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Neuroscience

Tuning en la banda Theta Hippocampal Published: August 2, 2017 doi: 10.3791/55851
Automatic Translation
1, 1
1Department of Psychiatry, Douglas Mental Health University Institute, McGill University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la grabación de la red neuronal rítmica teta y oscilaciones gamma de una preparación de hipocampo aislado todo. Describimos los pasos experimentales desde la extracción del hipocampo hasta los detalles de las grabaciones de parches de campo, unitarios y de células enteras, así como la estimulación optogenética del ritmo teta.

Abstract

Este protocolo describe los procedimientos para la preparación y registro del hipocampo entero aislado, de WT y ratones transgénicos, junto con mejoras recientes en metodologías y aplicaciones para el estudio de las oscilaciones de theta. Se presenta una caracterización simple de la preparación aislada del hipocampo mediante la cual se examina la relación entre los osciladores internos de la teta del hipocampo junto con la actividad de las células piramidales y las interneuronas GABAérgicas de las áreas cornu ammonis-1 (CA1) y subiculum (SUB). En general, se demuestra que el hipocampo aislado es capaz de generar oscilaciones intrínsecas de theta in vitro y que la ritmicidad generada dentro del hipocampo puede manipularse con precisión mediante la estimulación optogenética de interneuronas positivas a parvalbúmina (PV). La preparación hippocampal aislada in vitro ofrece una oportunidad única de usar grabaciones simultáneas en campo y intracelular de patch-clamp de neu visualmente identificadoPara comprender mejor los mecanismos subyacentes a la generación del ritmo theta.

Introduction

Las oscilaciones de la teta del hipocampo (4 - 12 Hz) están entre las formas más predominantes de actividad rítmica en el cerebro de los mamíferos y se cree que desempeñan papeles clave en funciones cognitivas como el procesamiento de la información espaciotemporal y la formación de memorias episódicas 1 , 2 , 3 . Mientras que varios estudios in vivo que ponen de relieve la relación de la teta modulada lugar de las células con la navegación espacial y la lesión estudios, así como la evidencia clínica, apoyan la opinión de que el hipocampo theta oscilaciones están involucrados en la memoria formación 4 , 5 , 6 , los mecanismos asociados Con la generación de oscilaciones de la teta del hipocampo todavía no se entienden completamente. Las investigaciones tempranas in vivo sugirieron que la actividad de theta dependía principalmente de osciladores extrínsecos, en particular de entrada rítmicaDe estructuras cerebrales aferentes como el septo y la corteza entorrinal 7 , 8 , 9 , 10 . Un papel para los factores intrínsecos - conectividad interna de las redes neuronales del hipocampo junto con las propiedades de las neuronas del hipocampo - también se postuló sobre la base de observaciones in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Sin embargo, aparte de unos cuantos estudios históricos 19 , 20 , 21 , las dificultades en el desarrollo de enfoques que podrían reproducir las actividades fisiológicamente realistas de la población en la preparación de la rebanada in vitro simpleS han retrasado durante mucho tiempo un examen experimental más detallado de las capacidades intrínsecas del hipocampo y áreas relacionadas para autogenerar oscilaciones teta.

Un inconveniente importante de la norma in vitro de corte fino de ajuste experimental es que la organización celular 3D y sináptica de las estructuras cerebrales se ve generalmente comprometida. Esto significa que no se pueden apoyar muchas formas de actividades de redes concertadas basadas en conjuntos de células distribuidas espacialmente, que van desde grupos localizados (≤1 mm de radio) hasta poblaciones de neuronas diseminadas a través de una o más áreas cerebrales (> 1 mm). Teniendo en cuenta estas consideraciones, un tipo diferente de enfoque fue necesario para estudiar cómo teta oscilaciones emergen en el hipocampo y propagar a corticales relacionados y subcortical las estructuras de salida.

En los últimos años, el desarrollo inicial de la "completa septo-hipocampo" preparación para examinar intera bidireccionalCiones de las dos estructuras 22 y la consiguiente evolución de la preparación del "hipocampo aislado", han revelado que las oscilaciones intrínsecas de la teta ocurren espontáneamente en el hipocampo sin entrada rítmica externa 23 . El valor de estos enfoques reside en la idea inicial de que toda la estructura funcional de estas regiones tenía que ser conservado con el fin de funcionar como un generador de ritmos theta in vitro [ 22] .

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Protocol

Todos los procedimientos se han realizado de acuerdo con los protocolos y directrices aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de McGill y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

1. Preparación in vitro del hipocampo agudo

NOTA: El aislamiento de la preparación intacta del hipocampo implica tres pasos principales: (1) Preparación de soluciones y equipo, (2) Disección del hipocampo y (3) Configuración del sistema de velocidad de perfusión rápida necesario para la generación de oscilaciones intrínsecas de teta. En este protocolo, el desempeño oportuno de los procedimientos -desde la disección hasta el registro- es particularmente importante porque el hipocampo aislado constituye una preparación tan densa, pero delicada, que el mantenimiento de la conectividad funcional de la estructura in vitro requiere gran cuidado. Preparar todo de antemano asegura que un nivel adecuado de perfusión está disponible tan pronto como sea posible para minimizar la celda dAmage y mantener la función fisiológica.

