Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לאסוף נוזל interstitial לב מבודדים, בלב עכברוש perfused. כדי להפריד פיזית transudate interstitial מ perfossate כלילי ורידי לב, הלב Langendorff perfused הוא הפוך, ואת transudate (נוזל interstitial) נוצר על פני הלב נאסף באמצעות כובע לטקס רכה.
Abstract
הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה ייחודית המאפשרת אוסף של transudate לב (CT) מן הלב מבודד, מלוחים perfused חולדה. לאחר בידוד ו זלילה מדרדר של הלב על פי טכניקת Langendorff, הלב הוא הפוך למצב הפוך הפוכה מיוצב מכנית על ידי קטטר בלון מוכנס לתוך החדר השמאלי. ואז, כובע לטקס דק - בעבר יצוק כדי להתאים את הגודל הממוצע של הלב חולדה - ממוקם מעל פני השטח epichardial. השקע של כובע לטקס מחובר צינורות סיליקון, עם פתיחת דיסטלי 10 ס"מ מתחת לרמת הבסיס של הלב, יצירת יניקה קלה. CT מיוצר ברציפות על פני השטח אפיקארדיאל נאסף בקבוקונים מקורר כקרח לניתוח נוסף. שיעור היווצרות ה- CT נע בין 17 ל -147 μL / min (n = 14) בשליטה ובליבות לא מקובעות, המייצגות 0.1-1% מהפרפוראטציה הקולית הוורידית. ניתוח פרוטאומי ופרפו גבוהRmance נוזל כרומטוגרפיה (HPLC) גילה כי CT שנאספו מכיל מגוון רחב של חלבונים ו metinerolic purinergic.
Introduction
אי ספיקת לב (HF) היא הגורם המוביל למוות בבני אדם בעולם 1 . HF מתרחשת לעיתים קרובות עקב דלקת שריר הלב, עלבונות איסכמיים בשריר הלב, ושיפוץ חדרי החדר, מה שמוביל להידרדרות הדרגתית של תפקוד הלב וכלי הדם של המטופלים. למרות ההתקדמות הקרדיולוגית וניתוח לב הורידו באופן משמעותי את תמותה HF, הם רק לשמש "מעכבים" חולף של תהליך מחלה מתקדמת באופן בלתי נמנע, כי יש תחלואה משמעותית. לכן, היעדר הטיפול היעיל הנוכחי מדגיש את הצורך לזהות מטרות מולקולריות חדשות שיכולות למנוע או אפילו להפוך HF. הדבר כולל שינויים במטריצה החוץ-תאית, תגובה חיסונית בלתי מבוקרת של הלב, ואינטראקציות בין תאי לב ולא-לב 2 .
חשוב להכיר כי microenvironment כי תאים לב חשופים direcTly צורות התגובה החיסונית והתחדשות של הלב הפגוע. בלב המבודד, המלוח-מלוח, נוצר CT על פני השטח בצורת טיפות קטנות הנגזרות מחלל הנוזלים הבין-ממדי ( כלומר, מיקרו-סביבה), הן בתנאים פיזיולוגיים והן בפאתופיזיולוגיים 3 , 4 , 5 . לכן, ניתוח של CT ( כלומר, נוזל interstitial) עשוי לעזור לזהות גורמים המווסתים את חילוף החומרים של הלב ואת תפקוד התכווצות 6 או להשפיע על תפקודי התא החיסונית לאחר המעבר אל הלב הפגוע. פוטנציאל זה עשוי להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול ב- HF.
