Summary
Здесь мы представляем протокол для записи ритмических нейронных сетевых тета и гамма-колебаний из изолированного цельного гиппокампального препарата. Мы описываем экспериментальные этапы извлечения гиппокампа на детали записей о полевых, унитарных и цельных клеточных зажимах, а также оптогенетическую стимуляцию тета-ритма.
Abstract
В этом протоколе описаны процедуры подготовки и записи из изолированного цельного гиппокампа, WT и трансгенных мышей, а также недавние улучшения в методологиях и приложениях для изучения тета-колебаний. Представлена простая характеристика изолированного гиппокампального препарата, в соответствии с которым взаимосвязь между внутренними гиппокампальными тета-осцилляторами исследуется вместе с активностью пирамидальных клеток и ГАМКергических интернейронов областей cornu ammonis-1 (CA1) и суббукула (SUB). В целом, мы показываем, что изолированный гиппокамп способен генерировать собственные тета-колебания in vitro и что ритмичность, генерируемая в гиппокампе, может быть точно манипулирована оптикогенной стимуляцией парвальбумин-положительных (PV) интернейронов. Изолированный гиппокампальный препарат in vitro предлагает уникальную возможность использовать одновременную запись в полевых и внутриклеточных патч-зажимах из визуально идентифицированных neuЧтобы лучше понять механизмы генерации тэта-ритма.
Introduction
Гипокампальные тэта-колебания (4 - 12 Гц) являются одними из наиболее преобладающих форм ритмической активности в мозге млекопитающих и, как полагают, играют ключевые роли в когнитивных функциях, таких как обработка пространственно-временной информации и формирование эпизодических воспоминаний 1 , 2 , 3 . В то время как несколько исследований in vivo , в которых подчеркивается взаимосвязь тетамодифицированных клеток места с исследованиями пространственной навигации и поражения, а также клинические данные, подтверждают мнение о том, что гиппокампальные тэта-колебания участвуют в формировании памяти 4 , 5 , 6 , связанные с механизмом С генерацией тэта-колебаний гиппокампа еще не полностью поняты. Ранние исследования in vivo предполагали, что тета-активность зависит главным образом от внешних осцилляторов, в частности ритмического входаОт афферентных структур головного мозга, таких как перегородка и энторинальная кора 7 , 8 , 9 , 10 . Роль внутренних факторов - внутренней связности нейронных сетей гиппокампа вместе со свойствами нейронов гиппокампа - была также постулирована на основе наблюдений in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Тем не менее, помимо нескольких знаковых исследований 19 , 20 , 21 , трудности в разработке подходов, которые могли бы воспроизвести физиологически реалистичные активности населения в простой обработке ломтиков in vitroДолгое время откладывали более подробное экспериментальное исследование внутренних свойств гиппокампа и связанных областей с самогенерирующими тета-колебаниями.
Важным недостатком стандартной экспериментальной установки тонких срезов in vitro является то, что трехмерная клеточная и синаптическая организация структур мозга обычно скомпрометирована. Это означает, что многие формы согласованных сетевых действий, основанные на пространственно распределенных ячейках, от локализованных групп (радиус ≤1 мм) до популяций нейронов, расположенных на одной или нескольких участках мозга (> 1 мм), не могут поддерживаться. Учитывая эти соображения, необходим другой тип подхода для изучения того, как возникают тэта-колебания в гиппокампе и распространяются на связанные корковые и подкорковые выходные структуры.
В последние годы начальная разработка «полного септогиппокампа» для изучения двунаправленного взаимодействияctions два структур 22, и последовавшая эволюции препарата «изолированный гиппокампа», показала , что собственные колебания теты возникают спонтанно в гиппокампе не хватает внешний ритмичного входа 23. Значение этих подходов заключается в первоначальном понимании того, что вся функциональная структура этих регионов должна быть сохранена для того, чтобы функционировать как генератор тета-ритма in vitro 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколами и рекомендациями, одобренными Комитетом по уходу за животными McGill University и Канадским советом по уходу за животными.
1. Острый гиппокамп в препарате in vitro
ПРИМЕЧАНИЕ. Изоляция неповрежденного гиппокампального препарата включает в себя три основных этапа: (1) Подготовка растворов и оборудования, (2) Рассечение гиппокампа и (3) Создание быстрой системы скорости перфузии, необходимой для генерации собственных тета-колебаний. В этом протоколе своевременное выполнение процедур - от вскрытия до записи - особенно важно, потому что изолированный гиппокамп представляет собой такую плотную, но деликатную подготовку, что поддержание функциональной связности структуры in vitro требует большой осторожности. Предварительная подготовка все гарантирует, что достаточный уровень перфузии доступен как можно раньше, чтобы свести к минимуму количество клеток dАктивировать и поддерживать физиологическую функцию.