  1. Solución de líquido espinal cerebral artificial a base de sacarosa (aCSF)
    1. Preparar 1 x solución de sacarosa de reserva para ser utilizado para la disección y la incubación post-disección. Combinar todos los componentes enumerados en la Tabla 1, a excepción de CaCl 2, en 1 L de agua desionizada, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
  2. Solución estándar aCSF
    1. Preparar aCSF estándar para la perfusión de alto caudal del hipocampo aislado durante las grabaciones electrofisiológicas. Para hacer que el concentrado (5X) stock LCRa, disolver todos los componentes enumerados en la Tabla 2, excepto CaCl 2, en 2 L de agua desionizada y almacenar a 4 ° C.
  3. Preparar el equipo
    1. Antes de iniciar la disección, configure el área del banco con una bandeja de plástico rellena de hielo (30 x 20 x 5 cm), tuberías de tuberías conectadas al carbógeno yEe de vidrio (10 x 2 cm) (Ver Figura 1 ).
    2. Añadir 300 ml de solución de sacarosa (1 x stock) a un vaso de precipitados de 500 ml, burbujearlo con carbógeno (95% de O 2 , 5% de CO 2 ) y añadir Ca 2+ [1,2 mM].
    3. Transferir 60 ml de esta solución de sacarosa a una placa de Petri de vidrio y dejar a temperatura ambiente. Coloque el resto en un congelador de 4 ° C durante 10 - 15 min.
    4. Burbujear la solución de sacarosa helada con carbógeno a lo largo de la disección.
    5. Llenar una segunda placa de Petri (cámara fría) con solución de sacarosa (4 ° C) y mantener en hielo.
    6. Añadir 30 ml de solución de sacarosa enfriada con hielo a un vaso de precipitados de 50 ml.

2. Dissección del hipocampo entero

NOTA: El método para diseccionar el hipocampo aislado es esencialmente idéntico al desarrollado y descrito originalmente 22 , pero con detalles adicionales y cambios con respecto al peVelocidad de grabación y técnicas de grabación.

  1. Disección cerebral
    1. Anestesiar el ratón (P20 - 35) bajo una campana extractora de humos con una pequeña toalla de papel empapada con 1 ml de isoflurano (100%) que se agrega a la jaula.
    2. Decapitar el ratón anestesiado y sumergir rápidamente la cabeza en solución de sacarosa helada (vaso de precipitados de 50 ml, ~ 5 s). Transferir sobre una toalla de papel.
    3. Utilice un bisturí para realizar una incisión cutánea medial (caudal a rostral) y empuje la piel por los lados para exponer el cráneo.
    4. Cortar el cráneo con una pequeña tijeras y utilizar una espátula para extraer rápidamente el cerebro y dejarlo caer en la placa de Petri que contiene solución de sacarosa helada. Deje 1-2 min para que el cerebro se enfríe.
    5. Mientras el cerebro se está recuperando, agregue 2 - 3 mL de solución de sacarosa sobre un plato de Petri (disección) cubierto de papel para lentes sobre hielo.
  2. Aislamiento del hipocampo
    1. Coloque el cerebro sobre el plato de disección en posición verticalnorte.
    2. Retire el cerebelo y la corteza frontal con una cuchilla de afeitar. Cortar el cerebro por la mitad a lo largo del plano midsagittal y devolver los dos hemisferios aislados a la cámara de contención. Deje 1 - 2 min más para la recuperación.
    3. Coloque el cerebro hemisectado solo en posición vertical sobre el plato de disección.
    4. Gire el plato hasta que las estructuras centro-medianas se enfrenten al observador y el contorno incrustado del complejo septal sea visible como una delgada capa de tejido en forma de pera anterior al tálamo.
    5. Mantenga firme el cerebro con la microspátula y coloque el extremo pequeño de la espátula recubierta de PTFE (politetrafluoroetileno) inmediatamente detrás del área septal (caudal).
    6. Inserte la espátula recubierta debajo del tabique y mueva la punta hacia abajo hasta alcanzar el plato de disección. Separar las fibras que conectan el área septal caudalmente. Repita la misma operación a lo largo del borde anterior del septo y corte las fibras que se conectan a la parte frontal del cerebro.
    7. Con la espátula sosteniendo ligeramente la parte interna de la corteza justo por encima del hipocampo en posición vertical, use la microspátula para tirar con cuidado hacia abajo del talámico, el hipotálamo y el resto de los núcleos del tronco encefálico. Utilice la espátula para cortar y quitar el tejido extraído.
    8. Girar el hemisferio aislado en su lado e identificar el contorno del hipocampo.
    9. Inserte la espátula recubierta en el ventrículo lateral, debajo del extremo rostral del hipocampo dorsal.
    10. Sostenga la espátula horizontalmente alineada con el plano medio sagital del cerebro hemipediado y deslícela a través del contorno liso de las paredes ventriculares hasta que la punta emerja caudalmente.
    11. Sostenga la espátula debajo del hipocampo y presiónela ligeramente sobre las fibras de conexión, a lo largo de la capa interior donde el hipocampo se une con la corteza superpuesta. Aplicar la microspátula en el lado externo de esta capa y deslizar contra la espátula recubierta para cortar a través de la conexión fiBers
    12. Para completar la extracción, gire el plato de disección e inserte la espátula recubierta debajo del hipocampo ventral. Sujete ligeramente el interior del pliegue cortical con la espátula y corte a través de las conexiones entorinales utilizando un movimiento de corte en contra de la microspátula.
      NOTA: El complejo septohippocampal completo puede ser removido colocando la espátula recubierta debajo del hipocampo entero, y sacando el tejido cerebral restante de debajo.
    13. Una vez que el aislamiento esté completo, mantenga el hipocampo descansando sobre el plato y agregue una gota de solución de sacarosa helada para mantenerla fresca. Cuidadosamente recortar cualquier cortical y fibras restantes y separar el hipocampo del septo mediante la aplicación suave de una hoja de afeitar a través del fórnix.
      NOTA: Si se van a realizar grabaciones de parches de células piramidales (ver Sección 4.6 Control optogenético), el hipocampo aislado puede cortarse transversalmente a un ángulo de 45 ° para exponer la capa piramidal de CA1 ("anglE-cut "), sin comprometer el circuito de red local en la porción restante del hipocampo.
    14. Se transfiere la preparación a solución de sacarosa a temperatura ambiente y se deja reposar durante 15 - 30 min antes de transferir a la cámara de registro.