אוסף CT מ לבבות Murine הוא מאתגר מבחינה טכנית. ב Langendorff-perfused לבבות רגילים, את האוסף הבלעדי של CT קשה כי תערובת של CT עם קורונארY ורידי שפכים ורידי באופן בלתי צפוי מדלל כל ריכוז של מטבוליטים / אנזימים ששוחררו מן החלל interstitial. אחת האסטרטגיות האפשריות להתגבר על הגבלה זו היא להוציא את השפכים הוורידים על ידי חשיפת הריאתי ובאותו זמן ליגנציה של הווריד הריאתי. עם זאת, שיטה זו עומדת בפני קשיים הקשורים cannulation ו קשירת של העורק הריאתי ואת הווריד, גרימת דליפה פוטנציאלית של שפכים ורידי לתוך transudate הלב. הרעיון של שימוש במודל לב הפוכה הוצג לראשונה על ידי קבוצת קמרמאייר, שהפכה את הלב המבודד והמבודד למצב הפוך, והניחה כובע לטקס דק על משטח האפיכארדיאל כדי למדוד ללא הרף את ה- CT ללא זיהום של שפכים ורידיים 8 , 9 . באמצעות הליך זה, CT הוצגה לספק מדד רגיש מאוד של מטבוליטים שוחרר מהלב 9 ,העברה נימית של חומצות שומן 8 , וחלקיקים נגיפיים 10 .
לאחרונה, גורמי פרקרין שיכולים להסדיר את התגובה החיסונית המקומית ולהגדיל את אנגיוגנזה לב 11 היו מעורבים בהשפעות החיוביות של טיפול מבוסס תאי גזע למחלות לב. הניתוח של CT בלב הפוך עשוי לסייע לזהות את הגורמים הפרקריים האישיים הללו באופן כימי. בנוסף, CT עשוי לעזור לזהות את הגורמים המעורבים ההפעלה vivo של תאים חיסוניים בלב.
התיאור המפורט של אוסף ה- CT ממשטח הלב, הניתן כאן, הוא שימושי עבור חוקרים החוקרים את יחסי הגומלין בין תאי החיסון, fibroblasts, תאי האנדותל, ואת cardiomyocytes ביחס לתפקוד הלב הכולל. כפי שצוין לעיל, נוזל interstitial נושאת את המידע לתקשורת תא אל תוך התא, בתוך הלב, WHIch ניתן להעריך בנוחות על ידי אוסף של CT. תיאור טכני מפורט, כולל פרוטוקול וידאו של איך לאסוף CT מן הלב הפוכה, צריך להקל על היישום העתידי של טכניקה ייחודית זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי סוכנות הרגולציה המקומית ( LANUV של Nordrhein-Westfalen, גרמניה) בוצעו על פי הנחיות השימוש בבעלי חיים. בעלי החיים היו מוזנים בדיאטה סטנדרטית של צ'או וקיבלו את מי הברז. כל הציוד והכימיקלים הדרושים לכל שלב של הניסוי זמינים בטבלה של חומרים .
1. הכנת כובע לטקס ו בלון Intraventricular
- יצירת עובש אלומיניום באמצעות מכונת כרסום התואמת את הגודל הממוצע של הלב חולדה (bodyweight של 300-350 גרם). פולנית תבנית עם נייר superfine (10/0) אמרי.
הערה: המדדים המפורטים של התבנית מוצגים בתרשים 1A . - אנכית לתקן את הצוואר של עובש אלומיניום למכונת כרסום כדי להכין את כובע לטקס.
הערה: מכונת הטחינה גורמת לעובי להסתובב לאט. לחלופין, מנוע חשמלי יכול לשמש. Li> - יוצקים 20 מ"ל של לטקס נוזלי (רכש מסחרית, ראה טבלה של חומרים ) לתוך כוס זכוכית 50 מ"ל.
- להנמיך את עובש עד הגוף כולו של עובש שקוע הפתרון לטקס.
- הרם לאט את התבנית (5 ס"מ לדקה) תוך כדי סיבוב.
- שמור סיבוב עובש במשך 15 דקות נוספות, עד לטקס על פני השטח של עובש הוא solidified.
- הוסף על 1 גרם של אבקת טלק על פני השטח של עובש (כבר מכוסה על ידי סרט לטקס דק) כדי למנוע נזק בעת ניתוק.
