Summary
Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.
Abstract
Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur der Rückenmark Neuronen. Die Neuronen werden aus neonatalen C57BL / 6-Mäusen gewonnen und sind am postnatalen Tag 1-3 isoliert. Ein Mausstreu, in der Regel 4-10 Welpen aus einem Zuchtpaar geboren, ist für ein Experiment gesammelt, und Wirbelsäule werden einzeln von jeder Maus nach Euthanasie mit Isofluran gesammelt. Die Wirbelsäule wird ausgeschnitten und dann wird das Rückenmark aus der Säule entnommen. Die Wirbelsäule werden dann gehackt, um die Oberfläche der Abgabe für eine enzymatische Protease zu erhöhen, die es ermöglicht, dass die Neuronen und andere Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Trituration wird dann verwendet, um die Zellen in Lösung freizusetzen. Diese Lösung wird anschließend in einem Dichtegradienten fraktioniert, um die verschiedenen Zellen in Lösung zu trennen, wodurch Neuronen isoliert werden können. Etwa 1-2,5 x 10 6 Neuronen können aus einer Wurfgruppe isoliert werden. Die Neuronen werden dann auf mit Klebstoff beschichteten Wells ausgesätRs, die für ein angemessenes Wachstum und Reifung zu ermöglichen. Die Neuronen dauern ca. 7 Tage, um die Reife im Wachstums- und Kulturmedium zu erreichen und können danach zur Behandlung und Analyse verwendet werden.
Introduction
Das Verständnis der Rückenmarkpathologie erfordert die Verwendung verschiedener Modelle, sowohl auf makroskopischer als auch auf mikroskopischer Ebene. Große und kleine Tiermodelle 1 , 2 , 3 werden für in vivo Untersuchungen von Rückenmarkserkrankungen und Verletzungen verwendet. Während das Studium dieser Probleme in vivo hat seine Verdienste, ist die Analyse des Rückenmarks auf ganze Rückenmark-Homogenat oder Gewebe-Abschnitte 4 begrenzt . Dies schafft eine gewisse Unklarheit beim Versuch, spezifische Reaktionen und Ziele im Rückenmark unter seinen residenten Neuronen und umgebenden Glia zu isolieren. Die zunehmende Verfügbarkeit von genetisch manipulierten Mäusen ermöglicht detailliertere Untersuchungen der Biologie auf zellulärer und molekularer Ebene. So wird hier ein neonatales Mausmodell verwendet, das die Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften und der Biologie der Rückenmark-Neuronen in vitro ermöglicht .
Die Isolierung und Aufrechterhaltung von Neuronen in vitro ist nicht besonders einfach. Es gibt eine relative Häufigkeit von Techniken für die Neuronisolation aus dem kortikalen Gewebe von adulten Nagetieren, die in einer beträchtlichen Anzahl von isolierten Neuronen ( dh Millionen) 5 , 6 , 7. Im Gegensatz dazu ist die Ausbeute an Neuronen aus dem Rückenmarkgewebe geringer, 8 , 9 , 10 , zum Teil aufgrund der geringeren Gewebemasse. Darüber hinaus gibt es bei Mäusen eine relative Mangel an Techniken zur Isolierung von Neugeborenen Rückenmarksneuronen und bestehende Methoden sind durch niedrigere Neuronenausbeuten ( dh Hunderte) 9 oder mühsame und ressourcenschonende Techniken begrenzt, die die Isolierung von embryonalen Mäusen erfordern 10 .In diesem Protokoll, wirVerwenden Sie eine Technik, die die kosten- und ressourcenwirksame Isolierung einer beträchtlichen Anzahl von Neuronen aus den Rückenmarken von Neugeborenen ermöglicht. Wie es bei bisher veröffentlichten Techniken üblich ist, verwenden wir Papain als enzymatische Protease und erlauben die Freisetzung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe 5 , 6 . Darüber hinaus verwenden wir einen Dichtegradienten für die raffinierte Zelltrennung, der sich bisher als wirksam erwiesen hat 6 , 10 . Während das Medium, in dem die Zellen inkubiert werden, in unserer Erfahrung variieren kann und wie bereits veröffentlicht 11 , ergänzt sich die Ergänzung mit frischem B27-Kulturmedium-Supplement als kritisch für die Neuron-Langlebigkeit. Die Neuronen sind typischerweise für bis zu 10 Tage lebensfähig, so dass eine Behandlung durchgeführt werden kann.
