार्डियक फ़ंक्शन के संबंध में प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लैस्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, और कार्डिओमायसाइट्स के परस्पर क्रिया का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए प्रयोगात्मक रूप से उपयोगी है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, मध्यवर्ती द्रव में हृदय से सेल संचार के लिए जानकारी है, जो किसीआईटी के संग्रह से आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है विस्तृत तकनीकी विवरण, उलट दिल से सीटी एकत्र करने का वीडियो प्रोटोकॉल भी शामिल है, इस अनूठी तकनीक के भविष्य के आवेदन को सुविधाजनक बनाने में मदद करनी चाहिए।
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Protocol
सभी प्रयोग स्थानीय विनियामक एजेंसी (नॉर्डरायिन-वेस्टफैलन, जर्मनी के लैनयूवी ) द्वारा अनुमोदित किए गए थे और जानवरों के उपयोग के दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किए गए थे। जानवरों को एक मानक चाउ आहार के साथ खिलाया गया था और नल का पानी प्राप्त किया गया था। प्रयोग के प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक सभी उपकरण और रसायनों सामग्री की तालिका में उपलब्ध हैं।
1. लेटेक्स कैप और इंट्रावेंटिकुलर बुलून की तैयारी
- एक मिलिंग मशीन का उपयोग करके एल्यूमीनियम मोल्ड बनायें जो चूहे के दिल के औसत आकार (300-350 ग्राम का वजन) से मेल खाता है। उत्कृष्ट (10/0) एमरी पेपर के साथ मोल्ड पोलिश
नोट: ढालना के विस्तृत मीट्रिक चित्रा 1 ए में दिखाए गए हैं - लेटेक्स कैप तैयार करने के लिए मिलिंग मशीन को एल्यूमीनियम ढालना की गड़बड़ी ठीक से ठीक करें।
नोट: मिलिंग मशीन मोल्ड को धीरे-धीरे बारी बारी से घटती है। वैकल्पिक रूप से, एक विद्युत मोटर का उपयोग किया जा सकता है li> - तरल लेटेक्स (व्यावसायिक रूप से खरीदा गया, सामग्री की तालिका देखें) के 50 एमएल ग्लास बीकर में 20 एमएल डालें
- जब तक ढालना के पूरे शरीर को लेटेक्स समाधान में डूब नहीं किया जाता है तब तक ढालना कम होता है।
- घूर्णन करते समय धीरे-धीरे ढालना (5 सेमी / मिनट) उठाएं
- एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए ढालना घूमते रहें, जब तक ढालना की सतह पर लेटेक्स मजबूत नहीं हो जाता।
- मोटे की सतह (पहले से ही एक पतली लेटेक्स फिल्म द्वारा कवर किया गया है) के लिए 1 ग्राम तालक पाउडर को जोड़ने के लिए क्षति को रोकने के लिए जबकि detaching।
- उंगलियों के साथ धीरे से अलग मोल्ड सतह से सूखे लेटेक्स टोपी; लेटेक्स कैप अब उपयोग के लिए तैयार है ( चित्रा 1 बी )।
- लाटेकस कैप के आउटलेट को 15 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग (आईडी = 0.2 मिमी) से कनेक्ट करें, बाद में सीटी के संग्रह के लिए उपयोग किया गया
- निलय के लेटेक्स गुब्बारे को पानी के साथ भरें और दृढ़ता से इसे 1 एमएल, पानी से भरे सिरिंज से जुड़े एल-आकार के धातु केनुला पर लगा दें (> चित्रा 1 सी)।
