Summary
Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.
Abstract
Wij presenteren een protocol voor de isolatie en de cultuur van de ruggengraat neuronen. De neuronen worden verkregen uit neonatale C57BL / 6 muizen en zijn geïsoleerd op postnatale dag 1-3. Een muis rommel, meestal 4-10 pups geboren uit een fokpaar, is verzameld voor een experiment, en wervelkoorden worden individueel van elke muis verzameld na euthanasie met isofluraan. De wervelkolom wordt uitgescheiden en vervolgens wordt het ruggenmerg uit de kolom vrijgegeven. De ruggenmergen worden vervolgens gehakt om het oppervlaktegebied van een enzymatische protease te verhogen waardoor de neuronen en andere cellen uit het weefsel vrijkomen. Trituratie wordt dan gebruikt om de cellen in oplossing te laten lossen. Deze oplossing wordt vervolgens gefractioneerd in een dichtheidsgradiënt om de verschillende cellen in oplossing te scheiden, waardoor neuronen geïsoleerd worden. Ongeveer 1-2,5 x 10 6 neuronen kunnen geïsoleerd worden uit één nestgroep. De neuronen worden dan geplant op putjes die met lijm facto zijn bedektRs die zorgen voor een goede groei en rijping. De neuronen duurt ongeveer 7 dagen om volwassenheid te bereiken in het groei- en kweekmedium en kan daarna worden gebruikt voor behandeling en analyse.
Introduction
Het begrijpen van ruggengraatpatologie vereist het gebruik van verschillende modellen, zowel op macroscopische als microscopische niveaus. Grote en kleine dierenmodellen 1 , 2 , 3 worden gebruikt voor in vivo onderzoeken naar ruggengraatziekte en letsel. Terwijl het bestuderen van deze problemen in vivo zijn voordelen heeft, is de analyse van het ruggenmerg beperkt tot het gehele ruggenmerghomogenaat of aan weefselafdelingen 4 . Dit zorgt voor een beetje dubbelzinnigheid bij het proberen om specifieke reacties en doelen in het ruggenmerg tussen zijn inwendige neuronen en omliggende glia te isoleren. De toenemende beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde muizen zorgt voor meer gedetailleerde onderzoeken van de biologie op cellulaire en moleculaire niveaus. Zo wordt hier een neonataal muismodel gebruikt, waarmee in vitro de unieke eigenschappen en biologie van ruggengraatneuronen kunnen worden onderzocht.
Ent "> Het isoleren en onderhouden van neuronen in vitro is niet bijzonder eenvoudig. Er is een relatief groot aantal technieken voor neuronisolatie van het corticale weefsel van volwassen knaagdieren die lijken te leiden tot een aanzienlijk aantal geïsoleerde neuronen (dat wil zeggen miljoenen) 5 , 6 , 7. In tegenstelling is de opbrengst van neuronen van het ruggenmergweefsel lager 8 , 9 , 10 , mede door de kleinere massa weefsel. Verder is er bij muizen een relatief lage mate van technieken voor de isolatie van neonatale Ruggenmergneuronen, en bestaande methoden worden beperkt door lagere neuronopbrengsten ( dwz honderden) 9 of moeizame en resourcezware technieken die de isolatie van embryonale muizen vereisen 10 .In dit protocol, wijGebruik een techniek die het mogelijk maakt om een kostbare en resource-effectieve isolatie van een aanzienlijk aantal neuronen uit de ruggenmergen van neonatale muizen mogelijk te maken. Zoals gebruikelijk bij eerder gepubliceerde technieken, gebruiken we papain als enzymatisch protease, waardoor neuronen uit het ruggengraatweefsel 5 , 6 vrijkomen. Daarnaast gebruiken we een dichtheidsgradiënt voor verfijnde celscheidingen, die eerder bleek effectief te zijn 6 , 10 . Terwijl het medium waarin de cellen geïncubeerd zijn, kunnen verschillen, in onze ervaring en zoals eerder gepubliceerd 11 , is de aanvulling met vers B27-kweekmedium supplement essentieel voor de lange levensduur van de neuron. De neuronen zijn meestal levensvatbaar voor maximaal 10 dagen, waardoor de behandeling kan worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De zorg en behandeling van dieren in deze procedure zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee aan de Universiteit van Colorado.