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Protocol
Die Pflege und Behandlung von Tieren in diesem Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Colorado durchgeführt.
1. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten und lagern Sie alle Lösungen bei geeigneten Temperaturen, wie in Tabelle 1 gezeigt .
2. Beschichtungsbrunnen und -rutschen
HINWEIS: Neuronen haften nicht gut an Kunststoff- oder Glasoberflächen.
- Einen Tag vor der Isolierung der Neuronen beschichten die Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Kulturplatte mit 0,5 ml Poly-D-Lysin (PDL, Tabelle 2 ) und lassen sie in eine laminare Strömungshaube O / N.
HINWEIS: Die bevorzugte Methode besteht darin, Platten mit 24 Vertiefungen zu verwenden und nur die Mittelbrunnen zu beschichten, da die Verdampfung von den peripheren Vertiefungen eher beschleunigt wird und zu inkonsistenten Ergebnissen führt. Zusätzlich können Glasscheiben in den Brunnen vor dem T platziert werdenO Beschichtung. Die Neuronen werden an den beschichteten Glasscheiben befestigt und können später zur weiteren mikroskopischen Bildgebung entfernt werden . - Am Tag der Isolierung, entfernen Sie die PDL aus den Brunnen. Mit einem sterilen Wasser für einige Minuten waschen, bevor das restliche Wasser entfernt und 1 h lang getrocknet wird (siehe unten).
- Nach dem Trocknen die Folien mit Laminin beschichten ( Tabelle 2 ).
HINWEIS: Etwa 10 & mgr; l Laminin (10 & mgr; g / & mgr; l) reichen aus, um jede Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte zu beschichten. Dies wird mit 340 μl Medium (Gesamtvolumen: 350 μL) gemischt, um den gesamten Brunnen zu bedecken. Lassen Sie diese für 2 h bei RT in einer Kulturhaube sitzen und dann vor dem Beschichten der Zellen abspülen.
3. Ernten von Wirbelsäulen
HINWEIS: Alle Instrumente sollten für die Sterilität autoklaviert werden (135 ° C und 30 psi für 4 x 7 min Zyklen).
- Euthanisieren Sie 1-3 Tage alte C57BL / 6 Maus-Welpen in einer Kammer mit Isofluran. Warte ab30 s nach der Beendigung der Bewegung und kneifen das Bein, um einen Mangel an Antwort zu bestätigen.
- Trennen Sie den Kopf vom Körper mit Schere, mit Welpen in der Bauchlage.
- Stabilisieren Sie die Hinterbeine oder Schwanz und Arme auf der Prozedur Tabelle, mit dorsalen Seite zum Benutzer.
- Schneiden Sie die Haut mit einer gebogenen Irisschere ab.
- Schneiden Sie das Rückenmark aus dem Lendenbereich gerade über die Hüften und fahren Sie fort, beide Seiten des Thorax zu schneiden, um es vom Körper zu trennen.
HINWEIS: Dies erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks von viszeralen Organen, um unbeabsichtigte Schäden an anderen Organen zu vermeiden ( Abbildung 1a ). - Nach 10 Sekunden in 3 x 10 cm Petrischalen, die 5 ml 0,2 μm Filter-sterilisierte Phosphat-gepufferte Saline (PBS) enthalten, um überschüssiges Gewebe zu entfernen, abwaschen.
- Setzen Sie eine 22 G-Nadel und Spritze mit 5 ml Filter-sterilisiertem PBS in das kaudale Ende der Wirbelsäule und bündig kranial, so dass die Schnur tO Ausfahrt in eine vierte Petrischale ( Abbildung 1b ).