- Исходное решение на основе сахарозы на основе Cerebral Spinal Fluid (aCSF)
- Подготовьте 1X раствор сахарозы, который будет использоваться для вскрытия и инкубации после вскрытия. Объедините все компоненты, перечисленные в таблице 1 , за исключением CaCl 2 , в 1 л деионизированной воды и храните при 4 ° C в течение 2 недель.
- Стандартное решение aCSF
- Подготовьте стандартную aCSF для перфузии высокого потока изолированного гиппокампа во время электрофизиологических записей. Чтобы сделать концентрированный (5X) запас aCSF, растворите все компоненты, перечисленные в таблице 2 , за исключением CaCl 2 , в 2 л деионизированной воды и храните при 4 ° C.
- Подготовьте оборудование
- Перед началом вскрытия установите рабочую площадку с заполненным льдом пластиковым лотком (30 x 20 x 5 см), соединительными линиями, связанными с углеродом, и т. Д.(10 х 2 см) (см. Рис. 1 ).
- Добавить 300 мл раствора сахарозы (1X) в стакан емкостью 500 мл, высушить его карбогеном (95% O 2 , 5% CO 2 ) и добавить Ca 2+ [1,2 мМ].
- Передайте 60 мл этого раствора сахарозы в стеклянную чашку Петри и оставьте при комнатной температуре. Поместите остаток в морозильную камеру на 4 ° C в течение 10 - 15 минут.
- Разогреть ледяной раствор сахарозы с карбогеном во время вскрытия.
- Заполните вторую чашку Петри (камера холодного удержания) раствором сахарозы (4 ° C) и держите на льду.
- Добавить 30 мл ледяного раствора сахарозы в 50 мл стакан.
2. Целая гиппокампная диссекция
ПРИМЕЧАНИЕ. Метод рассечения изолированного гиппокампа по существу идентичен методу, разработанному и описанному первоначально 22 , но с дополнительными деталями и изменениями в отношении peСкорости и скорости записи.
- Разделение мозга
- Анестезируйте мышь (P20-35) под вытяжной шкаф с небольшим бумажным полотенцем, смоченным 1 мл изофлурана (100%), который добавляется в клетку.
- Обезглавить обезболиваемую мышь и быстро погружать голову в ледяной раствор сахарозы (50 мл стакана, ~ 5 с). Перенесите на бумажное полотенце.
- Используйте скальпель, чтобы сделать срединный разрез кожи (каудальный для рострала) и надавить кожу по бокам, чтобы открыть череп.
- Отрежьте череп маленькими ножницами и используйте шпатель, чтобы быстро извлечь мозг и выбросить его в чашку Петри, содержащую ледяной раствор сахарозы. Позвольте 1-2 мин для охлаждения мозга.
- Пока мозг восстанавливается, добавьте 2 - 3 мл раствора сахарозы на бумагу с линзой, покрытую чашкой Петри (рассечение) на льду.
- Изоляция гиппокампа
- Поместите мозг на блюдо для рассечения в вертикальном положениип.
- Удалите мозжечок и лобную кору с лезвием бритвы. Вырежьте мозг пополам вдоль средней плоскости и верните два изолированных полушария в удерживающую камеру. Позвольте еще 1 - 2 мин для восстановления.
- Поместите один полуразрешенный мозг прямо на блюдо для рассечения.
- Поверните блюдо до тех пор, пока сетчатые структуры не окажутся у наблюдателя, а встроенный контур перегородчатого комплекса будет виден как тонкий грушевидный слой ткани перед таламусом.
- Удерживайте почечный мозг, устойчивый к микроспуте, и поместите маленький конец политетрафторэтиленового (PTFE) -гольного шпателя сразу позади (хвостовой) в зону перегородки.
- Вставьте покрытую шпателем под перегородку и перемещайте наконечник до тех пор, пока не будет достигнута тарелка для вскрытия. Разделите волокна, которые соединяют септальную область каудально. Повторите ту же операцию вдоль переднего края перегородки и разрежьте волокна, которые соединяются с лобной частью мозга.
- С помощью шпателя, слегка удерживающего внутреннюю часть коры чуть выше гиппокампа в вертикальном положении, используйте микрошапулу, чтобы осторожно вытащить таламические, гипоталамические и оставшиеся ядра ствола мозга. Используйте шпатель, чтобы отрезать и удалить оттянутую ткань.
