Summary
Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.
Abstract
Apresentamos um protocolo para o isolamento e a cultura dos neurônios da medula espinhal. Os neurônios são obtidos a partir de camundongos C57BL / 6 neonatais e são isolados no dia 1 pós-natal. Uma maca de rato, geralmente 4-10 cachorros nascidos de um par reprodutor, é recolhida para uma experiência e as cordas espinhais são coletadas individualmente de cada mouse após a eutanásia com isoflurano. A coluna vertebral é dissecada e depois a medula espinal é liberada da coluna. As cordas espinhais são então picadas para aumentar a área superficial de parto para uma protease enzimática que permite que os neurônios e outras células sejam liberados do tecido. A trituração é então usada para liberar as células em solução. Esta solução é subsequentemente fraccionada em um gradiente de densidade para separar as várias células em solução, permitindo que os neurônios sejam isolados. Aproximadamente 1-2,5 x 10 6 neurônios podem ser isolados de um grupo de lixo. Os neurônios são então semeados em poços revestidos com adesãoRs que permitem um crescimento e maturação adequados. Os neurônios levam aproximadamente 7 dias para atingir a maturidade no meio de crescimento e cultura e podem ser usados posteriormente para tratamento e análise.
Introduction
Compreender a patologia da medula espinhal requer o uso de vários modelos, tanto no nível macroscópico quanto microscópico. Os modelos de animais grandes e pequenos 1 , 2 , 3 são utilizados para investigações in vivo de doenças da medula espinhal e lesões. Ao estudar estas questões in vivo tem seus méritos, a análise da medula espinhal é limitada ao homogeneizado da medula espinal inteira ou às seções de tecido 4 . Isso cria alguma ambigüidade ao tentar isolar respostas e alvos específicos na medula espinhal entre seus neurônios residentes e glia circundante. A crescente disponibilidade de camundongos manipulados geneticamente permite investigações mais detalhadas da biologia em níveis celulares e moleculares. Assim, um modelo de rato neonatal é usado aqui, permitindo o estudo das propriedades únicas e biologia dos neurônios da medula espinhal in vitro .
O isolamento e manutenção de neurônios in vitro não é particularmente direto. Existe uma abundância relativa de técnicas de isolamento de neurônios do tecido cortical de roedores adultos que parecem resultar em um número substancial de neurônios isolados ( ou seja, milhões) 5 , 6 , 7. Em contraste, o rendimento de neurônios do tecido da medula espinhal é menor 8 , 9 , 10 , em parte devido à menor massa de tecido. Além disso, em camundongos, há uma escassez relativa de técnicas para o isolamento de neonatologia Os neurônios da medula espinhal e os métodos existentes são limitados por menores rendimentos de neurônios ( ou seja, centenas) 9 ou técnicas pesadas e pesadas que exigem o isolamento de camundongos embrionários 10 .Neste protocolo, nósUse uma técnica que permita o isolamento efetivo de custo e recursos de um número substancial de neurônios das cordas espinhais de camundongos neonatais. Como é comum em técnicas previamente publicadas, utilizamos papaina como protease enzimática, permitindo a liberação de neurônios do tecido da medula espinhal 5 , 6 . Além disso, usamos um gradiente de densidade para a separação de células refinadas, que anteriormente foi mostrado como efetivo 6 , 10 . Embora o meio em que as células estejam incubadas possa variar, em nossa experiência e como publicado anteriormente 11 , a suplementação com suplemento de meio de cultura B27 fresco provou ser crítica para a longevidade do neurônio. Os neurônios são geralmente viáveis por até 10 dias, permitindo que o tratamento seja realizado.
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Protocol
O atendimento e o tratamento dos animais neste procedimento foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade do Colorado.
1. Preparando Soluções
- Prepare e armazene todas as soluções a temperaturas apropriadas, conforme mostrado na Tabela 1 .
2. Coating Wells e Slides
NOTA: Os neurônios não aderem bem às superfícies de plástico ou de vidro.
- Um dia antes do isolamento dos neurônios, revestir os poços de uma placa de cultura estéril de 24 poços com 0,5 mL de poli-D-lisina (PDL, Tabela 2 ) e deixá-lo em uma camada de fluxo laminar O / N.