- Sammle das Rückenmark in einem 15-ml-Röhrchen mit 5 ml HABG ( Tabelle 1 ) auf Eis. Achten Sie darauf, dass Sie das Rückenmark nicht zerkleinern.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 für jeden Welpen im Wurf.
HINWEIS: Im Idealfall sollte dieser Vorgang weniger als 30 Minuten pro Rückenmark dauern, um eine gesunde Neuronisolation zu gewährleisten.
4. Neuronen isolieren
HINWEIS: Der folgende Schritt sollte in einer laminaren Strömungshaube durchgeführt werden. Vertrautheit mit der grundlegenden sterilen Technik wird erwartet.
- Tissue Mincing
- Nehmen Sie die Röhre mit den Rückenmark und schütteln Sie leicht, um das Gewebe zu suspendieren.
- Gießen Sie das Gewebe aus dem Röhrchen in eine 60 mm Glas Petrischale und würfeln Sie mit einer Rasierklinge, um feine Stücke ~ 0,5 mm Größe zu schaffen.
- Übertragen Sie das Gewebe mit einer breitlochigen Pipette in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml HABG.
- Legen Sie es in ein30 ° C Wasserbad für 30 min, damit die Zellen bei dieser Temperatur äquilibrieren können. Halten Sie die Zellen auf einen Shaker gerade genug, damit sie in der Flüssigkeit suspendiert werden können.
HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um zu vermeiden, dass die Zellen bei der Übertragung von Eis auf das Verdauungsmedium geschockt werden. Das Halten der Zellen bei 30 ° C hilft, den Zelltod zu verringern, der mit einem ansonsten erhöhten Stoffwechsel bei 37 ° C verbunden ist.
- Bereiten Sie das Verdauungsmedium vor ( Tabelle 1 ).
- Den Dichtegradienten vorbereiten (Tabelle 1).
- Bereiten Sie jede der 4 Schichten in 4 separaten 15-ml-Röhrchen vor, wie in Tabelle 1 beschrieben .
- Füge 1 ml aus jeder Schicht in ein neues 15-ml-Röhrchen. Beginnen Sie mit der Schicht 1 an der Unterseite und folgen Sie nacheinander, bis die Schicht 4 an der Spitze erreicht ist. Vermeiden Sie es, die Schichten beim Hinzufügen zu stören.
- Waschen Sie die PDL-beschichteten Platten aus Schritt 2.2. Waschen Sie mit sterilem Wasser für ein paar Minuten, bevor Sie restliches Wasser entfernen undSo dass sie für 1 h trocknen lassen.
- Übertragen Sie das Gewebe auf das Verdauungsmedium.
- Entfernen Sie das Gewebe-haltige Röhrchen aus dem Shaker-Wasserbad bei 30 ° C und lassen Sie es für einige Minuten absetzen.
- Entfernen Sie das Verdauungsmediumschlauch aus dem 37 ° C Wasserbad und saugen Sie es in eine Leur-Lock-Spritze.
- Absaugen Sie die überschüssige HABG aus dem Gewebe enthaltenden Rohr.
- Verwenden Sie auf der Spritze einen Leur-Lock-0,2 μm-Filter, um dem Gewebe enthaltenden Röhrchen ein Verdauungsmedium zuzusetzen.
- Legen Sie den Schlauch in ein 30 ° C Wasserbad für 30 min. Halten Sie die Zellen gerade genug schütteln, damit sie in der Flüssigkeit suspendiert werden können.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen nicht zu lange im Verdauungsmedium zu halten oder die Temperatur zu hoch zu lassen, was zu einer übermäßigen Verdauung führen kann und dazu führt, dass das Gewebe in einer gallertartigen Mischung suspendiert wird.
- Während dieser Periode das Laminin wie in Schritt 2.3 beschichten. <Li> Trituration durchführen ( dh die Zellen vom Gewebe trennen).