- Поверните изолированное полушарие на боку и определите контур гиппокампа.
- Вставьте шпатель с покрытием в боковой желудочек, под ростральным концом дорсального гиппокампа.
- Держите шпатель горизонтально выровненным с мидагитальной плоскостью полупомощенного мозга и проведите его через гладкий контур стенок желудочков до тех пор, пока наконечник не появится каудально.
- Держите шпатель под гиппокампом и слегка надавите на соединительные волокна вдоль внутреннего слоя, где гиппокамп соединяется с вышележащей корой. Нанесите микроспутку на внешнюю сторону этого слоя и надавите на покрытый шпатель, чтобы нарезать соединительную fiБерс.
- Чтобы завершить экстракцию, поверните рассекающую тарелку и вставьте покрытый шпатель под вентральный гиппокамп. Слегка удерживайте внутреннюю часть кортикальной складкой шпателем и прорезь через энторинальные соединения, используя режущее движение против микроспуты.
ПРИМЕЧАНИЕ. Весь комплекс septohippocampal можно удалить, поместив покрытый шпатель под весь гиппокамп и вытащив оставшуюся ткань головного мозга из-под нее. - После завершения изоляции держите гиппокамп на блюде и добавьте каплю ледяного раствора сахарозы, чтобы он охлаждался. Тщательно отрежьте оставшиеся корки и волокна и отделите гиппокамп от перегородки, аккуратно нанеся лезвие бритвы через лезвие.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если записи патч-фиксаторов должны выполняться из пирамидальных клеток (см. Раздел 4.6 «Оптогенетическое управление»), изолированный гиппокамп можно поперечно разрезать под углом 45 °, чтобы выставить пирамидальный слой CA1 («anglE-cut "), без ущерба для схемы локальной сети в оставшейся части гиппокампа. - Перенесите препарат в раствор сахарозы комнатной температуры и дайте ему остыть в течение 15-30 минут, прежде чем переносить в камеру записи.
3. Настройка быстрого перфузии для записи изолированного гиппокампа
- Настройте систему перфузии с гравитацией, чтобы обеспечить непрерывный высокоскоростной приток оксигенации aCSF при 20-25 мл / мин.
- Предварительно подготовьте флаконы aCSF (1X) и погрузите их в нагревательную ванну (~ 30 ° C) не менее чем за 15 минут до начала эксперимента. Включите встроенную систему нагревателя раствора (30 ° C).
- Используйте пузырьки для аквариумов и линии трубопроводов, соединенные с карбогенным резервуаром, чтобы насытить кислородом aCSF на протяжении всего эксперимента и добавить CaCl 2 [2 мМ] до начала перфузии.
- Остановите поток aCSF и перенесите гиппокамп в камеру записи, используя широкийКонец стеклянной пипетки. Дайте сахарозу насыщенный препарат остыть и оседать на дне.
- Поместите препарат в центр камеры для записи (в соответствии с осью входа-выхода) с гладкой поверхностью CA1 и SUB сверху. Стабилизируйте гиппокамп с небольшими весами на перегородке и височных конечностях и перезапустите поток aCSF.
4. Электрофизиология в изолированном гиппокампе
- Внеклеточная регистрация тэта-колебаний in vitro hippocampal
- Для внеклеточного мониторинга местного полевого потенциала (LFP) или активности одного элемента из изолированного гиппокампа in vitro используйте стеклянные микропипетки (1 - 3 МОм), заполненные aCSF. Записывайте малошумящие AC-связанные полевые потенциальные сигналы с помощью усилителя патч-зажима с коэффициентом усиления x1000, онлайновой полосовой фильтрацией 0,1 - 500 Гц и частотой дискретизации 5-20 кГц.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пользовательский микроскоп, используемый в этом протоколеОснащен объективами с низким (2.5X) и высоким увеличением (40X) для изображения с малым увеличением изображения гиппокампа, а также инфракрасной видеомикроскопией и эпифлуоресценцией для распознавания одной клетки. Компоненты этой системы включают вертикальный флуоресцентный микроскоп, кубики фильтра флуоресценции, аналоговую видеокамеру и цифровой захват кадров с программным обеспечением для обработки изображений, индивидуальную перфузионную камеру на стадии ( рис. 2А , вставка i) и высокоточные микроманипуляторы для нейронных записей и Размещение оптического волокна. - Используйте камеру, установленную на микроскопе, и подключите ее к компьютерному дисплею для осмотра препарата гиппокампа при малом увеличении (2.5X) и быстро проверьте, нет ли подрезов или повреждений внешней поверхности. Диагонально ориентированное расположение волнообразных волокон вдоль гладкой поверхности СА1 должно быть видимым ( рис. 2А , вставка ii) при сиянии проходящего света через гиппокамгной.