1. Oplossingen voorbereiden
- Bereid alle oplossingen op bij passende temperaturen, zoals weergegeven in tabel 1 .
2. Coating Wells en Slides
OPMERKING: Neurons houden zich niet goed aan plastic of glasoppervlakken.
- Een dag voorafgaand aan de isolatie van de neuronen, bedek de putjes van een steriele kweekplaat met 24 putjes met 0,5 ml Poly-D-Lysine (PDL; Tabel 2 ) en laat het in een laminair stromende kap O / N.
OPMERKING: De voorkeursmethode is om platen met 24 putjes te gebruiken en alleen de middelputten te bekleden, aangezien verdamping van de perifere putjes meestal versneld is en tot inconsistente resultaten leidt. Daarnaast kunnen glazen glijbanen in de putjes geplaatst wordenO coating. De neuronen hangen aan de gecoate glazen glijbanen en kunnen later worden verwijderd voor verdere microscopische afbeeldingen . - Verwijder de PDL van de putjes op de dag van isolatie. Wassen met steriel water voor een paar minuten voordat u nog resterend water verwijdert en laat het gedurende 1 uur drogen (zie hieronder).
- Na het drogen, bedek de dia's met laminine ( tabel 2 ).
OPMERKING: Ongeveer 10 μL laminine (10 μg / μl) is voldoende om elke put van een steriele 24-putjesplaat te bekleden. Dit wordt gemengd met 340 μL medium (totaal volume: 350 μl) om de hele put te bedekken. Laat dit gedurende 2 uur bij RT in een kweekkap zitten en daarna aspireren voordat u de cellen bekleedt.
3. Het oogsten van de wervelkolom
OPMERKING: Alle instrumenten moeten voor steriliteit geautoclaveerd worden (135 ° C en 30 psi voor 4 x 7 min cycli).
- Euthanize 1-3 dag oude C57BL / 6 muispups in een kamer met isofluraan. Wacht30 s na het stoppen van de beweging en knijp het been om een gebrek aan reactie te bevestigen.
- Scheep het hoofd van het lichaam met behulp van een schaar, met een pup in de slechte positie.
- Stabiliseer de achterpoten of staart en armen op de procedure tafel, met de rugzijde naar de gebruiker gericht.
- Knip de huid af met behulp van gebogen iris schaar.
- Knip het ruggenmerg van het lumbale gebied net boven de heupen en ga door om beide zijden van de thorax te snijden om het van het lichaam af te scheiden.
OPMERKING: dit vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van viscerale organen om onopzettelijke schade aan andere organen te vermijden ( figuur 1a ). - Was achtereenvolgens gedurende 10 seconden in 3 x 10 cm Petri-schotels die 5 ml 0,2 μm filtergesteriliseerde Fosfaatbufferde Saline (PBS) bevatten om overtollig weefsel te verwijderen.
- Plaats een 22 G-naald en een spuit gevuld met 5 ml met filtergesteriliseerde PBS in het caudale uiteinde van de wervelkolom en spoel craniaal, zodat het koord tO Uitgang in een vierde Petri schotel ( figuur 1b ).
- Verzamel het ruggenmerg in een 15 ml buis met 5 ml HABG ( Tabel 1 ) op ijs. Wees voorzichtig om het ruggenmerg te vermijden.
- Herhaal stap 3.1-3.8 voor elke pup in het nest.
OPMERKING: Ideaal gezien dient dit proces minder dan 30 minuten per ruggenmerg te nemen om een gezond neuronisolatie te waarborgen.
4. Isolerende Neuronen
OPMERKING: De volgende stap moet uitgevoerd worden in een laminaire stroomkap. Bekendheid met basis steriele techniek wordt verwacht.
- Tissue Mincing
- Neem de buis die de wervelkolom bevat en schud licht om het weefsel op te schorten.
- Giet weefsel uit de buis in een 60 mm glas Petri-schotel en dobbelstenen met een scheermesje om fijne stukjes van 0,5 mm te maken.