3. Configurar la perfusión rápida para la grabación del hipocampo aislado

  1. Instale el sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir el flujo continuo de alta velocidad de aCSF oxigenada a 20 - 25 mL / min.
    1. Preparar los frascos aCSF (1X) por adelantado y sumergirlos en un baño de calentamiento (~ 30 ° C) al menos 15 minutos antes del inicio del experimento. Encienda el sistema de calentador de solución en línea (30 ° C).
    2. Utilice burbujeadores de acuario y líneas de tubo conectado a un tanque de carbogen para oxigenar LCRa durante todo el experimento, y añadir CaCl 2 [2 mM] antes del inicio de la perfusión.
    3. Detenga el flujo de aCSF y transfiera el hipocampo a la cámara de grabación usando el anchoFinal de una pipeta de vidrio. Deje que la preparación saturada de sacarosa se hunda y se asiente en la parte inferior.
    4. Coloque la preparación en el centro de la cámara de registro (en línea con el eje de entrada-salida) con la superficie lisa de CA1 y SUB en la parte superior. Estabilizar el hipocampo con pesos pequeños en las extremidades septal y temporal y reiniciar el flujo aCSF.

4. Electrofisiología en el hipocampo aislado

  1. Registro extracelular de las oscilaciones in vitro de la teta del hipocampo
    1. Para el monitoreo extracelular del potencial de campo local (LFP) o actividad de una sola unidad del hipocampo aislado in vitro , utilice micropipetas de cristal (1 - 3 MΩ) llenas de aCSF. Registre señales de potencial de campo acoplado a AC de bajo ruido con un amplificador de abrazadera de patch de ganancia x1000, filtrado en banda en línea de 0,1 a 500 Hz y una frecuencia de muestreo de 5-20 kHz.
      NOTA: El microscopio personalizado que se utiliza en este protocoloEstá equipado con objetivos de baja (2.5X) y alta ampliación (40X) para la vista de baja amplificación del hipocampo, así como microscopía de video infrarrojo y epifluorescencia para el reconocimiento de una sola célula. Los componentes de este sistema incluyen el microscopio de fluorescencia vertical, cubos de filtro de fluorescencia, una cámara de video analógica y grabador digital de imágenes con software de imagen, una cámara de perfusión personalizada en el escenario ( Figura 2A , inserto i) y micromanipuladores de alta precisión para grabaciones neuronales y Colocación de fibra óptica.
    2. Utilice la cámara montada en el microscopio y conectada a la pantalla del ordenador para inspeccionar la preparación del hipocampo con una ampliación baja (2.5X) y compruebe rápidamente que no haya cortes o daños en la superficie externa. La disposición orientada diagonalmente de las fibras de alvéolos a lo largo de la superficie lisa de CA1 debería ser visible ( Figura 2A , inserto ii) al brillar la luz transmitida a través del hipocampus.
    3. Utilice el objetivo de amplio campo de ampliación baja para ver el hipocampo aislado y la colocación de los electrodos LFP en ubicaciones de grabación específicas.
      NOTA: En la Figura 2A se ilustra un diseño de la preparación aislada del hipocampo con múltiples electrodos colocados en diferentes lugares de grabación.
    4. Baje un electrodo LFP en el baño hasta que toque la superficie (alvéolo) del área CA1.
      NOTA: Esto generalmente produce un transitorio rápido en la grabación acoplada a CA, similar a lo que ocurre cuando el electrodo entra en contacto con el medio de grabación. Un monitor de audio puede ser útil para escuchar la señal del canal LFP después de este paso.
      NOTA: A menudo, los primeros signos de actividad sólo aparecen después de 10 - 15 min, por lo tanto, es importante no avanzar rápidamente en la preparación. Si después de este período el electrodo LFP superficial todavía no está recogiendo actividad, avanza un poco más abajo a través del estrato oriensY hacer una pausa periódicamente para ver si surge alguna forma de actividad mientras se aproxima a la capa celular principal. Si no se detecta nada después de otros 5 - 10 min, retraiga cuidadosamente el electrodo y colóquelo en otra parte a lo largo de la misma región.
    5. Avance el electrodo LFP a través de la capa piramidal. Obsérvese que la actividad de la agregación extracelular aumenta inicialmente a medida que se detecta la descarga de una sola unidad de las neuronas individuales (en su mayoría células piramidales e inhibidoras). Baje el electrodo más y observe que el pico empieza a desvanecerse de nuevo cuando la punta cruza en el radio. Observe que una oscilación claramente visible de la red en el rango de frecuencias theta (4 - 12 Hz) se hace evidente y alcanza la amplitud máxima (~ 100 - 300 μV) a medida que el lugar de grabación se baja a través del radio.
  2. Teta oscilaciones a través de una sola región
    1. Para probar las propiedades espaciales de las oscilaciones de la teta espontánea a través de la región CA1, coloque la punta oFa hace referencia al electrodo LFP en un sitio CA1 medial (situado medialmente a lo largo del eje longitudinal septo-temporal) y lo baja en el radioatum como se ha descrito anteriormente.
    2. Coloque un segundo electrodo LFP en un sitio CA1 (200 - 800 μm septal o temporal de la primera LFP) y observe que las oscilaciones de theta CA1 pueden sincronizarse en distancias relativamente grandes.
  3. Teta oscilaciones a través de capas
    1. Para probar las propiedades de las oscilaciones de theta a través de las capas del hipocampo, deje un electrodo LFP de referencia en un sitio de radiata CA1. Comenzando justo por encima del estrato orien- te, baje un segundo electrodo en la capa de células piramidales ya través del radiato. Observar una inversión gradual de la señal LFP (inversión de fase relativa) a través de la capa piramidal.
      NOTA: Para ejemplos representativos de estos tipos de actividad, véase la Figura 2B . Ejemplos de perfiles laminares / de profundidad y análisis de densidad de fuente de corriente (CSD)Está ilustrando el sitio de inversión de fase en hipocampos aislados que se han publicado previamente 23 , 24 , 25 .
