Summary
이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.
Abstract
우리는 척수 신경 세포의 분리 및 배양에 대한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런은 신생아 C57BL / 6 생쥐에서 얻은 있으며 출생 후의 하루 1-3에 격리되어 있습니다. 일반적으로 하나의 번식 쌍에서 태어난 4-10 마리의 강아지가 한 실험을 위해 모여지고, 척수는 isoflurane으로 안락사 한 후에 각 마우스에서 개별적으로 수집됩니다. 척수가 해부 된 다음 척수가 기둥에서 빠져 나옵니다. 척수는 조직에서 방출되는 뉴런 및 다른 세포를 허용 효소 프로 테아 제에 대한 배달의 표면적을 증가시키기 위해 다음 minched 있습니다. 이어서 분쇄를 사용하여 세포를 용액으로 방출한다. 이 용액을이어서 농도 구배로 분획하여 용액 중의 여러 세포를 분리하여 뉴런을 분리시킨다. 하나의 깔짚 그룹에서 약 1-2.5 x 106 개의 뉴런을 분리 할 수 있습니다. 그런 다음 뉴런을 접착제로 코팅 한 우물에 뿌린다적절한 성장과 성숙을 허용하는 rs. 뉴런은 성장 및 배양 배지에서 성숙에 도달하기까지 약 7 일이 걸리고 이후 치료 및 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
Introduction
척수 병리학을 이해하기 위해서는 거시적 인 수준과 미세한 수준 모두에서 다양한 모델을 사용해야합니다. 대형 및 소형 동물 모델 1 , 2 , 3 은 척수 질환 및 상해에 대한 생체 내 조사에 사용됩니다. 생체 내 에서 이러한 문제 를 연구하는 것은 장점이 있지만, 척수 분석은 전체 척수 균질 또는 조직 섹션 4 로 제한됩니다. 이것은 상주 뉴런과 주변 glia 사이의 척수에서 특정 반응과 표적을 격리하려고 할 때 약간의 모호성을 만듭니다. 유 전적으로 조작 된 생쥐가 증가함에 따라 세포 및 분자 수준에서 생물학에 대한보다 상세한 조사가 가능 해졌다. 따라서 신생아 마우스 모델이 여기에 사용 되어 시험 관내에서 척수 뉴런의 독특한 성질과 생물학적 특성을 연구 할 수 있습니다.
엔트 "> 체외에서 뉴런의 분리 및 유지 보수는 특히 간단하지 않습니다. 성인 설치류의 피질 조직에서 뉴런을 분리하기위한 기술이 상대적으로 풍부하여 고립 된 뉴런 ( 즉, 수백만 개 ) 대조적으로, 척수 조직으로부터의 뉴런의 수율은 부분적으로 조직의 질량이 더 적기 때문에 8 , 9 , 10 보다 낮다. 또한, 생쥐에서 신생아의 분리를위한 기술이 상대적으로 부족하다 척수 뉴런 및 기존 방법은 낮은 뉴런 수율 (수백) 또는 배아 마우스 10 의 고립을 요구 힘든 및 자원 무거운 기술에 의해 제한됩니다.이 프로토콜에서 우리는신생아 생쥐의 척수에서 상당한 수의 뉴런을 비용 효율적이고 자원 효율적으로 격리 할 수있는 기술을 사용하십시오. 이전에 발표 된 기술에서 흔히 볼 수 있듯이 우리는 파파인을 효소 적 프로테아제로 사용하여 척수 조직에서 뉴런의 방출을 허용합니다 5 , 6 . 또한, 우리는 정제 된 세포 분리를 위해 밀도 구배를 사용하는데, 이는 이전에 효과가 6 , 10 인 것으로 나타났습니다. 세포가 배양되는 배지는 다를 수 있지만, 우리의 경험 및 이전에 발표 된 11에서 , 신선한 B27 배양 배지 보충 물은 뉴런 수명에 결정적인 것으로 입증되었다. 뉴런은 일반적으로 치료를 수행 할 수 있도록 최대 10 일 동안 실행 가능합니다.
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Protocol
이 절차에서 동물의 보살핌과 치료는 콜로라도 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 표 1 에서와 같이 적절한 온도에서 모든 용액을 준비하고 보관하십시오.
