Summary
이 프로토콜은 고립 된, 관류 쥐 심장에서 심장 간질 유체를 수집하는 방법을 설명합니다. 관상 정맥 유출 물 관류 액으로부터 간질 혈관 유출 물을 물리적으로 분리하기 위해 관류 액 Langendorff가 반전되고 심장 표면에 형성된 유액 (간질 액)이 부드러운 라텍스 캡을 사용하여 수집됩니다.
Abstract
현재의 프로토콜은 고립 된, 염분 - 관류 쥐 심장에서 심장 transudate (CT)의 수집을 가능하게 독특한 접근 방식을 설명합니다. Langendorff 기술에 따라 심장의 격리 및 역류 관류 후 심장은 거꾸로 된 위치로 거꾸로 뒤집히고 좌심실에 삽입 된 풍선 카테터로 기계적으로 안정화됩니다. 그런 다음 얇은 라텍스 캡 (이전에 랫트 심장의 평균 크기와 일치하도록 캐스트)이 심 외막 표면 위에 배치됩니다. 라텍스 캡의 배출구는 실리콘 튜브에 연결되어 있으며, 심장의 기저부 아래 10cm 떨어진 원위 구멍이있어 약간의 흡입력을 생성합니다. 심 외막 표면에서 지속적으로 생성 된 CT는 추후 분석을 위해 얼음 냉각 바이알에 수집됩니다. 관상 동맥 정맥 유출 물 관류 액의 0.1-1 %를 차지하는 대조군과 경색 심전도에서 CT 생성 속도는 17 ~ 147 μL / min (n = 14)이었다. 프로테옴 분석 및 높은 perfo액상 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 수집 된 CT가 넓은 범위의 단백질과 푸린 일 대사 산물을 함유하고 있음을 보여주었습니다.
Introduction
심장 마비 (HF)는 전 세계적으로 인간의 주요 사망 원인입니다 1 . HF는 심근염, 허혈성 심근 손상, 좌심실 재 형성으로 인해 종종 발생하며 심장 수축 기능 및 환자의 삶의 질이 점진적으로 악화됩니다. 심장학 및 심장 수술의 진보가 HF 사망률을 현저히 낮추었지만, 심각한 병적 상태를 수반하는 불가피하게 진보적 인 질병 과정의 일시적인 지연 기 (delayers)로 작용할뿐입니다. 따라서 현재 유효한 치료법이 부족하여 HF를 예방하거나 심지어 역전시킬 수있는 새로운 분자 표적을 확인해야 할 필요성이 강조됩니다. 여기에는 세포 외 기질의 변화, 조절되지 않은 심장 면역 반응, 심장 및 비 - 심장 세포 간의 상호 작용이 포함됩니다 2 .
심장 세포가 direc에 노출되는 미세 환경부상당한 심장의 면역 및 재생 반응을 형성합니다. 격리 된 식염수 - 관류 심장에서 CT는 생리 및 병태 생리 조건 3 , 4 , 5 모두에서 간질 유체 공간 ( 즉, 미세 환경)에서 파생 된 작은 물방울의 형태로 심장 표면에 생성됩니다. 따라서 CT (간질 액)의 분석은 심장 대사 및 수축 기능을 조절하거나 부상당한 심장으로 이동 한 후 면역 세포 기능에 영향을주는 요인을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 잠재적으로 이것은 HF 치료를위한 새로운 치료 전략의 개발로 이어질 수 있습니다.
쥐 마음에서 CT 수집은 기술적으로 어렵습니다. 랑겐 도르프 (Langendorff)가 관류하는 보통의 심장에서 CT의 독점적 수집은 어렵다. 왜냐하면 CT와 코로나정맥 유출 물 관류 액은 틈새 공간에서 방출되는 대사 산물 / 효소의 농도를 예측할 수 없게 희석시킨다. 이 한계를 극복하기위한 가능한 한 가지 전략은 폐를 삽입하고 동시에 폐 정맥을 결찰하여 정맥 유출 물을 배제하는 것입니다. 그러나,이 방법은 폐동맥 및 정맥의 삽입 및 결찰과 관련된 어려움에 직면하여, 정맥 유출 물이 잠재적으로 심장 누출 물로 누출 될 수있다. 반전 심장 모델 사용의 개념은 고립 된 관류 된 심장을 거꾸로 된 위치로 뒤집어 놓은 심낭 표면에 얇은 라텍스 캡을 놓고 정맥류 유출 물의 오염없이 CT를 연속적으로 샘플링하는 Kammermeier 그룹에 의해 처음 소개되었습니다 8 , 9 . 이 절차를 사용하여 CT는 심장 9 에서 방출 된 대사 산물의 매우 민감한 측정을 제공하는 것으로 나타났습니다.지방산 8 및 바이러스 입자 10 의 모세관 이동.
최근에, 국소 면역 반응을 조절하고 심장 혈관 신생을 증가시키는 파라 크린 인자 (facacrine factors)가 줄기 세포 기반 치료법의 심장 질환에 대한 유익한 효과에 연루되어있다. 역전 된 심장에서의 CT 분석은 이러한 개별 파라 크린 요소를 화학적으로 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 CT는 심장에서 면역 세포의 생체 내 활성화에 관련된 요인을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.
여기에 제공된 심장 표면에서 CT 수집에 대한 자세한 설명은 전반적인 심장 기능과 관련하여 면역 세포, 섬유 아세포, 내피 세포 및 심근 세포의 상호 작용을 연구하는 연구자에게 실험적으로 유용합니다. 전술 한 바와 같이, 간질 액은 심장 내에서 세포 간 통신을위한 정보를 운반한다.ich는 CT의 수집에 의해 편리하게 평가 될 수있다. 반전 된 심장에서 CT를 수집하는 방법에 대한 비디오 프로토콜을 포함한 자세한 기술 설명은이 고유 기술의 향후 적용을 용이하게해야합니다.
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Protocol
모든 실험은 현지 규제 기관 ( LANUV of Nordrhein-Westfalen, Germany)의 승인을 받아 동물 용 지침에 따라 수행되었습니다. 동물에게 표준식이 요법을 공급하고 수돗물을 자유롭게 섭취 하였다. 실험의 각 단계에 필요한 모든 장비 및 화학 물질은 Table of Materials에 나와 있습니다.
1. 라텍스 캡과 심실 내 풍선의 준비
- 쥐 심장 (300-350g의 몸무게)의 평균 크기와 일치하는 밀링 머신을 사용하여 알루미늄 몰드를 만드십시오. 극 미세 (10/0) 에머리 종이로 곰팡이를 연마하십시오.
참고 : 몰드의 상세한 메트릭은 그림 1A에 나와 있습니다. - 알루미늄 몰드의 목 부분을 밀링 기계에 수직으로 고정하여 라텍스 캡을 준비하십시오.
참고 : 밀링 머신은 금형을 천천히 회전시킵니다. 대안으로, 전기 모터가 사용될 수있다. li> - 50 mL 유리 비이커에 20 mL의 액체 라텍스 (상업적으로 구입, 재료 표 참조)를 붓습니다.
- 주형의 전체 몸체가 라텍스 용액에 잠길 때까지 주형을 낮추십시오.
- 회전하면서 천천히 몰드 (5cm / min)를 들어 올립니다.
- 금형 표면의 라텍스가 고형화 될 때까지 금형을 15 분간 더 회전시킨다.
- 떼어 낼 때 손상을 방지하기 위해 곰팡이 표면 (이미 얇은 라텍스 필름으로 덮여 있음)에 약 1g의 활석 가루를 더합니다.
- 몰드 표면에서 이미 건조 된 라텍스 캡을 손가락으로 부드럽게 떼어냅니다. 라텍스 캡을 사용할 준비가되었습니다 ( 그림 1B ).
- 라텍스 캡의 출구를 15cm 실리콘 튜빙 (ID = 0.2mm)에 연결하고 나중에 CT 수집에 사용합니다.
- 심실 라텍스 풍선을 물로 채우고 1 mL의 물을 채운 주사기에 연결된 L 자 모양의 금속 캐뉼라에 단단히 고정시킵니다 (> 그림 1C).
참고 : 이것은 심장을 똑바로 세우는 데 사용됩니다 (아래 참조). - 부착 된 1 mL 주사기로 수축 / 팽창 테스트를 수행하여 풍선이 밀폐되었는지 확인하십시오.
- 차실 내 발달 압력의 미래 측정을 위해 압력 트랜스 듀서에 3 방향 정지 장치를 통해 캐 뉼러를 연결하십시오 ( 그림 1C ).
2. Krebs - Henseleit 버퍼 (KHB) 및 Langendorff 관류 시스템의 준비
- 상수 (롤러 펌프로 구동) 또는 일정 압력 (유리 컬럼의 정압으로 생성) 모드를 사용하여 Langendorff 관류 시스템을 설정하십시오.
참고 : Langendorff 심장 조제에 대한 자세한 내용은 이전에 설명되어 있습니다 12 . - 수정 된 KHB (mM 단위로 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4 · 7H 2 O, 1.21 K 2 HPO 4
- CaCl 2를 제외한 모든 화학 제품의 무게를 재고 2L 플라스크에 1.8L의 이중 증류수에 용해시킨다.
- 자기 교반하에 carbogen (95 % O 2 / 5 % CO 2 )으로 적어도 5 분 동안 평형 (pH : 7.4)을 위해 배지를 버블 링하십시오.
- 0.74 g의 CaCl2 .2H2O를 첨가하고 이중 증류수로 전체 부피를 2 L로한다.
- 추가 5 분 동안 carbogen으로 배지를 계속 저어주고 버블 링하십시오.
- 0.2 μm 필터를 통해 KHB를 필터링하여 심장의 미세 순환을 방해 할 수있는 작은 입자를 제거합니다.
- KHB를 미리 예열 된 수조 (38 ° C)에 넣으십시오. 100cmH2O 내부 압력을 생성하기 위해 카보 겐에 버블 링 유지KHB 저장소.
- KHB로 Langendorff 관류를 위해 100 cmH 2 O 정수압을 만들기 위해 저수지를 유리 칼럼에 연결하십시오. 카보 겐으로 칼럼 내부의 KHB 버블 링을 계속합니다.
- 대동맥 캐 뉼러 출구의 온도가 37 ° C가되도록 가온 시스템의 온도를 조절하십시오.
- 배관 시스템에 거품이 없는지 확인하십시오.
- KHB의 PO 2 가 500-600 mmHg (혈액 가스 분석기로 측정)에 도달 할 때까지 5 분 동안 carbogen으로 KHB를 산소 처리하십시오.
3. 격리와 심장의 Cannulation
참고 : 몸무게가 30 인 남성 Wistar 쥐0-350 g을 사용하여 심장의 크기가 프리 캐스트 라텍스 캡과 일치하도록 하였다. 랫트는 좌 동맥 내분비술 (LAD)을 50 분 동안 시행 한 후 재관류하거나 가짜 수술을 시행 하였다. 심근 경색 (MI)의 유도에 대한 방법론의 세부 사항은 다른 곳에서보고되었다. 경색 동물에서의 역 심장 실험은 수술 후 5 일에 수행되었다.
- 동물 보관실 (20L)에 연결된 이소 플루 란 증발기 (2 % V / V)를 사용하여 쥐를 마취.
- 깊은 마취가 끝나면 수술 테이블 (온도 조절이 아닌)에 쥐를 옮기십시오.
- 포셉을 사용하여 흉골 바로 아래의 피부와 근육을 들어 올리고 무거운 가위로 갈비뼈의 아래쪽 가장자리를 자릅니다.
- 미세한 가위를 사용하여 늑골 가장자리에서 횡경막을 약간 자릅니다. 갈비뼈를 꼬리 전체적으로 복부 흉벽의 플랩을 만들기 위해 자릅니다.
- 엄지 손가락으로 부드럽게 마음을 움켜 잡고손가락과 중간 손가락을 조심스럽게 올려 천천히 들어 올려서 심장 혈관이 약간 늘어지게하십시오.
- 대동맥이 완전히 노출 될 때까지 심장을 절제하십시오.
- 얼음처럼 차가운 KHB (4 ° C) 50 ML가 들어있는 100 ML 비커에 심장을 놓고 관류 장치로 이동하십시오.
- 즉시 대동맥을 통해 심장을 물방울 캐 뉼러에 올려 놓고 봉합 (4-0)으로 단단히 조이십시오. 기포가 심장에 들어 가지 않도록하십시오.
- 일정한 관류 압력 (100 cmH 2 O)을가하십시오. 또는 전체 유속 (20 mL / min으로 시작)을 적용 할 수 있습니다.
참고 : 흉부를 열 때부터 관류 캐뉼라에 심장을 연결하기까지의 시간은 숙련 된 조작원이 3 분 정도 걸립니다.
4. 역 모델
- 심장의 뒤쪽 벽면이 엉덩이가 될 때까지 대동맥 캐뉼라를 부드럽게 돌리십시오.
- 가위로 결합 조직을 제거하십시오.좌심방의 개방을 노출시켜 뇌실 내 삽관을위한 준비를합니다.
- 단단한 카테터에 부착 된 수축 된 라텍스 풍선을 왼쪽 심방을 통해 좌심실에 삽입하십시오.
- 전체 심실 구멍을 채울 때까지 풍선을 팽창시킵니다 (팽창 된 부피는 주사기에 미리 표시되어 있음).
- 심장이 거꾸로 될 때까지 뒤집어서 심실 내 풍선 카테터로지지하십시오.
- 그림 1C 에 나와 있듯이 견고한 금속 카테터가있는 심실 내 풍선을 사용하여 거꾸로 된 자세로 기계적으로 거꾸로 된 심장을 안정화시킵니다.
- 대동맥 근의 과도한 비틀림을 피하기 위해 심장의 위치를 조정하십시오.
- 이완기 혈압을 3-5 mmHg로 조정하십시오 (심실 내 풍선으로 측정, 그림 1C 참조).
- 심장의 심막 상피 표면을 관찰하고 작은 방울이 형성되도록하십시오.
- 라텍스 캡을 넣으십시오.부드럽게 손가락을 사용하여 전체 심장을 덮어서 심장 표면에 붙입니다.
- 라텍스 캡이 대부분의 심실 표면을 덮고 있는지 확인하십시오.
- 부드럽게 1 mL 주사기로 흡입하여 캡과 튜빙 내부의 기포를 제거하십시오 (있는 경우).
- CT 뽑는 튜빙의 원위 구멍을 심장의 수평 높이보다 10cm 아래로 조정하십시오.
참고 :이 절차는 음수 정압에 의한 약간의 흡입을 보장합니다. - 얼음에 놓인 1.5 mL 수집 튜브에 CT 방울을 NaCl과 1 : 1로 혼합합니다. CT 0.15-1.5 mL를 모으십시오.
참고 : 얼음 / 염화나트륨 혼합물은 수집 관의 온도를 영하 (약 -4 ° C) 이하로 안정화시킵니다.
참고 : 샘플링 시간은 실험 목적에 따라 다릅니다. CT의 유속은 가짜 수술 동물 (n = 3)에서 약 27 ± 20 μL / min이고 관상 동맥 연결 동물 (n = 11)에서는 100 ± 47 μL / min이다. - CT 샘플의 무게를 재조정하고 고정시킵니다.액체 질소에 넣고 나중에 측정을 위해 -80 ° C에 보관하십시오.
5. CT의 분석
- 과학적 질문에 따라 대사 산물 분석을 위해 CT 유체를 사용하십시오.
참고 : 그림 2 및 그림 3에 표시된 데이터는 일정한 압력 관류 (100 cmH 2 O)에서 수집되었으며 약 0.15-1.5 ML의 CT 유체가 10 분 이내에 수집되었습니다. 이 시간과 부피는 다양한 퓨린의 proteomic (최소 50 μL, 그림 2 ) 14 및 HPLC (최소 20 μL, 그림 3 ) 15 분석에 충분했습니다.
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Representative Results
반전 심장 모델은 격리 된 재관류 된 래트 심장 ( 그림 1A -C )에서 심장 간질 전달체의 수집을 가능하게합니다. 100 cmH 2 O의 일정한 압력에서 관류 할 때, 간질 유체 형성 속도는 고립 된 심장에서 관상 동맥 정맥 유출 물의 0.1-1 %에 해당하는 17 ~ 147 μL / min 범위였다.
CT의 단백질 함량은 bicinchoninic acid (BCA) 분석으로 측정했을 때 1.08 ± 0.40 mg / mL (n = 6) 인 것으로 나타났습니다. 일차원 겔 전기 영동 분석 (SDS-PAGE)은 심장 투과액에 존재하는 광범위한 단백질을 나타냅니다 ( 그림 2A ). 허혈 / 재관류 50 분을받은 심장에서 CT에 대해 2 차원 형광 차동 전기 영동 (2D-DIGE)을 수행 하였다. 도시 된 바와 같이 xfig "> 그림 2B에서 허혈성 심장의 CT에서 여러 단백질이 상향 조절 된 것으로 확인되었으며, 세포 외 기질 단백질은 70.1 %, 세포막 단백질은 4.6 %, 세포질 단백질은 17.2 %, 핵은 2.3 % 단백질 ( 표 1 ).
Purines은 특히 허혈성 손상 후 심장 면역 반응, 혈관 운동 신경계 및 심장 기능을 조절하는 중요한 신호 분자로 오랫동안 고려되어 왔습니다. CT의 수집은 MI와 같은 병태 생리 학적 조건 하에서 심장 간질 유체에 존재하는 다양한 대사 산물의 측정을 허용합니다. 그림 3 에서와 같이 HPLC로 측정 한 AMP, GMP, NADP, 아데노신, hypoxanthine 및 요산의 농도는 다른 방법을 사용하여 이전에보고 된 결과와 유사한 허혈성 심장에서 더 높았으며 ( 16 )class = "xref"> 17.
표 1 : 허혈성 심장의 CT에서 상향 조절 된 단백질의 목록. 허혈성 심장으로부터의 CT는 2D-DIGE에 의해 분석되고 프로테오믹스에 의해 동정되었다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1 : 역 심장 모델의 개략도. ( A ) 알루미늄 몰드는 알맞은 모양과 크기의 쥐 심장으로 구성되었다. ( B ) 몰드를 라텍스 용액에 담근 후, 약 0.01mm 두께의 라텍스 캡을 주조했다. ( C ) L에서angendorff 심장기구를 사용하여 대동맥 캐뉼라를 사용하여 대동맥을 통해 심장을 관류 한 다음 대동맥 캐뉼라를 역순으로 뒤집어 좌심실에 배치 된 심실 내 풍선으로 기계적으로지지했습니다. 압력 변환기를 통해 심실 내 압력 발달을 모니터링 하였다. 라텍스 캡은 오른쪽 및 왼쪽 심실 모두의 표면의 거의 90 %를 덮고, 콘센트는 심장 기저부 아래로 10cm 떨어진 원위 구멍으로 실리콘 튜브 (ID = 0.2mm)에 연결되었습니다. 이것은 약간 부정적인 정수압을 발생시켰다. 심장 과다 출혈 얼음 냉각시킨 1.5 mL 튜브에 수집한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : PrCT의 이석 분석. CT에서 단백질을 SDS-PAGE ( A )로 분리하고 2D-DIGE 분석 ( B )으로 확인 하였다. (A)의 경우 1-4 차선은 각 심장의 심장 샘플을 나타냅니다 (1 및 2 = 가짜, 3 및 4 = 경색). (B)의 경우, 2D-DIGE는 경색 된 심장에서 CT상에서 수행되었다. 단백질 동질성은 액체 크로마토 그래피 (LC) -MS / MS 14 , 15에 의해 확인되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CT의 Purines. CT에 존재하는 다양한 퓨린을 HPLC로 분석 하였다. 대표적인 HPLC는 가짜 (파란색) 심장과 경색 (검은 색) 심장에서 실행되며, 경색 된 심장은 더 높은AMP와 아데노신의 간질 농도는 있지만 hypoxanthine은 아닙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
반전 심장 모델은 잘 확립 된 Langendorff 심장 관류 기술 12를 기반으로하며, 심장을 거꾸로 뒤집은 상태로 고정시키고 견고한 심실 내 풍선 카테터를 사용하여이 위치를 유지함으로써 수행됩니다. 이러한 방법으로 심장 간질 누출은 관상 정맥 유출 물 관류 액으로부터 물리적으로 분리되어 심장의 기저부로부터 중력에 의해 떨어질 수있다. CT는 전체 심장 표면에 놓인 얇고 유연한 라텍스 캡을 사용하여 지속적으로 수집 할 수 있습니다.
이 방법은 Langendorff 장치의 비용 외에도 최소한의 비용으로 쉽게 수행 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 일부 단계는 기술적으로 재현 가능하고 안정적인 결과를 얻기 위해 중요합니다. 여기에는 라텍스 캡이 심장의 모양에 적절하게 맞춰지고 심방의 표면의 약 90 %가 커버되며 안면이 커버되지 않습니다. 시간에서 exc연장 된 허혈은 심장 신진 대사를 변화시키고 심장 투과의 형성 위험을 감수하면서 역류 관류의 수행에 동물의 심장을 3 분 이내에해야한다는 것을 의미한다. 심실 내 풍선으로 측정 한 확장기 좌심실 압력은 심실 구멍 (3-5 mmHg)을 채우도록 설정해야합니다. 과도하게 팽창 된 풍선은 혈관 압축에 의해 관상 동맥 흐름을 변경시킬 수 있습니다. 샘플링 바이알 (1.5 mL 튜브)은 잠재적 인 대사 산물 및 단백질 분해를 막기 위해 얼음에 보관해야합니다.
또한, 성공적인 실험은 심장의 준비, 격리 및 삽관 중 좋은 수동 취급에 크게 의존합니다. 이것은 연습이 필요합니다. 허혈성 손상으로부터 심장을 보호하려면 모든 준비가 얼음처럼 차가운 KHB로 수행되어야합니다. 심혼의 크기가 쥐 사이에서 다를지도 모르다, 유사한 bodyweights에도 불구하고, 경미한 1로 준비된 유액 뚜껑이있는 것이 적당하다서로 다른 크기의 서로 다른 크기의 하트.
격리 된 역전 심장 방법은 분리 된 쥐 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 및 기니아 피그 심장 16 에 대해 이전에 기술되어 있으며 다른 목적으로 사용되었다. 방법론에 대한 현재 설명에서 실험 설정 및 샘플 처리에 대한 몇 가지 수정 사항을 도입했습니다. 예를 들어, de Deckere 등이 소개 한 폐동맥의 삽관 (cannulation) 심장의 거꾸로 된 위치가 정맥 유출 물 관류 액에 의한 잠재적 인 오염을 방지하기 때문에,도 7에 도시 된 바와 같이 , 여기서는 수행되지 않았다. CT 용 수집 장치의 개방을 낮춤으로써 약간의 부압을가함으로써 CT 용 수집 장치를 단순화 하였다.반대로 심장 아래 10cm. 이렇게하면 누출 물질 샘플을 즉시 냉각시킬 수 있습니다. 샘플 CT의 급속 냉각을 보장하기 위해 수집 컵을 얼음과 NaCl의 같은 부피 혼합물 ( 즉, 1 : 1 비율)에 넣음으로써 -4 ℃의 온도로 예냉했다. 이것은 수집 된 CT 샘플의 빠른 냉각을 허용했습니다.
일반적으로 격리 된 랫트 심장은 생체 내 생리적 조건과 다르다는 점을 명심해야한다. 그 이유는 간질 유체 형성이 염분 - 관류 심장보다 더 적을 수 있기 때문이다. 따라서, 격리 된 심장에 의해 형성된 CT 는 생체 내 간질 유체의 실제 조성을 완전히 모방하지 못할 수있다. 또한, 현재의 설정은 정맥 유출 물 관류 액에 의한 잠재적 인 오염의 완전한 배제를 허용하지 않는다. 그러나, 정맥 출구가 심장 기저부 (직립 심장의 최저 수준)에 위치하기 때문에, 우리는그 오염은 수거 과정에 기여한다.
현재의 프로토콜은 심근 세포와 면역 세포, 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 섬유 아세포 및 비 - 심장 세포와 같은 비 - 심장 세포에 의해 간질 액으로 방출되는 다수의 대사 산물 및 단백질을 함유하는 심장 간질 유체를 샘플링하는 독특한 방법을 기술한다. 혈관 주위 세포. 심장 간질 투과는 작은 림프액과 함께 내피 장벽 ( 10)을 통한 유체 수송의 결과로서 형성된다. 그것은 심장 metabolites 7 , interstitial 공간에 용해 요인의 혼합물을 포함하고 심장 및 / 또는 비 심장 세포의 secretomes 9 . 따라서 여러 세포 유형이 CT의 형성에 기여합니다. 또한 형성 속도에 영향을 미치는 몇 가지 요인이 있습니다. 첫째, 종양 억제는 트랜스 캡슐을 조절하는 중요한 결정 인자로 보인다.관류 매질에 덱스 트란이나 알부민을 첨가함으로써 종양의 압력이 증가하여 CT 9,10 의 형성이 현저히 감소되었다. 둘째로, MI를 포함한 저산소증 동안 혈관 투과성의 증가는 관류 액의 유출 및 이에 따른 CT의 형성을 증가시킨다. 따라서 장래 연구에서 종양 억제 압력의 증가는 CT의 부피를 최소화하여 목표 분자를 풍부하게하는 적절한 수단이 될 수있다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NSFC 81570244, FoKo 23/2013 및 SFB 1116 / B01 및 뒤셀도르프 심혈관 연구소 (CARID)가 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