नोट: इसका उपयोग हृदय की ईमानदार स्थिति सुनिश्चित करने के लिए किया जाएगा (नीचे देखें)। - सुनिश्चित करें कि गुब्बारा संलग्न किया गया 1 एमएल सिरिंज के साथ कई डिफ़्लेटिंग / फुटेज परीक्षण करके एयरट्रीम है।
- प्रवेश द्वार कनेक्टिविटी, तीन-रास्ता रोक के माध्यम से, अंतरालगत विकसित दबाव ( चित्रा -1 सी ) के भविष्य के माप के लिए एक दबाव ट्रांसड्यूसर के साथ कनेक्ट करें।
2. क्रैब्स-हेंसिलिट बफर (केएचबी) और लैंगेंडॉरफ़ परफ्यूजन सिस्टम की तैयारी
- एक लैंडेंडॉरफ पेरिफ्यूजन सिस्टम को एक स्थिर-प्रवाह (एक रोलर पंप द्वारा संचालित) या लगातार-दबाव (एक ग्लास स्तंभ में स्थिर दबाव द्वारा उत्पन्न) मोड का उपयोग करके सेट करें।
नोट: Langendorff दिल की तैयारी के विवरण पहले 12 वर्णित किया गया है - संशोधित केएचबी के 2 एल तैयार करें (एमएम: 116.02 NaCl, 4.63 केएलएल, 1.10 एमजीएसओ 4 · 7 एच 2 ओ, 1.21 के 2 एचपीओ 4 2 · 2 एच 2 ओ, 24.88 एनएचओओ 3 , 8.30 डी-ग्लूकोस, और 2.0 सोडियम प्यूरवेट)।
- सभी रसायनों का वजन लें, लेकिन 2 2 एल फ्लास्क में 1.8 एल डबल डिस्टिल्ड पानी में उन्हें भंग करें।
- चुंबकीय सरगर्मी तहत संतुलन (पीएच: 7.4) के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए कार्बोजेन (95% ओ 2 /5% सीओ 2 ) के साथ मध्यम बबल।
- CaCl 2 .2 एच 2 ओ के 0.74 ग्राम जोड़ें और डबल डिस्टिल्ड वॉटर के साथ कुल मात्रा को 2 एल लें।
- एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए कार्बोजेन के साथ माध्यम को सरगर्मी और बुदबुदाती करना जारी रखें।
- दिल के microcirculation में बाधा डाल सकता है जो छोटे कणों को खत्म करने के लिए 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से केएचबी फ़िल्टर।
- लैंगेंडॉरफ छिड़काव प्रणाली की तैयारी।
- फ़िल्टर्ड केएचबी को एक पूर्व गर्म वाटर स्नान (38 डिग्री सेल्सियस) में रखें; 100 सीएमएच 2 ओ इन्सिड का दबाव पैदा करने के लिए कार्बोजेन के साथ बुदबुदाती रहेंई केएचबी जलाशय
- जलाशय को 100 सीएमएच स्थापित करने के लिए कांच के कॉलम से कनेक्ट करें; हेएचडीओस्टैटिक दबाव केएचएबी के साथ लैंगेंडॉरफ छिड़काव; कार्बन के साथ स्तंभ के अंदर केएचबी को बुदबुदाते रहें।
- वार्मिंग सिस्टम का तापमान समायोजित करें जिससे कि महाधमनी कैनुला आउटलेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस हो।
- सुनिश्चित करें कि टयूबिंग सिस्टम बुलबुला रहित है
- केएचबी के साथ एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए केएचबी ऑक्सीजनेट करें, जब तक किएचएच में पीओ 2 500-600 एमएमएचजी (एक रक्त गैस विश्लेषक द्वारा मापा जाता है) तक पहुंचता है।
- 100 सीएमएच 2 ओ के लगातार दबाव में या मैन्युअल स्विचिंग का उपयोग करते हुए लगभग 10-20 एमएल / मिनट के निरंतर प्रवाह पर चलाने के लिए छिड़काव प्रणाली को स्थापित करें। वैकल्पिक रूप से, एक विनिमेय एसटीएच पंप नियंत्रक का उपयोग तुरन्त छिड़काव मोड पर स्विच करने के लिए करें।
3. दिल की अलगाव और गर्भनाल