2. 코팅 웰 및 슬라이드
참고 : 뉴런은 플라스틱이나 유리 표면에 잘 부착되지 않습니다.
- 뉴런을 분리하기 하루 전에 0.5 ML의 폴리 -D- 리신 (PDL; 표 2 )으로 멸균 된 24- 웰 배양 플레이트의 웰을 코팅하고 층류 후드 O / N에 남겨 둡니다.
참고 : 선호하는 방법은 24 웰 플레이트를 사용하고 주변 웰에서의 증발이 더 가속화되어 일치하지 않는 결과를 초래하는 경향이 있으므로 중앙 웰만 코팅하는 것입니다. 또한 유리 슬라이드는 이전에 우물 안쪽에 놓을 수 있습니다.o 코팅. 뉴런은 코팅 된 유리 슬라이드에 부착되며 나중에 추가 현미경 이미징을 위해 제거 할 수 있습니다 . - 격리 당일에 우물에서 PDL을 제거하십시오. 남아있는 물을 제거하기 전에 몇 분 동안 멸균 수로 씻어서 1 시간 동안 건조시킵니다 (아래 참조).
- 건조 후 슬라이드를 라미닌으로 코팅하십시오 ( 표 2 ).
참고 : 약 10 μL의 laminin (10 μg / μL)로 멸균 된 24-well plate의 각 well을 코팅 할 수 있습니다. 이것은 전체 웰을 덮기 위해 340 μL의 배지 (총 부피 : 350 μL)와 혼합됩니다. 이것을 문화 후드에서 실온에서 2 시간 동안 놓은 다음 세포를 코팅하기 전에 대기음을 둡니다.
3. 척추 수확
참고 : 모든기구는 멸균을 위해 고압 증기 멸균해야합니다 (135 ° C 및 30 psi에서 4 x 7 분주기).
- 이소 플루 란 (isoflurane)이있는 챔버에서 1-3 일 된 C57BL / 6 마우스를 안락사하십시오. 기다림30 초 후에 움직이지 않고 다리를 꼬집고 응답이 없음을 확인합니다.
- 머리를 몸체에서 분리하려면 가위를 사용하십시오.
- 등받이가 사용자를 향하도록 절차 테이블에서 뒷다리 또는 꼬리와 팔을 안정시킵니다.
- 구부러진 홍채 가위로 피부를 자릅니다.
- 엉덩이 위의 요추 부위에서 척수를 잘라 내고 흉부의 양측을 절단하여 몸에서 분리하십시오.
참고 : 이것은 다른 장기에 대한 부주의 한 손상을 피하기 위해 내장 기관에서 척수를주의 깊게 절개해야합니다 ( 그림 1a ). - 과량의 조직을 제거하는 0.2 μm의 필터 멸균 인산염 - 버퍼 식염수 (PBS) 5 ML을 포함하는 3 X 10cm 페트리 접시 10 초 동안 연속적으로 씻으십시오.
- 척주의 꼬리 끝에 5 ML의 필터 멸균 PBS로 가득 22 G 바늘과 주사기를 삽입하고 cranially 플러시, 코드를 허용 to 네 번째 배양 접시로 빠져 나간다 ( 그림 1b ).
- 얼음 위에서 HABG ( 표 1 ) 5 ML과 15 ML 관에서 척수를 수집합니다. 척수가 부러지지 않도록주의하십시오.
- 깔개에있는 각 강아지에 대해 3.1-3.8 단계를 반복합니다.
참고 : 이상적으로이 과정은 건강한 신경 세포의 분리를 보장하기 위해 척수 당 30 분 미만이 소요됩니다.
4. 고립 뉴런
참고 : 다음 단계는 층류 후드에서 수행해야합니다. 기본적인 멸균 기술에 익숙해야합니다.
- 조직 채집
- 척수가 들어있는 튜브를 가볍게 흔드는 다.
- 튜브에서 조직을 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 면도날로 주사위를 굴려 ~ 0.5mm 크기의 미세 조각을 만듭니다.
- HABG 5 ML가 들어있는 15 ML 튜브에 와이드 보어 피펫으로 조직을 전송하십시오.