- Используйте объектив с широким полем с малым увеличением, чтобы просмотреть изолированный гиппокамп и размещение электродов LFP в определенных местах записи.
ПРИМЕЧАНИЕ. Схема изолированного гиппокампального препарата с несколькими электродами, размещенными в разных местах записи, показана на рисунке 2A . - Опустите LFP-электрод в ванну, пока он не коснется поверхности (alveus) области CA1.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно это приводит к быстрому переходному процессу в записи, связанной с AC, подобно тому, как это происходит, когда электрод контактирует с носителем записи. Звуковой монитор может быть полезен для прослушивания сигнала канала LFP после этого шага.
ПРИМЕЧАНИЕ. Зачастую ранние признаки активности появляются только через 10-15 мин, поэтому важно не быстро продвигаться к препарату. Если после этого периода поверхностный LFP-электрод все еще не поднимает активность, продвигайтесь немного дальше вниз по страту oriensИ периодически приостанавливать, чтобы увидеть, возникает ли какая-либо форма активности при приближении к основному уровню ячейки. Если после дополнительных 5-10 минут ничего не обнаружено, осторожно втяните электрод и поместите его в другое место по той же области. - Продвиньте электрод LFP через пирамидальный слой. Обратите внимание, что активность внеклеточного воспаления изначально увеличивается, когда обнаруживается одноблочный выброс от отдельных нейронов (в основном, пирамидальных и тормозных клеток корзины). Опустите электрод дальше и обратите внимание, что всплеск начинает снова исчезать, когда наконечник крепится к радиусу. Наблюдайте, что отчетливо видимая сетевая колебания в диапазоне частот тэта-диапазона (4-12 Гц) становится очевидной и достигает максимальной амплитуды (~ 100-300 мкВ), поскольку местоположение записи понижается через радиус.
- Для внеклеточного мониторинга местного полевого потенциала (LFP) или активности одного элемента из изолированного гиппокампа in vitro используйте стеклянные микропипетки (1 - 3 МОм), заполненные aCSF. Записывайте малошумящие AC-связанные полевые потенциальные сигналы с помощью усилителя патч-зажима с коэффициентом усиления x1000, онлайновой полосовой фильтрацией 0,1 - 500 Гц и частотой дискретизации 5-20 кГц.
- Тета-колебания в одной области
- Чтобы проверить пространственные свойства спонтанных тэта-колебаний в области CA1, поместите наконечник oFa для LFP-электрода в медиальном сайте CA1 (медиально расположенном вдоль продольной септо-временной оси) и опускать его в радианту, как описано ранее.
- Поместите второй LFP-электрод в сайт CA1 (перегородка с интервалом 200-800 м или временный из первого LFP) и наблюдайте, что CATA-тета-колебания могут синхронизироваться на относительно больших расстояниях.
- Тета-колебания по слоям
- Чтобы проверить свойства тэта-колебаний в слоях гиппокампа, оставьте опорный электрод LFP на сайте Radialum CA1. Начиная с чуть выше пласта oriens, опустите второй электрод в слой пирамидальной клетки и через радиус. Наблюдайте постепенную инверсию сигнала LFP (относительный поворот фазы) через пирамидальный слой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для типичных примеров этих видов деятельности см. Рисунок 2B . Примеры ламинарных / глубинных профилей и плотности источника тока (CSD)Иллюстрирует место разворота фазы в изолированных гиппокампах, опубликованном ранее 23 , 24 , 25 .
- Чтобы проверить свойства тэта-колебаний в слоях гиппокампа, оставьте опорный электрод LFP на сайте Radialum CA1. Начиная с чуть выше пласта oriens, опустите второй электрод в слой пирамидальной клетки и через радиус. Наблюдайте постепенную инверсию сигнала LFP (относительный поворот фазы) через пирамидальный слой.