- בעדינות לנתק עם האצבעות כבר מיובש כובע לטקס משטח עובש; כובע לטקס מוכן כעת לשימוש ( איור 1 ב ).
- חבר את שקע לטקס ל -15 ס"מ צינורות סיליקון (ID = 0.2 מ"מ), המשמש מאוחר יותר עבור אוסף של CT.
- ממלאים את הבלון לטקס חדרית עם מים בתקיפות לתקן אותו על צינור מתכת בצורת L מחובר מזרק 1 מ"ל, מלא מים (> איור 1 ג).
הערה: זה ישמש כדי להבטיח את מיקום זקוף של הלב (ראה להלן). - ודא כי הבלון הוא אטום על ידי ביצוע מספר ניפוח / ניפוח בדיקות עם המזרק המצורף 1 מ"ל.
- חבר את הצינורית, דרך לעצור שלוש פעמים, כדי מתמר הלחץ למדידה העתידית של הלחץ פיתחה intraventricular ( איור 1C ).
2. הכנת קרבס- Henseleit הצפת (KHB) ואת מערכת Langendorff זלוף
- הגדרת מערכת זלוף Langendorff באמצעות זרימה קבועה (מונע על ידי משאבת הרים) או קבוע הלחץ (שנוצר על ידי לחץ סטטי בעמודה זכוכית) במצב.
הערה: פרטים על הכנת Langendorff הלב תוארו בעבר 12 . - הכן 2 L של KHB שונה (ב mM: 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO 4 · 7H 2 O, 1.21 K 2 HPO 4 2 · 2H 2 O, 24.88 NaHCO 3 , 8.30 D גלוקוז, ו 2.0 נתרן pyruvate).
- לשקול את כל הכימיקלים אבל CaCl 2 ו לפזר אותם 1.8 L של מים מזוקקים פעמיים בקבוק 2-L.
- הבועה המדיום עם carbogen (95% O 2 /5% CO 2 ) במשך 5 דקות לפחות עבור איזון (pH: 7.4) תחת ערבוב מגנטי.
- הוסף 0.74 גרם של CaCl 2 .2H 2 O ולהעלות את נפח הכולל ל 2 עם מים מזוקקים פעמיים.
- המשך ערבוב מבעבע בינוני עם פחמן במשך 5 דקות נוספות.
- סינון KHB דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לחסל חלקיקים קטנים שעלולים לחסום את microcirculation של הלב.
- הכנת מערכת זלוף Langendorff.
- מניחים את KHB מסונן לתוך אמבט מים מחומם מראש (38 ° C); לשמור מבעבע עם carbogen כדי ליצור לחץ של 100 ס"מ 2 O InsidE מאגר KHB.
- חבר את המאגר לעמודה זכוכית להקים 100 cmH 2 O לחץ הידרוסטטי עבור זלוף Langendorff עם KHB; להמשיך מבעבע KHB בתוך הטור עם carbogen.
- התאם את הטמפרטורה של מערכת ההתחממות, כך הטמפרטורה בבית השקע אבי העורקים הוא 37 מעלות צלזיוס.
- ודא כי מערכת צינורות הוא ללא בועה.
- לחמצן את KHB עם פחמן במשך 5 דקות נוספות, עד PO 2 ב KHB מגיע 500-600 מ"מ כספית (נמדדת על ידי מנתח גז בדם).
- הגדרת מערכת זלוף לרוץ או בלחץ קבוע של 100 cmH 2 O או בזרימה קבועה של כ 10-20 מ"ל / דקה באמצעות מיתוג ידני. לחלופין, להשתמש בקר משאבת STH להחלפה כדי לעבור באופן מיידי למצב זלוף.