NOTA: O método preferido é usar placas de 24 poços e revestir apenas os poços centrais, uma vez que a evaporação dos poços periféricos tende a ser mais acelerada e a resultados inconsistentes. Além disso, lâminas de vidro podem ser colocadas dentro dos poços antes de tO revestimento. Os neurônios serão anexados às lâminas de vidro revestidas e podem ser removidos posteriormente para outras imagens microscópicas . - No dia do isolamento, retire o PDL dos poços. Lave com água esterilizada por alguns minutos antes de remover a água restante e deixe secar durante 1 h (veja abaixo).
- Após a secagem, cubra as lâminas com laminina ( Tabela 2 ).
NOTA: Aproximadamente 10 μL de laminina (10 μg / μL) é suficiente para revestir cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Isto é misturado com 340 μL de meio (volume total: 350 μL) para cobrir todo o poço. Deixe isso sentar-se durante 2 h à RT em um capuz de cultura e depois aspirar antes de revestir as células.
3. Colheita de Cordas Espinhais
NOTA: Todos os instrumentos devem ser autoclavados (135 ° C e 30 psi para ciclos de 4 x 7 min) para esterilidade.
- Eutanizar cachorros de rato C57BL / 6 de um dia de um dia em uma câmara com isoflurano. Esperar30 s após a cessação do movimento e pitada a perna para confirmar a falta de resposta.
- Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura, com cachorro na posição propensa.
- Estabilize as patas traseiras ou a cauda e os braços na mesa de procedimento, com o lado dorsal voltado para o usuário.
- Corte a pele com uma tesoura de íris curvada.
- Corte a medula espinhal da região lombar logo acima dos quadris e continue a cortar os dois lados do tórax para separá-lo do corpo.
NOTA: Isso requer a dissecação cuidadosa da medula espinhal dos órgãos viscerais para evitar danos inadvertidos a outros órgãos ( Figura 1a ). - Lave sequencialmente por 10 s em placas de Petri de 3 x 10 cm contendo 5 mL de solução salina tamponada com fosfato esterilizado (PBS) esterilizado com filtro de 0,2 μm para remover o excesso de tecido.
- Insira uma agulha de 22 G e uma seringa preenchida com 5 mL de PBS esterilizado em filtro na extremidade caudal da coluna vertebral e flush cranialmente, permitindo que o cordão tO saída para uma quarta placa de Petri ( Figura 1b ).
- Recolher a medula espinhal em um tubo de 15 mL com 5 mL de HABG ( Tabela 1 ) em gelo. Tenha cuidado para evitar esmagar a medula espinhal.
- Repita as etapas 3.1-3.8 para cada cachorro na liteira.
NOTA: Idealmente, este processo deve levar menos de 30 min por medula espinhal para garantir o isolamento saudável do neurônio.
4. Isolando neurônios
NOTA: O seguinte passo deve ser realizado em uma capa de fluxo laminar. É esperada familiaridade com a técnica estéril básica.
- Mincing de tecidos
- Pegue o tubo contendo as cordas espinhais e agite levemente para suspender o tecido.
- Despeje o tecido do tubo em uma placa de Petri de vidro de 60 mm e dê com uma lâmina de barbear para criar peças finas de 0,5 mm de tamanho.
- Transfira o tecido com uma pipeta de diâmetro largo para um tubo de 15 mL contendo 5 mL de HABG.
- Coloque-o em um30 ° C de banho de água durante 30 min para permitir que as células se equilibrem a esta temperatura. Mantenha as células em um agitador apenas o suficiente para permitir que elas sejam suspensas no fluido.
NOTA: Este passo é feito para evitar chocar as células após a transferência do gelo para o meio de digestão. Manter as células a 30 ° C ajuda a diminuir a morte celular associada a um aumento do metabolismo a 37 ° C.
- Prepare o meio de digestão ( Tabela 1 ).
- Prepare o gradiente de densidade (Tabela 1).
- Prepare cada uma das 4 camadas em 4 tubos separados de 15 mL, conforme descrito na Tabela 1 .
- Adicione 1 mL de cada camada a um novo tubo de 15 mL. Comece com a camada 1 na parte inferior e adicione-se sequencialmente até atingir a camada 4 no topo. Evite perturbar as camadas enquanto se adiciona.
- Lave as placas revestidas PDL do passo 2.2. Lave com água estéril por alguns minutos antes de remover qualquer água restante ePermitindo secar durante 1 h.
- Transfira o tecido para o meio de digestão.