- Entfernen Sie das Röhrchen aus dem 30 ° C Wasserbad und lassen Sie es für ein paar Minuten absetzen.
- Aspirate überschüssiges Verdauungsmedium.
- Das Gewebe in 2 ml HABG suspendieren.
- Mit einer schmalen Bohrpipette 10x für 45 s triturieren.
HINWEIS: Dies ist wahrscheinlich der einzige entscheidende Schritt und kann den Ertrag erheblich senken, wenn nicht richtig gemacht.- Sauge das Gewebe in die Pipette und leere sofort den Inhalt zurück.
- Vermeiden Sie die Einführung von Luft, da es die lebensfähige Ausbeute deutlich verringern wird.
HINWEIS: Die ideale Pipette ist eine 9-Zoll-Glaspipette, die Spitze der Pipette sollte feuerpoliert werden, um raue Oberflächen zu glätten, sie sollte dann durch Platzierung in einer 1: 20-Lösung von Dichlordimethylsilan (DMDCS) in Chloroform und O / N. Die Pipette sollte dann entfernt und an der Luft getrocknet werdenFür die Sterilisation autoklaviert werden.
Achtung: DMDCS und Chloroform sind leicht entflammbar und die Silikonisierung sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
- Aspirieren Sie die Top 2 ml Überstand und legen Sie sie in eine neue 15-ml-Röhre mit der Aufschrift "Sammlung".
- Wiederholen Sie die Schritte 4.7.3-4.7.5 zwei weitere Zeiten (das Zellsammelröhrchen sollte 6 ml am Ende haben).
- Langsam den Sammelrohrinhalt in das in Schritt 4.2 hergestellte Gradientenrohr übertragen, wodurch die Störung des Gradienten vermieden wird.
- An diesem Punkt entfernen Sie das zuvor hergestellte neurobasale Medium ( Tabelle 1 ) aus dem Kühlschrank und lassen Sie es in einem 37 ° C Bad warm werden.
- Reinige die Neuronen.
- Das Gradientenrohr für 15 min bei 800 xg und 22 ° C zentrifugieren.
- Sammeln Sie die gewünschte Schicht (en) mit einer Pipette ( Abbildung 2 ) und legen Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen. Für das hochreine NeuroN Isolierung ( dh > 90%), sammeln Schicht 3. Für mehr Ausbeute mit weniger Reinheit ( dh > 70-80%) sammeln Sie die Schichten 2 & 3.
- Verdünnen Sie den Dichtegradienten durch Zugabe von 5 ml HABG zu den neu gesammelten Schichten.
- Zentrifugieren bei 200 xg für 2 min bei 22 ° C.
- Den Überstand verwerfen, in 5 ml HABG erneut suspendieren und das Pellet zusetzen, um die Zellen zu suspendieren.
- Zentrifugieren bei 2 min 200 xg bei 22 ° C.
- Den Überstand verwerfen, in 3 ml Neurobasalmedium resuspendieren und das Pellet auffüllen, um die Zellen zu resuspendieren.
- Zähle die Zellen.
- Nehmen Sie 10 μl der Lösung, jetzt mit Zellen im neurobasalen Medium, und mischen mit 10 μl Trypanblau.
- 10 μl dieser Mischung in eine Glaszählkammer geben.
- Mit einer Standard-Glaszählkammer zählen die Anzahl der Zellen in jedem der vier 4 x 4 Quadranten. Fügen Sie alle Zellen gezählt (n), multiPly durch 2 (Verdünnungsfaktor), teilen sich mit 4 (Anzahl der gezählten Quadranten), multiplizieren mit 3 (Volumen des neurobasalen Mediums) und multiplizieren mit 10 4 , um die Konzentration der Zellen in Zellen / ml zu erhalten.
- Samen die Zellen auf Kulturplatten
- Die Zellsuspension auf 300.000 Zellen in 1 ml Neurobasalmedium verdünnen.
