Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Het omgekeerde hartmodel voor de interstitiële transudate-collectie van het Geïsoleerde Rat Hart

Published: June 20, 2017 doi: 10.3791/55849
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft een methode om hart interstitiële vloeistof uit het geïsoleerde, geperfuseerde rat hart te verzamelen. Om het interstitiële transudaat fysisch te scheiden van coronaire veneuze effluentperfusaat, wordt het geperfereerde hart van Langendorff omgekeerd en wordt de transudaat (interstitiële vloeistof) gevormd op het hartoppervlak verzameld met behulp van een zachte latexdop.

Abstract

Het onderhavige protocol beschrijft een unieke aanpak die het verzamelen van cardiale transudaat (CT) in staat stelt uit het geïsoleerde, zoutoplossing-geruceerde rat hart. Na de isolatie en retrograde perfusie van het hart volgens de Langendorff techniek, wordt het hart omgekeerd in een ondersteboven positie en wordt mechanisch gestabiliseerd door een ballonkatheter die in de linker ventrikel wordt ingebracht. Vervolgens wordt een dun latexdop - voorheen gegoten die overeenkomt met de gemiddelde grootte van het rathart - over het epicardiale oppervlak geplaatst. De uitlaat van de latexdop is verbonden met siliconenbuis, met de distale opening 10 cm onder het basisniveau van het hart, waardoor een kleine zuigvorming wordt veroorzaakt. CT die voortdurend op het epicardiale oppervlak wordt geproduceerd, wordt verzameld in ijskoude flesjes voor verdere analyse. De snelheid van CT-vorming varieerde van 17 tot 147 μl / min (n = 14) in controle- en infarcte harten, die 0,1-1% van het coronaire veneuze effluentperfusaat vertegenwoordigt. Proteomische analyse en hoge perfoRmance vloeistofchromatografie (HPLC) bleek dat de verzamelde CT een breed spectrum van eiwitten en purinergische metabolieten bevat.

Introduction

Hartfalen (HF) is de belangrijkste doodsoorzaak bij mensen wereldwijd 1 . HF komt vaak voor door myocarditis, ischemische beledigingen voor het myocardium, en linker ventriculaire remodeling, wat leidt tot de progressieve verslechtering van de hartcontractiele functie en de levenskwaliteit van de patiënten. Hoewel de vooruitgang in cardiologie en hartchirurgie de HF-sterfte aanzienlijk verlaagd heeft, dienen zij alleen als voorbijgaande "vertragers" van een onvermijdelijk progressief ziekteproces dat significante morbiditeit draagt. Daarom onderstreept het huidige gebrek aan effectieve behandeling de noodzaak om nieuwe moleculaire doelen te identificeren die HF kunnen voorkomen of zelfs keren. Dit omvat veranderingen in de extracellulaire matrix, ongecontroleerde cardiale immuunrespons en interacties tussen hart- en niet-cardiale cellen 2 .

Het is belangrijk om te erkennen dat de micro-omgeving die hartcellen aan direc zijn blootgesteldTly vormt de immuun- en regeneratieve reactie van het gewonde hart. In het geïsoleerde, zoutoplossende hart wordt CT op het hartoppervlak gegenereerd in de vorm van kleine druppels die afkomstig zijn uit de interstitiële vloeistofruimte ( dwz micro-omgeving), zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden 3 , 4 , 5 . Daarom kan analyse van de CT (interstitiële vloeistof) helpen bij het identificeren van factoren die hart metabolisme en contractiele functie 6 regelen of de immuuncelfuncties beïnvloeden na migratie in het gewond hart. Eventueel kan dit leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van HF.