- 그것을세포가이 온도에서 평형을 유지하도록 30 분 동안 30 ℃의 수조에서. 세포를 쉐이커에 방치하여 유체에 부유되도록하십시오.
참고 :이 단계는 얼음에서 소화 매개체로 세포가 옮겨지는 것을 막기 위해 수행됩니다. 세포를 30 ° C로 유지하면 37 ° C에서 신진 대사가 증가하는 것과 관련된 세포 사멸을 감소시키는 데 도움이됩니다.
- 소화 매체를 준비하십시오 ( 표 1 ).
- 밀도 구배를 준비하십시오 (표 1).
- 표 1에 나와있는 것처럼 4 개의 개별 15 mL 튜브에 4 개의 각 층을 준비하십시오.
- 새로운 15 mL 튜브에 각 층의 1 mL를 넣으십시오. 하단의 레이어 1부터 시작하여 상단의 레이어 4에 도달 할 때까지 순차적으로 추가합니다. 추가하는 동안 레이어를 방해하지 마십시오.
- 2.2 단계에서 PDL 코팅 판을 씻으십시오. 남아있는 물을 제거하기 전에 몇 분 동안 멸균 수로 씻으십시오.1 시간 동안 건조시킨다.
- 조직을 소화 배지에 옮기십시오.
- 30 ° C의 쉐이커 수조에서 조직 함유 튜브를 제거하고 몇 분 동안 침전되도록하십시오.
- 37 ° C 수조에서 소화 매체 튜브를 제거하고 leur-lock 주사기에 대기음을 내십시오.
- 조직 함유 튜브에서 과량의 HABG를 기음합니다.
- 시린지에 leur-lock 0.2 μm 필터를 사용하여 조직 함유 튜브에 소화 물질을 첨가하십시오.
- 튜브를 30 ° C의 수 욕조에 30 분간 놓습니다. 세포가 유체에 매달려있을만큼 충분히 흔들 리도록하십시오.
참고 : 소화제에 세포를 너무 오랫동안 보관하지 않거나 온도가 너무 높아져 과도한 소화로 이어져 조직이 젤라틴 혼합물에 부유하게 될 수 있습니다.
- 이 기간 동안 단계 2.3에서와 같이 라미닌을 코팅하십시오. <trituration을 수행하십시오 ( 즉 , 세포를 조직에서 분리하는 것).
- 흔들어서 30 ° C 수 욕조에서 튜브를 제거하고 몇 분 동안 침전되도록하십시오.
- 과량의 소화 매질을 대기음.
- HABG 2 ML에 휴지를 일시 중지합니다.
- 좁은 구경 피펫을 사용하여 45 초 동안 10 배로 씹습니다.
참고 : 이것은 아마도 가장 중요한 단일 단계 일 수 있으며 제대로 수행되지 않으면 생산량을 크게 줄일 수 있습니다.- 피펫으로 조직을 대기음 즉시 내용을 다시 비우십시오.
- 실용적인 생산량을 현저히 감소 시키므로 공기 주입을 피하십시오.
참고 : 이상적인 피펫은 9 "유리 피펫입니다 피펫의 끝 부분은 거친 표면을 부드럽게하기 위해 폴리싱해야합니다. 그런 다음 클로로포름에 디클로로 디메틸 실란 (DMDCS)의 1:20 용액에 넣고 실리콘 처리해야합니다. / N 피펫을 꺼내어 공기를 건조시킨 다음,살균을 위해 고압 증기 멸균해야합니다.
주의 사항 : DMDCS와 클로로포름은 매우 인화성이 있으므로 실리콘 연소는 흄 후드에서 수행해야합니다.
- 상층 액 2 mL를 기증하고 "collection"이라고 표시된 새 15 mL 튜브에 넣으십시오.
- 4.7.3-4.7.5 단계를 두 번 더 반복하십시오 (세포 수집 튜브 끝에 6 mL가 있어야합니다).
- 수집 튜브 내용물을 4.2 단계에서 준비한 그래디언트 튜브로 천천히 옮겨 그라데이션 중단을 피하십시오.