- Remova o tubo contendo tecido do banho de água do agitador a 30 ° C e deixe-o sedimentar por alguns minutos.
- Remova o tubo médio de digestão do banho-maria a 37 ° C e aspirá-lo para dentro de uma seringa.
- Aspirar o excesso de HABG do tubo contendo tecido.
- Use um filtro de seu filtro de 0,2 μm na seringa para adicionar o meio de digestão ao tubo contendo tecido.
- Coloque o tubo em um banho de água a 30 ° C durante 30 min. Mantenha as células tremendo o suficiente para permitir que elas sejam suspensas no fluido.
NOTA: É importante não manter as células no meio de digestão por muito tempo ou deixar a temperatura ficar muito alta, o que pode levar à digestão excessiva e resultar em suspensão do tecido em uma mistura gelatinosa.
- Durante este período, revestir a laminina como no passo 2.3. <Li> Realize a trituração ( ou seja, separe as células do tecido).
- Remova o tubo do banho de água agitado de 30 ° C e deixe-o se assentar durante alguns minutos.
- Aspirar o excesso de meio de digestão.
- Suspenda o tecido em 2 mL de HABG.
- Usando uma pipeta de diâmetro estreito, triture 10x por 45 s.
NOTA: Este é provavelmente o passo mais crucial e pode diminuir significativamente o rendimento se não for feito corretamente.- Aspirar o tecido na pipeta e imediatamente esvaziar o conteúdo.
- Evite a introdução de ar, pois diminuirá significativamente o rendimento viável.
NOTA: A pipeta ideal é uma pipeta de vidro de 9 ". A ponta da pipeta deve ser polida a fogo para suavizar superfícies rugosas. Em seguida, deve ser siliconada por colocação em uma solução 1:20 de diclorodimetilsilano (DMDCS) em clorofórmio e esquerda de O / N. A pipeta deve então ser removida e deixada secar ao ar. Posteriormente, éDeve ser autoclavado para esterilização.
Atenção: o DMDCS e o clorofórmio são altamente inflamáveis e a siliconização deve ser realizada em uma exaustão.
- Aspirar os 2 ml superiores de sobrenadante e colocá-lo em um novo tubo de 15 mL rotulado como "coleção".
- Repita as etapas 4.7.3-4.7.5 duas vezes adicionais (o tubo de coleta celular deve ter 6 mL até o final).
- Transmita lentamente o conteúdo do tubo de recolha para o tubo de gradiente preparado no passo 4.2, evitando a interrupção do gradiente.
- Neste ponto, remova o meio neurobasal previamente preparado ( Tabela 1 ) da geladeira e deixe-o aquecer em um banho de 37 ° C.
- Purifique os neurônios.
- Centrifugue o tubo gradiente por 15 min a 800 xg e 22 ° C.
- Colecione a (s) camada (s) desejada (s) com uma pipeta ( Figura 2 ) e coloque em um novo tubo de 15 mL. Para o neurociências de maior purezaN isolação ( ou seja, 90%), coletar camada 3. Para obter mais rendimento com menos pureza ( ie > 70-80%), colete as camadas 2 e 3.
- Diluir o gradiente de densidade adicionando 5 mL de HABG às camadas recém-coletadas.
- Centrifugar a 200 xg durante 2 min a 22 ° C.
- Descarte o sobrenadante, volte a suspender em 5 mL de HABG e pique o sedimento para suspender as células.
- Centrifugar durante 2 min 200 xg a 22 ° C.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda em 3 mL de meio neurobasal e pique o sedimento para ressuspender as células.
- Conte as células.
- Pegue 10 μL da solução, agora com células em meio neurobasal, e misture com 10 μL de azul de Trypan.
- Coloque 10 μL desta mistura numa câmara de contagem de vidro.
- Usando uma câmara de contagem de vidro padrão, conte o número de células em cada um dos quatro quadrantes de 4 x 4. Adicione todas as células contadas (n), multiPor 2 (fator de diluição), dividir por 4 (número de quadrantes contados), multiplicar por 3 (volume de meio neurobasal) e multiplicar por 10 4 para obter a concentração de células em células / mL.
- Semear as células em placas de cultura
- Diluir a suspensão celular para 300.000 células em 1 mL de meio neurobasal.