De collectie van CT uit muizenharten is technisch uitdagend. In regelmatige Langendorff-perfuse harten is de exclusieve collectie CT moeilijk omdat het mengsel van de CT met coronair isY veneuze effluent perfusaat verdient onvoorspelbaar elke concentratie van metabolieten / enzymen die vrijkomen uit de interstitiële ruimte. Een mogelijke strategie om deze beperking te overwinnen is het veneuze effluent uit te sluiten door de pulmonale kannulering en de pulmonale ader 7 gelijktijdig te ligeren. Deze werkwijze is echter geconfronteerd met problemen die verband houden met de kanulatie en ligatie van de pulmonale slagader en ader, waardoor potentiële lekkage van veneus effluent in het harttranssudaat wordt veroorzaakt. Het concept van het gebruik van een omgekeerd hartmodel werd voor het eerst geïntroduceerd door de groep Kammermeier, die het geïsoleerde, geperfumeerde hart in een omgekeerde positie omgekeerde en een dun latexdop op het epicardiale oppervlak plaatste om CT continu aan te nemen zonder de vervuiling van het veneuze effluent 8 , 9 . Met behulp van deze procedure bleek CT te beschikken over een zeer gevoelige maatregel van de metabolieten die uit het hart 9 vrijkomen,De capillaire overdracht van vetzuren 8 en virale deeltjes 10 .

Meer recentelijk hebben paracriene factoren die de lokale immuunrespons kunnen reguleren en cardiale angiogenese 11 kunnen vergroten, betrokken bij de gunstige effecten van stamcellen gebaseerde therapie bij hartziekten. De analyse van CT in het omgekeerde hart kan helpen om deze individuele paracriene factoren chemisch te identificeren. Daarnaast kan CT helpen bij het identificeren van de factoren die betrokken zijn bij de in vivo activering van immuuncellen in het hart.

De gedetailleerde beschrijving van de CT-collectie van het hartoppervlak, dat hier wordt verschaft, is experimenteel nuttig voor onderzoekers die het interactie van immuuncellen, fibroblasten, endotheelcellen en cardiomyocyten interpreteren met betrekking tot de algemene hartfunctie. Zoals hierboven vermeld, draagt ​​de interstitiële vloeistof de informatie voor cel-naar-celcommunicatie binnen het hart, whHet kan gemakkelijk worden beoordeeld door de collectie van CT. De gedetailleerde technische beschrijving, inclusief een videoprotocol om CT van het omgekeerde hart te verzamelen, zou de toekomstige toepassing van deze unieke techniek moeten vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door het lokale regelgevende agentschap ( LANUV van Nordrhein-Westfalen, Duitsland) en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van dierlijk gebruik. Dieren werden gevoed met een standaard chow dieet en kreeg kraanwater ad libitum . Alle apparatuur en chemicaliën die nodig zijn voor elke stap van het experiment zijn verkrijgbaar in de Tabel .

1. Voorbereiding van de Latex Cap en Intraventriculaire Ballon

  1. Maak een aluminium schimmel met een freesmachine die overeenkomt met de gemiddelde grootte van het rat hart (lichaamsgewicht van 300-350 g). Polijst de vorm met superfijn (10/0) ​​emery papier.
    OPMERKING: De gedetailleerde metrics van de mal zijn weergegeven in figuur 1A .
  2. Maak de nek van de aluminiumvorm op de freesmachine verticaal om de latexdop te bereiden.
    OPMERKING: De freesmachine laat de matrijs langzaam roteren. Alternatief kan een elektrische motor gebruikt worden. li>
  3. Giet 20 ml vloeibare latex (commercieel aangekocht, zie de Tabel van Materialen ) in een 50 ml glazen beker.
  4. Laat de vorm dalen tot het gehele lichaam van de vorm in de latexoplossing wordt gedompeld.
  5. Til de vorm langzaam (5 cm / min) langzaam op terwijl u draait.
  6. Houd de vorm nog 15 minuten langer in rotatie totdat de latex op het oppervlak van de mal wordt gestoldeerd.
  7. Voeg ongeveer 1 g talkpoeier toe aan het oppervlak van de mal (al bedekt met een dun latex film) om schade te voorkomen tijdens het losmaken.
  8. Verwijder voorzichtig met de vingers de reeds gedroogde latexdop van het vormoppervlak; De latex cap is nu klaar voor gebruik ( figuur 1B ).
  9. Sluit de uitlaat van de latexdop aan op 15 cm siliconenpijp (ID = 0,2 mm), die later gebruikt wordt voor de verzameling van CT.
  10. Vul de ventriculaire latexballon met water en bevestig hem stevig op een L-vormige metalen canule die is verbonden met een 1 ml, watergevulde spuit (> Figuur 1C).
    OPMERKING: Dit wordt gebruikt om de rechtop positionering van het hart te waarborgen (zie hieronder).
  11. Zorg ervoor dat de ballon luchtdicht is door meerdere afblaas- / opblaasproeven met de bijgevoegde 1 ml spuit uit te voeren.
  12. Verbind de canule via een driewegstop naar een drukomvormer voor de toekomstige meting van de intraventriculaire ontwikkelde druk ( Figuur 1C ).

