Summary
여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 세타 진동의 연구를위한 방법론 및 응용 프로그램의 최근 개선과 함께 고립 된 전체 해마, WT 및 유전자 변형 생쥐에서 준비하고 녹음 절차를 설명합니다. 고립 해마 준비의 간단한 특성 분석을 통해 내부 hippocampal theta 발진기와의 관계를 cornum ammonis-1 (CA1) 및 subiculum (SUB) 영역의 피라미드 세포 및 GABA 신경계 인터페론의 활성과 함께 검사합니다. 전반적으로, 우리는 고립 된 해마가 체외에서 본질적인 세타 진동 을 생성 할 수 있으며, 해마 내에 생성 된 리듬이 parvalbumin 양성 (PV) 신경 세포의 광학 유전 자극에 의해 정확하게 조작 될 수 있음을 보여줍니다. 시험관에서 분리 된 해마 제제는 시각적으로 확인 된 neu에서 동시에 현장 및 세포 내 패치 클램프 기록을 사용할 수있는 독특한 기회를 제공합니다theta 리듬 세대의 기본 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.
Introduction
Hippocampal theta oscillations (4 - 12 Hz)는 포유 동물의 뇌에서 가장 두드러진 리듬 활동 중 하나이며, 시공간 정보의 처리 및 일란성 기억 1 , 2 , 3의 형성과 같은인지 기능에서 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 공간 탐색 및 병변 연구와 함께 theta-modulated place-cell의 관계를 강조하는 몇 가지 생체 내 연구와 임상 증거는 hippocampal theta oscillations이 기억 형성 4 , 5 , 6에 관여한다는 견해를 뒷받침한다. 해마 생성의 세타 진동은 아직 완전히 이해되지 않았다. 초기 생체 내 조사는 세타 활성이 외인성 발진기, 특히 리듬 입력에 주로 의존한다고 제안했다중격과 entorhinal 피질 같은 구 심성 뇌 구조에서 7 , 8 , 9 , 10 . 내인성 요인 - 해마 신경 세포의 내부 연결성과 해마 뉴런의 성질 -은 시험관 내 관찰 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18에 근거하여 가정되었다. 그러나 몇 가지 획기적인 연구 19 , 20 , 21 을 제외하고 간단한 체외 조각 준비에서 생리적으로 현실적인 인구 활동을 복제 할 수있는 접근법을 개발하는 데 어려움이 있습니다오랫동안 해마와 그 주변의 본질적인 능력을 세타 진동을 스스로 발생시키는 데 더 상세한 실험적 검사를 지연시켰다.
체외의 얇은 슬라이스 실험 환경 에서 표준의 중요한 단점은 뇌 구조의 3D 세포 및 시냅스 조직이 일반적으로 손상된다는 것입니다. 즉, 공간적으로 분산 된 세포 어셈블리를 기반으로하는 여러 형태의 협동 네트워크 활동이 하나 이상의 뇌 영역 (> 1mm)에 걸쳐있는 국소 그룹 (반경 ≤1mm)에서 뉴런 인구에 이르기까지 지원 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 세타 진동이 해마에서 어떻게 나타나고 관련 피질 및 피질 하부 구조로 전파되는지 연구하는 데는 다른 유형의 접근법이 필요했습니다.
최근 몇 년 동안 양방향 intera를 검사하기위한 "완전한 septo-hippocampal"준비의 초기 개발두 구조물 (22) 및 「격리 해마 "제제 계속되는 진화 ctions는 고유 진동 세타 리듬 외부 입력 (23)이 결여 된 해마에서 자발적으로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법의 값은 이들 영역의 전체 기능 구성이 체외 (22)에서의 세타 리듬 발전기로서 작동하기 위해 유지했다 초기 통찰력에 놓여있다.
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Protocol
모든 절차는 McGill 대학 동물 관리위원회 및 동물 관리에 관한 캐나다위원회에서 승인 한 지침 및 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 급성 해마 in vitro 준비
참고 : 손상되지 않은 해마 준비를 분리하는 것은 (1) 솔루션 및 장비 준비, (2) 해마 해부 및 (3) 본질적인 세타 진동 생성에 필요한 빠른 관류 속도 시스템 설정. 이 프로토콜에서 해부에서 기록에 이르기까지 적시에 수행되는 절차는 격리 된 해마가 밀도가 높지만 섬세한 준비를 이루기 때문에 중요합니다. 즉, 생체 외 구조의 기능적 연결성을 유지하는 데는 많은주의가 필요합니다. 모든 것을 사전에 준비하면 세포 d를 최소화하기 위해 적절한 수준의 재관류를 가능한 한 빨리 사용할 수 있습니다.생리 기능을 상실하고 유지하십시오.
- 자당 기반의 인공 척수액 (aCSF) 용액
- 해부 및 해부 후 부화에 사용되는 1X 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 표 1에 열거 된 모든 성분을 CaCl 2를 제외하고 1L의 탈 이온수에 넣고 4 ℃에서 2 주 동안 보관한다.