- Breng het weefsel over met een brede boorpipet in een 15 ml buis die 5 ml HABG bevat.
- Plaats het in een30 ° C waterbad gedurende 30 minuten om de cellen te kunnen evenwaren bij deze temperatuur. Houd de cellen op een shaker net genoeg om ze in de vloeistof te laten ophangen.
OPMERKING: Deze stap is gedaan om de cellen niet te schokken bij overdracht van ijs naar het spijsverteringskanaal. Door de cellen bij 30 ° C te houden, wordt de dood van de cel geassocieerd met een verhoogde stofwisseling bij 37 ° C.
- Bereid het verteringsmedium op ( Tabel 1 ).
- Bereid de dichtheidsgradiënt op (Tabel 1).
- Bereid elk van de 4 lagen op in 4 aparte 15 ml buizen, zoals beschreven in tabel 1 .
- Voeg 1 ml van elke laag in een nieuwe 15 ml buis. Begin met laag 1 onderaan en volg opeenvolgend totdat u laag 4 bovenaan bereikt. Vermijd storing van de lagen tijdens het toevoegen van.
- Was de PDL-beklede platen uit stap 2.2. Wassen met steriel water voor een paar minuten voordat u nog resterende water verwijdertWaardoor ze gedurende 1 uur drogen.
- Breng het weefsel over naar het verteringsmedium.
- Verwijder de weefsel bevattende buis uit het waterbad van de shaker bij 30 ° C en laat het een paar minuten afspreken.
- Verwijder de spijsverteringskanaalbuis uit het waterbad van 37 ° C en aspireer het in een leurslotspuit.
- Aspiratie van de overmaat HABG uit de weefsel bevattende buis.
- Gebruik een leur-lock 0.2 μm filter op de injectiespuit om het verteringsmedium aan de weefsel bevattende buis toe te voegen.
- Plaats de buis gedurende 30 minuten in een 30 ° C waterbad. Houd de cellen net zo schudden dat ze in de vloeistof kunnen worden gesuspendeerd.
OPMERKING: Het is belangrijk om de cellen niet te lang in het verteringsmedium te houden of de temperatuur te hoog te laten, wat kan leiden tot overmatige vertering en resulteren in het weefsel in een gelatinezuurmengsel worden gesuspendeerd.
- Over deze periode bedek de laminine zoals in stap 2.3. <Li> Trituratie uitvoeren ( dwz scheiding van de cellen uit het weefsel).
- Verwijder de buis uit het schuddenbad van 30 ° C en laat het een paar minuten afspreken.
- Aspireren overtollig digestiemiddel.
- Schud het weefsel in 2 ml HABG op.
- Gebruik een smalle boringpipet, 10 x voor 45 s.
OPMERKING: Dit is waarschijnlijk de enige cruciale stap en kan de opbrengst aanzienlijk verminderen indien niet goed gedaan.- Aspirateer het weefsel in het pipet en laat de inhoud onmiddellijk leeg.
- Vermijd het introduceren van lucht, omdat het de levensvatbare opbrengst aanzienlijk zal afnemen.
OPMERKING: De ideale pipet is een glazen pipet van 9 inch. Het uiteinde van de pipet moet met vuur gepolijst worden om ruwe oppervlakken glad te vegen. Vervolgens moet het siliconen worden door plaatsing in een 1:20 oplossing van dichloordimethylsilaan (DMDCS) in chloroform en links O / N. De pipet moet dan verwijderd worden en de lucht laten drogen. Vervolgens is het pipetjeMoet geautoclaveerd worden voor sterilisatie.
Let op: DMDCS en chloroform zijn zeer ontvlambaar, en siliconen moet in een afzuigkap worden uitgevoerd.
- Aspireren de bovenste 2 ml supernatant en plaats het in een nieuwe 15 ml buis met de label "collectie".
- Herhaal stappen 4.7.3-4.7.5 nog twee keer (de cel verzamelt buis moet 6 ml aan het einde hebben).
- Verplaats de inhoud van de collectiebuis langzaam in de gradiëntbuis die in stap 4.2 is voorbereid, om de verstoring van de gradiënt te vermijden.
