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Neuroscience

नवजात शिशुओं से स्पाइनल कॉर्ड न्यूरॉन्स अलगाव और संस्कृति

Published: July 11, 2017 doi: 10.3791/55856

Summary

यह अध्ययन, WT नवजात चूहों से न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है। इसके लिए नियोननल माउस से रीढ़ की हड्डी की सावधान विच्छेदन की आवश्यकता होती है, इसके बाद मैनिकल और एनजीमामैटिक क्लेवेज के जरिए स्पाइनल कॉर्ड ऊतक से न्यूरॉन्स की जुदाई अलग होती है।

Abstract

हम रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। न्यूरॉन्स नवजात C57BL / 6 चूहों से प्राप्त होते हैं और प्रसवोत्तर दिन 1-3 पर पृथक होते हैं। आमतौर पर एक प्रजनन जोड़ी से पैदा हुए एक माउस कूड़े, एक प्रयोग के लिए इकट्ठे होते हैं, और आईफ़्लुरुनेन के साथ सुन्नत के बाद प्रत्येक माउस से रीढ़ की हड्डी को अलग-अलग एकत्र किया जाता है। स्पाइनल कॉलम को विच्छेदित किया जाता है और फिर रीढ़ की हड्डी को स्तंभ से जारी किया जाता है। रीढ़ की हड्डी की डोरियों को एंजाइमेटिक प्रोटीज के लिए डिलीवरी के सतह क्षेत्र में वृद्धि करने के लिए फिर से बनाया जाता है जो न्यूरॉन्स और अन्य कोशिकाओं को ऊतक से मुक्त होने की अनुमति देता है। उत्परिवर्तन तब कोशिकाओं को समाधान में रिलीज करने के लिए उपयोग किया जाता है बाद में यह समाधान घनत्व ढाल में भिन्न होता है ताकि समाधान में विभिन्न कोशिकाओं को अलग किया जा सके, जिससे न्यूरॉन्स को पृथक किया जा सके। लगभग 1-2.5 x 10 6 न्यूरॉन्स एक कूड़े समूह से पृथक हो सकते हैं। न्यूरॉन्स को चिपकने वाला तथ्य के साथ लेपित कुओं पर लगाया जाता हैआरएस कि उचित विकास और परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं। न्यूरॉन्स विकास और संस्कृति माध्यम में परिपक्वता तक पहुंचने में लगभग 7 दिन का समय लेते हैं और इसके बाद इलाज और विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

स्पाइनल कॉर्ड पैथोलॉजी को समझना, मैक्रोस्कोपी और सूक्ष्म स्तर पर, विभिन्न मॉडलों के उपयोग की आवश्यकता है। रीढ़ की हड्डी की बीमारी और चोट के विवो जांच के लिए बड़े और छोटे पशु मॉडल 1 , 2 , 3 का उपयोग किया जाता है विवो में इन मुद्दों का अध्ययन करते समय इसकी योग्यताएं होती हैं, रीढ़ की हड्डी का विश्लेषण पूरे रीढ़ की हड्डी के समरूप या ऊतक वर्ग 4 तक सीमित है। यह निवासी न्यूरॉन्स और आसपास के ग्लिया में रीढ़ की हड्डी में विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और लक्ष्यों को अलग करने की कोशिश करते समय कुछ अस्पष्टता पैदा करता है। आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ चूहों की बढ़ती उपलब्धता से सेलुलर और आणविक स्तरों पर जीव विज्ञान की अधिक विस्तृत जांच की अनुमति मिलती है। इस प्रकार, एक नवजात माउस मॉडल का उपयोग यहां किया जाता है, जो इन विट्रो में रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स के अद्वितीय गुणों और जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

एंट "> इन विट्रो में न्यूरॉन्स के अलगाव और रखरखाव विशेष रूप से सीधा नहीं है। वयस्क कृन्तकों के कॉर्टिकल टिशू से न्यूरॉन अलगाव के लिए तकनीकों का रिश्तेदार बहुतायत है, जो अलग-अलग न्यूरॉन्स ( यानी लाखों) की पर्याप्त संख्या में प्रतीत होते हैं 5 , 6 , 7. इसके विपरीत, ऊतक के छोटे द्रव्यमान के कारण रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से न्यूरॉन्स की मात्रा 8 , 9 , 10 कम है। इसके अलावा, चूहों में, नवजात के अलगाव के लिए तकनीकों का एक सापेक्ष कमी है रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स, और मौजूदा तरीकों को कम न्यूरॉन पैदावार ( यानी सैकड़ों) 9 या श्रमसाध्य और संसाधन-भारी तकनीकों से भ्रूणीय चूहों 10 के अलगाव की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में, हमएक ऐसी तकनीक का उपयोग करें जो नवजात शिशुओं के रीढ़ की हड्डी से मूल्य की पर्याप्त मात्रा में न्यूरॉन्स की लागत-और संसाधन-प्रभावी अलगाव के लिए अनुमति देता है। जैसा कि पहले प्रकाशित तकनीकों में सामान्य है, हम पापीन को एंजाइमेटिक प्रोटेज़ के रूप में उपयोग करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी के ऊतक 5 , 6 से न्यूरॉन्स की रिहाई के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हम परिष्कृत सेल अलगाव के लिए एक घनत्व ढाल का उपयोग करते हैं, जो पहले 6 , 10 प्रभावी होने के लिए दिखाया गया है। जबकि माध्यमों में कोशिकाएं incubated हैं हमारे अनुभव में और पहले से 11 प्रकाशित हो सकते हैं, जबकि ताजा B27 संस्कृति माध्यम पूरक के साथ पूरकता न्यूरॉन दीर्घायु के लिए महत्वपूर्ण साबित हुआ है। न्यूरॉन्स आम तौर पर 10 दिनों के लिए व्यवहार्य होते हैं, जिससे उपचार के लिए अनुमति दी जाती है।