NOTA: Com base na concentração de células obtidas nas etapas acima, adiciona-se meio neurobasal adicional para obter uma concentração final de 3 * 10 5 células / mL. A equação é C 1 V 1 = C 2 V 2 , onde C 1 é a concentração inicial de células obtidas a partir da colheita; V 1 é 3 mL; E C 2 é 3 * 10 5 células / mL, como discutido acima. A equação é resolvida para V 2 . Adicione o volume do meio neurobasal necessário para tornar o volume total de células em solução igual aV 2 . - Agite suavemente para distribuir as células em solução e adicione 1 mL a cada poço nas placas revestidas de 24 poços.
- Diluir a suspensão celular para 300.000 células em 1 mL de meio neurobasal.
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Representative Results
Usando esta técnica, uma única ninhada (4-10 filhotes) permite o isolamento de 1-2,5 10 6 neurônios adequados para semeadura em placas de cultura. Tipicamente, 4-8 poços são semeados na concentração mencionada acima ( ou seja, 300.000 células / mL). A Figura 3 demonstra o aparecimento de neurônios nesta concentração após uma semana de cultura em microscopia de luz de ampliação baixa ( a ) e alta ( b ). No entanto, também fomos capazes de cultivar células em concentrações tão altas como 500 000 células / poço e tão baixas como 100 000 células / poço. O uso de concentrações mais elevadas requer mais atenção média e cuidadosa às condições ambientais, pois os nutrientes podem ser esgotados rapidamente, levando a um ambiente ácido tóxico para as células. Com concentrações mais baixas, as células tendem a não atingir a maturidade total e um crescimento excessivo de células de suporte ( ou seja , oligodendrócitos,Croglia e astrocitos).
As células normalmente começarão a aderir à superfície dentro das primeiras horas ( Figura 4a ). Os axões começarão a brotar dentro das primeiras 24-48 h ( Figura 4b -4c ). As conexões entre vários neurônios em cultura geralmente atingem a maturidade aos 7 dias ( Figura 4d ), em que ponto as experiências são tipicamente realizadas nos neurônios.
Os neurônios são identificáveis sob microscopia de luz, pois apresentam projeções axonais distintas. Nossos isolamentos usando a camada 3 ( Figura 2 ) produz ~ 80-90% de neurônios em cultura. Isto foi confirmado utilizando a coloração imunofluorescente de marcadores específicos de neurónios. Na Figura 5c , a proteína do citoesqueleto neurônio Proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2) é sMostrando contornos e projeções axonais dos neurônios após uma semana em cultura. Da mesma forma, na Figura 6c , o marcador nuclear NeuN específico do neurônio é corado, mostrando núcleos neuronais. Esses marcadores neuronais são combinados com imagens de núcleo (DAPI, Figura 5a , 6a ) e citoplasma (GFP, Figura 5b , 6b ) e as imagens resultantes são mescladas ( Figura 5d , 6d ), detalhando a abundância relativa de neurônios para outras células em cultura. Ao usar as camadas 2 e 3, o rendimento dos neurônios é ligeiramente maior; No entanto, tendem a haver menos neurônios na solução pura (~ 70%).
Figura 1: coluna espinhal dissecada e medula espinhal liberada de um mouse neonatal de 3 dias. oA flecha em ( a ) aponta para a extremidade caudal da coluna vertebral, onde uma agulha é inserida para liberar a medula espinhal. Uma medula espinhal liberada ( b ) é mostrada submersa em PBS. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Gradiente de densidade, com células adicionadas depois da centrifugação. As camadas são delineadas e melhor visualizadas na descrição dos desenhos animados. A camada mais superficial (0) é geralmente detritos do tecido da medula espinhal. A camada 1 é rica em oligodendrócitos e astrocitos. As camadas 2 e 3 contêm a maioria dos neurônios. Enquanto a camada 3 contém neurônios com maior pureza, algumas células de suporte ( isto é, astrócitos e oligodendrócitos) são encontradas na camada 2. O peO llet no fundo contém principalmente células microgliais. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Microscopia leve de culturas de células neuronais após 7 dias de isolação. Na ampliação 10X ( a ), podem ser observadas conexões axonais entre vários conglomerados de neurônios. Na ampliação 40X ( b ), os neurônios podem ser visualizados mais de perto com suas projeções axonais. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 5: Mancha de Neurônios Imunofluorescentes com Marcador de Cistoesqueleto Neuronal MAP2. A coloração nuclear (DAPI) é mostrada em azul ( a ), com coloração citoplasmática (GFP) em proteína citoesquelética verde ( b ) e neurônio (MAP2) em vermelho ( c ). As imagens mescladas ( d ) são combinadas, mostrando a abundância relativa de neurônios.Target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mancha de Neurônios Imunofluorescentes com Marcador Nuclear Neuronal NeuN. A coloração nuclear (DAPI) é mostrada em azul ( a ), com coloração citoplasmática (GFP) em núcleos verdes ( b ) e neuronais (NeuN) em vermelho ( c ). As imagens mescladas ( d ) são combinadas, mostrando a abundância relativa de neurônios. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