नोट: 30 के bodyweights के साथ पुरुष Wistar चूहों0-350 ग्राम का इस्तेमाल किया गया ताकि दिल के आकार में प्री-कास्ट लाटेकस कैप का मिलान किया गया। चूहे या तो बाएं धमनियों की अवरोही (एलएडी) की 50 मिनट के लिए एक बंधन लेते हैं, फिर छिद्रण के बाद या भाप से संचालित होते हैं मायोकार्डियल इन्फ़्रक्शन (एमआई) की स्थापना के लिए कार्यप्रणाली का विवरण कहीं और 13 की सूचना मिली थी। ऑपरेशन के 5 दिन बाद infarct जानवरों में उल्लिखित दिल का प्रयोग किया गया।
- एक पशु होल्डिंग चैम्बर (20 एल) से जुड़ी एक isoflurane vaporizer (2% वी / वी) का उपयोग कर चूहों anesthetize।
- गहन संज्ञाहरण पर पहुंचने के बाद ऑपरेशन टेबल पर चूहे को स्थानांतरित करें (तापमान नियंत्रित नहीं)।
- संदंश का उपयोग करते हुए उरोस्थि के नीचे त्वचा और मांसपेशियों को उठाएं और भारी कैंची के साथ पसलियों के निचले अंतर के आसपास काट लें।
- ठीक कैंची का उपयोग करना, रिब मार्जिन पर, डायाफ्राम में एक छोटा सा कटौती करना। पूरी उदर छाती दीवार की झड़प बनाने के लिए पसलियों को काफ़ी काटा।
- धीरे से अंगूठे के साथ दिल को पकड़ो एकएन डी इंडेक्स और मध्यम उंगलियां और धीरे-धीरे इसे ऊपर की तरफ बढ़ाएं ताकि कार्डियक वाहिकाओं को थोड़ा बढ़ाया जा सके।
- महाधमनी पूरी तरह से उजागर होने तक हृदय को एक्साइज करें।
- 100 मिलीलीटर बीकर में 50 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा केएचबी (4 डिग्री सेल्सियस) वाले दिल को रखें और इसे छिड़काव तंत्र में स्थानांतरित करें।
- एरोटो के माध्यम से दिल को सीधे टपका हुआ प्रवेशनी पर माउंट करना और उसे सीवन (4-0) के साथ कसकर सुरक्षित करना। दिल में प्रवेश करने वाले हवाई बुलबुले से बचें
- लगातार छिड़काव दबाव लागू करें (100 सीएमएच 2 हे) वैकल्पिक रूप से, एक पूर्ण प्रवाह दर (20 एमएल / मिनट से शुरू) लागू किया जा सकता है।
नोट: छाती के उद्घाटन के समय से छिड़काव प्रवेशनी को हृदय के लगाव के लिए एक अनुभवी ऑपरेटर के हाथ में लगभग 3 मिनट लगाना चाहिए।
4. उलट दिल मॉडल
- धीरे-धीरे महाधमनी कैनुला को घुमाएं जब तक दिल की पीछे की दीवार एक चेहरे को देखने में न हो।
- कैंची के साथ संयोजी ऊतक निकालेंबाएं आर्टियम के उद्घाटन का पर्दाफाश करने के लिए, इसे अंतःस्रावी कैनोलेशन के लिए तैयार करना
- बाएं वेंट्रिकल में बाएं आर्टियम के माध्यम से एक कठोर कैथेटर से जुड़ा डिफ्लेटेड लेटेक्स गुब्बारा डालें।
- जब तक यह पूरे निलयिक गुहा को भरता नहीं तब तक गुब्बारा को बढ़ाइए (इन्वर्टिंग वॉल्यूम को सिरिंज पर पहले से चिह्नित किया गया है)।
- जब तक वह उल्टा नहीं हो जाता तब तक दिल को उलटा करें, अंतरालगत बुलबुला कैथेटर द्वारा इसका समर्थन करते हैं।
- जैसा चित्रा 1 सी में दिखाया गया है, एक कठोर धातु कैथेटर के साथ अंतःस्रावीय गुब्बारे का उपयोग करके ऊर्ध्वाधर हृदय को एक ईमानदार स्थिति में यंत्रवत् स्थिर करते हैं।
- महाधमनी जड़ के अत्यधिक घुमाव से बचने के लिए दिल की स्थिति को समायोजित करें।
- डायस्टोलिक दबाव को 3-5 एमएमएचजी (इंट्रा-वेंट्रिकुलर बैलून द्वारा मापा जाता है; चित्रा -1 सी देखें) को समायोजित करें।