- Op dit punt verwijder het eerder bereide neurobasale medium ( Tabel 1 ) uit de koelkast en laat het verwarmen in een bad van 37 ° C.
- Zuiver de neuronen.
- Centrifugeer de gradiëntbuis gedurende 15 minuten bij 800 xg en 22 ° C.
- Verzamel de gewenste laag (en) met een pipet ( Figuur 2 ) en plaats een nieuwe 15 ml buis. Voor de neuro met de hoogste zuiverheidN isolatie ( dwz > 90%), verzamel laag 3. Voor meer opbrengst met minder zuiverheid ( dwz > 70-80%), verzamel lagen 2 en 3.
- Verdun de dichtheidsgradiënt uit door 5 ml HABG toe te voegen aan de nieuw verzamelde lagen.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 min bij 22 ° C.
- Gooi de supernatant weg, zet opnieuw op in 5 ml HABG en flip de pellet om de cellen op te schorten.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten 200 xg bij 22 ° C.
- Verwijder de supernatant, resuspendeer in 3 ml neurobasaal medium en flip de pellet om de cellen te resuspenderen.
- Tel de cellen.
- Neem 10 μL van de oplossing, nu met cellen in neurobasaal medium, en meng met 10 μL Trypan Blue.
- Plaats 10 μl van dit mengsel in een glazen tellerkamer.
- Tellen het aantal cellen in elk van de vier 4 x 4 kwadranten met behulp van een standaard glas teltkamer. Voeg alle cellen geteld (n), multi toeVerdubbelen met 2 (verdunningsfactor), verdeel met 4 (aantal kwadranten geteld), vermenigvuldigd met 3 (volume neurobasaal medium) en vermenigvuldigd met 10 4 om de concentratie van cellen in cellen / ml te verkrijgen.
- Zaad de cellen op cultuurplaten
- Verdun de cel suspensie naar 300.000 cellen in 1 ml neurobasaal medium.
OPMERKING: Op basis van de concentratie van cellen verkregen in de bovenstaande stappen wordt extra neurobasaal medium toegevoegd om een uiteindelijke concentratie van 3 * 10 5 cellen / ml te verkrijgen. De vergelijking is C1V1 = C2V2, waarbij Ci de initiële concentratie van cellen is die uit de oogst zijn verkregen; V1 is 3 ml; En C2 is 3 * 10 5 cellen / ml, zoals hierboven besproken. De vergelijking is opgelost voor V 2 . Voeg het volume neurobasaal medium toe dat nodig is om het totale volume cellen in oplossing gelijk te makenV 2 . - Schud zachtjes om de cellen in oplossing te verdelen en voeg 1 ml toe aan elke put in de gecoate 24-putjesplaten.
- Verdun de cel suspensie naar 300.000 cellen in 1 ml neurobasaal medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze techniek kan een enkel nest (4-10 pups) de isolatie van 1-2,5 10 6 neuronen die geschikt zijn voor het zaaien op cultuurplaten. Typisch worden 4-8 putjes geplant bij de hierboven genoemde concentratie ( dwz 300.000 cellen / ml). Figuur 3 toont het uiterlijk van neuronen bij deze concentratie na een week in de cultuur bij lage ( a ) en hoge ( b ) vergrotingslichtmicroscopie. We hebben echter ook cultuurcellen kunnen beginnen bij concentraties tot 500.000 cellen / putjes en zo laag als 100.000 cellen / putjes. Het gebruik van de hogere concentraties vereist meer middelgrote en zorgvuldige aandacht voor de omgeving, aangezien voedingsstoffen snel kunnen worden uitgeput, wat leidt tot een giftig zuur milieu voor de cellen. Met lagere concentraties hebben cellen de neiging om niet volledig volwassenheid te bereiken, en een overgroei van ondersteunende cellen ( dwz oligodendrocyten, miCroglia en astrocyten) wordt waargenomen.