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Protocol

इस प्रक्रिया में पशुओं की देखभाल और उपचार कोलोराडो विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया।

1. तैयारी समाधान

  1. उचित तापमान पर सभी समाधान तैयार और संचय करें, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है।

2. कोटिंग वेल्स और स्लाइड्स

नोट: न्यूरॉन्स प्लास्टिक या ग्लास सतहों का अच्छी तरह से पालन नहीं करते हैं।

  1. न्यूरॉन्स के अलगाव से एक दिन पहले, 0.5 एमएल पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल; तालिका 2 ) के साथ एक बाँझ 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुएं और एक लामिना का प्रवाह हुड ओ / एन में इसे छोड़ दें
    नोट: परिष्कृत कुओं से वाष्पीकरण और अधिक तीव्र हो जाता है और असंगत परिणामों को जन्म देने के रूप में, पसंदीदा विधि 24 अच्छी तरह प्लेटें और केवल केंद्र के कुएं कोट का उपयोग करना है। इसके अतिरिक्त, ग्लास स्लाइड कुओं के अंदर पहले टी में रखे जा सकते हैंओ कोटिंग न्यूरॉन्स लेपित गिलास स्लाइड से संलग्न होंगे और बाद में आगे सूक्ष्म इमेजिंग के लिए हटाया जा सकता है
  2. अलगाव के दिन, कुओं से पीडीएल निकालें। किसी भी शेष पानी को हटाने और इसे 1 घंटे (नीचे देखें) के लिए सूखी अनुमति देने से पहले कुछ मिनट के लिए बाँझ पानी से धो लें।
  3. सुखाने के बाद, कोट को लैमिनिन के साथ स्लाइड ( तालिका 2 )।
    नोट: लगभग 10 μL लमिनिन (10 ग्राम / μL) एक बाँझ 24-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के कोट के लिए पर्याप्त है। यह पूरी अच्छी तरह से कवर करने के लिए 340 μL मध्यम (कुल मात्रा: 350 μL) के साथ मिश्रित है इसे एक आरटी पर 2 घंटे के लिए एक संस्कृति हुड में रखें और फिर कोशिकाओं को कोटिंग से पहले आकांक्षा।

3. रीढ़ की हड्डी के तारों का कटाई

नोट: सभी वाद्ययंत्र बाँझपन के लिए (135 डिग्री सेल्सियस और 30 psi 4 x 7 मिनट के चक्रों के लिए) autoclaved होना चाहिए।

  1. Isoflurane के साथ एक चैम्बर में 1-3 दिन पुराने C57BL / 6 माउस पिल्थ का नामकरण करें रुकिए30 एस आंदोलन की समाप्ति के बाद और प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के लिए पैर चुटकी।
  2. कैंची का उपयोग शरीर से सिर अलग करें, प्रवण स्थिति में पिल्ला के साथ।
  3. उपयोगकर्ता के सामने पृष्ठीय पक्ष के साथ, प्रक्रिया तालिका पर पिछले पैर या पूंछ और हथियारों को स्थिर करें।
  4. वक्रित आईरिस कैंची का उपयोग करके त्वचा को काट लें।
  5. कूल्हों के ऊपर के काठ का क्षेत्र से रीढ़ की हड्डी को काटें और शरीर से अलग करने के लिए छाती के दोनों किनारों को काटने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: इसके लिए अन्य अंगों ( चित्रा 1 ए ) को अनजान नुकसान से बचने के लिए आंत अंग से रीढ़ की हड्डी की सावधान विच्छेदन की आवश्यकता होती है।
  6. अनुक्रमिक रूप से 10 सेमी के लिए 3 एक्स 10 सेमी पेट्री डिश, जिसमें 5 एमएल 0.2 माइक्रोन फिल्टर-स्टेरलाइज्ड फॉस्फेट-बीफ़ेड सलाईन (पीबीएस) युक्त अतिरिक्त ऊतक निकालने के लिए धो लें।
  7. रीढ़ की हड्डी के कॉलम के पूंछ के अंत में 5 एमएल फिल्टर-निष्फल पीबीएस से भरा 22 जी सुई और सिरिंज डालें और क्रर्नली फ्लश करें, कॉर्ड की अनुमति देंओ चौथी पेट्री डिश ( चित्रा 1 बी ) में बाहर निकलें
  8. बर्फ पर 5 एमएल एचएबीजी ( टेबल 1 ) के साथ 15 एमएल ट्यूब में रीढ़ की हड्डी को ले लीजिए रीढ़ की हड्डी को कुचलने से बचने के लिए देखभाल का उपयोग करें।
  9. कूड़े में प्रत्येक पिल्ला के लिए चरण 3.1-3.8 दोहराएं।
    नोट: स्वस्थ न्यूरॉन अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए आदर्श रूप से, इस प्रक्रिया को रीढ़ की हड्डी के लिए 30 मिनट से कम लेना चाहिए।