- हृदय की एपिकार्डियल सतह को देखें और यह सुनिश्चित करें कि छोटे बूंदों का रूप।
- लेटेक्स टोपी को रखेंदिल की सतह को धीरे-धीरे उंगलियों से पूरे दिल को कवर करने के लिए धक्का देकर
- सुनिश्चित करें कि लेटेक्स टोपी में अधिकतर निलय वाले सतह को शामिल किया गया है।
- 1-एमएल सिरिंज के साथ धीरे-धीरे चूसने से हवा के बुलबुले, यदि कोई हो, टोपी के अंदर और टयूबिंग को हटा दें।
- दिल के क्षैतिज स्तर के नीचे सीटी-लेटिंग टयूबिंग के 10 सेमी नीचे के बाहरी उद्घाटन को समायोजित करें।
नोट: यह प्रक्रिया नकारात्मक जल-संपीड़न दबाव से थोड़ी चूसने की गारंटी देती है। - नाइट के साथ 1: 1 मिश्रित बर्फ में रखा गया 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में सीटी के बूँदें लीजिए सीटी के बारे में 0.15-1.5 एमएल लीजिए
नोट: बर्फ / NaCl मिश्रण तापमान को ट्यूब में तापमान शून्य से नीचे (लगभग -4 डिग्री सेल्सियस) स्थिर करता है।
नोट: नमूना समय प्रायोगिक उद्देश्य पर निर्भर करता है। सीटी के प्रवाह की दर लगभग 27 ± 20 μL / मिनट में शाम-संचालित पशुओं (एन = 3) और कोरोनरी-लिगेटेड जानवरों (एन = 11) के लिए 100 ± 47 μL / मिनट है। - वजन और स्नैप-फ्रीज सीटी नमूनोंतरल नाइट्रोजन में और बाद में माप के लिए उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
5. सीटी का विश्लेषण
- वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर, चयापचयों के विश्लेषण के लिए सीटी द्रव का प्रयोग करें।
नोट: चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाए गए डेटा को लगातार-दबाव छिड़काव (100 सीएमएच 2 ओ) से एकत्र किया गया था, और सीटी तरल पदार्थ का 0.15-1.5 एमएल 10 मिनट की अवधि के भीतर एकत्र किया गया था। इस समय और मात्रा प्रोटिओमिक (न्यूनतम: 50 μL; चित्रा 2 ) 14 और एचपीएलसी (न्यूनतम: 20 μL; चित्रा 3 ) के लिए पर्याप्त थे।
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Representative Results
उलटा हुआ दिल मॉडल एक पृथक, रेट्रो-पेर्फूड चूहे के दिल ( चित्रा 1 ए- सी ) में हृदय में अंतराल ट्रूडेट का संग्रह सक्षम करता है। जब 100 सीएमएच 2 ओ के निरंतर दबाव में लगाया जाता है, तो अंतरीय द्रव गठन की दर 17 से 147 μL / मिनट के बीच होती है, जो अलग दिल में कोरोनरी शिरापरक प्रवाह का 0.1-1% है।
सीसी की प्रोटीन सामग्री, जैसे कि बिकिनचोनिनिक एसिड (बीसीए) परख के साथ मापा जाता है, को 1.08 ± 0.40 मिलीग्राम / एमएल (एन = 6) पाया गया था। एक-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण (एसडीएस पृष्ठ) ने कार्डियक ट्रांसयूडेट ( चित्रा 2 ए ) में उपस्थित प्रोटीन का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम प्रकट किया। दो-आयामी प्रतिदीप्ति अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन (2 डी-डीआईजीई) को सीटी पर हृ € ााटन से किया जाता है जो कि 50 मि.मी. से है Ichemia / reperfusion। के रूप में दिखाया गया चित्रा -2 बी, चित्रा 2 बी, कई प्रोटीन ईशैमीक दिलों में सीटी में अपरिवर्तनीय पाया गया। प्रोटीनों के बीच में पता चला कि 70.1% बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन थे, 4.6% सेलुलर झिल्ली प्रोटीन थे, 17.2% प्रोटीन cytoplasmic थे, और 2.3% परमाणु थे प्रोटीन ( तालिका 1 )।