  4. Oscilaciones gamma y acoplamiento teta-gamma en el hipocampo intacto
    1. Coloque un electrodo de campo en el borde CA1 / SUB y bájelo hasta que se sitúe en la interfase entre las capas piramidal y molecular. A este nivel, se puede registrar un potencial de campo que muestra oscilaciones gamma claras con cambios de amplitud que bloquean la fase al ritmo teta local 24 . Ajustar la escala para observar la escala de tiempo lenta del acoplamiento theta-gamma. Tenga en cuenta que las ráfagas gamma se producen en dos bandas de frecuencia distintas, que pueden ser reveladas por la banda de paso de filtrar la señal de LFP en curso en la lenta (25 - 50 Hz) y gamma rápida (150 - 250 Hz) Rango (Véase la Figura 2C para representante filtró Trazas).
  5. Grabación de la abrazadera de parche de células enteras durante las oscilaciones in vitro de la teta del hipocampo
    NOTA: En esta parte del protocolo, el objetivo es obtener grabaciones de parche de parche de células enteras visualmente guiadas a partir de interneuronas identificadas en hipocampos aislados de ratones transgénicos PV-TOM que expresan la proteína fluorescente, tdTomato, bajo el control del promotor PV Más detalles ver materiales y Ref. 26 ).
    1. Utilice microscopía de video de fluorescencia con una ampliación baja (2.5X) y alta potencia (40X) para visualizar las interneuronas positivas a tdTomato situadas cerca de la superficie de una preparación de hipocampo de un ratón PV-TOM ( Figura 3 ). Obsérvese que aunque las neuronas PV-TOM pueden ser visualizadas con éxito y dirigidas a parches a través del alvéolo (hasta 100 μm), las células piramidales no fluorescentes también se pueden alcanzar con relativa facilidad cuando el hipocampo se prepara con la técnica de corte angular Sección 2.2.14 nota).
    2. Bajo una vista de baja amplificación del hipocampo, coloque un electrodo LFP en CA1 / SUB para monitorear las oscilaciones de theta mientras se prepara para experimentos de pinza de parche.
    3. Cambie a una ampliación de 40X y sumerja el objetivo sobre la región de destino; Bájelo hasta que las capas superiores se vuelvan visibles. Manipular la posición del microscopio para asegurar un acceso abierto suficiente para la aproximación de la pipeta de remiendo desde el lado opuesto.
    4. Bajo microscopía de fluorescencia, seleccione una célula fluorescente PV-TOM y enfoque con una pipeta de parche (2 - 3 MΩ) llena de solución intracelular estándar.
    5. Use una boquilla para aplicar presión positiva de luz a la pipeta y monitoree la resistencia mientras el electrodo se baja a la celda. Cuando la punta encuentra la célula objetivo, la resistencia de la pipeta aumenta y aparece un hoyuelo transparente cuando la presión positiva empuja la membrana. Suelte la presión y compruebe que el pulso de corriente se aplaste a medida que empieza a formarse un sello. Inmediatamente clAmp a un potencial hiperpolarizado (-70 mV), y una vez que se consigue un sellado GΩ, rompa la membrana celular con una pequeña cantidad de presión negativa aplicada a través del soporte de la pipeta.
    6. Una vez en la configuración de células enteras, examinar las propiedades fisiológicas de células PV identificadas durante espontánea hipocampo oscilaciones ( Figura 3B ].
    7. Obsérvese que el registro de potencial de membrana intracelular a partir de células FV se caracteriza por un comportamiento de pico rápido y ráfagas de potenciales de acción sincronizados con el ritmo teta CA1 / SUB en curso.
    8. Cambiar a la tensión de sujeción y sostener la célula a diferentes potenciales de membrana para caracterizar la relación entre las corrientes sinápticas excitador versus inhibitorio generado por la actividad rítmica intrínseca. Un ejemplo de grabación de pinza de parche de una célula piramidal se muestra en la Figura 3A para comparación.
  6. Control optogenético en el hipocampo aislado NOTA: Para el control optogenético de la actividad de la red del hipocampo, se utiliza una estrategia específica de tipo celular que implica la activación rítmica de células GABAérgicas que contienen PV, ya que estas células desempeñan un papel importante en la sincronización de las poblaciones de células principales en el hipocampo aislado 25 . La expresión selectiva de la canal excitadora de rhodopsina-2 (ChR2) en células PV se consigue cruzando la línea de ratón PV-Cre con ratones que expresan constitutivamente a ChR2 Cre dependiente (Ai32), generando de este modo ratones PV-ChY. Alternativamente, se pueden inyectar construcciones de vectores virales ( por ejemplo , AAVdj-ChETA-eYFP) en el hipocampo de ratones PV-Cre o PV-TOM (P15-16) para dirigir la expresión de la opsina excitadora en interneuronas CA1 / SUB ( Figura 4A ).
    NOTA: Esta estrategia se ha descrito previamente 25 .
    1. Colocar un electrodo LFP en el área CA1 / SUB y remendar una célula piramidal cercana en el hipocampo aisladoAmpus de un ratón que expresa la sensibilidad sensible a la luz azul opsina ChR2 en PV interneuronas.
    2. Coloque una guía óptica de fibra óptica (0.2 - 1 mm de diámetro) por encima de la preparación del hipocampo y centrarla en la región grabada. Utilice luz azul (473 nm) de una fuente de LED para la estimulación optogenética, consistente en impulsos de luz (10-20 ms, activados por una señal lógica de transistor-transistor) o comandos de tensión de onda sinusoidal entregados a frecuencias theta (4 - 12 Hz).
      NOTA: El conjunto de estimulación de luz basado en LED personalizado se ha descrito en otro lugar 25 .
    3. Cambiar a la abrazadera de corriente y caracterizar la actividad de la piramidal durante las oscilaciones de la teta espontánea.
    4. Iniciar el protocolo de estimulación y registrar las respuestas de la luz. Observe que las oscilaciones de campo y la actividad sináptica en la neurona grabada se sincronizan cada vez más durante la estimulación optogenética y que la estimulación rítmica de las células FV da como resultado un control robusto de ambas frecuenciasY la potencia de las oscilaciones theta ( Figura 4 ).