4. न्यूरॉन्स अलग

नोट: निम्न चरण एक लामिनार प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए। बुनियादी बाँझ तकनीक के साथ परिचित उम्मीद है।

  1. ऊतक खनन
    1. रीढ़ की हड्डी वाली रस्सी वाले ट्यूब को लें और ऊतक को निलंबित करने के लिए हल्के से हिलाएं।
    2. ट्यूब से ऊतक को 60 मिमी कांच पेट्री डिश और एक रेजर ब्लेड के साथ पासा डालें जिससे कि ठीक टुकड़े बनाने के लिए ~ 0.5 मिमी आकार का हो।
    3. एक विस्तृत बोर विंदुक के साथ ऊतक को 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5 एमएल एचएबीजी युक्त ट्रांसफर करें।
    4. इसे एक में रखें30 डिग्री के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने के लिए कोशिकाओं को इस तापमान पर संतुलित करना। कक्षों को एक प्रकार के बरतन पर रखें जो उन्हें तरल पदार्थ में निलंबित करने की अनुमति दें।
      नोट: यह कदम पाचन माध्यम से बर्फ से स्थानांतरण पर कोशिकाओं को चौंकाने से बचने के लिए किया जाता है। 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अन्यथा बढ़ी हुई चयापचय के साथ जुड़े सेल की मृत्यु कम करने में मदद करता है
  2. पाचन माध्यम ( तालिका 1 ) तैयार करें
  3. घनत्व ढाल तैयार करें (तालिका 1)
    1. 4 अलग-अलग 15 एमएल ट्यूबों में प्रत्येक 4 परतों को तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में उल्लिखित है।
    2. प्रत्येक परत से 1 नए एमएल ट्यूब में 1 एमएल जोड़ें। नीचे 1 परत के साथ शुरू करें और शीर्ष पर परत 4 तक पहुंचने तक क्रमिक रूप से जोड़ें। जोड़ते समय परतों को परेशान करने से बचें।
  4. चरण 2.2 से पीडीएल-लेपित प्लेट्स धो लें। किसी भी शेष पानी को हटाने से पहले कुछ मिनट के लिए बाँझ पानी से धो लें औरउन्हें 1 घंटे के लिए सूखने की अनुमति
  5. ऊतक को पाचन माध्यम पर स्थानांतरित करें
    1. 30 डिग्री सेल्सियस पर टकराने वाले पानी के स्नान से टिशू युक्त ट्यूब निकालें और इसे कुछ मिनटों तक व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से पाचन मध्यम ट्यूब निकालें और इसे एक झुर्री-लॉक सिरिंज में महाप्राणन करें।
    3. ऊतक युक्त ट्यूब से अतिरिक्त एचएबीजी को बंद करना।
    4. टिश्यू युक्त ट्यूब को पचन माध्यम जोड़ने के लिए सिरिंज पर 0.2 लीटर का लोअर-लॉक का प्रयोग करें।
    5. 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पानी के नल में ट्यूब रखें कोशिकाओं को पर्याप्त मात्रा में रखने के लिए उन्हें तरल पदार्थ में निलंबित करने की अनुमति दें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि पाचन माध्यम में कोशिकाओं को बहुत अधिक समय तक न रखने या तापमान को अधिक ऊंचा होने दें, जिससे अत्यधिक पाचन हो सकता है और परिणामस्वरूप जिलेटिनस मिश्रण में टिशू को निलंबित किया जा सकता है।
  6. इस अवधि के दौरान, चरण 2.3 के रूप में कोट को लैमिनिन
  7. <Li> ट्रिप्रेशन ( अर्थात् ऊतक से कोशिकाओं को अलग करना)।
    1. मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से ट्यूब निकालें और इसे कुछ मिनट के लिए व्यवस्थित करने दें
    2. अतिरिक्त पाचन माध्यम की आकांक्षा।
    3. एचएबीजी के 2 एमएल में ऊतक निलंबित करें
    4. एक संकीर्ण-बोर विंदुक का उपयोग करना, 45 एस के लिए 10x ट्रिटूरेट करें
      नोट: यह संभवतः एक सबसे महत्वपूर्ण कदम है और उचित रूप से नहीं किया जाता है तो वह काफी कम कर सकता है।
      1. विंदुक में ऊतक की आकांक्षा और तुरंत वापस सामग्री खाली।
      2. हवा को शुरू करने से बचें, क्योंकि यह व्यवहार्य उपज कम कर देगा