De cellen beginnen typisch te beginnen aan het oppervlak te hangen binnen de eerste paar uur ( Figuur 4a ). Axons beginnen te spruiten in de eerste 24-48 uur ( Figuur 4b -4c ). Verbindingen tussen verschillende neuronen in de cultuur bereiken typisch volwassenheid op 7 dagen ( Figuur 4d ), op welk moment worden experimenten typisch uitgevoerd op de neuronen.
Neuronen zijn herkenbaar onder lichtmicroscopie, aangezien zij verschillende axonale projecties hebben. Onze isolaties met laag 3 ( Figuur 2 ) geven ~ 80-90% neuronen in de cultuur. Dit werd bevestigd met behulp van de immunofluorescente kleuring van neuronspecifieke markers. In figuur 5c is het neuro-cytoskeletale eiwit Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) sVertoont, waarin een overzicht van de neuronen en axonale projeksies na een week in de cultuur wordt getoond. Op soortgelijke wijze wordt in Figuur 6c de neuronspecifieke nucleaire marker NeuN gekleurd, die neuronale kernen toont. Deze neuronale markers worden gecombineerd met beeldvorming van nucleïne (DAPI, Figuur 5a , 6a ) en cytoplasma (GFP, Figuur 5b , 6b ) en de resulterende beelden worden samengevoegd ( Figuur 5d , 6d ), waarin de relatieve overvloed van neuronen aan andere cellen wordt beschreven cultuur. Bij gebruik van lagen 2 en 3 is de opbrengst van neuronen iets hoger; Er zijn echter minder neuronen in de pure oplossing (~ 70%).
Figuur 1: Wervelkolom Dissected and Spinal Cord Uitgebracht uit een 3-daagse Neonatale Muis. DeDe pijl in ( a ) wijst naar het caudale uiteinde van de wervelkolom, waar een naald wordt ingevoegd om het ruggenmerg los te maken. Een vrijgegeven ruggenmerg ( b ) wordt ondergedompeld in PBS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Densiteitsgradiënt, met cellen toegevoegd na centrifugatie. De lagen zijn geschetst en beter zichtbaar op de cartoonafbeelding. De meest oppervlakkige laag (0) is over het algemeen puin van het ruggenmergweefsel. Laag 1 is rijk aan oligodendrocyten en astrocyten. Lagen 2 en 3 bevatten de meerderheid van de neuronen. Terwijl laag 3 neuronen bevat met de hoogste zuiverheid, worden sommige ondersteunende cellen ( dwz astrocyten en oligodendrocyten) gevonden in laag 2. De peLlet op de bodem bevat voornamelijk microglialcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lichtmicroscopie van neuronale celculturen na 7 dagen isolatie. Bij 10X vergroting ( a ) kunnen axonale verbindingen onder verschillende conglomeraten van neuronen worden gezien. Bij 40X vergroting ( b ) kunnen de neuronen nauwgezet worden weergegeven met hun axonale projecties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Immunofluorescente Vlek van Neuronen met Neuronale Cytoskeletale Marker MAP2. Nucleaire kleuring (DAPI) wordt in rood ( c ) getoond in blauw ( a ), met cytoplasmatische kleuring (GFP) in groen ( b ) en neuron-cytoskeletaal eiwit (MAP2). De samengevoegde beelden ( d ) worden gecombineerd, waarbij de relatieve overvloed van neuronen wordt weergegeven.Target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 6: Immunofluorescente Vlek van Neuronen met Neuronale Nucleaire Marker NeuN. Nucleaire kleuring (DAPI) wordt getoond in blauw ( a ), met cytoplasmatische kleuring (GFP) in groen ( b ) en neuronale kernen (NeuN) in rood ( c ). De samengevoegde beelden ( d ) worden gecombineerd, waarbij de relatieve overvloed van neuronen wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Media | opslagruimte | ingrediënten | Voorbereiding | ||
| HABG | 4 ° C / 24 uur | 100 ml | - Ontdooi B27 in 4 ° C koelkast O / N - Filter steriliseren (0,22 μm) | ||