2. Bereiding van Krebs-Henseleit Buffer (KHB) en het Langendorff Perfusion System

  1. Stel een Langendorff perfusie systeem in door gebruik te maken van een constante stroom (aangedreven door een roller pomp) of constante druk (gegenereerd door statische druk in een glazen kolom) modus.
    OPMERKING: Details van de Langendorff hartpreparatie zijn eerder beschreven 12 .
  2. Bereid 2 L van een gemodificeerd KHB (in mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4 · 7H20, 1,21 K2HP04
  3. Weeg alle chemicaliën maar CaCl 2 en los ze op in 1,8 liter dubbel gedistilleerd water in een 2-liter fles.
  4. Bubble het medium met carbogen (95% O2 / 5% CO2) gedurende tenminste 5 minuten voor evenwicht (pH: 7,4) onder magnetisch roeren.
  5. Voeg 0,74 g CaCl2 .2H20 toe en breng het totale volume op tot 2 liter met dubbel gedestilleerd water.
  6. Ga verder met roeren en bubbel het medium met carbogen gedurende nog eens 5 minuten.
  7. Filter de KHB door een 0.2 μm filter om kleine deeltjes te elimineren die de microcirculatie van het hart kunnen belemmeren.
  • Bereiding van het Langendorff perfusiesysteem.
    1. Plaats het gefilterde KHB in een voorverwarmd waterbad (38 ° C); Blijf borrelend met carbogeen om een ​​druk van 100 cmH2O insidue te genererenE het KHB reservoir.
    2. Verbind het reservoir met de glazen kolom om 100 cmH 2 O hydrostatische druk te bepalen voor de Langendorff perfusie met KHB; Blijf de KHB in de kolom blijven bubberen met carbogen.
    3. Stel de temperatuur van het verwarmingssysteem in, zodat de temperatuur bij de aorta canule uitlaat 37 ° C is.
    4. Zorg ervoor dat het buissysteem belvrij is.
    5. Oxygenate het KHB met carbogen gedurende nog eens 5 minuten totdat de PO 2 in het KHB 500-600 mmHg bereikt (gemeten door een bloedgasanalysator).
  • Stel het perfusiesysteem in om met een constante druk van 100 cmH 2O of bij een constante stroom van ongeveer 10-20 ml / min te draaien met handmatig schakelen. Alternatief, gebruik een verwisselbare STH pomp controller om direct over te schakelen naar de perfusie modus.
  • 3. Isolatie en Cannulatie van het Hart

    OPMERKING: Mannelijke Wistar ratten met lichaamsgewichten van 300-350 g werden gebruikt, zodat de afmetingen van de harten overeenstemmen met de voorgegoten latex cap. Ratten ondergaan een ligatie van de linker arteriële aflopende (LAD) gedurende 50 minuten, gevolgd door reperfusie of sham opereren. Details van de methode voor de inductie van myocardinfarct (MI) werden elders gerapporteerd 13 . De omkerende experimenten in de infarctdieren werden 5 dagen na de operatie uitgevoerd.

    1. Verdovende ratten met behulp van een isofluraan verdamper (2% V / V) verbonden met een dierenhouderkamer (20 L).
    2. Breng de ratten naar een operatietafel (niet temperatuurgestuurd) nadat de verdoving bereikt is.
    3. Hef de huid en spier net onder de sternum met behulp van tang en snijd de onderste rand van de ribben met zware scharen.
    4. Gebruik fijne scharen, maak een kleine snede in het diafragma, aan de ribmarge. Knip de ribben caudaal om een ​​flap van de hele ventrale borstwand te maken.
    5. Pak het hart voorzichtig met de duim aNd-index en middelste vingers en haal het langzaam omhoog omhoog zodat de hartvaten lichtjes worden gestrekt.
    6. Accijns het hart tot de aorta volledig is blootgesteld.
    7. Plaats het hart in een 100 ml beker die 50 ml ijskoud KHB (4 ° C) bevat en verplaats het naar het perfusieapparaat.
    8. Monteer het hart onmiddellijk via de aorta op een druppelende canule en stevig vast met een hechting (4-0). Vermijd luchtbellen die in het hart komen.
    9. Dien de constante perfusiedruk toe (100 cmH 2 O). Als alternatief kan een volle stromingssnelheid (beginnend met 20 ml / min) worden toegepast.
      Opmerking: De tijd vanaf de opening van de thorax naar de gehechtheid van het hart tot de perfusie canule moet ongeveer 3 minuten in de handen van een ervaren operator nemen.