- 표준 aCSF 솔루션
- electrophysiological 녹음 동안 격리 해마의 높은 유속 관류에 대한 표준 aCSF를 준비합니다. 농축 (5X) 스톡 aCSF를 만들기 위해서는 탈 이온수 2 L에 CaCl 2를 제외한 표 2에 열거 된 모든 성분을 녹이고 4 ° C에서 보관하십시오.
- 장비 준비
- 해부를 시작하기 전에 얼음으로 채워진 플라스틱 트레이 (30 x 20 x 5cm), 카보 겐 연결 튜브 라인 및 three 유리 페트리 접시 (10 x 2 cm) ( 그림 1 참조).
- carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2)과 칼슘을 추가 2+ [1.2 mm]가 함께, 500㎖의 비커에 거품을 수크로오스 용액 300 ㎖ (1X 스톡)를 추가한다.
- 이 페로쉬 액 60mL를 유리 배양 접시에 옮기고 실온에서 방치한다. 나머지를 4 ° C의 냉동고에 10-15 분 동안 놓습니다.
- 해부를 통해 carbogen과 얼음 차가운 자당 솔루션을 버블 링하십시오.
- 두 번째 페트리 접시 (차가운 체임 챔버)를 자당 용액 (4 ° C)으로 채우고 얼음에 보관하십시오.
- 빙 냉한 자당 용액 30 mL를 50 mL 비커에 넣는다.
2. 전 해마 해부
참고 : 격리 된 해마를 해부하는 방법을 개발하는 것과 본질적으로 동일하며 원래 22 만 체육에 대한 자세한 내용 및 변경 설명rfusion 속도 및 녹음 기술.
- 뇌 절개
- 바구니에 추가되는 이소 플루 란 (100 %) 1 ML로 담가 작은 종이 타월로 퓸 후드 아래 마우스 (P20 - 35) 마취.
- 마취 된 마우스를 처치하고 얼음으로 찬 자당 용액 (50 mL 비이커, 약 5 초)에서 머리를 빠르게 담그십시오. 종이 타월로 옮깁니다.
- 메스를 사용하여 내측 피부 절개를하고 (옆구리에 꼬리 쪽) 피부를 양쪽으로 밀어서 두개골을 노출시킵니다.
- 작은 가위로 두개골을 열어 주걱을 사용하여 신속하게 두뇌를 추출하고 얼음 차가운 자당 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 놓습니다. 두뇌가 식을 때까지 1-2 분 정도 기다리십시오.
- 두뇌가 회복하는 동안, 얼음에 렌즈 종이 덮여 페트리 (해부) 요리에 2 - 3 ML 자당 솔루션을 추가합니다.
- 해마 분리
- 똑바로 positio에 해부 접시에 두뇌를 놓으십시오엔.
- 면도날로 소뇌와 전두엽 피질을 제거하십시오. midsagittal 비행기를 따라 반으로 뇌를 잘라내고 두 격리 반구를 들고 챔버로 반환합니다. 회복을위한 추가 1 ~ 2 분을 허용하십시오.
- 단일 hemisected 두뇌를 해부 접시에 똑바로 놓습니다.
- midsagittal 구조가 관찰자와 마주 치게 될 때까지 접시를 회전시키고 중격 복합물의 삽입 된 윤곽이 시상선 앞쪽에 얇은 배 모양의 조직으로 보입니다.
- hemi - sected 두뇌를 microspatula로 고정하고 polyptetrafluoroethylene (PTFE) 코팅 된 주걱의 작은 끝을 septal 영역 바로 뒤에 (caudal) 놓습니다.
- 중격 아래에 코팅 된 주걱을 삽입하고 해부 접시에 도달 할 때까지 팁을 아래로 이동하십시오. septal 영역을 연결하는 섬유를 절단합니다. 중격의 앞쪽 가장자리를 따라 동일한 작업을 반복하고 두뇌의 정면 부분에 연결하는 섬유를 잘라.
- 주걱으로 직립 위치에 해마 바로 위의 피질의 안쪽 부분을 가볍게 잡고, 시상 하부, 시상 하부 및 남아있는 뇌간 핵을 조심스럽게 내려 오기 위해 미세 주걱을 사용하십시오. 뽑아 낸 티슈를 잘라내어 제거하려면 주걱을 사용하십시오.
- 고립 된 반구를 돌려서 해마의 윤곽을 확인하십시오.
- 코팅 된 주걱을 등쪽 해마의 주둥이 끝 부분 아래쪽 측면 심실에 삽입합니다.
- 주걱을 hemi - sected 두뇌의 midsagittal 비행기와 수평으로 정렬 잡고 팁이 꼬리로 나타날 때까지 심실 벽의 부드러운 윤곽을 통해 밀어.