| Hibernate A | 97,8 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Neurobasale Media | 4 ° C / 1 week | 100 ml | - Ontdooi B27 in 4 ° C koelkast O / N - Filter steriliseren (0,22 μm) - Aliquot 50 ml porties in 50 ml buizen (opslaan bij 4 ° C) | ||
| Neurobasale A | 97 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Pen / Strep [1%] | 1 ml | ||||
| Digestie Media | Dag van Isolatie | 10 ml | - Schud krachtig Laat het gedurende 30 minuten in 37 ° C zitten (ideaal bereid 30 minuten voor gebruik) - Filter steriliseren (0,22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 ml | ||||
| papaïne | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml | ||||
| Dichtheid Gradiënt | Dag van Isolatie | 1 gradiënt | |||
| Laag | Optiprep | HABG | |||
| (0,13 ml) | (5,29 ml) | ||||
| 1 onderkant | 0,26 ml | 1,24 ml | |||
| 2 | 0,19 ml | 1,31 ml | |||
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml | |||
| 4 Top | 0,11 ml | 1,39 ml | |||
Tabel 1: Voorbereiding van de media en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
| Coating Substraat | opslagruimte | ingrediënten | Voorbereiding | |
| PDL | Bevriezen-ontdooien een keer | Poly-D-Lysine Hydrobromide | 5 mg | - Aliquot 4 ml in 15 ml buizen en direct opslaan in -20 ° C - 0,5 ml / putje (24-putjesplaat) |
| Steriel Water | 50 ml | |||
| laminine | Dag van de coating | Laminine (1 mg / ml) | 80 μl | - Genoeg voor 8 putten in een 24-putje plaat - 0,35 ml / putje (24-putjesplaat) |
| Neurobasaal Medium | 2,72 ml | |||
Tabel 2: Bereiding van de Coating Substraten die werden gebruikt om de Wells te coaten waarop de Neuronen worden gekweekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek zorgt voor de betrouwbare cultuur van de ruggengraat neuronen. Zodra de vaardigheid in de techniek is bereikt, duurt het ongeveer 3,5 uur om te voltooien. We hebben in ongeveer 4 uur de isolatie van neuronen uit 2 afzonderlijke nestjes (16 muizen totaal) kunnen uitvoeren. De belangrijkste stap in haalbaarheid is om de ruggengraatjes van de muizen op een goede manier te kunnen extraheren. De opbrengst zorgt voor het platen van meerdere putjes en voor het vermogen om de neuronen onder verschillende omstandigheden te testen. We hebben de neuronen na volwassenheid kunnen behandelen en proteïne-expressie op betrouwbare wijze kunnen evalueren met behulp van Western blot-analyse. Bovendien maakt het gebruik van glazen glijbanen in de putjes voor neuronbijlagen mogelijk voor de verdere kleuring van de neuronen.
Deze procedure is voordelig omdat het embryonale weefsel en de bijbehorende arbeidsintensiteit niet nodig heeft. Bovendien is het niet nodig om volwassen ruggenmergen te gebruiken om voldoende weefsel te verzamelen voor adequaatE neuron isolatie. Dit voorkomt de factor van leeftijdsverbindingsgedrag in neuronfysiologie, zoals gezien bij volwassen muizen. Deze techniek is echter niet zonder beperkingen. Zoals eerder vermeld worden oudere neuronen uitgesloten door gebruik te maken van neonatale muizen, en dit kan een beperking zijn als leeftijdgerelateerd gedrag en biologie het onderzoeksgebied is. Er is een leercurve voor de procedure, die niet alleen nodig is om de opbrengst te optimaliseren, maar om ervoor te zorgen dat de geïsoleerde neuronen gezond zijn. De uitwendige techniek van het ruggenmerg kan enige tijd duren, vooral bij pasgeboren muizen. We hebben opgemerkt dat langere tijd in verband met de extractie van de ruggenmerg leidt tot neuronen die voor een aanzienlijk kortere periode kunnen worden gekweekt. Dit wordt iets verlicht door de plaatsing van de neuronen op ijs; Maar de tijd speelt nog steeds een sleutelrol.