HINWEIS: Basierend auf der Konzentration der in den obigen Schritten erhaltenen Zellen wird zusätzliches neurobasales Medium zugegeben, um eine Endkonzentration von 3 · 10 & sup5; Zellen / ml zu erhalten. Die Gleichung ist C 1 V 1 = C 2 V 2 , wobei C 1 die Anfangskonzentration der aus der Ernte gewonnenen Zellen ist; V & sub1; ist 3 ml; Und C & sub2; ist 3 · 10 & sup5; Zellen / ml, wie oben diskutiert. Die Gleichung ist für V 2 gelöst. Fügen Sie das Volumen des neurobasalen Mediums hinzu, das notwendig ist, um das Gesamtvolumen der Zellen in Lösung gleich zu machenV 2 - Schütteln Sie sanft, um die Zellen in Lösung zu verteilen und fügen Sie 1 ml zu jeder Vertiefung in den beschichteten 24-Well-Platten hinzu.
- Die Zellsuspension auf 300.000 Zellen in 1 ml Neurobasalmedium verdünnen.
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Representative Results
Mit dieser Technik erlaubt ein einzelner Wurf (4-10 Welpen) die Isolierung von 1-2,5 10 6 Neuronen, die für die Aussaat auf Kulturplatten geeignet sind. Typischerweise werden 4-8 Vertiefungen in der oben erwähnten Konzentration ( dh 300.000 Zellen / ml) ausgesät. Abbildung 3 zeigt das Auftreten von Neuronen in dieser Konzentration nach einer Woche in der Kultur bei der Nieder- ( a ) und der Hoch- ( b ) Vergrößerungslichtmikroskopie. Allerdings haben wir auch in der Lage, Zellen in Konzentrationen so hoch wie 500.000 Zellen / Brunnen und so niedrig wie 100.000 Zellen / Brunnen zu kultivieren. Die Verwendung der höheren Konzentrationen erfordert mehr mittlere und sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Umweltbedingungen, da Nährstoffe schnell abgebaut werden können, was zu einer toxischen sauren Umgebung für die Zellen führt. Bei niedrigeren Konzentrationen neigen die Zellen dazu, die Vollreife nicht zu erreichen, und eine Überwucherung von unterstützenden Zellen ( dh Oligodendrozyten, miCroglia und astrozyten) beobachtet wird.
Die Zellen beginnen typischerweise in den ersten paar Stunden an der Oberfläche zu haften ( Abbildung 4a ). Axone beginnen, innerhalb der ersten 24-48 h zu sprießen ( Abbildung 4b -4c ). Verbindungen zwischen verschiedenen Neuronen in Kultur erreichen typischerweise die Reife an 7 Tagen ( Abbildung 4d ), an welcher Stelle Experimente typischerweise an den Neuronen durchgeführt werden.
Neuronen sind unter Lichtmikroskopie identifizierbar, da sie deutliche axonale Projektionen haben. Unsere Isolierungen mit Schicht 3 ( Abbildung 2 ) ergeben ~ 80-90% Neuronen in Kultur. Dies wurde unter Verwendung der immunfluoreszierenden Färbung von neuronspezifischen Markern bestätigt. In Abbildung 5c ist das Neuron-Zytoskelettprotein Microtubule-assoziiertes Protein 2 (MAP2) sUnd zeigte Umrisse und axonale Projektionen der Neuronen nach einer Woche in der Kultur. Ähnlich ist in Fig. 6c der neuronenspezifische Kernmarker NeuN gefärbt, der neuronale Kerne zeigt. Diese neuronalen Marker werden mit dem Zellkern (DAPI, Fig. 5a , 6a ) und dem Cytoplasma (GFP, Fig. 5b , 6b ) kombiniert, und die resultierenden Bilder werden zusammengeführt ( Fig. 5d , 6d ), wobei die relative Häufigkeit von Neuronen auf andere Zellen in Kultur. Bei der Verwendung der Schichten 2 und 3 ist die Ausbeute an Neuronen etwas höher; Allerdings neigen dazu weniger Neuronen in der reinen Lösung (~ 70%).