- 해마 아래의 주걱을 잡고 해마가 위에있는 피질과 결합하는 내부 층을 따라 연결 섬유 위로 가볍게 누르십시오. 이 층의 외부면에 미세 주걱을 바르고 코팅 된 주걱에 대해 슬라이드시켜 연결하는 fi맥주.
- 추출을 완료하려면 해부 접시를 회전하고 복부 해마 아래에 코팅 된 주걱을 삽입합니다. 피질 주름의 내부를 주걱으로 가볍게 잡고 미세 주걱에 대한 슬라이싱 동작을 사용하여 엔도르린 연결부를 절단합니다.
참고 : 전체 septohippocampal 복잡한은 전체 해마 아래에 코팅 된 주걱을 배치하고 아래에서 나머지 뇌 조직을 꺼내 제거 할 수 있습니다. - 일단 고립이 완료되면, 해마를 접시에 휴식을 유지하고 차가운 유지하기 위해 얼음 차가운 자당 솔루션의 방울을 추가합니다. 조심스럽게 남은 피질과 섬유를 잘라내어 면도날을 천천히 가해 중격에서 해마를 분리합니다.
참고 : 패치 클램프 녹음이 피라미드 세포 (4.6 절 참조)에서 수행되어야하는 경우 격리 된 해마는 CA1의 피라미드 층을 노출시키기 위해 45 ° 각도로 횡 방향으로 절단 될 수 있습니다 ( "angle- 컷 "준비) 해마의 나머지 부분에서 로컬 네트워크 회로를 손상시키지 않습니다. - 제제를 상온의 자당 용액에 옮기고 15 ~ 30 분간 회복시켜 녹음 챔버로 옮긴다.
3. 격리 된 해마 기록을위한 빠른 관류 설정
- 20 - 25 mL / min에서 산소가 공급 된 aCSF를 연속적으로 고속 유입 할 수 있도록 중력 식 관류 시스템을 설치하십시오.
- 미리 aCSF (1X) 플라스크를 준비하고 실험 시작 15 분 전에 예열 욕조 (~ 30 ° C)에 담그십시오. 인라인 용액 히터 시스템을 켜십시오 (30 ° C).
- 실험 전반에 걸쳐 aCSF에 산소를 공급하는 카보 겐 탱크에 연결된 수족관 버블 러와 튜빙 라인을 사용하고 재관류 시작 전에 CaCl 2 [2 mM]를 첨가하십시오.
- aCSF 흐름을 중지하고 와이드를 사용하여 기록 챔버에 해마를 전송유리 피펫의 끝입니다. 자당 포화 제제가 침전되어 바닥에 침전되도록하십시오.
- CA1과 SUB의 매끄러운 표면을 맨 위에 놓고 녹음 챔버의 중심에 (입구 - 출구 축과 일치하여) 준비물을 놓습니다. septal과 temporal extremes에서 작은 무게로 해마를 안정화시키고 aCSF flow를 다시 시작하십시오.
고립 해마에서의 전기 생리학
- 생체 외 hippocampal 쎄타 발현의 세포 외 기록
- LVD (Local Field Potential) 또는 체외 격리 된 해마로부터의 단일 단위 활동의 세포 외 모니터링을 위해 aCSF로 채워진 유리 마이크로 피펫 (1 - 3 MΩ)을 사용하십시오. 이득 x1000의 패치 클램프 증폭기, 온라인 대역 통과 필터링 0.1 - 500 Hz 및 5-20 kHz의 샘플링 속도로 저잡음 AC 결합 필드 전위 신호를 기록하십시오.
참고 :이 프로토콜에 사용되는 맞춤형 현미경는 해마의 저배율보기를위한 저배율 (2.5X) 및 고배율 (40X) 대 상뿐만 아니라 단일 셀 인식을위한 적외선 비디오 현미경 및 후광 형광을 갖추고 있습니다. 이 시스템의 구성 요소로는 직립 형광 현미경, 형광 필터 큐브, 이미징 소프트웨어가있는 아날로그 비디오 카메라 및 디지털 프레임 그래버, 단계별 사용자 지정 관류 챔버 ( 그림 2A , 삽입 된 i) 및 연결 기록 용 고정밀 미세 조절기 및 광섬유 배치. - 현미경에 장착 된 카메라를 사용하고 컴퓨터 디스플레이에 연결하여 저배율 (2.5 배)에서 해마 준비를 검사하고 언더컷이 없거나 외부 표면이 손상되지 않았는지 신속하게 확인합니다. CA1의 매끄러운 표면을 따라 대각선 방향으로 배치 된 새우 섬유 배열은 해마 (hippocam)를 통해 투과 된 빛을 비출 때 가시적이어야한다 ( 그림 2A , 삽입 2)고름.
- 격리 된 해마와 특정 기록 위치에 LFP 전극을 배치하려면 저배율 와이드 필드 대물 렌즈를 사용하십시오.
참고 : 서로 다른 녹음 위치에 배치 된 여러 개의 전극이있는 격리 된 해마 준비의 레이아웃이 그림 2A에 나와 있습니다. - CA1 영역의 표면 (alveus)에 닿을 때까지 LFP 전극을 조에 넣으십시오.