    4. Terugkerend-hartmodel

    1. Draai de aorta canule voorzichtig tot de achterste wand van het hart in een gezichtsbezichting staat .
    2. Verwijder het bindweefsel met een schaarOm de opening van het linker atrium bloot te stellen, waardoor het klaar is voor intraventriculaire canulatie.
    3. Plaats de ontlate latexballon die via een linker atrium in het linker ventrikel aan een stijve katheter is bevestigd.
    4. Blader de ballon totdat het de hele ventriculaire holte invult (het opblaasvolume is vooraf gemarkeerd op de spuit).
    5. Keer het hart om tot het ondersteboven is, ondersteund door de intraventriculaire ballonkatheter.
    6. Zoals getoond in figuur 1C , stabiliseert het omgekeerde hart mechanisch in een staande positie met behulp van de intraventriculaire ballon met een stijve metalen katheter.
    7. Pas de positie van het hart aan om overmatige verdraaiing van de aortische wortel te vermijden.
    8. Stel de diastolische druk in op 3-5 mmHg (gemeten door de intra-ventriculaire ballon, zie figuur 1C ).
    9. Let op het epicardiale oppervlak van het hart en zorg ervoor dat kleine druppels vormen.
    10. Plaats de latex cap oNto het oppervlak van het hart door het voorzichtig te duwen om het hele hart met de vingers te bedekken.
    11. Zorg ervoor dat de latexdop het merendeel van het ventriculaire oppervlak bedekt.
    12. Verwijder de luchtbellen, indien aanwezig, in de dop en de buis door zachtjes te zuigen met een 1 ml spuit.
    13. Verstel de distale opening van de CT-slangen tot 10 cm onder het horizontale niveau van het hart.
      OPMERKING: Deze procedure zorgt voor een kleine zuiging door negatieve hydrostatische druk.
    14. Verzamel druppels CT in een 1,5 ml collectie buis geplaatst in ijs gemengd 1: 1 met NaCl. Verzamel ongeveer 0,15-1,5 ml CT.
      OPMERKING: Het ijs / NaCl mengsel stabiliseert de temperatuur in de verzamelbuis tot onder nul (ongeveer -4 ° C).
      OPMERKING: De bemonsteringstijd hangt af van het experimentele doel. De stromingssnelheid van de CT is ongeveer 27 ± 20 μl / min in schuimbeheerde dieren (n = 3) en 100 ± 47 μl / min voor de coronaire ligaten (n = 11).
    15. Weeg en snap-freeze CT-monstersIn vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C voor latere metingen.

    5. Analyse van de CT

    1. Gebruik de CT-vloeistof voor de analyse van metabolieten, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag.
      OPMERKING: De gegevens in Figuur 2 en Figuur 3 werden verzameld uit een constante druk perfusie (100 cmH20) en ongeveer 0,15-1,5 ml CT vloeistof werd verzameld binnen een periode van 10 minuten. Deze tijd en volume waren voldoende voor de proteomische (minimum: 50 μL, Figuur 2 ) 14 en HPLC (minimum: 20 μL; Figuur 3 ) analyse van verschillende purines.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Het omgekeerde hartmodel maakt het mogelijk om hart interstitiële transudaat in een geïsoleerde retro-perfuse rat hart te maken ( Figuur 1A- C ). Bij perfusie bij een constante druk van 100 cmH20 var de mate van interstitiële vloeistofvorming tussen 17 en 147 μl / min, wat 0,1-1% van het coronaire veneuze effluent in het geïsoleerde hart bedroeg.