3. בידוד ו cannulation של הלב
הערה: חולדות Wistar זכר עם משקולות של 300-350 גרם שימשו כך גדלים של לבבות תאמו מראש הטלת לטקס. חולדות עברו גם קשירת של העורקים השמאלית יורד (LAD) במשך 50 דקות, ואחריו reperfusion או הופעלו הונאה. פרטים על המתודולוגיה של אינדוקציה של אוטם שריר הלב (MI) דווחו במקום אחר 13 . ניסויי הלב הפוכים בחיות האינפריות בוצעו 5 ימים לאחר הניתוח.
- להרדים חולדות באמצעות מאדה isoflurane (2% V / V) מחובר לחדר בעל חיים מחזיק (20 L).
- מעבירים את החולדות לטבלת הניתוח (לא טמפרטורה מבוקרת) לאחר הרדמה עמוקה הוא הגיע.
- הרם את העור ואת השריר ממש מתחת לחזה באמצעות מלקחיים לחתוך סביב השוליים התחתונים של הצלעות עם מספריים כבדים.
- בעזרת מספריים בסדר, לעשות חתך קטן לתוך הסרעפת, על שולי צלעות. חותכים את הצלעות caudally לעשות דש של הקיר החזה כולו הגחון.
- בעדינות לתפוס את הלב עם האגודל אNd אינדקס ואצבעות באמצע לאט להרים אותו כלפי מעלה, כך כלי הדם להיות מתוח מעט.
- הבלו את הלב עד אבי העורקים נחשף במלואו.
- מניחים את הלב בתוך כוס 100 מ"ל המכיל 50 מ"ל של KHB קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) ולהעביר אותו למנגנון זלוף.
- מיד לעלות על הלב דרך אבי העורקים על צינורית נוטף בבטחה להדק אותו עם תפר (4-0). הימנע בועות אוויר נכנסים ללב.
- החל לחץ זלוף קבוע (100 ס"מ 2 O). לחלופין, קצב זרימה מלא (החל מ 20 מ"ל / דקה) ניתן להחיל.
הערה: הזמן מפתיחת בית החזה כדי המצורף של הלב צינורית זלוף צריך לקחת בערך 3 דקות בידיו של מפעיל מנוסה.
4. הפוך לב דגם
- בעדינות לסובב את צינורית אבי העורקים עד הקיר האחורי של הלב הוא בפנים אל פנים .
- הסר את רקמת החיבור במספרייםכדי לחשוף את הפתיחה של אטריום שמאל, מה שהופך אותו מוכן cannulation intraventricular.
- הכנס את בלון לטקס deflated מחוברת קטטר נוקשה דרך אטריום שמאל לתוך החדר השמאלי.
- לנפח את הבלון עד שהוא ממלא את חלל החדר כולו (נפח מנפח מסומן מראש על המזרק).
- הפוך את הלב עד שהוא הפוך, תומך בו על ידי קטטר בלון תוך תוך ורידי.
- כפי שמוצג בתרשים 1C , לייצב באופן מכני את הלב הפוכה במצב זקוף באמצעות בלון תוך intraventricular עם קטטר מתכת נוקשה.
- התאם את המיקום של הלב כדי למנוע פיתול מוגזם של שורש אבי העורקים.
- התאם את הלחץ diastolic ל 3-5 מ"מ כספית (נמדדת על ידי בלון תוך חדרתי, ראה איור 1C ).
- צפו על פני השטח של הלב של הלב ולוודא כי טיפות קטנות הטופס.
- מניחים את כובע לטקס oאל פני השטח של הלב על ידי דחיפה בעדינות אותו כדי לכסות את הלב כולו באמצעות האצבעות.
- ודא כי מכסה לטקס מכסה את רוב השטח החדר.
- הסר את בועות אוויר, אם בכלל, בתוך הכובע ואת צינורות על ידי מציצה בעדינות עם מזרק 1 מ"ל.
- התאם את הפתיחה הדיסטלית של צינור ה- CT לתת עד 10 ס"מ מתחת לרמה האופקית של הלב.