참고 : 이것은 일반적으로 전극이 기록 매체에 닿으면 발생하는 것과 유사한 AC 결합 기록에서 빠른 과도 현상을 일으 킵니다. 오디오 모니터는이 단계 후에 LFP 채널 신호를 청취하는 데 유용 할 수 있습니다.
참고 : 종종 활동의 초기 징후는 10-15 분 후에 만 나타나므로 준비 단계로 빨리 넘어 가지 않는 것이 중요합니다. 이 기간이 지난 후에도 표면 LFP 전극이 여전히 활동을 포착하지 못하면 지층 oriens를 조금 더 아래로 전진하십시오주요 셀 레이어에 접근하는 동안 어떤 형태의 활동이 발생하는지 주기적으로 확인하십시오. 5 ~ 10 분 후에 아무 것도 감지되지 않으면 조심스럽게 전극을 집어 넣고 같은 지역의 다른 곳에 두십시오. - 피라미드 층을 통해 LFP 전극을 전진시킵니다. 개별 뉴런 (주로 피라미드 및 억제 성 바스켓 세포)으로부터의 단일 단위 방출이 검출됨에 따라 세포 외 스파이크 활동이 초기에 증가하는 것을 관찰하십시오. 전극을 더 낮추고 팁이 방사선에 교차하면서 스파이크가 다시 흐려지기 시작합니다. 시타 - 주파수 범위 (4 - 12 Hz)에서 명확하게 보이는 네트워크 발진이 분명 해지고 방사 위치를 통해 방사 크기가 낮아짐에 따라 최대 진폭 (~ 100 - 300 μV)에 도달한다는 것을 관찰하십시오.
- LVD (Local Field Potential) 또는 체외 격리 된 해마로부터의 단일 단위 활동의 세포 외 모니터링을 위해 aCSF로 채워진 유리 마이크로 피펫 (1 - 3 MΩ)을 사용하십시오. 이득 x1000의 패치 클램프 증폭기, 온라인 대역 통과 필터링 0.1 - 500 Hz 및 5-20 kHz의 샘플링 속도로 저잡음 AC 결합 필드 전위 신호를 기록하십시오.
- 단일 영역의 세타 진동
- CA1 영역에서 자발적인 세타 진동의 공간 특성을 시험하기 위해 팁중앙 CA1 부위 (길이 방향의 중격 - 측두 축을 따라 중간에 위치)에서 LFP 전극을 참조하고 이전에 설명한대로 방사체로 내립니다.
- 두 번째 LFP 전극을 CA1 사이트 (200 - 800 μm septal 또는 첫 번째 LFP에서 일시적)에 배치하고 CA1 쎄타 진동이 비교적 큰 거리에서 동기화 될 수 있음을 관찰합니다.
- 레이어를 통한 쎄타 진동
- 해마 층의 세타 진동의 특성을 시험하기 위해 CA1 라지 타텀 사이트에 기준 LFP 전극을 남겨 둡니다. 지층 oriens 바로 위에서 시작하여 두 번째 전극을 피라미드 세포층으로 내리고 radiatum을 통과시킵니다. 피라미드 층을 가로 지르는 LFP 신호의 점진적인 반전 (상대 위상 역전)을 관찰하십시오.
참고 : 이러한 유형의 활동에 대한 대표적인 예는 그림 2B를 참조하십시오. 층류 / 깊이 프로파일 및 전류 소스 밀도 (CSD) 분석기의 예고립 해마에서의 위상 반전 위치가 이전에 23 , 24 , 25 로 발표되었다.
- 해마 층의 세타 진동의 특성을 시험하기 위해 CA1 라지 타텀 사이트에 기준 LFP 전극을 남겨 둡니다. 지층 oriens 바로 위에서 시작하여 두 번째 전극을 피라미드 세포층으로 내리고 radiatum을 통과시킵니다. 피라미드 층을 가로 지르는 LFP 신호의 점진적인 반전 (상대 위상 역전)을 관찰하십시오.
- 손상되지 않은 해마에서 감마 진동과 theta-gamma 커플 링
- 필드 전극을 CA1 / SUB 경계에 놓고 피라미드 층과 분자 층 사이의 계면에 위치 할 때까지 낮추십시오. 이 레벨에서 로컬 세타 리듬으로 위상 고정되는 진폭 변화로 명확한 감마 진동을 표시하는 필드 전위를 기록 할 수 있습니다 24 . 쎄타 - 감마 커플 링의 느린 시간 스케일을 관찰하기 위해 스케일링을 조정하십시오. 감마 버스트는 두 개의 다른 주파수 대역에서 발생하며 저속 (25 - 50 Hz) 및 빠른 감마 (150 - 250 Hz) 범위에서 진행중인 LFP 신호를 대역 통과 필터링하여 나타낼 수 있습니다 ( 그림 2C 참조) 흔적).