Er zijn belangrijke stappen in de procedure die helpen om de optimale opbrengst van neuronen te waarborgen. Als de neuronopbrengst niet is als eXpected, een paar stappen moeten worden geëvalueerd. Ten eerste moet het aantal ruggenmergen ideaal meer zijn dan 4. Wanneer 3 ruggenmergen of minder gebruikt worden, is de opbrengst meestal minder dan 1 miljoen neuronen. Voldoende voorbereiding van het verteringsmedium moet worden gewaarborgd (stap 4.5). Door het weefsel te lang in het spijsverteringskanaal te verlaten, veroorzaakt de overmatige afbraak van cellen, terwijl het gebruik van verteeringsmedium dat niet geactiveerd is bij 37 ° C tot minder geïsoleerde neuronen zal leiden. Tenslotte moet de trituratie techniek (stap 4.7) met precisie uitgevoerd worden. Lage opbrengsten komen meestal voort uit onvoldoende trituratie. Een goede indicator is om te zien of de oplossing tijdens de trituratie bewolkt wordt. Als dit niet gebeurt, is het waarschijnlijk dat de trituratie te zacht is.
Als de opbrengst is zoals verwacht, maar de neuronen lijken niet te regenereren processen binnen de eerste 1-2 dagen, het probleem is meestal een falen in de juiste coating, met ofwel onvoldoende wassenOf drogen (stap 2.2). Als de cellen in eerste instantie processen verwerken maar daarna apoptotisch worden voor het 5-7 dagen mark, kunnen er verschillende problemen zijn. Zorg er eerst voor dat de HABG-oplossing binnen 24 uur van isolatie wordt bereid en dat het nieuwe B27-supplement dat op dezelfde dag van HABG-voorbereiding is ontdooid, wordt gebruikt. De antioxidanten in deze supplement moeten fris zijn en niet verlopen. Vervolgens zorg ervoor dat er geen bubbels worden geïntroduceerd tijdens het trituratieproces (stap 4.7). De introductie van luchtbellen draagt bij aan dit probleem en kan verband houden met het drogen van de neuronen. Zorg er ook voor dat de cultuur niet wordt besmet met verontreiniging, die kan worden toegeschreven aan steriliteitsfalen.
Hier beschrijven we het gebruik van platen met 24 putjes waarop de neuronen kunnen zaaien. Soms is het nodig om tijds- en / of doseringsproeven uit te voeren, zoals bij gebruik van farmacologische middelen. De techniek kan worden aangepast en de neuronen kunnen worden geplant op 48-putjes plAtes in plaats daarvan. Aangezien het oppervlak van een put in een 48-putjesplaat de helft van die in een 24-putjesplaat is, dienen de gebruikte hoeveelheden coatingoplossingen in de helft te worden gesneden. De cellen moeten ook bij de helft van het volume worden bedekt ( dwz 0,5 ml in plaats van 1,0 ml). Hun concentratie moet echter hetzelfde blijven ( dwz 1-5 x 10 5 cellen / ml). Terwijl deze studie is uitgevoerd met behulp van C57BL / 6 muizen, zou de techniek toepasbaar moeten zijn over andere genetisch gemanipuleerde stammen.
Ruggenmerg ischemie en bescherming is een gebied van groeiende belangstelling 12 , 13 , 14 . Klinisch kan thoracabdominale aortische chirurgie resulteren in verwoestende verlammingen in verband met ruggenmerg-ischemie en reperfusie, waarvan de pathofysiologie 15 tot 16 volledig wordt begrepen. Begrijpen hoe neuronen reageren op thE stress van ischemie is haalbaar met dit model. Onze groep heeft eerder gepubliceerd op ruggengraat neuronale verwonding in verband met ischemische belediging door zuurstof glucose deprivatie met behulp van deze techniek 17 . Het model is ook uitgebreid met de cultuur van astrocyten, gescheiden van neuronen 18 .
Ten slotte is deze techniek waardevol voor de studie van ruggengraatpatofysiologie en neuronale microbiologie. De serumvrije cultuur zorgt voor nauwkeurige milieucontrole. Het biedt directe toegang tot de toepassing van farmacologische middelen. Gecombineerd met extra technieken, zoals zuurstofglucose-deprivatie, kan deze techniek nuttig zijn om ons begrip van de pathofysiologie van determinanten van ruggenmerg ischemie uit te breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen bekendmakingen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