    Het eiwitgehalte van de CT, gemeten met de bicinchoninezuur (BCA) -assay, bleek 1,08 ± 0,40 mg / ml (n = 6) te zijn. Eendimensionale gelelektroforese analyse (SDS-PAGE) onthulde een breed spectrum van eiwitten die aanwezig zijn in het harttranssudaat ( Figuur 2A ). Tweedimensionale fluorescentieverschillen gelelektroforese (2D-DIGE) werd uitgevoerd op CT van het hart onderworpen aan 50 minuten ischemie / reperfusie. Zoals getoond in Xfig "> Figuur 2B bleek dat verschillende eiwitten in de CT van de ischemische harten werden gereguleerd. Onder de geïdentificeerde eiwitten waren 70,1% extracellulaire matrix eiwitten, 4,6% cellulaire membraan eiwitten, 17,2% cytoplasmatische eiwitten en 2,3% nucleair Eiwitten ( tabel 1 ).

    Purines zijn al lange tijd beschouwd als zwenkbare signaalmoleculen die de cardiale immuunrespons, vasomotorische toon en hartfunctie regelen, met name na ischemische verwonding. De collectie van CT laat de meting van een verscheidenheid aan metabolieten die aanwezig zijn in de hartinterstitiële vloeistof onder pathofysiologische omstandigheden, zoals MI, toe. Zoals getoond in Figuur 3 is de concentratie van AMP, GMP, NADP, adenosine, hypoxanthine en urinezuur gemeten door HPLC waar hoger in het ischemische hart, wat vergelijkbaar is met de resultaten die eerder zijn gemeld met behulp van andere methoden 16 ,Class = "xref"> 17.

    tafel 1
    Tabel 1: Lijst van upregulated eiwitten in de CT van ischemische harten. CT uit ischemische harten werd geanalyseerd door 2D-DIGE en geïdentificeerd door proteomics. Klik hier om deze tafel te downloaden.

    Figuur 1
    Figuur 1: Schematische tekeningen van het omgekeerde hartmodel. ( A ) Een aluminium schimmel werd geconstrueerd uit een adequaat gevormde en grote rat hart. ( B ) Na het dompelen van de mal in latexoplossing werd een latexdop met een dikte van ongeveer 0,01 mm gegoten. ( C ) In een LAngendorff hartapparaat, werd het hart via de aorta geperfuseerd door gebruik te maken van een aorta canule, die later in een ondersteboven positie omgekeerd werd en mechanisch ondersteund werd door een intra-ventriculaire ballon die in de linker ventrikel werd geplaatst. Intraventriculaire drukontwikkeling werd gecontroleerd via een druk transducer. De latexdop bedekte bijna 90% van het oppervlak van zowel de rechter- als linker ventrikel, en de uitlaat was verbonden met siliciumbuis (ID = 0,2 mm), met de distale opening 10 cm onder de basis van het hart. Dit leidde licht negatieve hydrostatische druk op. Het harttranssudaat Wordt gewoonlijk verzameld in een ijsgekoelde, 1,5 ml buis. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2: PrOteomische analyse van de CT. Proteïnen in de CT werden gescheiden door SDS-PAGE ( A ) en geïdentificeerd door 2D-DIGE analyse ( B ). Voor (A) geven rijstroken 1-4 hartmonsters van individuele harten aan (1 en 2 = sham; 3 en 4 = infarcted). Voor (B) werd 2D-DIGE uitgevoerd op de CT van een infarct hart. De eiwitidentiteit werd bevestigd door vloeistofchromatografie (LC) -MS / MS 14 , 15 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 3
    Figuur 3: Purines in de CT. Verschillende purines aanwezig in de CT werden geanalyseerd door HPLC. Representatieve HPLC-runs uit het sham (blauw) en het infarct (zwart) hart tonen aan dat het infarct hart een hogereInterstitiële concentratie van AMP en adenosine, maar niet hypoxanthine. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Het omgekeerde hartmodel is gebaseerd op de gevestigde Langendorff-hart perfusie-techniek 12 en wordt uitgevoerd door het hart in een omgekeerde positie te omkeren en deze positie vast te houden door middel van een starre intra-ventriculaire ballonkatheter. Op deze manier kan cardiale interstitiële transudaat fysiek gescheiden zijn van coronaire veneuze effluentperfusaat, die door de zwaartekracht van de basis van het hart druppelt. De CT kan continu worden verzameld door middel van een dunne en flexibele latex cap op het oppervlak van het gehele hart.