- 체외 hippocampal theta oscillations 동안 전체 세포 패치 클램프 녹음
참고 : 프로토콜의이 부분에서는 PV promoter (tdTomato)의 제어하에 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 형질 전환 PV-TOM 마우스로부터 격리 된 해마에서 확인 된 신경 세포로부터 시각적으로 유도 된 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻는 것이 목표입니다 자세한 내용은 참고 자료 및 참조 26 ).- PV - TOM 마우스 ( 그림 3 )에서 hippocampal 준비 표면 근처에 tdTomato 긍정적 인 interneurons을 시각화하기 위해 낮은 (2.5X) 및 높은 전력 (40X) 확대와 형광 비디오 현미경을 사용하십시오. PV-TOM 뉴런은 알 부스 (최대 100 μm)를 통한 패치를 성공적으로 시각화하고 표적화 할 수 있지만, 해마가 앵글 컷 기술로 준비 될 때 비 형광성 피라미드 세포에 비교적 쉽게 도달 할 수 있음을 유의하십시오 (참조 섹션 2.2.14 주).
- 해마의 낮은 배율보기에서 패치 클램프 실험을 준비하면서 세타 진동을 모니터링하기 위해 CA1 / SUB에 LFP 전극을 배치하십시오.
- 배율을 40X로 전환하고 대상 영역에 목표물을 담그십시오. 상단 레이어가 보일 때까지 낮추십시오. 반대쪽에서 패치 피펫 접근을위한 충분한 오픈 액세스를 보장하기 위해 현미경의 위치를 조작.
- 형광 현미경 검사에서 형광 PV-TOM 세포를 선택하고 표준 세포 내 용액으로 채워진 패치 피펫 (2 - 3 MΩ)으로 접근하십시오.
- 마우스 피스를 사용하여 가벼운 양의 압력을 피펫에 가하고 전극이 세포로 내려갈 때 저항을 모니터링합니다. 팁이 표적 세포를 만날 때, 피펫 저항이 증가하고 양성 압력이 막을 밀 때 명확한 딤플이 나타난다. 압력을 해제하고 씰이 형성되기 시작할 때 전류 펄스가 평평 해지는지 확인하십시오. 즉시 clamp에서 과분극 된 전위 (-70 mV)로 전환되고 GΩ 씰이 달성되면 피펫 홀더를 통해 가해지는 소량의 음압으로 세포막이 파열됩니다.
- 일단 전체 세포 구성, 자발적인 해마 진동 ( 그림 3B ) 동안 식별 PV 세포의 생리 특성을 검사하십시오.
- PV 세포에서 세포 내막 전위 기록은 진행중인 CA1 / SUB 쎄타 리듬과 동기화되는 빠른 전위 행동 및 파열 작용 전위를 특징으로한다는 것을 관찰하십시오.
- 전압 클램프로 전환하고 본질의 리듬 활동에 의해 생성 된 흥분성 대 억제 성 시냅스 전류의 비율을 특성화하기 위해 세포를 다른 멤브레인 전위로 유지합니다. 비교를 위해 피라미드 셀로부터의 패치 클램프 기록의 예가 도 3a 에 도시되어있다.
- 격리 된 해마의 Optogenetic 제어 참고 : hippocampal 네트워크 활동의 optogenetic 제어 들어, 이러한 세포가 고립 된 해마 25 의 주요 세포 인구를 동기화에 중요한 역할을 것으로 나타 났습으로 PV 함유 GABAergic 세포의 리듬 활성화와 관련된 세포 유형의 구체적인 전략은 여기에 사용됩니다. PV 세포에서 흥분성 채널 루돕 신 -2 (ChR2)의 선택적 발현은 PV-Cre 마우스 라인을 ChR2 Cre 의존적으로 발현하는 마우스 (Ai32)와 교차시킴으로써 PV-ChY 마우스를 생성함으로써 달성된다. 또는 CA1 / SUB interneurons에서 흥분성 옵신의 발현을 유도하기 위해 PV-Cre 또는 PV-TOM 마우스 (P15-16)의 해마에 바이러스 벡터 구조물 ( 예 : AAVdj-ChETA-eYFP)을 주입 할 수 있습니다 ( 그림 4A ).
참고 :이 전략은 이전에 설명되었습니다 25 .- CA1 / SUB 영역에 LFP 전극을 놓고 격리 된 hippoc에 인근 피라미드 셀을 패치하십시오PV 신경 세포에서 청색 빛 민감성 흥분성 옵신 ChR2를 발현하는 마우스의 ampus.
- 광섬유 광 가이드 (직경 0.2 - 1mm)를 해마 제제 위에 놓고 기록 된 부위의 중앙에 놓습니다. 세타 주파수 (4 - 12 Hz)에서 전달되는 광 펄스 (트랜지스터 - 트랜지스터 논리 신호에 의해 트리거되는 10 - 20 ms) 또는 사인파 전압 명령으로 구성된 광 발생 자극을위한 LED 소스의 청색 빛 (473 nm)을 사용하십시오.