| meios de comunicação | Armazenamento | Ingredientes | Preparação | ||
| HABG | 4 ° C / 24h | 100 mL | - Descongelar B27 em 4 ° C refrigerador O / N - Filtro esterilizado (0,22 μm) | ||
| Hibernar A | 97,8 mL | ||||
| B27 [2%] | 2 mL | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 mL | ||||
| Mídia Neurobasal | 4 ° C / 1 semana | 100 mL | - Descongelar B27 em 4 ° C refrigerador O / N - Filtro esterilizado (0,22 μm) - Alíquotas de 50 mL em tubos de 50 mL (armazenar a 4 ° C) | ||
| Neurobasal A | 97 mL | ||||
| B27 [2%] | 2 mL | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 mL | ||||
| Pen / Strep [1%] | 1 mL | ||||
| Mídia de digestão | Dia de isolamento | 10 mL | - Agite bem - Deixe-o sentar-se em banho a 37 ° C durante 30 min (idealmente preparado 30 min antes do uso) - Filtro esterilizado (0,22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 mL | ||||
| Papaína | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 mL | ||||
| Gradiente de densidade | Dia de isolamento | 1 Gradiente | |||
| Camada | OptiPrep | HABG | |||
| (0,13 mL) | (5,29 mL) | ||||
| 1 Parte inferior | 0,26 mL | 1,24 mL | |||
| 2 | 0,19 mL | 1,31 mL | |||
| 3 | 0,15 mL | 1,35 mL | |||
| 4 Topo | 0,11 mL | 1,39 mL | |||
Tabela 1: Preparação da mídia e soluções usadas neste protocolo.
| Substrato de revestimento | Armazenamento | Ingredientes | Preparação | |
| PDL | Congelar-descongelar uma vez | Hidrobrometo de poli-D-lisina | 5 mg | - Alíquota de 4 mL em tubos de 15 mL e armazene imediatamente a -20 ° C - 0,5 mL / poço (placa de 24 poços) |
| Água estéril | 50 mL | |||
| Laminin | Dia do revestimento | Laminina (1 mg / mL) | 80 μL | - Bastante para 8 poços em um prato de 24 poços - 0,35 mL / poço (placa de 24 poços) |
| Meio Neurobasal | 2,72 mL | |||
Tabela 2: Preparação dos substratos de revestimento utilizados para revestir os poços sobre os quais os neurônios são cultivados.
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Discussion
Esta técnica permite a cultura confiável dos neurônios da medula espinhal. Uma vez alcançada a proficiência na técnica, demora cerca de 3,5 h para completar. Nós conseguimos realizar o isolamento de neurônios de 2 camadas separadas (16 camundongos totais) em aproximadamente 4 h. O passo-chave na viabilidade é poder extrair com eficiência as cordas espinhais dos ratos. O rendimento permite revestir vários poços e a capacidade de testar os neurônios em várias condições. Nós conseguimos tratar os neurônios após a maturidade e avaliar de forma confiável a expressão da proteína usando análise de transferência de Western. Além disso, o uso de lâminas de vidro dentro dos poços para anexos de neurônios permite a análise de coloração adicional dos neurônios.
Este procedimento é vantajoso porque não requer tecido embrionário e a intensidade de trabalho associada. Além disso, não é necessário usar cordas espinhais adultas para coletar tecido suficiente para adequarE isolamento do neurônio. Isso evita o comportamento do composto do fator de idade na fisiologia dos neurônios, como visto com ratos adultos. No entanto, esta técnica não está sem limitações. Como mencionado anteriormente, os neurônios idosos são excluídos usando camundongos neonatais, e isso pode ser uma limitação se o comportamento e a biologia relacionados à idade for a área de investigação. Existe uma curva de aprendizado para o procedimento, que é necessário não só para otimizar o rendimento, mas para garantir que os neurônios isolados sejam saudáveis. A técnica de extração da medula espinhal pode levar algum tempo para dominar, especialmente com os camundongos recém-nascidos. Observamos que o tempo prolongado associado à extração da coluna vertebral leva a neurônios que podem ser cultivados durante um período significativamente mais curto. Isso é um pouco atenuado pela colocação dos neurônios no gelo; No entanto, o tempo ainda desempenha um papel fundamental.