प्यूरिनियों को लंबे समय से निर्णायक सिग्नलिंग अणु माना जाता है जो कि हृदय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, वास्कोरर टोन और कार्डियक फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है, विशेष रूप से आइसकेमिक चोट के बाद। सीटी के संग्रह में एमए के साथ-साथ पैथोफिसियोलॉजिकल स्थितियों के तहत कार्डिएक इंटरसिस्टिकल तरल पदार्थ में उपस्थित विभिन्न प्रकार के चयापचयों के माप परमिट होते हैं जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, एचपीएलसी द्वारा मापा एएमपी, जीएमपी, एनएडीपी, एडेनोसिन, हाइपॉक्सैथीन और यूरिक एसिड की एकाग्रता, जहां इस्केमिक दिल में उच्च होता है, जो अन्य तरीकों से पहले की रिपोर्ट के परिणाम के समान है , 16 ,Class = "xref"> 17
तालिका 1: इस्कीमिक दिल के सीटी में अपरिमित प्रोटीन की सूची। एसिमिक दिलों का सीटी 2 डी-डीआईजीई द्वारा विश्लेषण किया गया था और प्रोटिओमिक्स द्वारा पहचाने गए थे। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 1: उलट दिल मॉडल के योजनाबद्ध चित्र। ( ए ) एक एल्यूमीनियम मोल्ड उचित आकार और आकार के चूहे के दिल से बनाया गया था। ( बी ) लेटेक्स समाधान में ढालने के बाद, 0.01 मिमी की मोटाई के साथ लेटेक्स कैप को कास्ट किया गया था। ( सी ) एक एल मेंएडेन्डेरफ़ दिल तंत्र, हृदय महाधमनी के माध्यम से एक महाधमनी प्रवेशनी का उपयोग करके परिरक्षित किया गया था, जिसे बाद में एक उल्टा स्थिति में उलटा गया था और यंत्रवत् छोड़ दिया वेंट्रिकल में रखा इंट्रा-वेंट्रिकुलर गुब्बारा द्वारा समर्थित था। इंट्राएंटिक्लिकुलर प्रेशर डेवलपमेंट की निगरानी एक दबाव ट्रांसड्यूसर के माध्यम से की गई थी। लाटेकैप कैप ने दायें और बायां निलय दोनों की सतह के लगभग 90% को कवर किया, और आउटलेट सिलिकॉन टयूबिंग (आईडी = 0.2 मिमी) से जुड़ा था, दिल के आधार से बाहर का उद्घाटन 10 सेमी नीचे यह थोड़ा नकारात्मक हाइड्रोस्टैटिक दबाव उत्पन्न करता है। कार्डियक ट्रांसडेट आमतौर पर एक बर्फ ठंडा, 1.5 एमएल ट्यूब में एकत्र किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: प्रासीटी के ओटेओमिक विश्लेषण सीटी में प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ ( ए ) द्वारा अलग किए गए थे और 2 डी-डीआईजीई विश्लेषण ( बी ) द्वारा पहचाने गए थे। (ए) के लिए, लेन 1-4 अलग-अलग दिलों से कार्डियक नमूनों को इंगित करता है (1 और 2 = शिम; 3 और 4 = अवरक्त) (बी) के लिए, 2 डी-डीआईजीई को सीटी पर एक अवरक्त हृदय से किया गया था। तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) -एमएमएस / एमएस 14 , 15 द्वारा प्रोटीन की पहचान की पुष्टि की गई थी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: CT में Purines एचपीएलसी द्वारा सीटी में उपस्थित विभिन्न पुरीणों का विश्लेषण किया गया। प्रतिनिधि एचपीएलसी शिम (नीला) और अवरक्त (काला) हार्ट शो से चलता है कि अवरक्त हृदय एक उच्चतर दर्शाता हैएएमपी और एडेनोसिन की अंतःस्राथमिक एकाग्रता, लेकिन हाइफोक्सीथाइन नहीं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