- Гамма-колебания и тета-гамма-связь в неповрежденном гиппокампе
- Поместите полевой электрод на границу CA1 / SUB и опустите его, пока он не встанет на поверхность раздела между пирамидальным и молекулярным слоями. На этом уровне может быть зарегистрирован потенциал поля, отображающий явные гамма-колебания с изменениями амплитуды, которые могут быть записаны в фазовый синхронизм в локальный тета-ритм 24 . Настройте масштабирование, чтобы наблюдать медленную шкалу времени тета-гамма-связи. Обратите внимание, что гамма-всплески встречаются в двух разных полосах частот, которые могут быть обнаружены путем полосовой фильтрации текущего LFP-сигнала в диапазоне медленного (25-50 Гц) и быстрого гамма (150-250 Гц) (см. Рисунок 2C для типичного фильтрованного следы).
- Запись цельного клеточного зажима во время тэта-колебаний in vitro hippocampal
ПРИМЕЧАНИЕ. В этой части протокола цель состоит в том, чтобы получить визуально управляемые записи цельного клеточного зажима из идентифицированных интернейронов в изолированных гиппокампах из трансгенных мышей PV-TOM, экспрессирующих флуоресцентный белок, tdTomato, под контролем PV-промотора (для Подробнее см. Материалы и Ref 26 ).- Используйте флуоресцентную видеомикроскопию с низким (2,5X) и высоким (40X) увеличением для визуализации tdTomato-позитивных интернейронов, расположенных вблизи поверхности гиппокампального препарата от мыши PV-TOM ( рис. 3 ). Обратите внимание, что в то время как нейроны PV-TOM могут быть успешно визуализированы и нацелены на патч через альвеку (до 100 мкм), нефлуоресцентные пирамидальные клетки также могут быть достигнуты относительно легко, когда гиппокамп готовят методом углового разреза (см. Раздел 2.2.14).
- При малом увеличении зрения гиппокампа поместите LFP-электрод в CA1 / SUB, чтобы контролировать колебания theta при подготовке к эксперименту с зажимами.
- Переключитесь на 40-кратное увеличение и погрузите цель в целевую область; Опустите его, пока верхние слои не станут видимыми. Управляйте положением микроскопа, чтобы обеспечить достаточный открытый доступ для подхода патч-пипетки с противоположной стороны.
- При флуоресцентной микроскопии выберите люминесцентную ячейку PV-TOM и подходите к ней с помощью пипетки (2 - 3 МОм), заполненной стандартным внутриклеточным раствором.
- Используйте кусочек рта, чтобы нанести легкое положительное давление на пипетку и контролировать сопротивление, когда электрод опускается на ячейку. Когда наконечник встречает клетку-мишень, сопротивление пипетки увеличивается, и появляется ясная ямочка, когда положительное давление нажимается на мембрану. Отпустите давление и убедитесь, что текущий импульс сглаживается по мере того, как уплотнение начинает формироваться. Сразу же clУсилителя к гиперполяризованному потенциалу (-70 мВ), и как только будет достигнуто уплотнение GΩ, разрыхлите клеточную мембрану с небольшим количеством отрицательного давления, нанесенного через держатель пипетки.
- Изучив физиологические свойства идентифицированной фотоэлемента во время спонтанных гиппокампальных колебаний ( рис. 3B ), изучите физиологические свойства идентифицированной фотоэлемента.
- Обратите внимание, что запись потенциала внутриклеточного мембран из фотоэлементов характеризуется быстродействующим поведением и всплесками потенциалов действия, синхронизированными с текущим тета-ритмом CA1 / SUB.
- Переключитесь на зажим напряжения и удерживайте ячейку при разных мембранных потенциалах, чтобы охарактеризовать соотношение возбуждающих и тормозных синаптических токов, генерируемых внутренней ритмической активностью. Пример записи патч-фиксатора из пирамидальной ячейки показан на рисунке 3A для сравнения.
- Оптогенетический контроль в изолированном гиппокампе ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптогенетического контроля активности сети гиппокампа используется специальная стратегия клеточного типа, включающая ритмическую активацию PV-содержащих GABAergic клеток, поскольку эти клетки, как было показано, играют важную роль в синхронизации основных популяций клеток в изолированном гиппокампе 25 . Селективную экспрессию возбуждающего channelrhodopsin-2 (ChR2) в клетках PV достигается путем пересечения линии мыши PV-Cre с мышами, конститутивно экспрессирующими ChR2 Cre-зависимо (Ai32), тем самым генерируя мышей PV-ChY. Альтернативно, вирусные векторные конструкции ( например , AAVdj-ChETA-eYFP) могут быть введены в гиппокамп мышей PV-Cre или PV-TOM (P15-16) для управления экспрессией возбуждающего опсина в интернейронах CA1 / SUB ( рисунок 4A ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта стратегия была описана ранее 25 .- Поместите электрод LFP в область CA1 / SUB и нанесите соседнюю пирамидальную ячейку в изолированный гиппоокAmpus мыши, выражающей чувствительный к синему свету возбуждающий опсин ChR2 в PV интернейронах PV.