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Representative Results

Esta sección ilustra ejemplos de resultados que pueden obtenerse estudiando las oscilaciones de theta en la preparación hipocampal aislada de ratón in vitro . El procedimiento de disección para extraer el hipocampo aislado se ilustra en la Figura 1 . Usando esta preparación, se pueden examinar las oscilaciones intrínsecas de la teta durante la colocación de múltiples electrodos de campo, registrando la actividad total y las entradas sinápticas sincronizadas a las poblaciones neuronales en diferentes regiones y capas del hipocampo aislado ( Figura 2 ). Se presentan resultados representativos de la fijación simultánea de parches y registros extracelulares de células enteras para caracterizar las propiedades de disparo y sinápticas de tipos celulares específicos durante las oscilaciones espontáneas de la teta del hipocampo ( Figura 3 ), así como durante la manipulación optogenética de la actividad rítmicaG "> Figura 4).

Figura 1
Figura 1: Procedimiento de disección para la preparación de hipocampo intacto aislado.
(A) Vista general de la configuración de la disección. Arriba a la derecha: frasco de solución de sacarosa enfriada con hielo carbogenado (1); Abajo a la izquierda: bandeja de plástico rellena de hielo (2) que sujeta el plato de disección cubierto con papel de lentes (3); La cámara de contención fría que contiene solución de sacarosa (4); Y un conjunto de herramientas quirúrgicas (5). ( B ) Vista del cerebro del ratón antes de la hemisección en el plato de disección. ( C ) Recuperación del cerebro hemisectado en la cámara de contención fría y vista ampliada (inserción) del hemisferio izquierdo del cerebro antes de insertar el extremo pequeño de la espátula recubierta debajo del tabique. ( D ) Espátula revestida colocada bajo el hipocampo aislado, a lo largo de la región CA1 / SUB, con el resto del cerebroEl tejido se extrae por debajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Configuración de la configuración para la grabación de las oscilaciones teta in vitro de la preparación del hipocampo intacto en la cámara de grabación sumergida.
(A) El hipocampo aislado se muestra con un diseño de las regiones del hipocampo y múltiples electrodos colocados en cuatro sitios diferentes de grabación distribuidos septotemporally (indicado por asteriscos blancas). En la vista de la plataforma de la cámara de registro mostrada anteriormente (inserto i), la entrada y la salida para el flujo de perfusión rápida están indicadas por los números (1, 2). En la imagen ampliada del hipocampo que se muestra a continuación (inserto ii), se coloca un electrodo en la mitadEl CA1 sepetotemporal y las fibras del alveo son fácilmente visibles, corriendo diagonalmente hacia el subículo. S: septal, T: temporal, f / fx: fimbria-fornix. B ) Representación esquemática de la organización de capas CA1 con trazas LFP representativas registradas simultáneamente a partir de stratum oriens (gris) y stratum radiatum (negro). Observe la fase invertida de las señales entre las dos capas. Alv: estrato alveo, PR: estrato pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Ejemplo de trazado de LFP que muestra oscilación teta espontánea registrada desde el área CA1 / SUB (segmento de 20 seg) y segmentos expandidos de 2 seg (abajo) de la señal no filtrada; Paso de banda filtrado para frecuencias teta (0,5 - 12 Hz); Gamma lenta (25 - 55 Hz); Y gamma rápido (125 - 250 Hz). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3: Actividad específica del tipo de células de células piramidales y de interneuron de PV durante las oscilaciones tetaticas espontáneas en la preparación de hipocampo intacto de un ratón PV-TOM.