        नोट: आदर्श विंदुक एक 9 "कांच विंदुक है। विंदुक की टिप खरोंच सतहों को सुचारू बनाने के लिए पॉलिश की जानी चाहिए। यह क्लोरोफॉर्म में 1 9 4 समाधान में डाइक्लोरोमोडिमेथिलसिलेन (डीएमडीसीएस) के प्लेसमेंट द्वारा सिलिकॉन किया जाना चाहिए और ओ छोड़ दिया जाएगा / एन। पिपेट को तब हटा दिया जाना चाहिए और इसे हवा में सूखने की अनुमति दी जानी चाहिए। इसके बाद, यह एसनसबंदी के लिए आटोक्लेव किया जाना चाहिए।
        सावधानी: डीएमडीसीएस और क्लोरोफॉर्म अत्यधिक ज्वलनशील हैं, और सिलिकॉनिंग एक धूआं हुड में किया जाना चाहिए।
    5. सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष 2 एमएल को महाप्राणित करें और इसे "संग्रह" नामक एक नए 15 एमएल ट्यूब में रखें।
    6. चरण दोहराएं 4.7.3-4.7.5 दो अतिरिक्त समय (सेल संग्रह ट्यूब के अंत तक 6 एमएल होना चाहिए)।
    7. धीरे-धीरे संकलन ट्यूब सामग्री को चरण 4.2 में तैयार की गई ढाल ट्यूब में स्थानांतरित करें, जो कि ढाल के विघटन से बचें।
  8. इस बिंदु पर, रेफ्रिजरेटर से पहले तैयार न्यूरोबासल माध्यम ( तालिका 1 ) को हटा दें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में गर्म करने की अनुमति दें।
  9. न्यूरॉन्स शुद्ध।
    1. ढाल ट्यूब को 800 मिनट और 22 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
    2. एक विंदुक ( चित्रा 2 ) के साथ वांछित परत (एस) ले लीजिए और एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। उच्चतम शुद्धता न्यूरो के लिएएन अलगाव ( यानी > 90%), स्तर 3 इकट्ठा। कम शुद्धता ( यानी > 70-80%) के साथ अधिक उपज के लिए, परतों 2 और 3 एकत्रित करें
    3. नए एकत्रित परतों में 5 एमएल एचएबीजी जोड़कर घनत्व ढाल को ढंकना।
    4. 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 200 xg पर अपकेंद्रित्र
    5. सतह पर तैरनेवाला त्याग दें, 5 एमएल एचएबीजी में पुनः निलंबित करें, और कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए गोली को झटका दें।
    6. 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट 200 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र
    7. सतह पर तैरनेवाला त्याग दें, न्यूरोबासल माध्यम के 3 एमएल में रिसास्पेेंड करें, और कोशिकाओं को पुन: resppend करने के लिए गोली फ़्लिक करें।
  10. कोशिकाओं की गणना करें
    1. समाधान के 10 μL ले लो, अब neurobasal माध्यमों में कोशिकाओं के साथ, और 10 μL ट्रिपन ब्लू के साथ मिश्रण।
    2. एक ग्लास गिनती कक्ष में इस मिश्रण के 10 μL रखें।
    3. एक मानक ग्लास गिनती कक्ष का उपयोग करना, चार 4 x 4 quadrants में से प्रत्येक में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। गिनती गई सभी कोशिकाओं (एन), मल्टी जोड़ेंकोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 2 (कमजोर पड़ने वाले कारक) द्वारा प्लाई, 4 से विभाजित (चौगुना की संख्या गिना जाता है), 3 (न्यूरोबासल माध्यम की मात्रा), और 10 4 से गुणा करके गुणा करें।
      समीकरण
  11. संस्कृति प्लेटों पर कोशिकाओं बीज
    1. न्यूरोबासल माध्यम के 1 एमएल में 300,000 कोशिकाओं को सेल निलंबन पतला।
      नोट: उपरोक्त चरणों में प्राप्त कोशिकाओं की एकाग्रता के आधार पर, 3 * 10 5 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त न्यूरोबासल माध्यम जोड़ा जाता है। समीकरण सी 1 वी 1 = सी 2 वी 2 है , जहां सी 1 फसल से प्राप्त कोशिकाओं की प्रारंभिक एकाग्रता है; वी 1 3 एमएल है; और सी 2 3 * 10 5 कोशिकाओं / एमएल, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है समीकरण को v 2 के लिए हल किया जाता है के बराबर समाधान में कोशिकाओं की कुल मात्रा बनाने के लिए आवश्यक neurobasal माध्यम की मात्रा जोड़ेंवी 2
    2. समाधान में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए धीरे-धीरे हिलाएं और लेपित 24-अच्छी तरह प्लेटों में प्रत्येक कुएं में 1 एमएल जोड़ें।