참고 : 사용자 정의 LED 기반 광 자극 어셈블리는 다른 곳에서 설명했습니다 25 . - 전류 클램프로 전환하고 자발적인 세타 진동 동안 피라미드의 활동을 특성화합니다.
- 자극 프로토콜을 시작하고 빛의 반응을 기록합니다. 기록 된 신경 세포에서 현장 진동과 시냅스 활동이 광학 유전 자극 동안 점점 더 동기화되고 PV 세포의 리듬 페이싱이 두 주파수( 그림 4 ).
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Representative Results
이 섹션 은 체외에서 마우스 격리 hippocampal 준비 에 세타 진동을 공부하여 얻을 수있는 결과의 예를 보여줍니다. 분리 된 해마를 추출하기위한 해부 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 준비를 사용하여 내장 된 세타 진동은 여러 필드 전극을 배치하는 동안 검사 할 수 있으며 전반적인 활동을 기록하고 격리 된 해마의 여러 지역 및 레이어에있는 연결 인구에 대한 시냅스 입력을 동기화 할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 동시 전체 세포 패치 클램프 및 세포 외 녹음의 대표 결과는 자발적인 해마 세타 진동 ( 그림 3 ) 동안뿐만 아니라 리듬 활동의 optogenetic 조작 중에 특정 세포 유형의 발화 및 시냅스 특성을 특성화하기 위해 제공됩니다g "> 그림 4).
그림 1 : 격리 된 손상없는 해마 준비에 대한 해부 절차.
( a ) 절개 설정의 일반 뷰. 오른쪽 위 : carbogenated ice-cold sucrose 용액 플라스크 (1); 왼쪽 하단 : 얼음으로 채워진 플라스틱 트레이 (2) 렌즈 종이 (3)로 덮인 해부 접시를 들고; 상기 저온 유지 챔버는 수 크로스 용액 (4)을 함유한다. 및 수술 도구 세트 (5). 해부 접시에 hemisection하기 전에 마우스 뇌의 ( b )보기. ( c ) 콜드 홀딩 챔버에서 반공 된 두뇌의 회복 및 중격 아래 코팅 된 주걱의 작은 끝을 삽입하기 전에 왼쪽 뇌 반구의 확대 된보기 (삽입). ( d ) 격리 된 해마 아래, CA1 / SUB 영역을 따라 남은 뇌와 함께 놓인 코팅 된 주걱조직이 아래에서 빠져 나옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 침지 된 기록 챔버에서 손상되지 않은 해마 준비 (inact Hippocampal preparation)에서 시험관 쎄타 진동을 기록하기위한 설정 구성.
( a ) 격리 해마는 hippocampal region의 레이아웃과 septotemporally (white 별표로 표시)에 분포 된 4 개의 다른 녹음 사이트에 배치 된 다중 전극으로 보여진다. 상기 (삽입 삽 입)에 나타낸 기록 챔버 플랫폼의 관점에서, 빠른 관류 흐름을위한 입구 및 출구는 번호 (1, 2)로 표시된다. 아래에 표시된 해마의 확대 된 이미지 (인 세트 ii)에서, 하나의 전극이 중반sepetotemporal CA1과 폐포의 섬유는 쉽게 볼 수 있으며 대구쪽으로 비스듬히 달려 있습니다. S : 중격, T : 임시, f / fx : fimbria-fornix. ( b ) 지층 오리엔트 (회색)와 지층 radiatum (흑색)에서 동시에 기록 된 대표 LFP 추적과 CA1 레이어의 조직의 도식 표현. 두 층 사이의 신호의 반전 된 위상에 주목하십시오. Alv : stratum alveus, PR : stratum pyramidale, SR : stratum radiatum. SLM : Stratum Lacunosum Moleculare. ( c ) 필터링되지 않은 신호로부터 CA1 / SUB 영역 (20 초 세그먼트)과 2 초 확장 세그먼트 (아래)에서 기록 된 자발적인 세타 진동을 보여주는 예제 LFP 추적; theta 주파수 (0.5 - 12 Hz)에 대해 대역 통과 필터링 됨. 느린 감마 (25 - 55 Hz); 및 빠른 감마 (125-250 Hz). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : PV-TOM 마우스에서 무해 해마 준비의 자발적인 세타 진동 동안 피라미드 세포 및 PV Interneuron의 세포 유형 특정 활동.