(A) La actividad sináptica grabado desde una célula piramidal durante oscilaciones theta. Las trazas de pinzas de corriente (panel izquierdo) muestran un disparo espontáneo pero no rítmico en reposo, y los potenciales postsinápticos inhibidores (iPSPs) que no estaban claramente sincronizados con la oscilación lentamente emergente de LFP. Las grabaciones de tensiones (panel derecho) muestran que las correspondientes corrientes postsinápticas inhibitorias (iPSCs) tienen su potencial de inversión alrededor de -70 mV. ( B ) Actividad sináptica registrada a partir de una interneurona fluorescente de PV de rápido crecimiento durante las oscilaciones teta. En la abrazadera de corriente (izquierda), esta célula se disparaba espontáneamente en reposo y fue impulsada fuertemente por po rítmico excitadorStsynaptic potenciales (ePSPs) que fueron fase de bloqueo con la oscilación estable LFP. En las grabaciones de tensión de sujeción (derecha), el potencial de inversión de corriente postsináptica excitatoria fue de aproximadamente 0 mV. Los dibujos esquemáticos en la parte superior muestran la configuración experimental junto con la colocación de electrodos de parche y campo en las imágenes de ampliación CA1 / SUB y alta (40X) de la pila piramidal registrada y de la interneurona PV fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Potencial de campo local y grabaciones simultáneas de abrazaderas de parche de neuronas piramidales y fotovoltaicas CA1 / SUB individuales durante oscilaciones tetaticas espontáneas y optogenéticas en el hipocampo aislado.
Un B ) Caracterización de una neurona piramidal que muestra la imagen de la célula registrada (parte inferior) de las propiedades típicas de Spike Regular (RS) (arriba) y alta (40X). C ) Grabación de corriente de la misma célula en el potencial de membrana despolarizado (negro) junto con la señal de LFP (gris) y mostrando IPSPs rítmicos sincronizados durante la oscilación espontánea (izquierda) y durante la estimulación de luz theta-frecuencia (6 Hz) derecho). El patrón de estimulación de la luz (sombreado azul) se representa en la parte superior de los trazos de voltaje. D ) Spectrograma y espectro de potencia de la forma de onda LFP antes, durante y después de una simulación de luz de 6 Hz (línea de base, estimulación, post). ( E ) Imágenes de fluorescencia y de campo luminoso de baja ampliación del aislamientoEd hipocampo preparación mostrando eYFP fluorescencia (en verde) localizada en la región CA1 / SUB. ( F ) Caracterización de los pasos actuales que muestran el comportamiento de Fast-Spiking (FS) de una interneurona registrada de PV-TOM (imagen de fluorescencia 40X a continuación). ( G ) Registro de potencial de membrana que muestra EPSPs grandes y disparo rítmico de la célula fotovoltaica registrada sincronizada con la señal LFP durante la oscilación espontánea del campo (izquierda) y durante la estimulación luminosa (derecha) a 3 Hz. ( H ) Promedio disparado por el campo (FTA) de los picos de las células fotovoltaicas sobre la señal CAF / CA LFP. La descarga de la célula fotovoltaica en múltiples ensayos (centrada en los picos LFP) se convirtió en un FTA de picos registrados durante la oscilación espontánea (línea de base) y durante la estimulación de la luz (stim). Los gráficos de la parte media y inferior muestran las tramas raster de los picos y los histogramas de probabilidad de la punta (la probabilidad media se muestra en rojo). Los gráficos más altos muestran gráficas de la señal LFP promedio que aumentaron en potencia duranteHt en paralelo con el disparo altamente sincronizado de la célula fotovoltaica bloqueada en fase hasta el pico de la oscilación LFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SOLUCIÓN DE SUCROSE (1X) PARA HIPOCAMPO AISLADO
(Solución de reserva)
Compuesto MW Conc. Final. (MM) Cantidad para 1 L (g)
Sacarosa 342,3 252 86,26 g
NaHCO $ ₃ $ 84,01 24 2,020 g
glucosa 180,2 10
KCl 74,55 3 0,223 g
MgSO _ { 4} 120,4 2 0,241 g
NaH _ { 2} PO _ { 4} 120 1,25 0,150 g
CaCl $ ₂ $ .2H2O [1 M] 147 1.2 120 mu l / 0,1 l *
* Añadir 360 μL de CaCl 2 [1 M] para 0,3 L de solución de sacarosa oxigenada
PH = 7,4 cuando se oxigenó, Osm 310 - 320