Abbildung 1: Wirbelsäule zerlegt und Rückenmark Freigegeben von einer 3 Tage alten neonatalen Maus. DasPfeil in ( a ) zeigt auf das kaudale Ende der Wirbelsäule, wo eine Nadel eingesetzt wird, um das Rückenmark freizugeben. Ein freigesetztes Rückenmark ( b ) wird in PBS untergetaucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Dichtegradient, mit Zellen nach der Zentrifugation hinzugefügt. Die Schichten sind skizziert und besser auf der Karikatur-Darstellung visualisiert. Die oberflächliche Schicht (0) ist in der Regel Trümmer aus dem Rückenmark Gewebe. Schicht 1 ist reich an Oligodendrozyten und Astrozyten. Die Schichten 2 und 3 enthalten die Mehrheit der Neuronen. Während Schicht 3 Neuronen mit der höchsten Reinheit enthält, werden einige Stützzellen ( dh Astrozyten und Oligodendrozyten) in Schicht 2 gefundenLlet an der Unterseite enthält hauptsächlich Mikrogliazellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Lichtmikroskopie von neuronalen Zellkulturen nach 7 Tagen Isolierung. Bei 10facher Vergrößerung ( a ) sind axonale Verbindungen zwischen verschiedenen Konglomeraten von Neuronen zu sehen. Bei 40facher Vergrößerung ( b ) können die Neuronen mit ihren axonalen Projektionen genauer sichtbar gemacht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Immunfluoreszenzfärbung von Neuronen mit neuronalem Zytoskelettmarker MAP2. Die Kernfärbung (DAPI) wird in blau ( a ) mit cytoplasmatischer Färbung (GFP) in grün ( b ) und Neuron-zytoskeletalen Protein (MAP2) in Rot ( c ) gezeigt. Die zusammengeführten Bilder ( d ) werden kombiniert und zeigen die relative Häufigkeit von Neuronen.Target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Immunfluoreszenzfärbung von Neuronen mit neuronalem Kernmarker NeuN. Die Kernfärbung (DAPI) ist in blau ( a ) mit cytoplasmatischer Färbung (GFP) in grün ( b ) und neuronalen Kernen (NeuN) in Rot ( c ) dargestellt. Die zusammengeführten Bilder ( d ) werden kombiniert und zeigen die relative Häufigkeit von Neuronen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Medien | Lagerung | Zutaten | Vorbereitung | ||
| HABG | 4 ° C / 24h | 100 ml | - Tau B27 in 4 ° C Kühlschrank O / N - Filter sterilisieren (0,22 μm) | ||
| Hibernate A | 97,8 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Neurobasale Medien | 4 ° C / 1 Woche | 100 ml | - Tau B27 in 4 ° C Kühlschrank O / N - Filter sterilisieren (0,22 μm) - 50 ml Portionen in 50 ml Röhrchen verteilen (bei 4 ° C lagern) | ||
| Neurobasal A | 97 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Pen / Strep [1%] | 1 mL | ||||
| Verdauungsmedien | Tag der Isolierung | 10 ml | - Kräftig schütteln - Lassen Sie es in 37 ° C Bad für 30 min sitzen (idealerweise vor 30 Minuten vorbereitet) - Filter sterilisieren (0,22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 ml | ||||
| Papain | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml | ||||
| Dichtegradient | Tag der Isolierung | 1 Gradient | |||
| Schicht | OptiPrep | HABG | |||
| (0,13 ml) | (5,29 ml) | ||||
| 1 unten | 0,26 ml | 1,24 ml | |||
| 2 | 0,19 ml | 1,31 ml | |||
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml | |||
| 4 oben | 0,11 ml | 1,39 ml | |||
Tabelle 1: Vorbereitung der Medien und Lösungen in diesem Protokoll.