- 이 시점에서, 냉장고에서 이전에 준비 neurobasal 매체 ( 표 1 )를 제거하고 37 ° C 목욕에서 따뜻하게 수 있습니다.
- 뉴런을 정화하십시오.
- 800 xg 및 22 ° C에서 15 분 동안 그라디언트 튜브를 원심 분리하십시오.
- 피펫으로 원하는 층을 채취하고 ( 그림 2 ) 새로운 15 mL 튜브에 넣으십시오. 가장 높은 순도의 신경( 즉 > 90 %), 층 3을 수집하십시오.보다 적은 순도 ( 즉, > 70-80 %)로 더 많은 수율을 얻으려면 2 층과 3 층을 수집하십시오.
- 새로 수집 된 층에 HABG 5 ML을 추가하여 밀도 기울기를 희석.
- 22 ° C에서 2 분 동안 200 XG에서 원심 분리하십시오.
- 뜨는 물을 버리고 HABG 5 mL에 다시 부어 넣고 펠렛을 가볍게 쳐서 세포를 부순다.
- 22 ° C에서 2 분 200 XG로 원심 분리기.
- 뜨는을 버리고, neurobasal 매체의 3 ML에 resuspend, 그리고 세포를 resuspend에 펠렛을 가볍게 두드리십시오.
- 세포를 센다.
- neurobasal 매체의 세포와 솔루션의 10 μL을 가지고, Trypan 블루 10 μL와 섞는다.
- 이 혼합물의 10 μL를 유리 세면기에 넣으십시오.
- 표준 유리 계수 챔버를 사용하여 네 4 x 4 사분면 각각의 셀 수를 계산합니다. 카운트 된 셀 (n), 멀티 셀 모두 추가(희석 인자)를 곱하고, 4로 나눈 값 (4 분면의 수), 3 (신경 매체의 부피)을 곱하고, 10 4 를 곱하여 세포 / mL의 세포 농도를 구한다.
- 배양 판에 세포를 뿌린다.
- neurobasal 매체 1 ML 300,000 세포로 세포 현탁액을 희석.
참고 : 위의 단계에서 얻은 세포의 농도를 기반으로 추가 neurobasal 매체는 3 * 10 5 세포 / ML의 최종 농도를 얻기 위해 추가됩니다. 방정식은 C 1 V 1 = C 2 V 2 이고, 여기서 C 1 은 수확에서 얻은 세포의 초기 농도이다. V1은 3 mL; C 2 는 상기 논의 된 바와 같이 3 * 105 세포 / mL이다. 방정식은 V 2에 대해 풀립니다. 솔루션에 세포의 총 볼륨을 만드는 데 필요한 neurobasal 매체의 볼륨을 추가V 2 . - 부드럽게 흔들어 용액에 세포를 분배하고 코팅 24 잘 접시에 각 잘 1 ML을 추가합니다.
- neurobasal 매체 1 ML 300,000 세포로 세포 현탁액을 희석.
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Representative Results
이 기술을 사용하여, 단일 쓰레기 (4-10 새끼) 문화 플레이트에 시딩에 적합한 1-2.5 10 6 뉴런의 고립 수 있습니다. 일반적으로, 4-8 우물은 위에서 언급 한 농도 ( 즉 300,000 세포 / ML)에 뿌렸다. 그림 3 은 낮은 ( a ) 및 높은 ( b ) 배율 광학 현미경에서 문화에서 일주일 후이 농도에서 뉴런의 모습을 보여줍니다. 그러나, 우리는 또한 50 만 세포 / 웰 및 100,000 세포 / 웰만큼 낮은 농도로 세포를 배양 할 수 있었다. 높은 농도를 사용하면 영양 상태가 빨리 고갈되어 세포에 독성이있는 산성 환경으로 이끄면서 환경 조건에보다주의 깊게주의를 기울일 필요가 있습니다. 농도가 낮을수록 세포는 완전한 성숙에 이르지 못하며지지 세포의 과증식 (oligodendrocytes, microglia 및 astrocytes)가 관찰됩니다.