הערה: הליך זה מבטיח מציצה קלה על ידי לחץ הידרוסטטי שלילי. - איסוף טיפות של CT בצינור 1.5 מ"ל צינור להציב בקרח מעורב 1: 1 עם NaCl. איסוף על 0.15-1.5 מ"ל של CT.
הערה: תערובת הקרח / NaCl מייצבת את הטמפרטורה בצינור האיסוף מתחת לאפס (כ -4 ° C).
הערה: זמן הדגימה תלוי במטרות הניסוי. קצב הזרימה של CT הוא כ 27 ± 20 μL / min בחיות המופעלות בדם (n = 3) ו 100 ± 47 μL / min עבור בעלי חיים ligated כלילית (n = 11). - לשקול ו-להקפיא דגימות CTב חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס למדידות מאוחר יותר.
5. ניתוח של CT
- השתמש נוזל CT לניתוח של מטבוליטים, בהתאם לשאלה המדעית.
הערה: הנתונים המוצגים באיור 2 איור 3 נאספו מתוך זלוף לחץ מתמיד (100 ס"מ 2 O), ועל 0.15-1.5 מ"ל של נוזל CT נאסף בתוך תקופה של 10 דקות. הפעם והנפח היו מספיק עבור proteomic (מינימום: 50 μL, איור 2 ) 14 ו HPLC (מינימום: 20 μL, איור 3 ) 15 ניתוח של purines שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל הלב הפוכה מאפשר איסוף של transstate interstitial הלב בלב מבודד, רטרו perfused חולדה ( איור 1A- C ). כאשר perfused בלחץ קבוע של 100 cmH 2 O, שיעור היווצרות נוזל interstitial נע בין 17 ו 147 μL / min, בהיקף של 0.1-1% של שפכים ורידי הלב כליל בלב בודד.
תכולת החלבון של ה- CT, כפי שנמדדה עם assay bicinchoninic (BCA), נמצאה 1.08 ± 0.40 מ"ג / מ"ל (n = 6). ניתוח חד מימדי ג 'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) חשף מגוון רחב של חלבונים נוכח transudate לב ( איור 2 א ). דו מימדי פלואורסצנטי ההבדל ג'ל אלקטרופורזה (2D-DIGE) בוצעה על CT מהלב נתון 50 דקות של איסכמיה / reperfusion. כמו שמוצג ב Xfig "> איור 2 ב ', נמצאו חלבונים אחדים בבדיקת CT של לב איסכמי, כאשר 70.1% מהחלבונים שזוהו היו חלבוני מטריקס חוץ-תאיים, 4.6% היו חלבונים בממברנה הסלולרית, 17.2% היו חלבונים ציטופלזמיים ו -2.3% חלבונים ( טבלה 1 ).
פורינים נחשבים מזה זמן רב למולקולות איתות מרכזיות המווסתות את התגובה החיסונית של הלב, הטון הווסומטרי ותפקוד הלב, במיוחד לאחר פגיעה איסכמית. אוסף CT מאפשר מדידה של מגוון של מטבוליטים נוכח נוזל interstitial הלב בתנאים phophophysiological, כגון MI. כפי שמוצג בתרשים 3 , הריכוז של AMP, GMP, NADP, אדנוזין, hypoxanthine, חומצת השתן נמדדת על ידי HPLC שבו גבוה יותר בלב איסכמי, אשר דומה לתוצאות שפורסמו בעבר בשיטות אחרות 16 ,Class = "xref"> 17.
טבלה 1: רשימה של חלבונים upregulated ב CT של לב איסכמי. CT מ לב איסכמי נותח על ידי 2D-DIGE ו מזוהה על ידי proteomics. לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.