उलटा हुआ दिल मॉडल अच्छी तरह से स्थापित लैंगेंडॉरफ दिल की छिड़काव तकनीक 12 पर आधारित है और यह हृदय को उल्टा पोजीशन में घुसने और एक कठोर इंट्रा-वेंट्रिकुलर बैलून कैथेटर का उपयोग करके इस स्थिति को धारण करके किया जाता है। इस तरह से, हृदयात्मक अंतराल ट्रुदुडेट शारीरिक रूप से कोरोनरी शिरापरक द्रवप्रसार से अलग हो सकता है, हृदय 9 के आधार से गुरुत्वाकर्षण द्वारा टपकाव किया जा सकता है। संपूर्ण हृदय की सतह पर रखी पतली और लचीली लेटेक्स टोपी के माध्यम से सीटी को लगातार एकत्र किया जा सकता है।
Langendorff तंत्र के अलावा न्यूनतम लागत के साथ, विधि प्रदर्शन करना आसान है। फिर भी, कुछ कदम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्थिर परिणाम प्राप्त करने के लिए तकनीकी रूप से महत्वपूर्ण हैं। इनमें शामिल करना सुनिश्चित करना शामिल है कि लेटेक्स कैप ठीक से दिल के आकार को फिट बैठते हैं और एट्रिएरा नहीं बल्कि वेंट्रिकल की सतह के लगभग 90% को कवर करते हैं। Exc से समयजानवर से दिल को रेट्रो-पेफ्युज़न के प्रदर्शन के लिए 3 मिनट से कम होना चाहिए, क्योंकि लंबे समय तक इस्कीमिया कार्डियक चयापचय को बदलने और कार्डियक ट्रांसदुटेस के गठन का जोखिम उठाता है। डायस्टोलिक छोड़ दिया निलय दबाव, अंतराल वेंट्रिकुलर गुब्बारा द्वारा मापा, निलय गुहा (3-5 मिमी एचजी) भरने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। एक अति-फुलाया गुब्बारे संवहनी संपीड़न द्वारा कोरोनरी प्रवाह को बदल सकता है। चयापचय और ब्याज की प्रोटीन के किसी भी संभावित गिरावट से बचने के लिए नमूना शीशी (1.5 एमएल ट्यूब) बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
इसके अतिरिक्त, सफल प्रयोगों को तैयार करने, अलगाव, और दिल के cannulation के दौरान अच्छे मैनुअल हैंडलिंग पर गंभीर रूप से निर्भर हैं। इसके लिए अभ्यास आवश्यक है इस्कीमिक क्षति से दिल की रक्षा के लिए, बर्फ की ठंड केएचबी के साथ सभी तैयारी पूरी की जानी चाहिए। क्योंकि चूहे के आकार समान चूहे के बावजूद, चूहे के बीच भिन्न हो सकते हैं, इसलिए लेटेक्स टोपियां कम से तैयार होने की सलाह दी जाती हैवाई विभिन्न आयाम जो दिल के विभिन्न आकारों के अनुरूप हैं।
पृथक उलट-हृदय पद्धति को पृथक चूहा 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 और गिनी पिग दिल 16 के लिए वर्णित किया गया है और इसका विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोग किया गया था। कार्यप्रणाली के हमारे वर्तमान विवरण में, हमने प्रायोगिक सेटअप और नमूना प्रसंस्करण में कुछ संशोधनों की शुरुआत की है। उदाहरण के लिए, फुफ्फुसीय धमनी के cannulation, के रूप में डे डेकेर एट अल द्वारा प्रस्तुत 7 , यहाँ नहीं किया गया था, क्योंकि दिल की उल्टे स्थिति शिरापरक प्रवाह