세포는 일반적으로 처음 두 시간 내에 표면에 부착되기 시작합니다 ( 그림 4a ). Axons은 처음 24-48 시간 내에 새싹이 나기 시작합니다 ( 그림 4b -4c ). 문화의 다양한 뉴런 사이의 연결은 전형적으로 실험이 일반적으로 뉴런에 수행되는 7 일 ( 그림 4d )에서 성숙에 도달합니다.
뉴런은 뚜렷한 축색 돌기가 있기 때문에 광학 현미경으로 확인할 수 있습니다. 3 층 ( 그림 2 )을 사용한 우리의 격리는 문화에서 ~ 80-90 %의 뉴런을 산출합니다. 이것은 뉴런 특이 적 마커의 면역 형광 염색을 사용하여 확인되었습니다. 그림 5c 에서 뉴런 세포 뼈대 단백질 인 Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2)는 s문화에서 1 주일 후 뉴런의 개요와 축삭 투영을 보여 주었다. 유사하게, 도 6c 에서, 뉴런 - 특이 적 핵성 마커 인 NeuN은 염색되어 뉴런 핵을 나타낸다. 이 뉴런 마커는 핵 (DAPI, 그림 5a , 6a )과 세포질 (GFP, 그림 5b , 6b ) 이미징으로 결합되며 결과 이미지는 병합됩니다 ( 그림 5d , 6d ). 문화. 레이어 2와 3을 사용할 때 뉴런의 수율은 약간 높습니다. 그러나 순수한 용액에서 뉴런이 적어지는 경향이 있습니다 (~ 70 %).
그림 1 : 3 일 된 신생아 마우스에서 해부 및 척수 방출. 그만큼( a )의 화살표는 척추의 꼬리 쪽을 가리키며, 바늘이 삽입되어 척수를 놓습니다. 릴리스 된 척수 ( b )는 PBS에 잠긴 상태로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 원심 분리 후 추가 된 세포의 밀도 기울기. 레이어는 윤곽을 그리며 만화 묘사에서 더 잘 시각화됩니다. 가장 얕은 층 (0)은 일반적으로 척수 조직의 파편입니다. 레이어 1은 희소 돌기 아교 세포와 성상 세포가 풍부합니다. 레이어 2와 레이어 3은 대부분의 뉴런을 포함합니다. 레이어 3에는 가장 높은 순도의 뉴런이 포함되어 있지만 일부 지원 셀 ( 즉, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포)은 레이어 2에서 발견됩니다. pe바닥의 llet은 주로 소교 세포를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 7 일간의 분리 후 신경 세포 배양의 가벼운 현미경. 10X의 배율 ( a )에서 뉴런의 다양한 대기업 사이의 축삭 연결을 볼 수 있습니다. 40X 배율 ( b )에서, 뉴런은 축삭 돌기에보다 근접하게 시각화 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 신경 세포 골격 표지자 MAP2를 사용하여 뉴런의 Immunofluorescent 얼룩. 핵 염색법 (DAPI)은 녹색 ( b ) 및 뉴런 세포 간질 단백질 (MAP2)의 적색 ( c )에서 세포질 염색 (GFP)과 파란색 ( a )로 표시됩니다. 병합 된 이미지 ( d )는 결합되어 뉴런의 상대적 풍부함을 보여줍니다.target = "_ blank">이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 뉴런 핵 마커 NeuN을 사용하는 뉴런의 Immunofluorescent Stain. 핵 염색법 (DAPI)은 녹색 ( b ) 및 신경 세포 핵 (NeuN)에서 적색 ( c )의 세포질 염색 (GFP)과 함께 청색 ( a )으로 표시됩니다. 병합 된 이미지 ( d )는 결합되어 뉴런의 상대적 풍부함을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 | 저장 | 성분 | 예비 | ||
| HABG | 4 ° C / 24 시간 | 100 mL | - 4 ° C 냉장고 O / N에서 B27 해동 - 필터 살균 (0.22 μm) | ||
| 최대 절전 모드 A | 97.8 mL | ||||
| B27 [2 %] | 2 mL | ||||
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL | ||||
| Neurobasal Media | 4 ° C / 1 주 | 100 mL | - 4 ° C 냉장고 O / N에서 B27 해동 - 필터 살균 (0.22 μm) - 50 mL 튜브 (4 ℃에서 보관)에 분취 량 50 mL 분량 | ||
| 신경근 A | 97 mL | ||||
| B27 [2 %] | 2 mL | ||||
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL | ||||
| Pen / Strep [1 %] | 1 mL | ||||
| 소화제 | 격리의 날 | 10 mL | - 격렬하게 흔들어 라. - 30 분 동안 37 ° C의 욕조에 놓아 두십시오 (사용하기 전에 30 분 이상 준비하십시오) - 필터 살균 (0.22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 mL | ||||
| 파파인 | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.025 mL | ||||
| 밀도 기울기 | 격리의 날 | 1 기울기 | |||
| 층 | OptiPrep | HAB지 | |||
| (0.13 mL) | (5.29 mL) | ||||
| 1 바닥 | 0.26 mL | 1.24 mL | |||
| 2 | 0.19 mL | 1.31 mL | |||
| 삼 | 0.15 mL | 1.35 mL | |||
| 4 위로 | 0.11 mL | 1.39 mL | |||
표 1 : 이 프로토콜에서 사용 된 미디어 및 솔루션 준비.