איור 1: שרטוטים סכמטיים של מודל הלב הפוכה. ( א ) עובש אלומיניום נבנתה מלבב בצורת עכברוש בגודל מתאים. ( ב ) לאחר שקוע עובש לתוך תמיסת לטקס, כובע לטקס, עם עובי של 0.01 מ"מ, היה יצוק. ( ג ) ב Lמנגנון הלב angendorff, הלב היה perfused דרך אבי העורקים באמצעות צינורית אבי העורקים, אשר הפך מאוחר יותר למצב הפוך, ונתמך מכנית על ידי בלון תוך חדרתי ממוקם לתוך החדר השמאלי. Intraventricular לחץ על הלחץ היה פיקוח באמצעות מתמר לחץ. מכסה האטקס מכוסה כמעט 90% משטח הפנים של החדר הימני והשמאלי, והשקע מחובר לצינור הסיליקון (ID = 0.2 מ"מ), כאשר הפתח הדיסטלי הוא 10 ס"מ מתחת לבסיס הלב. זה יצר מעט לחץ הידרוסטטי שלילי. הלב מתרחש הוא נאסף בדרך כלל לתוך הצינון מקורר 1.5 מ"ל צינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: יחסי ציבורניתוח oteomic של CT. חלבונים ב CT הופרדו על ידי SDS-PAGE ( A ) ו מזוהה על ידי ניתוח DIGE 2D ( B ). עבור (A), נתיבים 1-4 מצביעים על דגימות לב מהלב היחיד (1 ו -2 = דמה, 3 ו -4 = אוטם). עבור (B), 2D-DIGE בוצע על CT מ בלב infarcted. זהות החלבון אושרה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) -MS / MS 14 , 15 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Purines ב- CT. שונים purines הנוכחי של CT נותחו על ידי HPLC. נציג HPLC פועל מתוך הלבשה (כחול) ו infarcted (שחור) הלב להראות כי הלב infarcted מוצג גבוה יותרריכוז interstitial של AMP ו אדנוזין, אבל לא hypoxanthine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל הלב הפוכה מבוסס על טכניקת זלוף הלב המבוצעת היטב של Langendorff 12 , והיא מבוצעת על ידי הפיכת הלב למצב הפוך ולהחזקה בתנוחה זו באמצעות קטטר נוקשה בתוך חדר הבלון. בדרך זו, transudate interstitial הלב יכול להיות מופרד פיזית מן perfusate כלילי ורידי, נוטף על ידי כוח הכבידה מן הבסיס של הלב 9 . CT ניתן לאסוף ברציפות באמצעות כובע לטקס דק וגמיש להציב על פני השטח של הלב כולו.
השיטה קלה לביצוע, עם עלות מינימלית בנוסף לזה של מנגנון Langendorff. עם זאת, כמה צעדים הם קריטיים מבחינה טכנית להשגת תוצאות לשחזור ויציב. אלה כוללים להבטיח כי מכסה לטקס מתאים בצורה נכונה את הצורה של הלב ואת מכסה על 90% משטח פני החדר, לא את הפרוזדורים. הזמן מהוא הלב מן החיה כדי הביצועים של רטרו-זלוף צריך להיות פחות מ 3 דקות, כמו איסכמיה ממושכת נושאת את הסיכון של שינוי חילוף החומרים של הלב ואת היווצרות transudate לב. הלחץ הדיאסטולי השמאלי של החדר, הנמדד על ידי הבלון תוך חדרתי, צריך להיות מוגדר כדי למלא את חלל החדר (3-5 מ"מ כספית). בלון מנופח יתר על המידה עשוי לשנות את זרימת הלב על ידי דחיסת כלי הדם. בקבוקון הדגימה (צינור 1.5 מ"ל) צריך להישמר על הקרח, כדי למנוע השפלה פוטנציאלית של מטבוליטים חלבונים של עניין.