Tabla 1.

SOLUCIÓN ESTÁNDAR ACSF (5X) PARA LA PERFUSIÓN
(Solución de reserva)
Compuesto MW Conc. Final. (MM) Cantidad para 2 L 5X
NaCl 58,44 126 73,6
NaHCO $ ₃ $ 84,01 24 20,2
glucosa 180,2 10 18
KCl 74,55 4 3.355
MgSO _ { 4} 120,4 2 2,41
NaH _ { 2} PO _ { 4} 120 1,25 1,5
Ascorbato 176.1 0,4 0,705
CaCl $ ₂ $ .2H2O [1 M] 147 2 2 ml / L *
* Añadir 2 ml de CaCl 2 [1 M] para 1 L aCSF (1x) solución oxigenada
PH = 7,4 cuando se oxigenó, Osm 310 - 320
♦ Para esta solución de aCSF se usa un K [ + ] o [K + ] o KC ligeramente elevado para aumentar la excitabilidad de las redes del hipocampo y facilitar la aparición de oscilaciones de theta.

Tabla 2.

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Discussion

Mientras que las grabaciones electrofisiológicas de cortes de hipocampo agudo constituyen una técnica in vitro estándar, los métodos aquí presentados difieren sustancialmente del enfoque clásico. A diferencia de las preparaciones de rebanadas finas donde las capas celulares específicas son visibles en la superficie y pueden ser examinadas directamente, las preparaciones intactas del hipocampo se asemejan más a configuraciones in vivo en las que los electrodos se bajan en regiones cerebrales dirigidas mientras atraviesan capas individuales. La integridad del hipocampo se preserva junto con la conectividad funcional y las propiedades de las poblaciones neuronales locales. Esto proporciona una herramienta compleja y poderosa para investigar las oscilaciones de la red a pequeña y gran escala en el hipocampo. Por ejemplo, la combinación de circuitos precableados y propiedades específicas del tipo de célula en la red produce oscilaciones teta y gamma rítmicas generadas intrínsecamente y espontáneamente que imitan características importantes de hippocaMpal actividad in vivo . Usando los métodos presentados en este protocolo, el hipocampo se puede extraer rápidamente del cerebro del roedor y permanecer viable durante varias horas en un ambiente de flujo rápido de aCSF. Las técnicas electrofisiológicas básicas se aplican fácilmente para investigar cómo la actividad sincrónica y la función sináptica de tipos neuronales específicos influyen en la dinámica del hipocampo.

Nuestro procedimiento ha proporcionado la primera oportunidad de explorar sistemáticamente la dinámica de las oscilaciones potenciales de campo local a través de todo el eje septo-temporal (dorso-ventral) del hipocampo in vitro (ver Ref. 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). En la red y los niveles fisiológicos, la preparación intacta conserva: 1) La syna funcionalinteracciones PTIC entre las células necesarias para soportar de forma fiable las oscilaciones de la red intrínsecas con el rango de frecuencia y el perfil de las ondas theta in vivo, 2) El cambio brusco en la fase relativa de oscilación theta en el nivel de estrato piramidal, 3) La distribución espacial y la coherencia de theta La oscilación en el hipocampo y su interacción con los ritmos locales de frecuencia gamma, 4) la relación amplitud-fase de las ondas theta / gamma y 5) la asociación temporal específica de la célula principal y el disparo de interneurona con las oscilaciones de la teta potencial del campo.