- Поместите оптическую направляющую оптического волокна (диаметр 0,2 - 1 мм) над препаратом гиппокампа и центрируйте его на зарегистрированной области. Используйте голубой свет (473 нм) от источника светодиода для оптогенетической стимуляции, состоящий из световых импульсов (10-20 мс, вызванных транзисторным транзисторным логическим сигналом) или команд синусоидального напряжения, подаваемых на частотах ТТА (4 - 12 Гц).
ПРИМЕЧАНИЕ. Пользовательская светодиодная световая установка была описана в другом месте 25 . - Переключитесь на текущий зажим и охарактеризуйте активность пирамидального во время спонтанных тэта-колебаний.
- Запустите протокол стимуляции и запишите ответы на свет. Отметим, что колебания поля и синаптическая активность в зарегистрированном нейроне становятся все более синхронизированными во время оптогенетической стимуляции и что ритмическая стимуляция PV-клеток приводит к надежному контролю как частотыEncy и мощность тэта-колебаний ( рис. 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе приведены примеры результатов, которые могут быть получены путем изучения тета-колебаний в мышином изолированном гиппокампальном препарате in vitro . Процедура вскрытия для выделения изолированного гиппокампа проиллюстрирована на рисунке 1 . Используя этот препарат, собственные тета-колебания можно исследовать при размещении нескольких полевых электродов, регистрируя общую активность и синхронизированные синаптические входы в популяции нейронов в разных регионах и слоях изолированного гиппокампа ( рис. 2 ). Представлены репрезентативные результаты одновременного цельного клеточного зажима и внеклеточных записей для характеристики обжига и синаптических свойств конкретных типов клеток во время спонтанных тэта-колебаний гиппокампа ( рис. 3 ), а также при оптогенетической манипуляции ритмической активностью (G "> Рисунок 4).
Рисунок 1: Процедура рассечения препарата Изолированный неповрежденный гиппокамп.
( A ) Общий вид установки рассечения. Вверху справа: карбонизированная ледяная колба для раствора сахарозы (1); Нижний левый: ледяной пластиковый лоток (2), держащий рассекательную тарелку, покрытую бумагой для линз (3); Камера холодного удерживания, содержащая раствор сахарозы (4); И набор хирургических инструментов (5). ( Б ) Просмотр мозга мыши до полусекции на рассекающей таре. ( C ) Восстановление полупозволенного мозга в холодной удерживающей камере и увеличенный вид (вставка) левого полушария головного мозга, прежде чем вставлять маленький конец покрытого шпателя под перегородку. ( D ) Покрытый шпатель, помещенный под изолированным гиппокампом, вдоль области CA1 / SUB, с оставшимся мозгомТкань вытаскивается из-под нее. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Конфигурация установки для записи в тета-колебаниях in vitro из интактного гиппокампа в подповерхностной записывающей камере.
(А) Выделенный гиппокампе показан с компоновкой гиппокампа областей и нескольких электродов , расположенных в четырех различных записывающих сайтов распределенных septotemporally (обозначены белыми звездочками). С точки зрения платформы регистрационной камеры, показанной выше (вставка i), вход и выход для быстрого перфузионного потока обозначены цифрами (1, 2). В увеличенном изображении гиппокампа, показанного ниже (вставка ii), один электрод помещается в серединеSepetotemporal CA1 и волокна альвеки легко видны, бегущие по диагонали к суббукулу. S: септал, T: временный, f / fx: fimbria-fornix. ( Б ) Схематическое представление организации слоев СА1 с репрезентативными следами ЛФП, регистрируемыми одновременно из страт-ориен (серый) и стратиграфического радиуса (черный). Обратите внимание на инвертированную фазу сигналов между двумя слоями. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Пример трассировки LFP, показывающий спонтанное колебание тета, зарегистрированное из области CA1 / SUB (сегмент 20 секунд) и 2 сек. Расширенных сегментов (ниже) из нефильтрованного сигнала; Полосовой фильтр для частот тэта (0,5-12 Гц); Медленная гамма (25 - 55 Гц); И быстрая гамма (125 - 250 Гц). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Конкретная активность клеточного типа пирамидальной клетки и PV Interneuron во время спонтанных тета-колебаний при интактном гиппокампе с помощью мыши PV-TOM.