| 코팅 기재 | 저장 | 성분 | 예비 | |
| PDL | 한 번 동결 - 해동 | Poly-D-Lysine Hydrobromide | 5 mg | - 15 mL 튜브에 나누어 진 4 mL를 넣고 즉시 -20 ° C에 보관하십시오 - 0.5 mL / 웰 (24- 웰 플레이트) |
| 멸균 수 | 50 mL | |||
| 라미닌 | 도장 일 | 라미닌 (1 mg / mL) | 80 μL | - 24-well 판에 8 개 웰 - 0.35 mL / 웰 (24- 웰 플레이트) |
| 신경 매체 | 2.72 mL | |||
표 2 : 뉴런이 배양되는 웰을 코팅하기 위해 사용 된 코팅 기재의 제조.
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Discussion
이 기술은 척수 신경 세포의 안정적인 배양을 가능하게합니다. 기술 숙달이 완료되면 완료하는 데 약 3.5 시간이 걸립니다. 우리는 약 4 시간 동안 2 마리의 분리 된 새끼 (총 16 마리의 마우스)로부터 뉴런의 분리를 수행 할 수있었습니다. 실행 가능성의 핵심 단계는 쥐에게서 능숙하게 척수를 추출 할 수 있다는 것입니다. 항복은 여러 개의 웰을 플레이 팅하고 다양한 조건 하에서 뉴런을 테스트하는 능력을 허용합니다. 우리는 성숙 후 뉴런을 치료하고 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 단백질 발현을 신뢰할 수있게 평가할 수있었습니다. 또한, 뉴런 첨부 파일에 대한 우물 내부에 유리 슬라이드를 사용하면 뉴런의 더 얼룩 분석을 허용합니다.
이 절차는 배아 조직 및 관련 노동 강도를 필요로하지 않는다는 점에서 유리하다. 또한, 적절한 척추 조직을 얻기 위해 성인 척수를 사용할 필요가 없습니다.e 신경 세포 격리. 이것은 성인 생쥐에서 볼 수 있듯이 뉴런 생리학에서 나이 합성의 요인을 방지합니다. 그러나이 기술은 제한이 없습니다. 앞에서 언급했듯이 신생아 생쥐를 사용하면 나이 든 뉴런을 배제하고 나이 관련 행동과 생물학이 조사 영역이라면 제한적 일 수 있습니다. 수확량을 최적화 할뿐만 아니라 격리 된 뉴런을 건강하게 유지하는 데 필요한 절차에 대한 학습 곡선이 있습니다. 척수 추출 기술은 특히 새로 태어난 마우스의 경우 숙달하는데 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다. 우리는 척수의 추출과 관련된 연장 된 시간이 상당히 짧은 기간 동안 배양 될 수있는 뉴런을 유도한다는 것을 발견했습니다. 이것은 얼음 위에 뉴런을 배치함으로써 다소 완화됩니다. 그러나 시간은 여전히 중요한 역할을합니다.