Mientras que la ausencia de la entrada externa al hipocampo puede aparecer como una limitación a la técnica, también permite el estudio de la dinámica interna del hipocampo de una manera que no se puede hacer in vivo . Además, los insumos externos pueden imitarse mediante la estimulación optogenética de terminales de fibra específicas y vías aferentes. Las preparaciones intactas ofrecen nuevas posibilidades de estudioCómo las actividades de la red se propagan e interactúan en redes a gran escala que implican el hipocampo y otras estructuras conectadas. Como tal, una aplicación principal de la técnica de preparación intacta es la investigación de la conectividad de red funcional dentro o entre las regiones del cerebro. Por lo tanto, el uso del hipocampo in vitro in vitro no sólo debe proporcionar información adicional sobre las propiedades celulares y de red del hipocampo, sino también arrojar luz sobre cómo interactúan para dar forma al proceso, la integración y la generación de información dentro del cerebro.

Las oscilaciones rítmicas de la red que enganchan la señalización electroquímica coordinada de conjuntos neuronales grandes actúan como mecanismo central para codificar, almacenar y transferir información dentro ya través de áreas del cerebro. Se cree que las oscilaciones del hipocampo son cruciales para el procesamiento de la información espaciotemporal, la codificación y la memoria. Por el contrario, se cree que la disfunción del hipocampo subyace a los trastornosH como la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia, que se asocian con los patrones de oscilación alterada [ 29] . Como tal, el estudio de las oscilaciones del hipocampo autogeneradas usando preparaciones hippocampales intactas se ha convertido en un medio renovado para elucidar las propiedades básicas de la función y disfunción del sistema nervioso.

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Disclosures

Los autores no declaran ningún interés comercial o financiero competitivo.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Ciencias Naturales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9625
Sucrose Sigma Aldrich S9378
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S8282
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M7506
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7528
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich A7631-25G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-25 brain extraction
Scalpel Handle #4, 14 cm WPI 500237 brain extraction
Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) WPI 500456 brain extraction
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 Ultident 02-90010-20 brain extraction
Fine Point Curved Dissecting Scissors Thermo Fisher Scientific 711999 brain extraction
Teflon (PTFE) -coated thin spatula VWR 82027-534 hippocampal preparation
Hayman Style Microspatula Fisher Scientific 21-401-25A hippocampal preparation
Lab spoon Fisher Scientific 14-375-20 hippocampal preparation
Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A hippocampal preparation
Droper Fisher Scientific hippocampal preparation
Razor blades Single edged VWR 55411-055 hippocampal preparation
Lens paper (4 x 6") VWR 52846-001 hippocampal preparation
Glass petri dishes (100 x 20 mm) VWR 25354-080 hippocampal preparation
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm n.a. n.a. hippocampal preparation
Single Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B perfusion system
Aquarium air stones for bubbling n.a. n.a. perfusion system
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) Fisherbrand 14-171-129 perfusion system
Electric Skillet Black & Decker n.a. perfusion system
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)  Vitalaire SG466204A perfusion system
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) n.a. n.a. perfusion system
Submerged recording Chamber custom design (FM) n.a. Commercial alternative may be used
Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) WPI 1B150F-4 electrophysiology
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Q-Humbug electrophysiology
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular devices MULTICLAMP electrophysiology
Multiclamp 700B Commander Program Molecular devices MULTICLAMP electrophysiology
Digital/Analogue converter Molecular devices DDI440 electrophysiology
PCLAMP10 Molecular devices PCLAMP10 electrophysiology
Vibration isolation table  Newport n.a. electrophysiology
Micromanipulators (manually operated ) Siskiyou  MX130 electrophysiology (LFP)
Micromanipulators (automated) Siskiyou  MC1000e electrophysiology (patch)
Audio monitor  A-M Systems Model 3300 electrophysiology
Micropipette/Patch pipette puller Sutter P-97 electrophysiology
Custom-built upright fluorescence microscope Siskiyou n.a. Imaging
Analogue video camera COHU 4912-2000/0000 Imaging
Digital frame grabber with imaging software EPIX, Inc PIXCI-SV7 Imaging
Olympus 2.5X objective Olympus MPLFLN Imaging
Olympus 40X water immersion objective Olympus UIS2 LUMPLFLN Imaging
Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system  custom n.a. optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)
Name Company Catalog Number Comments
Animals
PV::Cre (KI) mice Jackson Laboratory stock number 008069 Allow  Cre-directed gene expression in PV interneurons
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) Jackson Laboratory stock number 007905 Express TdTomato following Cre-mediated recombination
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP Jackson Laboratory stock
number 012569		 Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase
PVChY mice In house breeding n.a. Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP

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References

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Neurociencia Número 126 Hipocampo oscilaciones neurales ritmo teta interneuronas, electrofisiología optogenética.
Tuning en la banda Theta Hippocampal<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados
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Manseau, F., Williams, S. Tuning in… More

Manseau, F., Williams, S. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (126), e55851, doi:10.3791/55851 (2017).

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