(А) синаптической активности , зарегистрированной из пирамидальной клетки во время тета колебаний. Траектории тока (левая панель) показывают спонтанный, но не ритмичный выстрел в покое и тормозные постсинаптические потенциалы (iPSP), которые не были четко синхронизированы с медленно возникающими колебаниями LFP. Записи на затворе (правая панель) показывают, что соответствующие тормозные постсинаптические токи (iPSC) имеют потенциал разворота около -70 мВ. ( Б ) Синаптическая активность, регистрируемая с помощью флуоресцентного флуоресцентного PV-интернейрона во время тэта-колебаний. В токовом зажиме (слева) эта ячейка самопроизвольно стреляла в покое и сильно приводилась в движение ритмическим возбуждением поStsynaptic потенциалов (ePSP), которые были заблокированы по фазе со стабильным колебанием LFP. В записях напряжения (справа) возбуждающий постсинаптический потенциал разворота тока составлял приблизительно 0 мВ. Схематические чертежи сверху показывают экспериментальную установку вместе с размещением патч-и полевых электродов в изображениях CA1 / SUB и высокого (40X) изображений записанной пирамидальной ячейки и флуоресцентного PV-интернейрона. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Локальный потенциал поля и одновременные записи зажима паттерна от одиночных пирамидальных и PV-нейронов CA1 / SUB во время спонтанных и оптико-обусловленных тета-колебаний в изолированном гиппокампе.
( A B ) Характеристика пирамидального нейрона, показывающая типичные свойства обычного пика (RS) (сверху) и высокое увеличение (40X) изображения записанной клетки (внизу). ( C ) Запись образца с токовым зажимом одной и той же ячейки при деполяризованном мембранном потенциале (черный) вместе с сигналом LFP (серый) и показом синхронизированных ритмических IPSP во время спонтанного колебания (слева) и при световом стимулировании на частоте (6 Гц) правильно). Схема световой стимуляции (синее затенение) изображается поверх следов напряжения. ( D ) Спектрограмма и спектры мощности формы LFP до, во время и после симуляции 6 Гц (базовая линия, стимул, пост). ( E ) Низкое увеличение ярко-полевых и флуоресцентных изображений изолятаEd hippocampal, показывающий флуоресценцию eYFP (в зеленом цвете), локализованную в области CA1 / SUB. ( F ) Характеристика текущих этапов, показывающая поведение Fast-Spiking (FS) зарегистрированного интернейрона PV-TOM (изображение флуоресценции 40X ниже). ( G ) Запись мембранного потенциала, показывающая большие EPSP и ритмичное срабатывание зарегистрированной PV-ячейки, синхронизированной с сигналом LFP во время спонтанного колебания поля (слева) и во время световой стимуляции (справа) при 3 Гц. ( H ) Полевое триггерное среднее (FTA) всплесков фотоэлементов по сигналу LFP CA1 / SUB. Выделение PV-клетки по нескольким испытаниям (в центре с пиками LFP) превращалось в FTA шипов, регистрируемых во время спонтанного осцилляции (базовой линии) и во время легкой стимуляции (стимул). Средний и нижний графики показывают растровые графики спайков и гистограммы вероятности спайка (средняя вероятность показана красным цветом). Самые верхние графики показывают графики среднего LFP-сигнала, который увеличивается при мощности во время лигаHt параллельно с сильно синхронизированным обжигом фотоэлемента с фазовой синхронизацией до пика колебаний LFP. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| РАССЕЯНИЕ УЗКИ (1X) ДЛЯ ИЗОЛИРОВАННОГО HIPPOCAMPUS | |||
| (Основной раствор) | |||
| Соединение | МВт | Окончательный концерт. (мМ) | Сумма за 1 л (г) |
| сахароза | 342,3 | 252 | 86,26 г |
| NaHCO 3 | 84,01 | 24 | 2,020 г |
| глюкоза | 180,2 | 10 | |
| KCl | 74,55 | 3 | 0,223 г |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 0,241 г |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 0,150 г |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] | 147 | 1.2 | 120 мкл / 0,1 л * |
| * Добавить 360 мкл CaCl 2 [1 М] для 0,3 л насыщенного кислородом раствора сахарозы | |||
| PH = 7,4 при окислении, Osm 310 - 320 | |||
Таблица 1.