    De methode is eenvoudig uit te voeren, met minimale kosten naast die van het Langendorff apparaat. Niettemin zijn enkele stappen technisch kritisch voor het verkrijgen van reproduceerbare en stabiele resultaten. Deze omvatten onder andere het verzekeren dat de latex cap goed past bij de vorm van de harten en ongeveer 90% van het oppervlak van de ventrikels, niet de atria, bedekt. De tijd van excHet hart van het dier tot de prestatie van de retroperfusie zou moeten zijn, moet minder dan 3 minuten zijn, aangezien langdurige ischemie het risico heeft op het veranderen van hartstofmetabolisme en de vorming van cardiale transudaat. De diastolische linker ventriculaire druk, gemeten door de intraventriculaire ballon, moet worden ingesteld om de ventriculaire holte te vullen (3-5 mmHg). Een overbelaste ballon kan coronaire stroming door vasculaire compressie veranderen. De bemonsteringsflesje (1,5 ml buis) moet op ijs worden gehouden om mogelijke afbraak van metabolieten en eiwitten van belang te voorkomen.

    Daarnaast zijn succesvolle experimenten kritisch afhankelijk van goede handmatige hantering tijdens de voorbereiding, isolatie en canulatie van het hart. Dit vereist oefening. Om harten te beschermen tegen ischemische schade, moeten alle preparaten worden uitgevoerd met ijskoud KHB. Aangezien de grootte van de harten kan variëren tussen ratten, ondanks soortgelijke lichaamsgewichten, is het raadzaam om latex caps op te stellen met lichteY verschillende afmetingen die passen bij de verschillende maten van de harten.

    De geïsoleerde omgekeerde hartmethode is eerder beschreven voor de geïsoleerde rat 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 en cavia hart 16 en werd gebruikt voor verschillende doeleinden. In onze huidige beschrijving van de methodologie hebben we enkele wijzigingen aangebracht in de experimentele opstelling en de verwerking proeven. Bijvoorbeeld, de cannulatie van de pulmonale slagader, zoals geïntroduceerd door de Deckere et al. 7 , werd hier niet uitgevoerd, aangezien de omgekeerde positie van het hart mogelijke vervuiling voorkomt met veneuze effluent perfusaat. De verzamelinrichting voor CT werd vereenvoudigd door een kleine negatieve druk in te voeren door de opening van de CT-verhuurbad te verlagenNg tot 10 cm onder het omgekeerde hart. Dit maakt het makkelijker om de transudaatmonsters direct af te koelen. Om de snelle afkoeling van het monster CT te waarborgen, werden de verzamelkoppen voorafgekookt tot een temperatuur van -4 ° C door ze in een gelijke hoeveelheid ijs en NaCl te plaatsen (dat wil zeggen een verhouding van 1: 1). Dit zorgde voor de snelle koeling van de verzamelde CT-monsters.

    In het algemeen moet men in gedachten houden dat het geïsoleerde rat hart verschilt van in vivo fysiologische aandoeningen, doordat de interstitiële vloeistofvorming waarschijnlijk minder is dan in het zoutoplossend hart. De CT die door het geïsoleerde hart gevormd wordt, kan derhalve niet de ware samenstelling van de in-vivo interstitiële vloeistof volledig nabootsen. Bovendien staat de huidige opstelling niet toe dat de mogelijke besmetting met veneuze effluent perfusaat volledig wordt uitgesloten. Aangezien de veneuze afvoer zich bevindt op de hartbasis (het laagste niveau van het rechtop hart), geloven wij nietDie besmetting draagt ​​bij aan het inzamelingsproces.