בנוסף, ניסויים מוצלחים תלויים בצורה ביקורתית על טיפול ידני טוב במהלך ההכנה, בידוד, ו cannulation של הלב. זה דורש בפועל. כדי להגן על לבם מפני נזק איסכמי, כל ההכנות צריך להתבצע עם KHB קר כקרח. מאז הגדלים של הלבבות עשויים להשתנות בין חולדות, למרות משקולות דומות, מומלץ לקבל כמוסות לטקס מוכן עם קלY ממדים שונים המתאימים לגדלים שונים של הלבבות.
השיטה מבודדת לב הלב תוארה בעבר עבור חולדה מבודד 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 ו גינאה חזיר הלב 16 ו שימש למטרות שונות. בתיאור הנוכחי שלנו של המתודולוגיה, יש לנו הציג כמה שינויים ההתקנה ניסיוני לעיבוד מדגם. לדוגמה, את cannulation של העורק הריאתי, כפי שהציג דה Deckere et al. 7 , לא בוצע כאן, שכן המיקום הפוכה של הלב מונע זיהום פוטנציאלי עם perfusate שפכים ורידי. התקן האיסוף עבור CT היה פשוט על ידי הצגת לחץ שלילי קל על ידי הפחתת הפתיחה של CT-leti לתתNg עד 10 ס"מ מתחת הלב הפוכה. זה מקל על מנת מיד מגניב את דגימות transudate. כדי להבטיח את הקירור המהיר של CT המדגם, כוסות איסוף היו precooled לטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על ידי הצבת אותם בתערובת נפח שווה של קרח NaCl ( כלומר, יחס 1: 1). זה איפשר את הקירור המהיר של דגימות CT שנאספו.
באופן כללי, יש לזכור כי הלב עכברוש מבודד שונה בתנאים פיזיולוגיים vivo , כי היווצרות נוזל interstitial סביר להניח פחות מאשר בלב מלוחים perfused. CT שנוצר על ידי לב בודד ולכן לא יכול לחקות לחלוטין את ההרכב האמיתי של נוזל interstitial vivo . בנוסף, ההתקנה הנוכחית אינה מאפשרת את הרחקה מלאה של זיהום פוטנציאלי עם perfossate ורידים שפכים. עם זאת, מאז שקע ורידי ממוקם בבסיס הלב (הרמה הנמוכה ביותר של הלב זקוף), אנחנו לא מאמיניםכי זיהום תורם לתהליך איסוף.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ייחודית לדגימה נוזל interstitial הלב, אשר מכיל שפע של מטבוליטים וחלבונים משוחררים לתוך נוזל interstitial ידי cardiomyocytes ותאי לב לא, כגון תאים חיסוניים, תאים אנדותל, תאי שריר חלקים של כלי הדם, fibroblasts, ו Pericytes. Transudate interstitial הלב נוצר כתוצאה של התחבורה נוזל על פני המכשול האנדותל 10 , יחד עם חלק קטן של נוזל הלימפה. הוא מכיל תערובת של מטבוליטים לבביים 7 , גורמים מסיסים בחלל interstitial, ו secretomes של הלב ו / או תאים לב לא 9 . לכן, מספר סוגי תאים לתרום להיווצרות של CT. בנוסף, ישנם מספר גורמים המשפיעים על קצב היווצרות. ראשית, לחץ אונקוטי נראה כגורם עיקרי המווסת את טרשת נפוצהתנועת נוזל Ary, שכן הגידול בלחץ אונקוטי על ידי הוספת dextran או אלבומין למדיום זלוף הקטינה באופן משמעותי את היווצרות CT 9 , 10 . שנית, עלייה חדירות וסקולרית במהלך היפוקסיה 9 , 16 , כולל MI, מגביר את extravasation של perfusate ולכן היווצרות של CT. לכן, במחקרים עתידיים, הגידול בלחץ אונקוטי עשוי להיות אמצעי מתאים כדי למזער את נפח CT, ובכך להעשיר את מולקולות היעד של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי NSFC 81570244, Foko 23/2013, SFB 1116 / B01 ועל ידי מכון המחקר לב וכלי דם דיסלדורף (CARID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