| Beschichtungssubstrat | Lagerung | Zutaten | Vorbereitung | |
| PDL | Einfrieren-Tauwetter einmal | Poly-D-Lysin-Hydrobromid | 5 mg | - Aliquot 4 ml in 15 ml Röhrchen geben und sofort in -20 ° C aufbewahren - 0,5 ml / Vertiefung (24-Well-Platte) |
| Steriles Wasser | 50 mL | |||
| Laminin | Tag der Beschichtung | Laminin (1 mg / ml) | 80 & mgr; l | - Genug für 8 Brunnen in einer 24-Well-Platte - 0,35 ml / Vertiefung (24-Well-Platte) |
| Neurobasales Medium | 2,72 ml | |||
Tabelle 2: Vorbereitung der Beschichtungssubstrate, die verwendet werden, um die Wells zu beschichten, auf denen die Neuronen kultiviert werden.
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Discussion
Diese Technik ermöglicht die zuverlässige Kultur der Rückenmark Neuronen. Sobald die Technik erreicht ist, dauert es ca. 3,5 Stunden. Wir konnten die Isolierung von Neuronen aus 2 getrennten Würfen (16 Mäuse insgesamt) in ca. 4 h durchführen. Der entscheidende Schritt in der Machbarkeit ist es, die Rückenmarke von den Mäusen kompetent zu extrahieren. Die Ausbeute ermöglicht das Plattieren von mehreren Vertiefungen und die Fähigkeit, die Neuronen unter verschiedenen Bedingungen zu testen. Wir konnten die Neuronen nach der Reife behandeln und die Proteinexpression mit Hilfe der Western-Blot-Analyse zuverlässig bewerten. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Glasscheiben in den Wells für Neuron-Attachments die weitere Färbeanalyse der Neuronen.
Dieses Verfahren ist insofern vorteilhaft, als es kein embryonales Gewebe und die damit verbundene Arbeitsintensität erfordert. Darüber hinaus ist es nicht notwendig, adulte Wirbelsäule zu verwenden, um genügend Gewebe zu sammelnE Neuronisolation. Dies verhindert, dass der Faktor des Alters Compounding Verhalten in Neuron Physiologie, wie bei erwachsenen Mäusen gesehen. Diese Technik ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Wie bereits erwähnt, werden alte Neuronen unter Verwendung von neonatalen Mäusen ausgeschlossen, und dies kann eine Einschränkung sein, wenn altersbedingtes Verhalten und Biologie der Untersuchungsbereich ist. Es gibt eine Lernkurve für die Prozedur, die nicht nur notwendig ist, um die Ausbeute zu optimieren, sondern um sicherzustellen, dass die isolierten Neuronen gesund sind. Die Rückenmark-Extraktionstechnik kann einige Zeit dauern, um vor allem mit neugeborenen Mäusen zu meistern. Wir haben bemerkt, dass eine längere Zeit, die mit der Extraktion der Rückenmarksmittel verbunden ist, zu Neuronen führt, die für eine wesentlich kürzere Zeit kultiviert werden können. Dies wird durch die Platzierung der Neuronen auf Eis etwas gemildert; Die Zeit spielt aber immer noch eine zentrale Rolle.
Es gibt wichtige Schritte in der Prozedur, die helfen, die optimale Ausbeute an Neuronen zu gewährleisten. Wenn die Neuronenausbeute nicht e istEs sollten einige Schritte ausgewertet werden. Zuerst sollte die Anzahl der Wirbelsäule idealerweise größer als 4 sein. Wenn 3 Rückenmarken oder weniger verwendet werden, beträgt die Ausbeute gewöhnlich weniger als 1 Million Neuronen. Eine ausreichende Vorbereitung des Verdauungsmediums muss gewährleistet sein (Schritt 4.5). Wenn man das Gewebe zu lange im Verdauungsmedium verlässt, wird ein übermäßiger Abbau der Zellen verursacht, während das Verdauungsmedium, das bei 37 ° C nicht aktiviert wurde, zu weniger isolierten Neuronen führt. Schließlich muss die Triturationstechnik (Schritt 4.7) präzise durchgeführt werden. Niedrige Erträge resultieren in der Regel aus einer unzureichenden Verreibung. Ein guter Indikator zeigt, ob die Lösung während der Verreibung bewölkt wird - wenn dies nicht geschieht, ist es wahrscheinlich, dass die Verreibung zu sanft ist.