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Representative Results

इस तकनीक का उपयोग करते हुए, एक एकल कूड़े (4-10 पिल्ले) संस्कृति प्लेटों पर सीडिंग के लिए उपयुक्त 1-2.5 10 6 न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए अनुमति देता है। आमतौर पर, 4-8 कुएं को ऊपर उल्लिखित एकाग्रता ( अर्थात 300,000 कोशिकाओं / एमएल) में वरीयता दी जाती है। चित्रा 3 कम-( ) और उच्च- ( बी ) आवर्धन प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर संस्कृति में एक सप्ताह के बाद इस एकाग्रता में न्यूरॉन्स की उपस्थिति दर्शाता है। हालांकि, हम सांद्रता कोशिकाओं में 500,000 से अधिक कोशिकाओं / अच्छी तरह से तथा 100,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से कम के रूप में सांद्रता कोशिकाओं में सक्षम रहे हैं। उच्च सांद्रता का उपयोग पर्यावरण की स्थितियों पर अधिक माध्यमिक और सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है, क्योंकि पोषक तत्वों को जल्दी से समाप्त किया जा सकता है, जिससे कोशिकाओं के लिए विषैले अम्लीय वातावरण हो सकता है। कम सांद्रता के साथ, कोशिकाएं पूर्ण परिपक्वता तक नहीं पहुंचती हैं, और समर्थन कोशिकाओं का एक अतिवृद्धि ( यानी ऑलिगोडेन्ड्रोसाइट्स, मीलक्रोग्लिया, और एस्ट्रोसाइट्स) मनाया जाता है।

आमतौर पर कोशिकाओं को पहले कुछ घंटों ( चित्रा 4 ए ) के भीतर की सतह का पालन करना शुरू कर दिया जाएगा। ऐक्सोन पहले 24-48 घंटे ( चित्रा 4 बी -4 सी ) के भीतर अंकुरित होने लगेंगे । संस्कृति में विभिन्न न्यूरॉन्स के बीच कनेक्शन आम तौर पर 7 दिनों ( चित्रा 4 डी ) पर परिपक्वता तक पहुंचते हैं, जो बिंदु पर प्रयोगों को आमतौर पर न्यूरॉन्स पर किया जाता है।

न्यूरॉन्स प्रकाश माइक्रोस्कोपी के नीचे पहचाने जाते हैं, क्योंकि उनके पास अक्षीय अनुमान हैं। परत 3 ( चित्रा 2 ) का इस्तेमाल करते हुए हमारी अलगाव संस्कृति में 80-90% न्यूरॉन्स उत्पन्न करती है। यह न्यूरॉन-विशिष्ट मार्करों के immunofluorescent धुंधला का उपयोग करके पुष्टि की गई थी चित्रा 5 सी में , न्यूरॉन साइटोस्केलेलेट प्रोटीन माइक्रोट्रूब्यूले-एसोसिएटेड प्रोटीन 2 (एमएपी 2) एस हैसंस्कृति में एक सप्ताह के बाद न्यूरॉन्स की रूपरेखा और अक्षीय अनुमानों को दर्शाते हुए, इसी प्रकार, चित्रा 6 सी में , न्यूरॉन-विशिष्ट परमाणु मापक न्यूयाएन रंगीन है, जो न्यूरोनल नाभिक दिखा रहा है। इन न्यूरॉनल मार्करों को नाभिक (डीएपीआई, चित्रा 5 ए , 6 ए ) और कोशिका द्रव्य (जीएफपी, चित्रा 5 बी , 6 बी ) इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, और परिणामी छवियों को विलय कर दिया जाता है ( चित्रा 5 डी , 6 डी ), न्यूरॉन्स के सापेक्ष बहुतायत में अन्य कोशिकाओं को बताते हुए संस्कृति। परतों 2 और 3 का उपयोग करते समय, न्यूरॉन्स की उपज थोड़ा अधिक है; हालांकि, शुद्ध समाधान (~ 70%) में कम न्यूरॉन्स होते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: स्पाइनल कॉलम विच्छेदित और रीढ़ की हड्डी का एक 3 दिवसीय नवजात माउस से जारी किया गया।तीर में ( ) रीढ़ की हड्डी के मुताबिक, जहां एक सुई को रीढ़ की हड्डी को रिहा करने के लिए डाला जाता है। एक रीढ़ रीढ़ की हड्डी ( बी ) पीबीएस में जलमग्न दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: घनत्व ढाल, सेंथिफ्यूजेशन के बाद जोड़े गए सेल के साथ। परतों को रेखांकित किया गया है और कार्टून चित्रण पर बेहतर ढंग से देखा गया है। सबसे सतही परत (0) आमतौर पर रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से मलबे है। परत 1 oligodendrocytes और astrocytes में समृद्ध है 2 और 3 परतों में अधिकांश न्यूरॉन्स होते हैं जबकि परत 3 में उच्चतम शुद्धता के साथ न्यूरॉन्स होते हैं, कुछ सहायक कोशिकाएं ( यानी, एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेन्ड्रोसाइट्स) परत 2 में पाए जाते हैं। पेतल पर लिलेट में मुख्यतः माइक्रोग्लियल कोशिकाएं होती हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: अलगाव के 7 दिनों के बाद न्यूरॉनल सेल संस्कृतियों की प्रकाश माइक्रोस्कोपी। 10 एक्स बढ़ाई ( ) पर, न्यूरॉन्स के विभिन्न समूहों के बीच अक्षीय कनेक्शन देखा जा सकता है। 40 एक्स बढ़ाई ( बी ) में, न्यूरॉन्स को उनके अक्षीय अनुमानों के साथ अधिक बारीकी से देखा जा सकता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
> चित्रा 4: वेल्स पर सीडिंग के बाद न्यूरॉन्स का समय पाठ्यक्रम। छवि ( ) कोशिकाओं को 1 एच, ( बी ) 24 एच, ( सी ) 48 एच, और ( डी ) बीस के 1 सप्ताह बाद दिखाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: न्यूरॉनल साइटोस्केलेटल मार्कर एमएपी 2 का उपयोग करके न्यूरॉन्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंट डेन। परमाणु धुंधला (डीएपीआई) नीले ( ) में दिखाया गया है, जिसमें ग्रीन ( बी ) और न्यूरॉन साइटोस्केलेट प्रोटीन (एमएपी 2) में लाल ( सी ) में साइप्लास्मेनिक स्टेनाइजिंग (जीएफपी) है। विलय की गई छवियां ( डी ) संयुक्त हैं, जो न्यूरॉन्स के रिश्तेदार बहुतायत दिखाते हैं।लक्ष्य = "_ रिक्त"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
6 चित्रा: न्यूरॉनल न्यूक्लियर मार्कर NeuN का उपयोग न्यूरॉन्स के Immunofluorescent दाग परमाणु धुंधला (डीएपीआई) नीले ( ) में दिखाया गया है, जिसमें हरे रंग की बी ( बी ) और न्यूरोनल नाभिक (एनयूएन) में लाल ( सी ) में साइटोप्लाज्मिक धुंधला (जीएफपी) है। विलय की गई छवियां ( डी ) संयुक्त हैं, जो न्यूरॉन्स के रिश्तेदार बहुतायत दिखाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