Existem etapas importantes no procedimento que ajudam a garantir o melhor rendimento dos neurônios. Se o rendimento do neurônio não é como eXpected, algumas etapas devem ser avaliadas. Primeiro, o número de cordas espinhais deve ser idealmente superior a 4. Quando 3 cordas espinhais ou menos são usadas, o rendimento geralmente é inferior a 1 milhão de neurônios. Deve ser assegurada a preparação adequada do meio de digestão (passo 4.5). Deixar o tecido durante muito tempo no meio de digestão causará uma degradação excessiva das células, enquanto se usa meio de digestão que não foi ativado a 37 ° C resultará em menos neurônios isolados. Finalmente, a técnica de trituração (etapa 4.7) deve ser realizada com precisão. Os baixos rendimentos geralmente resultam de uma trituração inadequada. Um bom indicador é ver se a solução fica turva durante a trituração - se isso não acontecer, é provável que a trituração seja muito suave.
Se o rendimento for esperado, mas os neurônios não aparecem regenerar os processos nos primeiros 1-2 dias, o problema geralmente é uma falha no revestimento adequado, com lavagem inadequadaOu secagem (passo 2.2). Se as células inicialmente projetam processos, mas depois se tornam apoptóticas antes da marca de 5-7 dias, podem haver várias questões. Primeiro, assegure-se de que a solução HABG seja preparada dentro de 24 h de isolamento e que o suplemento B27 fresco que tenha sido descongelado no mesmo dia da preparação de HABG seja usado. Os antioxidantes deste suplemento precisam ser frescos e não expirados. Em seguida, assegure-se de que não são introduzidas bolhas durante o processo de trituração (etapa 4.7). A introdução de bolhas de ar contribui para esta questão e pode estar relacionada à secagem dos neurônios. Além disso, assegure-se de que a cultura não está sobrecarregada com a contaminação, o que pode ser atribuído a falhas na esterilidade.
Aqui, descrevemos o uso de placas de 24 poços sobre as quais semear os neurônios. Às vezes, é necessário realizar testes de tempo e / ou dosagem, como, por exemplo, quando se utilizam agentes farmacológicos. A técnica pode ser modificada e os neurônios podem ser semeados em 48 poEm vez disso. Uma vez que a área de superfície de um poço em uma placa de 48 poços é metade disso em uma placa de 24 poços, os volumes de soluções de revestimento utilizados devem ser cortados pela metade. As células também devem ser revestidas a metade do volume ( ou seja, 0,5 mL em vez de 1,0 mL). No entanto, a sua concentração deve permanecer a mesma ( ou seja, 1-5 x 10 5 células / mL). Embora este estudo tenha sido realizado usando camundongos C57BL / 6, a técnica deve ser aplicável em outras cepas manipuladas geneticamente.
A isquemia da medula espinhal e a proteção é uma área de crescente interesse 12 , 13 , 14 . Clinicamente, a cirurgia aórtica toracoabdominal pode resultar em paralisia devastadora relacionada à isquemia e reperfusão da medula espinhal, cuja fisiopatologia continua a ser completamente compreendida 15,16 . Entendendo como os neurônios respondemO estresse da isquemia é viável usando este modelo. Nosso grupo já publicou uma lesão neuronal da medula espinhal relacionada ao insulto isquêmico através da privação de oxigênio na glicose usando essa técnica 17 . O modelo também foi estendido para incluir a cultura dos astrócitos, separada dos neurônios 18 .
Em conclusão, esta técnica é valiosa para o estudo da fisiopatologia da medula espinhal e da microbiologia neuronal. A cultura sem soro permite um controle ambiental preciso. Permite acesso direto à aplicação de agentes farmacológicos. Combinado com técnicas adicionais, como a privação de glicose de oxigênio, esta técnica pode ser útil para expandir nossa compreensão da fisiopatologia da isquemia determinante da medula espinhal.
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Disclosures
Os autores não possuem divulgações.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
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