perfusate के साथ संभावित संदूषण को रोकता है। CT-letting tubi के उद्घाटन को कम करके थोड़ा सा नकारात्मक दबाव डालने से सीटी के लिए संग्रहण उपकरण को सरल बनाया गया थारिवर्स दिल के नीचे 10 सेंटीमीटर तक एनजी। यह आसानी से transudate नमूनों को शांत करने के लिए आसान बनाता है नमूना सीटी के तेजी से कूलिंग को सुनिश्चित करने के लिए, संग्रह कप को बर्फ-नाक ( यानी, 1: 1 अनुपात) के बराबर मात्रा में मिश्रण में रखकर -4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर लगाया गया। इसने एकत्र किए गए सीटी नमूनों के त्वरित कूलिंग की अनुमति दी।
आम तौर पर, यह ध्यान रखना चाहिए कि पृथक चूहे का दिल विवो शारीरिक स्थितियों में से अलग होता है, इसमें कि बीच में द्रव का गठन खारा-छिद्र दिल से कम होता है। पृथक हृदय द्वारा सीटी का गठन किया जा सकता है इसलिए विवो इंटरस्टिकल तरल पदार्थ की वास्तविक रचना की पूरी तरह से नकल नहीं किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान सेटअप शिरापरक प्रवाहयुक्त perfusate के साथ संभावित संदूषण के पूर्ण बहिष्करण की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, शिरापरक आउटलेट कार्डियक बेस (ईमानदार दिल के निम्नतम स्तर) पर स्थित होने के बाद से, हम विश्वास नहीं करतेकि संदूषण संग्रह प्रक्रिया में योगदान देता है
वर्तमान प्रोटोकॉल हृदय अन्तर्निहित तरल पदार्थ का नमूना करने के लिए एक अनूठी विधि का वर्णन करता है, जिसमें कार्डियोयोमोसाइट्स और गैर-हृदय कोशिकाएं जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाएं, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, फाइब्रोब्लैस्ट्स, और pericytes। कार्डियक इंटरस्टिशिअल ट्रुदुडेट का गठन एन्डोथेलियल बाधा 10 में तरल पदार्थ परिवहन के परिणामस्वरूप किया जाता है, साथ में लसीका द्रव के एक छोटे से अंश के साथ। इसमें कार्डियक मेटाबोलिट्स 7 , अंतरालीय जगह में घुलनशील कारक, और कार्डियक और / या गैर-कार्डियक कोशिकाओं 9 के मिश्रण शामिल हैं इसलिए, कई सेल प्रकार सीटी के गठन में योगदान करते हैं। इसके अलावा, कई कारक हैं जो गठन की दर को प्रभावित करते हैं। सबसे पहले, ऑनकोटिक दबाव एक प्रमुख निर्धारक लगता है जो ट्रांस-कैपिल को नियंत्रित करता हैएरी तरल पदार्थ आंदोलन, क्योंकि डेक्सट्रान या एल्बिन जोड़कर छिड़काव माध्यम तक ओंकोटिक दबाव बढ़ने से सीटी 9 , 10 का गठन कम हो गया। दूसरा, एमआई सहित हाइपोक्सिया 9 , 16 के दौरान संवहनी पारगम्यता में वृद्धि , perfusate की अतिरिक्त मात्रा बढ़ाता है और इस तरह सीटी के गठन इसलिए, भविष्य के अध्ययनों में, सीटी की मात्रा को कम करने के लिए ऑनकोटिक दबाव बढ़ाना एक उपयुक्त साधन हो सकता है, जिससे हित के लक्षित अणुओं को समृद्ध किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है
Acknowledgments
इस अध्ययन को एनएसएफसी 81570244, फोको 23/2013, और एसएफबी 1116 / बी 001 और कार्डियोवास्कुलर रिसर्च इंस्टिट्यूट डसेलडोर्फ (कैरिड) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