    Het onderhavige protocol beschrijft een unieke methode om hart interstitiële vloeistof te proeven, die een veelheid van metabolieten en eiwitten bevat die in de interstitiële vloeistof worden vrijgegeven door cardiomyocyten en niet-hartcellen, zoals immuuncellen, endothelcellen, vasculaire gladde spiercellen, fibroblasten en pericyten. Hart interstitiële transudaat wordt gevormd als gevolg van vloeistoftransport over de endotheliale barrière 10 , samen met een kleine fractie lymfevloeistof. Het bevat een mengsel van cardiale metabolieten 7 , oplosbare factoren in de interstitiële ruimte en secretomen van hart- en / of niet-cardiale cellen 9 . Daarom dragen verschillende celtypes bij aan de vorming van CT. Daarnaast zijn er verschillende factoren die de snelheid van de vorming beïnvloeden. Ten eerste lijkt oncotische druk een belangrijke determinant die trans-capill regeltAry vloeistofbeweging, aangezien de toename van oncotische druk door dextran of albumine toe te voegen aan het perfusiemedium de vorming van CT 9 , 10 aanzienlijk verminderde. Ten tweede, een toename van de vaatpermeabiliteit tijdens hypoxie 9 , 16 , inclusief MI, versterkt de extravasatie van het perfusaat en daarmee de vorming van CT. Daarom kan in toekomstige studies de toename van oncotische druk een geschikt middel zijn om het volume van CT te minimaliseren, waardoor de gerichte moleculen van belang worden verrijkt.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

    Acknowledgments

    Deze studie werd gefinancierd door NSFC 81570244, FoKo 23/2013, en SFB 1116 / B01 en door het Cardiovasculaire Onderzoeksinstituut Düsseldorf (CARID).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Latex Solution ProChemie Z-Latex LA-TZ http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
    Aluminum Mold Home made - Reverse heart model
    Universal Ovens Memmert UNB 400 Reverse heart model
    Latex Balloon Hugo Sachs Size 4 Reverse heart model
    Milling Machine Proxxon MF70 Reverse heart model
    Sodium Chloride Sigma SZBD0810V Chemicals
    Sodium Hydrogen Carbonate Roth 68852 Chemicals
    Potassium Chloride Merck 49361 Chemicals
    Magnesium Sulphate Heptahydrate Merck 58861 Chemicals
    Potassium Dihydrogen Phosphate Merck 48731 Chemicals
    D(+)-Glucose Anhydrous Merck 83371 Chemicals
    Calcium Chloride Dihydrate Fluka 21097 Chemicals
    Balance VWR SE 1202 Weighing chemicals
    Double Distilled Water Millpore - Disolving chemicals
    Medical Pressure Transducer Gold - Langendorff apparatus
    Medical Flow Probe Transonic 3PXN Langendorff apparatus
    Heating Circulating Bath Haake  B3 ; DC1 Langendorff apparatus
    Laboratory and Vaccum Tubing Tygon R-3603 Langendorff apparatus
    Animal Research Flowmeters Transonic T206 Langendorff apparatus
    PowerLab Data Acquisition Device AD Instruments Chart 7.1 Langendorff apparatus
    LabChart Data Acquisition Software AD Instruments Chart 7.1 Langendorff apparatus
    Peristaltic Pump Glison MINIPULS 3 Langendorff apparatus
    Glass Water Column home made - Langendorff apparatus
    Water Bath Protective Agent VWR 462-7000 Langendorff apparatus
    Sterile Disposable Filters (0.2 µm) Thermo Scientific 595-4520 Langendorff apparatus
    Blood gas analyzers Radiometer ABL90 FLEX PLUS Gas analyzer
    70% ethanol VWR UN1170 Cleaning  tubings
    100% ethanol Merck 64-17-5 Cleaning tubings
    Wistar Rats Janvier - Animals
    Stainless Scissors AESCULAP BC702R Surgical Instruments
    Stainless Scissors AESCULAP BC257R Surgical Instruments
    Big Forceps AESCULAP - Surgical Instruments
    8m/m Stainless Forceps F.S.T 11052-10 Surgical Instruments
    superfine (10/0) emery paper 3M 051111-11694 Reverse heart model

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
    2. Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
    3. Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
    4. de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
    5. Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
    6. Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
    7. De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
    8. Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
    9. Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
    10. Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
    11. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
    12. Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
    13. Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
    14. Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
    15. Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
    16. Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
    17. Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).

    Tags

    Geneeskunde nummer 124 Langendorff perfusie omgekeerd hart rat interstitiële vloeistof myocardinfarct HPLC proteomics
    Het omgekeerde hartmodel voor de interstitiële transudate-collectie van het Geïsoleerde Rat Hart
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Tan, K., Ding, Z., Steckel, B.,More

    Tan, K., Ding, Z., Steckel, B., Hartwig, S., Lehr, S., Deng, X., Schrader, J. The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart. J. Vis. Exp. (124), e55849, doi:10.3791/55849 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter