Summary
Bu protokol, izole edilmiş perfüze edilmiş fare kalpten kardiyak interstisyel sıvıyı toplamak için bir yöntemi açıklamaktadır. İnterstisyel transüdaatı koroner venöz atık perfüzattan fiziksel olarak ayırmak için, Langendorff perfüze edilen kalp ters çevrilir ve kalp yüzeyinde oluşan transüda (interstisyel sıvı) yumuşak bir lateks kapak kullanılarak toplanır.
Abstract
Mevcut protokol, izole edilen salinle perfüze edilen fare kalpten kardiyak transüda (BT) toplanmasına olanak tanıyan eşsiz bir yaklaşımı açıklamaktadır. Kalbin Langendorff tekniğine göre izole edilmesi ve retrograd perfüzyonundan sonra, kalp ters çevrilir ve sol ventriküle yerleştirilen bir balon kateteri ile mekanik olarak stabilize edilir. Daha sonra, daha önce sıçan kalbinin ortalama ebadına uyacak şekilde dökülen ince bir lateks kapak epikardiyal yüzeye yerleştirilir. Lateks kapağın çıkışı, silikon boruya bağlanır ve distal açıklık kalbin taban seviyesinin 10 cm altına düşer ve hafif emiş oluşturur. Epikardiyal yüzey üzerinde sürekli üretilen BT, daha ileri analiz için buzla soğutulmuş şişelerde toplanır. Koroner venöz atık perfüzatın% 0.1-1'sini oluşturan kontrollü ve enfarktüslü kalpte CT oluşum hızı 17 ila 147 μL / dk (n = 14) arasında değişmektedir. Proteomik analiz ve yüksek performansRmance sıvı kromatografisi (HPLC), toplanan BT'nin geniş bir protein spektrumu ve purinergik metabolitleri içerdiğini ortaya koydu.
Introduction
Kalp yetmezliği (HF) dünya çapındaki insanlarda önde gelen ölüm nedenidir 1 . HF genellikle miyokardit, iskemik miyokard hasarları ve sol ventriküler yeniden modelleme nedeniyle ortaya çıkar ve kardiyak kontraktil fonksiyonun ve hastaların yaşam kalitesinin ilerleyici bozulmasına neden olur. Kardiyoloji ve kardiyak cerrahideki gelişmeler HF mortalitesinde belirgin bir düşüşe sahip olmakla birlikte, önemli bir morbiditeye sahip olan kaçınılmaz ilerleyici bir hastalık sürecinin geçici "geciktiricileri" olarak görev yapmaktadır. Bu nedenle, mevcut etkin tedavi eksikliği, HF'yi önleyebilecek veya hatta tersine çevirebilecek yeni moleküler hedefleri tanımlama gereksinimini ortaya koymaktadır. Bu, hücre dışı matriksteki değişiklikler, kontrol edilemeyen kardiyak immün yanıt ve kardiyak ve non-kardiyak hücreler arasındaki etkileşimleri içerir 2 .
Kardiyak hücrelerin direkt olarak maruz kaldıkları mikro çevreyi tanımak önemlidirYaralı kalbin bağışıklık ve rejeneratif tepkisini şekillendirir. İzole edilmiş salinle perfüze edilen kalpte, CT, fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında 3 , 4 , 5 olmak üzere, interstisyel sıvı boşluğundan ( yani, mikro çevre) türemiş küçük damlacıklar şeklinde kalp yüzeyinde üretilir. Bu nedenle, BT'nin ( yani, interstisyel sıvı) analizi, kalp metabolizmasını ve kontraktil fonksiyonunu düzenleyen faktörlerin belirlenmesine veya hasar gören kalbe göç ettikten sonra immün hücre fonksiyonlarını etkilemesine yardımcı olabilir. Potansiyel olarak, bu, KY tedavisi için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine yol açabilir.
Kemirgen kalplerdeki BT koleksiyonu teknik açıdan zorlayıcıdır. Düzenli Langendorff perfüze edilen kalpte, BT'nin özel koleksiyonu zordur çünkü BT'nin koronar ile karışımıY venöz atık perfüzat, interstisyel boşluktan salınan herhangi bir metabolit / enzim konsantrasyonunu beklenmedik şekilde inceltir. Bu kısıtlılığın üstesinden gelmek için olası bir strateji, pulmoner kanülle venöz atığın dışlanması ve aynı anda pulmoner ven 7'nin bağlanmasıdır . Bununla birlikte, bu yöntem pulmoner arter ve venin bağlanması ve bağlanması ile ilgili zorluklarla karşı karşıya olup, venöz atığın kardiyak transüda sızmasına neden olabilir. Bir ters kalp modeli kullanma kavramı, ilk önce izole edilmiş, perfüze edilmiş kalbi ters çeviren Kammermeier grubu tarafından ortaya atıldı ve venöz atıkların kontaminasyonu olmaksızın BT'yi sürekli örneklemek için epikardiyal yüzeye ince bir lateks kap yerleştirdi. 8 , 9 . Bu prosedürü kullanarak BT'nin kalpten 9 salınan metabolitlerin çok hassas bir ölçümü sağladığı gösterildi,Yağlı asitlerin 8 kılcal aktarımı ve viral parçacıklar 10 .
Daha yakın zamanlarda, lokal immün yanıtı düzenleyen ve kalp anjiyogenezisini 11 arttıran parakrin faktörler, kök hücre temelli kalp hastalığı tedavisinin yararlı etkileri ile ilişkilendirilmiştir. Ters çevrilmiş kalpteki CT'nin analizi, bu bireysel parakrin faktörleri kimyasal olarak tanımlamaya yardımcı olabilir. Buna ek olarak, BT, kalpteki bağışıklık hücrelerinin in vivo aktivasyonuyla ilgili faktörleri tanımlamaya yardımcı olabilir.
Burada verilen kalp yüzeyinden CT koleksiyonunun ayrıntılı açıklaması, genel kardiyak fonksiyonla ilişkili bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerin etkileşimini inceleyen araştırmacılar için deneysel açıdan yararlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, interstisyel sıvı, hücreden hücreye iletişim için bilgiyi kalp içinde taşır;BT uygun bir şekilde toplanarak değerlendirilebilir. Ters çevrilmiş kalpten BT nasıl toplanacağına dair bir video protokolü de dahil olmak üzere ayrıntılı teknik açıklama, bu benzersiz tekniğin gelecekteki uygulamasını kolaylaştırmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler yerel düzenleyici kurum (Nordrhein-Westfalen, Almanya'nın LANUV) tarafından onaylandı ve hayvan kullanımı yönergelerine göre gerçekleştirildi. Hayvanlar standart dondurma diyeti ile beslendi ve ad libitum musluk suyu aldı. Deneyin her adımında gerekli olan tüm ekipman ve kimyasallar Malzeme Tablosu'nda mevcuttur.
1. Lateks Kapağı ve İntraventriküler Balonun Hazırlanması
- Sıçan kalbinin ortalama boyuyla (vücut ağırlığı 300-350 g) eşleşen bir freze makinesini kullanarak alüminyum kalıp yapın. Süper ince (10/0) zımpara kağıdıyla kalıpları silin.
NOT: Kalıbın ayrıntılı ölçümleri Şekil 1A'da gösterilmiştir. - Lateks kapağını hazırlamak için alüminyum kalıbın boynunu freze makinesine dikey olarak sabitleyin.
NOT: Freze makinesi, kalıbın yavaş yavaş döndürülmesine neden olur. Alternatif olarak, bir elektrik motoru kullanılabilir. li> - 20 mL sıvı lateks (ticari olarak satın alın, Malzeme Tablosu'na bakın) 50 mL cam beher içine dökün.
- Kalıbın tüm gövdesi lateks solüsyona dalıncaya kadar kalıp indirin.
- Döndürürken kalıbı yavaşça kaldırın (5 cm / dak.).
- Kalıp yüzeyindeki lateks katılaşıncaya kadar, kalıbı 15 dakika daha karıştırmaya devam edin.
- Ayırırken hasar görmesini önlemek için kalıbın yüzeyine (zaten ince bir lateks film ile kaplı) yaklaşık 1 g talk pudrası ekleyin.
- Kalıp yüzeyinden önceden kurutulmuş lateks kapağı parmaklarla hafifçe ayırın; Lateks kapağı şimdi kullanıma hazırdır ( Şekil 1B ).
- Lateks kapağının çıkışını daha sonra CT'nin toplanması için kullanılan 15 cm silikon tüpüne (KIM. = 0.2 mm) bağlayın.
- Ventriküler lateks balonu su ile doldurun ve 1 mL'lik, su dolu bir şırıngaya bağlı bir L şeklinde metal kanül üzerine sıkıca sabitleyin (> Şekil 1C).
NOT: Bu, kalbin dik konumda olmasını sağlamak için kullanılacaktır (aşağıya bakınız). - Ekli 1 mL şırınga ile birkaç deflasyon / şişirme testi gerçekleştirerek balonun hava geçirmez olduğundan emin olun.
- İlerletilmiş intraventriküler basınç gelişimini ölçmek için kanülü üç yönlü bir durdurucu vasıtasıyla bir basınç transdüktörüne bağlayın ( Şekil 1C ).
2. Krebs-Henseleit Tampon (KHB) ve Langendorff Perfüzyon Sisteminin Hazırlanması
- Sabit akış (bir silindir pompa tarafından tahrik edilen) veya sabit basınç (bir cam kolondaki statik basınç ile üretilen) modunu kullanarak bir Langendorff perfüzyon sistemi oluşturun.
NOT: Langendorff kalp preparatının ayrıntıları daha önce 12 açıklanmıştır. - Modifiye edilmiş bir KHB'nin 2 L'si hazırlayın (mM: 116.02 NaCl, 4.63 KC1, 1.10 MgS04.7H20, 1.21 K2 HPO4
- Tüm kimyasalları ancak CaCl 2 tartın ve 2 L'lik bir şişede 1.8 L'lik iki damıtık suda çözündürün.
- Ortamı karboksilik (% 95 O 2 /% 5 CO 2 ) ile manyetik karıştırma altında dengelemede (pH: 7.4) en az 5 dakika kabarcık haline getirin.
- 0.74 g CaCI2.2H20 ilave edin ve toplam hacmi, iki kez damıtılmış su ile 2 L'ye getirin.
- Karbondioksit ile ortamı 5 dakika daha karıştırıp köpürtmeye devam edin.
- Kalbin mikrosirkülasyonunu engelleyebilecek küçük parçacıkları ortadan kaldırmak için KHB'yi 0.2 um filtreyle filtreleyin.
- Filtrelenen KHB'yi önceden ısıtılmış su banyosuna (38 ° C) yerleştirin; 100 cmH2O basınç içerecek şekilde karbogen ile kabarcık tutunE KHB rezervuarını.
- KHB ile Langendorff perfüzyonu için 100 cmH2O hidrostatik basıncı oluşturmak için rezervuarı cam kolona bağlayın; Karbon ile kolonun içindeki KHB'yi kabarcıklandırmaya devam edin.
- Aortik kanül çıkışındaki sıcaklık 37 ° C olacak şekilde ısıtma sisteminin sıcaklığını ayarlayın.
- Boru sisteminin kabarcıksız olduğundan emin olun.
- KHB'deki PO2 500-600 mmHg'ye (bir kan gazı analizörü ile ölçülene kadar) ulaşana kadar, KHB'yi karbojen ile oksijenle ilave 5 dakika oksijenleyin.
3. Kalp Yalıtımı ve Kanülasyon
NOT: Vücut ağırlığı 30 olan erkek Wistar sıçanları0-350 g kalp boyutları ön dökme lateks kapağı ile eşleşecek şekilde kullanılmıştır. Sıçanlar sol atardamardan 50 dakika boyunca inen (LAD) bağlandıktan sonra reperfüzyon uygulandı veya sahte ameliyat edildi. Miyokard infarktüsünün (MI) indüksiyonu için metodolojinin ayrıntıları başka yerlerde bildirilmiştir 13 . Enfarktüslü hayvanlarda yapılan ters kalp deneyleri ameliyattan 5 gün sonra gerçekleştirildi.
- Bir hayvan tutma odasına (20 L) bağlı bir izofluran buharlaştırıcı (% 2 V / V) kullanarak sıçanlara anestezi uygulayın.
- Derin anesteziye ulaşıldıktan sonra sıçanları bir çalışma masasına (sıcaklık kontrollü değil) aktarın.
- Forseps kullanarak göğüs kemiğinin hemen altındaki cildi ve kasları kaldırın ve ağır makaslarla kaburgaların alt kenarlarında kesin.
- İnce makas kullanarak, kaburga kenarında diyaframın içine küçük bir kesit yapın. Tüm ventral göğüs duvarının bir flebi yapmak için kaburgaları kaudally kesin.
- Kalbi başparmak ile hafifçe kapın aIndeks ve orta parmakları kaldırın ve yavaşça kaldırın böylece kalp damarları hafif gerilir.
- Aort tamamen açığa çıkıncaya kadar kalbi tüketin.
- Kalbi, 50 mL buz soğukluğundaki KHB (4 ° C) içeren 100 mL'lik bir behergreye yerleştirin ve perfüzyon aparatına taşıyın.
- Hemen kalpten aort yoluyla damlayan bir kanül üzerine monte edin ve dikişle sıkıca tutun (4-0). Kalbe giren hava kabarcığından kaçının.
- Sabit perfüzyon basıncı uygulayın (100 cmH 2 O). Alternatif olarak, tam akış hızı (20 mL / dakika ile başlanarak) uygulanabilir.
Not: Toraksın açılmasından yüreğin perfüzyon kanülüne bağlanmasına kadar olan süre deneyimli bir operatörün elinde yaklaşık 3 dakika sürmelidir.
4. Reversed-heart Model
- Kalbin arka duvarı yüzü görünene dek aortik kanülü yavaşça döndürün.
- Bağ dokusunu makasla çıkartınSol atriyumun açılmasını açığa çıkararak intraventriküler kanülasyona hazır hale getirir.
- Sol atriyum yoluyla katı bir katetere tutturulmuş havalandırılmış lateks balonu sol ventriküle yerleştirin.
- Balonu, tüm ventriküler boşluğu doldurana kadar şişirin (şişirme hacmi şırıngada önceden işaretlenmiştir).
- Kalbi ters çevene kadar ters çevirin, bunu intraventriküler balon kateteri ile destekleyin.
- Şekil 1C'de gösterildiği gibi, sert bir metal kateteri ile intraventriküler balon kullanılarak ters çevrilmiş kalbi dik konumda mekanik olarak stabilize eder.
- Aort kökünün aşırı bükülmesini önlemek için kalbin pozisyonunu ayarlayın.
- Diyastolik basıncı 3-5 mmHg'ye ayarlayın (intra-ventriküler balon ile ölçülür; bkz. Şekil 1C ).
- Kalbin epikardiyal yüzeyini gözleyin ve küçük damlacıkların oluşmasını sağlayın.
- Lateks kapağı o yerleştirinParmaklarını kullanarak tüm kalbi hafifçe bastırarak kalbe yüzeye sürükleyin.
- Lateks kapağın ventriküler yüzeyin çoğunu kapladığından emin olun.
- Varsa, kapak ve tüp içindeki hava kabarcıklarını 1 mL'lik şırıngayla hafifçe emerek çıkarın.
- CT-letting hortumunun distal açıklığını kalbin yatay seviyesinin 10 cm altına ayarlayın.
NOT: Bu prosedür, negatif hidrostatik basınca karşı hafif emmeyi sağlar. - NaCl ile 1: 1 oranında karıştırılmış buz içine yerleştirilmiş 1.5 mL'lik bir toplama tüpünde damlalar toplayın. Yaklaşık 0.15-1.5 mL BT toplayın.
NOT: Buz / NaCl karışımı, toplama borusundaki sıcaklığı sıfırdan (yaklaşık -4 ° C) sabitleştirir.
NOT: Örnekleme süresi, deneysel amaca bağlıdır. BT'nin akış hızı, sahte işletilen hayvanlarda (n = 3) yaklaşık 27 ± 20 μL / dk ve koroner lige olan hayvanlar için (n = 11) 100 ± 47 μL / dk'dır. - BT örneklerini tartın ve snap-freeze edinSıvı azot içinde eritin ve sonraki ölçümler için onları -80 ° C'de saklayın.
5. CT'nin analizi
- Bilimsel soruna bağlı olarak, metabolitlerin analizi için CT sıvısını kullanın.
NOT: Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilen veriler sabit basınçlı bir perfüzyon (100 cmH20) 'dan toplanmış ve yaklaşık 0.15-1.5 mL CT sıvısı 10 dakika içinde toplanmıştır. Bu zaman ve hacim, çeşitli purinlerin proteomik (minimum 50 μL; Şekil 2 ) 14 ve HPLC (minimum: 20 μL; Şekil 3 ) için yeterliydi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ters kalp modeli, izole edilmiş, retro-perfüze edilmiş sıçan kalbinde kardiyak interstisyel transüdaatın toplanmasını sağlar ( Şekil 1A- C ). 100 cmH2O sabit bir basınçta perfüze edildiğinde, interstisyel sıvı oluşumu hızı, izole edilen kalpteki koroner venöz atığın% 0.1-1'i kadar, 17 ila 147 uL / dakika arasında değişmektedir.
Bilinçoninik asit (BCA) tahlili ile ölçülen BT'nin protein içeriği, 1.08 ± 0.40 mg / mL (n = 6) olarak bulundu. Tek boyutlu jel elektroforez analizi (SDS-PAGE), kardiyak transüda ( Şekil 2A ) ait geniş bir protein spektrumu ortaya koymuştur. İki boyutlu floresan farkı jel elektroforezi (2D-DIGE), BT'de kalpten 50 dakika iskemi / reperfüzyona tabi tutuldu. Da gösterildiği gibi Şekil 2B'de, iskemik kalplerin BT'sinde birkaç proteinin yukarı doğru düzenlendiği saptanmıştır: Tanımlanan proteinlerin% 70.1'i hücre dışı matris proteinleri,% 4.6'sı hücresel membran proteinleri,% 17.2'si sitoplazmik proteinler ve% 2.3'ü nükleer Proteinler ( Tablo 1 ).
Pürinler özellikle iskemik hasardan sonra kardiyak bağışıklık cevabı, vazomotor tonus ve kardiyak fonksiyonu düzenleyen önemli sinyal molekülleri olarak düşünülmüştür. CT toplanması, MI gibi patofizyolojik koşullar altında kardiyak interstisyel sıvıda bulunan çeşitli metabolitlerin ölçülmesine izin verir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, iskemik kalpte daha yüksek olan, daha önce diğer yöntemler 16 kullanılarak bildirilen sonuçlara benzer HPLC ile ölçülen AMP, GMP, NADP, adenosin, hipoksantin ve ürik asit konsantrasyonu ,Sınıf = "xref"> 17.
Tablo 1: BT'de iskemik kalplerin upregüle protein listesi. BT iskemik kalpten 2D-DIGE ile analiz edildi ve proteomikler ile tanımlandı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 1: Ters kalp modelinin şematik çizimleri. ( A ) Uygun biçimde şekillendirilmiş ve boyutlandırılmış bir sıçan kalbinden bir alüminyum kalıp yapılmıştır. ( B ) Kalıbı lateks çözeltisine batırdıktan sonra, yaklaşık 0.01 mm kalınlığında bir lateks kapak dökülmüştür. ( C ) Bir LAngendorff kalp cihazı, kalp bir aortik kanül kullanılarak aort yoluyla perfüze edildi ve daha sonra ters çevrildi ve sol ventriküle yerleştirilen bir intra-ventriküler balon ile mekanik olarak desteklendi. İntraventriküler basınç gelişimi bir basınç dönüştürücü ile izlendi. Lateks kapağı hem sağ hem de sol ventrikül yüzeyinin yaklaşık% 90'ını kapladı ve çıkış, distal açıklığı kalbin tabanının 10 cm altında olacak şekilde silikon boruya (ID = 0,2 mm) bağlandı. Bu, hafif negatif hidrostatik basınç oluşturdu. Kalp transüdaatı Genellikle buzla soğutulmuş 1.5 mL tüp içine toplanır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: PrBT'nin oteomik analizi. CT'deki proteinler SDS-PAGE ( A ) ile ayrılmış ve 2D-DIGE analizi ( B ) ile tanımlanmıştır. (A) için, şerit 1-4 bireysel kalpten alınan kalp örneklerini göstermektedir (1 ve 2 = sahte; 3 ve 4 = enfarktüslü). (B) için, enfarktütlü bir kalpten BT'de 2D-DIGE yapıldı. Protein kimliği sıvı kromatografi (LC) -MS / MS 14,15 ile teyit edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: BT'de pürinler. BT'de bulunan çeşitli pürinler HPLC ile analiz edildi. Temsilci HPLC, sahte (mavi) ve enfarktüslü (siyah) kalpten gelir ki, enfarktüslü kalbin daha yüksek birAMP ve adenosinin interstisyel konsantrasyonu, ancak hipoksantin yok. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ters kalp modeli, iyi kurulmuş Langendorff kalp perfüzyon tekniğine 12 dayalıdır ve kalbi ters çeviren bir pozisyona çevirerek ve bu pozisyonu katı bir intra-ventriküler balon kateteri kullanarak tutarak gerçekleştirilir. Böyle bir şekilde, kalp interstisyel transüdat, kalbin tabanından yerçekimi damlamasıyla, koroner venöz atık perfüzattan fiziksel olarak ayrılabilir. BT tüm kalbin yüzeyine yerleştirilen ince ve esnek bir lateks kap yardımıyla sürekli toplanabilir.
Bu yöntem, Langendorff cihazına ek olarak en düşük maliyetle gerçekleştirmek kolaydır. Bununla birlikte, bazı basamaklar, tekrarlanabilir ve kararlı sonuçlar elde etmek için teknik açıdan kritiktir. Bunlara, lateks kapağın kalbin şekline uygun olmasını ve atriyumların değil, ventriküllerin yüzeyinin yaklaşık% 90'ını kaplamasını sağlar. Exc'den itibaren zamanUzamış iskemi, kalp metabolizmasını değiştirme ve kalp transüda- tının oluşumu riskini taşıdığı için kalpten hayvandan retroperfüzyonun performansına kadar geçen süre 3 dakikadan az olmalıdır. İntraventriküler balon ile ölçülen diastolik sol ventriküler basınç, ventriküler boşluğu (3-5 mmHg) dolduracak şekilde ayarlanmalıdır. Aşırı şişirilmiş balon vasküler kompresyon ile koroner akışı değiştirebilir. İlgilenilen metabolitlerin ve proteinlerin herhangi bir potansiyel bozulmasını önlemek için numune şişesi (1.5 mL tüp) buz üzerinde tutulmalıdır.
Buna ek olarak, başarılı deneyler kritik olarak, kalp hazırlığı, izolasyonu ve kanülasyonu sırasında iyi manuel kullanıma bağlıdır. Bu uygulama gerektirir. Kalpleri iskemik hasardan korumak için tüm hazırlıklar buz gibi soğuk KHB ile yapılmalıdır. Kalbin boyutları, sıçanlar arasında farklılık gösterebileceğinden, benzer vücut ağırlığına rağmen, hafifçe hazırlanmış lateks kapakların kullanılması önerilirKalbin farklı boyutlarına uyan farklı boyutlar.
İzole edilmiş ters kalp yöntemi, izole edilmiş sıçan 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 ve kobay kalp 16 için daha önce tanımlanmış olup farklı amaçlar için kullanılmıştır. Metodolojiyi tanımlamak için, deney düzeneğinde ve örnek işleme için bazı değişiklikler getirdik. Örneğin Deckere ve ark. Tarafından getirilen pulmoner arter kanülasyonu, 7 , burada gerçekleştirilmedi, çünkü kalbin ters çevrilmiş konumu, venöz atık perfüzat ile olası kontaminasyonu önledi. CT için toplama cihazı, CT-izin borusunun açılmasını düşürerek hafif bir negatif basınç getirerek basitleştirildiTers kalp altında 10 cm. Bu, transüda ait numunelerin derhal soğutulmasını kolaylaştırır. Numune CT'sinin hızlı bir şekilde soğumasını sağlamak için, toplama bardakları, eşit hacimde bir buz ve NaCl karışımı ( ör., 1: 1 oranında) yerleştirilerek -4 ° C sıcaklığa soğutulmuştur. Bu, toplanan BT numunelerinin hızlı soğumasına izin verdi.
Genellikle, izole edilmiş sıçan kalbi, interstisyel sıvı oluşumunun salinle perfüze edilmiş kalpte olduğundan daha az olması nedeniyle in vivo fizyolojik koşullardan farklı olduğunu akılda tutmalıdır. Dolayısıyla, izole kalp tarafından oluşturulan BT , canlı organizma içi interstisyel sıvının gerçek kompozisyonunu bütünüyle taklit edemez. Buna ek olarak, mevcut düzenleme, venöz atık perfüzat ile potansiyel kontaminasyonun tamamen dışlanmasına izin vermemektedir. Bununla birlikte, venöz çıkış, kardiyak tabanda (dik kalpteki en düşük seviye) bulunduğu için, inanmıyoruzBu bulaşma toplama sürecine katkıda bulunur.
Bu protokol, interstisyel sıvıda kardiyomiyositler ve kalp dışı hücreler, örneğin bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, vasküler düz kas hücreleri, fibroblastlar tarafından salınan çok sayıda metabolit ve protein içeren örnek kardiyak interstisyel sıvıya özgü bir yöntemi açıklamaktadır. perisitler. Kardiyak interstisyel transüdat, lemfatik sıvının küçük bir kısmı ile birlikte endotel bariyeri 10 boyunca sıvı taşınmasının sonucu olarak oluşur. Kalp metabolitleri 7 , interstisyel boşlukta çözünür faktörler ve kardiyak ve / veya kardiyak olmayan hücrelerin sekretomaları karışımı 9 içerir . Bu nedenle, birkaç hücre türü CT oluşumuna katkıda bulunur. Buna ek olarak, oluşum hızını etkileyen birçok faktör vardır. İlk olarak, onkotik basınç, trans-kapiller'i düzenleyen önemli bir belirteç gibi gözükmektedirPerfüzyon ortamına dekstran veya albümin ekleyerek onkotik basıncın artması CT 9 , 10'un oluşumunu önemli ölçüde azalttı. İkincisi, MI da dahil olmak üzere hipoksi 9 , 16 sırasında vasküler geçirgenlikte bir artış, perfüzatın ekstravazasyonunu ve dolayısıyla BT oluşumunu arttırır. Bu nedenle gelecekteki çalışmalarında, onkotik basıncın artması BT hacminin en aza indirgenmesi için uygun bir araç olabilir ve böylece hedeflenen hedef molekülleri zenginleştirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu çalışma NSFC 81570244, FoKo 23/2013 ve SFB 1116 / B01 tarafından ve Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü Düsseldorf (CARID) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