| СТАНДАРТНОЕ РЕШЕНИЕ ACSF (5X) ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ | |||
| (Основной раствор) | |||
| Соединение | МВт | Окончательный концерт. (мМ) | Сумма за 2 литра 5X |
| NaCl | 58,44 | 126 | 73,6 |
| NaHCO 3 | 84,01 | 24 | 20,2 |
| глюкоза | 180,2 | 10 | 18 |
| KCl | 74,55 | ♦ 4,5 | 3,355 |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 2,41 |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 1,5 |
| аскорбат | 176,1 | 0,4 | 0,705 |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] | 147 | 2 | 2 мл / л * |
| * Добавьте 2 мл CaCl 2 [1 M] для 1 л кислородсодержащего раствора aCSF (1x) | |||
| PH = 7,4 при окислении, Osm 310 - 320 | |||
| ♦ Для этого aCSF-раствора (по сравнению с обычным aCSF 2,5 мМ KCl) используется слегка повышенный [K + ] o, чтобы увеличить возбудимость сетей гиппокампа и способствовать возникновению тета-колебаний. | |||
Таблица 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как электрофизиологические записи из острых гиппокампальных срезов составляют стандартную методику in vitro , представленные здесь методы существенно отличаются от классического подхода. В отличие от препаратов тонкого среза, где определенные клеточные слои видны на поверхности и могут быть исследованы непосредственно, интактные гиппокампальные препараты более схожи с конфигурациями in vivo, где электроды опускаются в целевые области мозга при пересечении отдельных слоев. Целостность гиппокампа сохраняется вместе с функциональной связностью и свойствами местных нейронных популяций. Это обеспечивает сложный и мощный инструмент для исследования небольших и крупномасштабных колебаний сети в гиппокампе. Например, комбинация предустановленных схем и специфических свойств клеточного типа в сети производит внутренние и спонтанно генерируемые ритмические тета-и гамма-колебания, которые имитируют важные особенности гиппокаMpal активности in vivo . Используя методы, представленные в этом протоколе, гиппокамп можно быстро извлечь из мозга грызунов и оставаться жизнеспособным в течение нескольких часов в быстро протекающей среде aCSF. Основные электрофизиологические методы легко применяются для исследования того, как синхронная активность и синаптическая функция конкретных типов нейронов влияют на динамику гиппокампа.
Наша методика предоставила первую возможность систематически исследовать динамику колебаний локальных полевых потенциалов на всей септо-временной (дорзо-вентральной) оси гиппокампа in vitro (см. Ссылки 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). На сетевом и физиологическом уровнях неповрежденный препарат сохраняет: 1) Функциональная синаPtic взаимодействия между ячейками, требуемые для надежной поддержки собственных колебаний сети с частотным диапазоном и профилем тэта-волн in vivo ; 2) резкое изменение относительной фазы тэта-колебаний на уровне стратиграфического пирамидала; 3) пространственное распределение и когерентность тета Колебания в гиппокампе и его взаимодействие с локальными гамма-частотными ритмами, 4) Амплитудно-фазовое соотношение тета-гамма-волн и 5) Специфическая временная ассоциация стрельбы главной ячейки и интернейрона с тэта-колебаниями поля.
В то время как отсутствие внешнего входа в гиппокамп может быть ограничено техникой, оно также позволяет изучать внутреннюю динамику гиппокампа способом, который не может быть выполнен in vivo . Кроме того, внешние входы могут быть имитированы оптико-электронной стимуляцией конкретных волоконных терминалов и афферентных путей. Непрерывные препараты предлагают новые возможности для изученияКак сетевые действия распространяются и взаимодействуют в крупномасштабных сетях с участием гиппокампа и других связанных структур. Таким образом, одним из основных применений метода интактной подготовки является исследование функциональных сетевых соединений внутри или между областями мозга. Поэтому использование неповрежденного гиппокампа in vitro не только дает дополнительную информацию о клеточных и сетевых свойствах гиппокампа, но также проливает свет на то, как они взаимодействуют для формирования обработки, интеграции и генерации информации в мозге.
Ритмические колебания сети, взаимодействующие с координированной электрохимической сигнализацией больших нейронных ансамблей, выступают в качестве центрального механизма кодирования, хранения и передачи информации внутри и между областями мозга. Гиппокампальные колебания считаются решающими для обработки пространственно-временной информации, кодирования и памяти. И наоборот, гиппокампальная дисфункция, как полагают, лежит в основе нарушенийЧ как болезнь Альцгеймера и шизофрения, которые связаны с измененными колебательными узорами 29 . Таким образом, изучение самогенерированных гиппокампальных колебаний с использованием интактных гиппокампальных препаратов стало новым средством для выяснения основных свойств функции и дисфункции нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют никаких конкурирующих коммерческих или финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Канадскими институтами исследований в области здравоохранения и естественных наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