뉴런의 최적 수율을 보장하는 데 도움이되는 중요한 단계가 있습니다. 뉴런 수율이 e가 아닌 경우몇 단계를 평가해야합니다. 첫째, 척수의 개수는 이상적으로 4 개 이상이어야합니다. 척추 3 개 이하를 사용하는 경우 일반적으로 1 백만 개의 뉴런 미만입니다. 소화 배지의 적절한 준비가 보장되어야한다 (단계 4.5). 37 ° C에서 활성화되지 않은 소화 배지를 사용하면 분리 된 뉴런이 줄어들지 만 소화 배지에서 조직을 너무 오래 방치하면 세포가 과도하게 파괴됩니다. 마지막으로, 분쇄 기술 (단계 4.7)을 정밀하게 수행해야한다. 낮은 수확량은 일반적으로 부적절한 분쇄로 인해 발생합니다. 좋은 지표는 분쇄 중에 용액이 흐려 지는지 여부를 확인하는 것입니다. 이것이 일어나지 않으면 분쇄가 너무 부드럽습니다.
수율이 예상대로이지만 뉴런이 처음 1-2 일 이내에 프로세스를 재생성하지 못하는 경우 문제는 적절한 코팅이 제대로 이루어지지 않았거나 부적절한 세척또는 건조 (단계 2.2). 세포가 초기에 과정을 투사하지만 5-7 일 전에 세포 자멸사가된다면 몇 가지 문제가있을 수 있습니다. 먼저, HABG 용액을 24 시간 내에 분리하고 HABG 준비 당일에 해동시킨 신선한 B27 보충제를 사용하는지 확인하십시오. 이 보충제의 산화 방지제는 신선하고 만료되지 않아야합니다. 다음으로, 연삭 공정 (4.7 단계) 중에 기포가 유입되지 않도록하십시오. 기포의 도입은이 문제에 기여하며 뉴런의 건조와 관련 될 수 있습니다. 또한, 문화가 오염으로 압도되어서는 안되며, 이는 불임의 실패로 인한 것일 수 있습니다.
여기, 뉴런을 뿌리는 24- 웰 플레이트의 사용을 기술한다. 때때로, 약리학 적 약제를 사용할 때와 같이 시간 및 / 또는 복용 시험을 수행 할 필요가 있습니다. 이 기술은 수정 될 수 있으며 뉴런은 48- 웰 플레이트에 시딩 될 수있다대신 ates. 48- 웰 플레이트의 웰의 표면적은 24- 웰 플레이트의 표면적의 절반이므로, 사용 된 코팅 용액의 부피는 절반으로 줄여야한다. 세포도 절반 부피로 코팅해야합니다 ( 예 : 1.0 mL 대신 0.5 mL). 그러나, 그 농도는 동일하게 유지되어야합니다 ( 즉, 1-5 x 105 세포 / mL). 이 연구는 C57BL / 6 마우스를 사용하여 수행되었지만이 기술은 다른 유전자 조작 균주에 적용 할 수 있어야합니다.
척수 허혈과 보호는 점점 관심이 집중되고있는 영역입니다 12 , 13 , 14 . 임상 적으로 흉 복부 대동맥 수술은 척수 허혈과 재관류와 관련하여 심각한 마비를 일으킬 수 있으며 그 병태 생리학은 완전히 이해되어야한다 15 , 16 . 뉴런이 th에 어떻게 반응하는지 이해하기허혈의 스트레스는이 모델을 사용하여 실현 가능합니다. 우리 그룹은 이전에이 기술을 사용하여 산소 포도당 결핍을 통한 허혈성 모욕과 관련된 척수 신경 손상을 발표했습니다 17 . 모델은 또한 뉴런과는 별개로 성상 세포의 배양을 포함하도록 확장되었습니다.
결론적으로이 기술은 척수 병리학 및 신경 세포 미생물학 연구에 유용합니다. 무 혈청 배양으로 정확한 환경 조절이 가능합니다. 그것은 약리학 적 약제의 적용을위한 직접적인 접근을 가능하게합니다. 산소 포도당 박탈과 같은 추가적인 기술과 결합하여,이 기술은 결정적인 척수 허혈의 병태 생리학에 대한 우리의 이해를 넓히는 데 유용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 인정하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
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