( a ) 시타 진동 동안 피라미드 세포에서 기록 된 시냅스 활동. 전류 클램프 흔적 (왼쪽 패널)은 휴식시 자발적이지만 리듬없는 발화를 나타내며 천천히 떠오르는 LFP 발진과 명확하게 동기화되지 않은 억제 시냅스 후 전위 (iPSP)를 나타냅니다. 전압 - 클램프 녹음 (오른쪽 패널)은 대응하는 억제 시냅스 전류 (iPSCs)가 약 70mV의 역 전위를 가짐을 보여줍니다. ( b ) 시타 진동 동안 빠른 스파이크 (fast-spiking) 형광 PV 신경 계통으로부터 기록 된 시냅스 활성. 전류 클램프 (왼쪽)에서이 셀은 자발적으로 휴식을 취하고 리드미컬 한 흥분 점안정한 LFP 발진으로 위상 고정 된 시냅스 전위 (ePSP). 전압 - 클램프 기록 (오른쪽)에서, 흥분성 시냅스 후 전류 역전 전위는 약 0 mV였다. 상단의 개략도는 CA1 / SUB에 패치 전극과 필드 전극을 배치하고 기록 된 피라미드 셀과 형광 PV 신경 세포의 고배율 (40X) 확대 이미지와 함께 실험 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 격리 된 해마에서 자발적 및 Optogenetically 구동 쎄타 진동 동안 단일 CA1 / SUB 피라미드 및 PV 뉴런에서 지역 필드 잠재력과 동시 패치 클램프 녹음.
( a b ) 기록 된 세포 (하단)의 전형적인 레귤러 - 스파이 킹 (RS) 성질 (상부) 및 고배율 (40X) 이미지를 나타내는 피라미드 뉴런의 특징. ( c ) LFP 신호 (회색)와 함께 탈분극 막 전위 (흑색)에서 동일한 셀의 샘플 전류 클램프 기록 및 자발 발진 (왼쪽) 및 세타 - 주파수 (6Hz) 광 자극 동안 동기화 된 리듬 IPSP 보여줌 권리). 빛의 자극 패턴 (파란색 음영)이 전압 트레이스의 상단에 그려져 있습니다. ( d ) 6Hz 광 시뮬레이션 (기준선, 자극, 사후) 전후의 LFP 파형의 스펙트로 그램 및 파워 스펙트럼. ( e ) isolat의 저배율 명 시야 및 형광 이미지CA1 / SUB 부위에 국소화 된 eYFP 형광 (녹색)을 나타내는 에드 하 마커 제제. ( f ) 기록 된 PV-TOM 간질 신경 세포 (아래 40X 형광 영상)의 Fast-Spiking (FS) 거동을 보여주는 현재 단계 특성화. ( g ) 3 Hz에서 자발적인 장 진동 (왼쪽)과 광 자극 (오른쪽) 동안 LFP 신호와 동기화 된 기록 된 PV 셀의 큰 EPSP 및 리듬 발사를 보여주는 막 전위 기록. ( h ) CA1 / SUB LFP 신호에 대한 PV 셀 스파이크의 필드 트리거 평균 (FTA). 여러 번의 실험 (LFP 피크를 중심으로)을 통한 PV 셀의 방전은 자연 발진 (기준선) 및 광 자극 (자극) 중에 기록 된 스파이크의 FTA로 변환되었습니다. 중간 그래프와 하단 그래프는 스파이크 및 스파이크 확률 막대 그래프의 래스터 도표를 보여줍니다 (평균 확률은 빨간색으로 표시됨). 최상단의 그래프는 lig 동안 전력이 증가한 평균 LFP 신호의 플롯을 보여줍니다PV 전지의 고도로 동기화 된 발사와 병행하여 자극은 LFP 발진의 피크에 위상 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단리 된 HIPPOCAMPUS를위한 SUCROSE SOLUTION (1X) | |||
| (주식 솔루션) | |||
| 화합물 | MW | 최종 콘서트. (mM) | 1L 당 금액 (g) |
| 자당 | 342.3 | 252 | 86.26 g |
| NaHCO3을 | 84.01 | 24 | 2.020 g |
| 포도당 | 180.2 | 10 | |
| KCl | 74.55 | 삼 | 0.223 g |
| 황산 | 120.4 | 2 | 0.241 g |
| 의 NaH 2 PO 4 | 120 | 1.25 | 0.150 g |
| CaCl2를 .2H2O [M 1] 스톡 | 147 | 1.2 | 120 μL / 0.1 L * |
| * 360 μL CaCl2를 [M 1] 0.3 L 산소화 자당 용액에 대해 추가 | |||
| 산소가 공급되면 pH = 7.4, Osm 310-320 | |||
1 번 테이블.
| 난황을위한 표준 ACSF 용액 (5X) | |||
| (주식 솔루션) | |||
| 화합물 | MW | 최종 콘서트. (mM) | 2L 5X에 대한 금액 |
| NaCl | 58.44 | 126 | 73.6 |
| NaHCO3을 | 84.01 | 24 | 20.2 |
| 포도당 | 180.2 | 10 | 18 |
| KCl | 74.55 | ♦ 4.5 | 3.355 |
| 황산 | 120.4 | 2 | 2.41 |
| 의 NaH 2 PO 4 | 120 | 1.25 | 1.5 |
| 아스 코르 베이트 | 176.1 | 0.4 | 0.705 |
| CaCl2를 .2H2O [M 1] 스톡 | 147 | 2 | 2 mL / L * |
| * 1 L aCSF (1x) 산화 용액에 대해 2 mL CaCl 2 [1 M] | |||
| 산소가 공급되면 pH = 7.4, Osm 310-320 | |||
| hippocampal 네트워크의 흥분성을 증가시키고 theta oscillations의 출현을 용이하게하기 위해이 aCSF 솔루션에 대해 약간 증가 된 [K + ] o가 사용됩니다 (일반적인 aCSF 2.5 mM KCl과 비교). | |||
표 2.