मीडिया भंडारण सामग्री तैयारी
HABG 4 डिग्री सेल्सियस / 24 घंटे 100 एमएल 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज ओ / एन में बीजे में पिघलना
फ़िल्टर बाँझ (0.22 माइक्रोन)
हाइबरनेट ए 97.8 एमएल
बी 27 [2%] 2 एमएल
ग्लुटामाक्स [0.5 मिमी] 0.25 एमएल
न्यूरोबासल मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस / 1 सप्ताह 100 एमएल 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज ओ / एन में बीजे में पिघलना
फ़िल्टर बाँझ (0.22 माइक्रोन)
- 50 एमएल ट्यूब में विभाज्य 50 एमएल भाग (4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर)
न्यूरोबैसल ए 97 एमएल
बी 27 [2%] 2 एमएल
ग्लुटामाक्स [0.5 मिमी] 0.25 एमएल
पेन / स्टेप [1%] 1 एमएल
पाचन मीडिया अलगाव का दिन 10 एमएल - उत्साह पूर्वक हिलाना
- इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्नान करने दें (आदर्श रूप से उपयोग किए जाने से 30 मिनट पूर्व)
फ़िल्टर बाँझ (0.22 माइक्रोन)
HA-सीए 10 एमएल
papain 25 मिलीग्राम
ग्लुटामाक्स [0.5 मिमी] 0.025 एमएल
घनत्व ढालदार अलगाव का दिन 1 ग्रेडियंट
परत OptiPrep HABजी
(0.13 एमएल) (5.2 9 एमएल)
1 नीचे 0.26 एमएल 1.24 एमएल
2 0.1 9 एमएल 1.31 एमएल
3 0.15 एमएल 1.35 एमएल
4 शीर्ष 0.11 एमएल 1.3 9 एमएल

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मीडिया और समाधान तैयार करना।

कोटिंग सब्सट्रेट भंडारण सामग्री तैयारी
पीडीएल एक बार रुक-पिघलना पॉली-डी-लाइसिन हाइड्रोबॉमाइड 5 मिलीग्राम - विभाज्य 4 एमएल 15 मिलीलीटर ट्यूबों में और तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें
- 0.5 एमएल / अच्छी तरह से (24-अच्छी तरह से प्लेट)
जीवाणुरहित जल 50 एमएल
laminin कोटिंग का दिन लैमिनिन (1 मिलीग्राम / एमएल) 80 μL - एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में 8 कुओं के लिए पर्याप्त है
- 0.35 एमएल / अच्छी तरह से (24-अच्छी तरह से प्लेट)
न्यूरोबासल माध्यम 2.72 एमएल

सारणी 2: न्यूरॉन्स संवर्धित हैं पर वेल्स को कोट के लिए कोटिंग सब्स्ट्रेट्स तैयार करना।