Wenn die Ausbeute wie erwartet ist, aber die Neuronen nicht scheinen, Prozesse innerhalb der ersten 1-2 Tage zu regenerieren, ist das Problem normalerweise ein Versagen in der richtigen Beschichtung, mit entweder unzureichendem WaschenOder Trocknen (Schritt 2.2). Wenn die Zellen zunächst Prozesse projizieren, aber später vor der 5-7-Tage-Marke apoptotisch werden, könnte es mehrere Probleme geben. Zuerst sicherstellen, dass die HABG-Lösung innerhalb von 24 Stunden Isolierung vorbereitet wird und dass frische B27-Ergänzung, die am selben Tag der HABG-Zubereitung aufgetaut wurde, verwendet wird. Die Antioxidantien in dieser Ergänzung müssen frisch und nicht abgelaufen sein. Als nächstes stellen Sie sicher, dass keine Blasen während des Verreibungsprozesses eingeführt werden (Schritt 4.7). Die Einführung von Luftblasen trägt zu diesem Thema bei und kann mit der Trocknung der Neuronen in Zusammenhang stehen. Auch stellen Sie sicher, dass die Kultur nicht mit Kontamination überwältigt wird, was auf Fehler in der Sterilität zurückzuführen ist.
Hier beschreiben wir die Verwendung von 24-Well-Platten, auf denen die Neuronen zu säen. Manchmal ist es notwendig, Zeit- und / oder Dosierungsversuche durchzuführen, wie zB bei der Verwendung von pharmakologischen Wirkstoffen. Die Technik kann modifiziert werden und die Neuronen können auf 48-well plStattdessen Da die Oberfläche einer Vertiefung in einer 48-Well-Platte die Hälfte davon in einer 24-Well-Platte ist, sollten die verwendeten Volumen der Beschichtungslösungen halbiert werden. Die Zellen sollten auch mit der Hälfte des Volumens ( dh 0,5 ml anstelle von 1,0 ml) beschichtet werden. Allerdings sollte ihre Konzentration gleich bleiben ( dh 1-5 x 10 5 Zellen / ml). Während diese Studie mit C57BL / 6-Mäusen durchgeführt wurde, sollte die Technik über andere genetisch manipulierte Stämme anwendbar sein.
Rückenmark Ischämie und Schutz ist ein Gebiet von wachsenden Interesse 12 , 13 , 14 . Klinisch kann die Thorakoabdominal-Aortenchirurgie zu einer verheerenden Lähmung im Zusammenhang mit der Rückenmarks-Ischämie und Reperfusion führen, deren Pathophysiologie vollständig verstanden wird 15 , 16 . Verstehen, wie Neuronen auf th reagierenDer Stress der Ischämie ist mit diesem Modell möglich. Unsere Gruppe hat zuvor auf neunonale Verletzung des Rückenmarks im Zusammenhang mit ischämischer Beleidigung durch Sauerstoff-Glukose-Deprivation mit dieser Technik veröffentlicht 17 . Das Modell wurde auch um die Kultur der Astrozyten, getrennt von Neuronen, erweitert.
Abschließend ist diese Technik für das Studium der Wirbelsäulen-Pathophysiologie und der neuronalen Mikrobiologie wertvoll. Die serumfreie Kultur ermöglicht eine präzise Umweltkontrolle. Es ermöglicht einen direkten Zugang zur Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen. Kombiniert mit zusätzlichen Techniken, wie z. B. Sauerstoff-Glukose-Deprivation, kann diese Technik nützlich sein, um unser Verständnis der Pathophysiologie der determinanten Rückenmark Ischämie zu erweitern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
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