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Discussion
급성 hippocampal 조각에서 electrophysiological 녹음은 표준 체외 기술을 구성하는 동안, 여기에 제시된 방법은 고전적인 접근 방식과 크게 다릅니다. 특정 세포 층이 표면에서 볼 수 있고 직접 검사 할 수있는 얇은 슬라이스 준비와 달리 손상되지 않은 해마 준비물은 개별 층을 통과하면서 전극을 대상 뇌 영역으로 낮추는 생체 내 구성과 유사합니다. 해마의 무결성은 기능적 연결성 및 국부 연결 인구의 특성과 함께 보존됩니다. 이것은 해마에서 소규모 및 대규모 네트워크 진동을 조사하기위한 복잡하고 강력한 도구를 제공합니다. 예를 들어 네트워크에 사전 배선 된 회로와 셀 유형의 특정 특성이 결합되어있어 본질적으로 자발적으로 생성 된 리드 미칼 한 세타 및 감마 진동을 생성하여 히포카의 중요한 특징을 모방합니다생체 내에서의 mpal 활성. 이 프로토콜에 제시된 방법을 사용하면 해마는 설치류의 뇌에서 신속하게 추출 할 수 있으며 빠르게 흐르는 aCSF 환경에서 몇 시간 동안 실행 가능합니다. 기본적인 전기 생리학적인 기술은 특정 신경 유형의 동기 활동 및 시냅스 기능이 해마 역 동학에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 쉽게 적용됩니다.
우리의 절차는 체외 에서 해마의 전체 septo - temporal (dorso - ventral) 축을 가로 질러 국부 장 전위 진동의 역학을 체계적으로 탐구 할 수있는 최초의 기회를 제공했다 (참조 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). 네트워크 및 생리 학적 수준에서, 손상되지 않은 준비는 1) 기능적 시냅스생체 내에서 세타 파의 주파수 범위와 프로파일을 가지고 고유 한 네트워크 진동을 안정적으로지지하는데 필요한 세포 사이의 상호 작용, 2) 층 피라미드 수준에서 세타 진동의 상대 위상의 급격한 변화, 3) 세타의 공간 분포 및 결맞음 해마에서의 진동 및 국부적 인 감마 주파수 리듬과의 상호 작용, 4) 세타 / 감마파의 진폭 - 위상 관계, 5) 주요 세포와 인터내셔널의 소성과 현장 전위 세타 진동의 시간적 관련성.
해마에 대한 외부 입력이 없으면 기술에 한계가있는 것처럼 보이지만, 해마의 내부 동력학을 생체 내에서 수행 할 수없는 방식으로 연구 할 수도 있습니다. 또한, 외부 입력은 특정 섬유 말단 및 구 심성 경로의 광 유발 자극에 의해 모방 될 수있다. 완전한 준비는 새로운 가능성을 제공합니다.네트워크 활동이 해마와 다른 연결 구조와 관련된 대규모 네트워크에서 어떻게 전파되고 상호 작용하는지. 이와 같이 손상되지 않은 준비 기술의 주요 응용은 뇌 영역 내 또는 뇌 영역 간 기능 네트워크 연결성을 조사하는 것입니다. 따라서 시험 관내 손상되지 않은 해마를 사용하면 해마의 세포 및 네트워크 특성에 대한 추가 정보를 제공 할뿐만 아니라 뇌 내에서 정보의 처리, 통합 및 생성을 형성하는 상호 작용 방법을 밝혀야합니다.
큰 뉴런 앙상블의 조화 된 전기 화학 신호 전달에 관여하는 리듬 네트워크 진동은 뇌 영역 내에서 그리고 뇌 영역을 가로 질러 정보를 인코딩, 저장 및 전송하기위한 중심 메커니즘으로 작용합니다. Hippocampal 진동은 시공간 정보, 부호화 및 기억의 처리에 중요하다고 생각된다. 반대로, 해마 기능 장애는 장애의 근본 원인으로 생각된다.변경된 진동 패턴 (29)과 연관된 알츠하이머 병 및 정신 분열증, 같은 시간. 이와 같이, 손상되지 않은 해마 제제를 사용하는자가 생성 된 해마 진동의 연구는 신경계 기능 및 기능 장애의 기본 특성을 설명하기위한 새로운 수단이되었다.
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Disclosures
저자는 상업적 또는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 보건 연구소 (Canadian Institute of Health Research and Natural Sciences)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
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