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Discussion

यह तकनीक रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स की विश्वसनीय संस्कृति के लिए अनुमति देता है। तकनीक में प्रवीणता हासिल होने के बाद, इसे पूरा करने के लिए लगभग 3.5 घंटे लगते हैं। हम लगभग 4 घंटे में 2 अलग-अलग लिटर (16 चूहों कुल) से न्यूरॉन्स के अलगाव को पूरा करने में सक्षम हैं। व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कदम चूहों से रीढ़ की हड्डी को निकालने में सक्षम है। उपज कई कुओं चढ़ाने और विभिन्न स्थितियों के तहत न्यूरॉन्स की जांच करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है। हम परिपक्वता के बाद न्यूरॉन्स का इलाज करने और पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्वसनीय मूल्यांकन करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, न्यूरॉन संलग्नक के लिए कुओं के अंदर ग्लास स्लाइड का उपयोग न्यूरॉन्स के आगे धुंधला विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

यह प्रक्रिया लाभप्रद है क्योंकि इसमें भ्रूण के ऊतकों और संबद्ध श्रम तीव्रता की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, पर्याप्त रीढ़ की हड्डी की डोरियों का उपयोग करने के लिए पर्याप्त मात्रा में ऊतक लेने के लिए आवश्यक नहीं हैई न्यूरॉन अलगाव यह न्यूरॉन फिजियोलॉजी में उम्र के चक्र के व्यवहार को रोकता है, जैसा कि वयस्क चूहों के साथ देखा गया है। हालांकि, इस तकनीक की कोई सीमा नहीं है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, वृद्ध न्यूरॉन्स को नवजात चूहों का उपयोग करके बाहर रखा गया है, और यह एक सीमा हो सकती है अगर उम्र से संबंधित व्यवहार और जीव विज्ञान जांच का क्षेत्र है। प्रक्रिया के लिए एक सीखने की अवस्था है, जो न केवल उपज का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है, बल्कि यह सुनिश्चित करने के लिए कि पृथक न्यूरॉन्स स्वस्थ हैं। स्पाइनल कॉर्ड निष्कर्षण तकनीक में मास्टर करने के लिए कुछ समय लग सकता है, विशेषकर नवजात चूहों के साथ। हमने पाया है कि रीढ़ की हड्डी की निकासी से जुड़े लंबे समय तक न्यूरॉन्स की ओर बढ़ जाती है जो कि काफी कम अवधि के लिए सुसंस्कृत हो सकते हैं। बर्फ पर न्यूरॉन्स की नियुक्ति से कुछ हद तक कम किया गया है; हालांकि, समय अभी भी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है

प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम हैं जो न्यूरॉन्स की इष्टतम उपज सुनिश्चित करने में सहायता करते हैं। यदि न्यूरॉन उपज ई के रूप में नहीं हैउम्मीद है, कुछ कदमों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी की संख्या आदर्श रूप से 4 से अधिक होनी चाहिए। जब ​​3 रीढ़ की हड्डी या कम का उपयोग किया जाता है, तो उपज आम तौर पर 1 मिलियन न्यूरॉन्स से कम होता है। पाचन माध्यम की पर्याप्त तैयारी सुनिश्चित की जानी चाहिए (चरण 4.5)। पाचन माध्यम में लंबे समय तक ऊतक को छोड़ने से कोशिकाओं के अत्यधिक टूटने का कारण बनता है, जबकि पाचन माध्यम का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय नहीं किया गया है, इसके परिणामस्वरूप कम पृथक न्यूरॉन्स होंगे। अंत में, ट्रिप्रेशन तकनीक (चरण 4.7) को सटीक रूप से किया जाना चाहिए। कम पैदावार आम तौर पर अपर्याप्त विचलन से होती है। एक अच्छा सूचक यह देख रहा है कि क्या ट्रिट्यूशन के दौरान समाधान ढीला हो जाता है - यदि ऐसा नहीं होता है, तो यह संभावना है कि ट्रिटिशन बहुत कोमल है।

यदि उपज अपेक्षित है लेकिन न्यूरॉन्स पहले 1-2 दिनों के भीतर प्रक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए प्रकट नहीं होते हैं, तो समस्या आमतौर पर उचित कोटिंग में विफल होती है, या तो अपर्याप्त धुलाई के साथया सुखाने (चरण 2.2)। यदि कोशिकाएं प्रारम्भिक रूप से प्रोजेक्ट करती हैं लेकिन बाद में 5-7 दिन के निशान से पहले apoptotic हो जाती हैं, तो कई समस्याएं हो सकती हैं। सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि एचएबीजी समाधान अलगाव के 24 घंटे के भीतर तैयार किया गया है और यह ताजा बी 27 पूरक जो एचएबीजी तैयारी के उसी दिन में विघटित हो गया है इसका उपयोग किया जाता है। इस पूरक में एंटीऑक्सीडेंट्स को ताजा होना चाहिए और समय सीमा समाप्त नहीं होने की आवश्यकता है। आगे, सुनिश्चित करें कि ट्रिप्रेशन प्रक्रिया (चरण 4.7) के दौरान कोई बुलबुले पेश नहीं किया गया है। हवा के बुलबुले का परिचय इस मुद्दे में योगदान देता है और न्यूरॉन्स के सुखाने से संबंधित हो सकता है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि संस्कृति संदूषण से अभिभूत नहीं है, जो बाँझपन में असफलताओं को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

यहां, हम 24-अच्छी तरह प्लेट्स के उपयोग के बारे में बताते हैं जिन पर न्यूरॉन्स बीज बो रहे हैं। कभी-कभी, समय और / या खुराक परीक्षणों को पूरा करना आवश्यक है, जैसे कि औषधीय एजेंटों का उपयोग करते समय तकनीक को संशोधित किया जा सकता है और न्यूरॉन्स को 48-अच्छी तरह से पीएल पर लगाया जा सकता हैबजाय एटीस चूंकि एक 48-अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से सतह का क्षेत्र 24-अच्छी तरह से एक थाली में आधा है, इसलिए कोटिंग समाधानों की मात्रा का उपयोग आधा भाग में किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को आधा मात्रा ( जैसे 1.0 एमएल के बजाय 0.5 एमएल) पर ले जाना चाहिए। हालांकि, उनकी एकाग्रता समान रहनी चाहिए ( यानी 1-5 x 10 5 कोशिका / एमएल)। जबकि इस अध्ययन में सी 57 बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया है, यह तकनीक अन्य अनुवांशिक रूप से छेड़छाड़ वाले उपभेदों पर लागू होनी चाहिए।

रीढ़ की हड्डी आइस्किमिया और संरक्षण बढ़ती रुचि का एक क्षेत्र है 12 , 13 , 14 । नैदानिक ​​रूप से, थोरोकोआडोडोमोनिक महाधमनी सर्जरी का परिणाम स्पाइनल कॉर्ड इस्किमिया और रीपरफ्यूजन से संबंधित विनाशकारी पक्षाघात हो सकता है, जिसमें रोगग्रंथिविज्ञान पूरी तरह से 15 , 16 को समझा जाता है। समझ कैसे न्यूरॉन्स वें का जवाबइस मॉडल का उपयोग करके ischemia के ई तनाव संभव है। हमारे समूह ने इस तकनीक 17 का उपयोग करके ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव के माध्यम से इस्कीमिक अपमान से संबंधित रीढ़ की हड्डी की न्यूरोनल चोट पर पहले प्रकाशित किया है। मॉडल को एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृति को शामिल करने के लिए भी विस्तारित किया गया है, जो न्यूरॉन्स 18 से अलग है।

निष्कर्ष में, यह तकनीक रीढ़ की हड्डी रोग विज्ञान और न्यूरोनल सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए मूल्यवान है। सीरम मुक्त संस्कृति सटीक पर्यावरण नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। यह औषधीय एजेंटों के आवेदन के लिए सीधी पहुंच सक्षम बनाता है। ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव जैसे अतिरिक्त तकनीकों के साथ, यह तकनीक निर्णायक रीढ़ की हड्डी आइसकेमिया के रोग विज्ञान के बारे में हमारी समझ को विस्तारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों में कोई खुलासा नहीं है

Acknowledgments

लेखकों के पास कोई स्वीकार नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hibernate A Medium - 500 mL Thermo-Fisher A1247501 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501
Hibernate A Minus Calcium - 500 mL Brainbits HA-Ca http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/
Glutamax 100X - 100 mL Thermo-Fisher 35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079
B27 Supplement 50X - 10 mL Thermo-Fisher 17504044 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044
Papain, Lyophilized - 100 mg Worthington LS003119 http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html
Neurobasal A Medium - 500 mL Thermo-Fisher 10888022 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo-Fisher 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg Sigma-Aldrich P6407-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US
Mouse Laminin - 1 mg Thermo-Fisher 23017015 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015
Trypan Blue - 20 mL Sigma-Aldrich T8154-20ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US
OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL Sigma-Aldrich D1556-250ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US
Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) Sigma-Aldrich 440272-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US
Chloroform Sigma-Aldrich 288306-1L http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US
Glass Pippette - 9" Sigma-Aldrich 13-678-20C http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US
Pipette bulb - 5 mL Sigma-Aldrich Z186678-3EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1
BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm Sigma-Aldrich BR455717-10EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US
Sterile 24-Well Cell Culture Plate Sigma-Aldrich M8812-100EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US
Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) Fischer Scientific 02-671-6 https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716
Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated Neuvitro GG-12-1.5-Pre http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm
NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL Abcam ab177487 After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C
MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL Abcam ab11267 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C

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नवजात शिशुओं से स्पाइनल कॉर्ड न्यूरॉन्स अलगाव और संस्कृति
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Eldeiry, M., Yamanaka, K., Reece, T. More

Eldeiry, M., Yamanaka, K., Reece, T. B., Aftab, M. Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (125), e55856, doi:10.3791/55856 (2017).

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