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Biochemistry

प्रोटीन फिल्म अवरक्त Electrochemistry एक [नाईफ] Hydrogenase द्वारा एच2 ऑक्सीकरण के अध्ययन के लिए प्रदर्शन किया

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक तकनीक का वर्णन, प्रोटीन फिल्म अवरक्त electrochemistry, जो एक कार्बन इलेक्ट्रोड पर प्रत्यक्ष विद्युत नियंत्रण के तहत मैटीरियल redox प्रोटीन spectroscopically अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है । एक प्रोटीन नमूने के अवरक्त स्पेक्ट्रा लागू संभावितों की एक श्रेणी में और समाधान की एक किस्म के तहत दर्ज किया जा सकता है ।

Abstract

redox प्रोटीन की रसायन विज्ञान को समझना तरीकों की मांग है कि प्रोटीन के भीतर redox केंद्रों पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं । प्रोटीन फिल्म electrochemistry की तकनीक, जिसमें एक प्रोटीन एक इलेक्ट्रोड सतह पर इस तरह है कि इलेक्ट्रोड शारीरिक इलेक्ट्रॉन दाताओं या स्वीकार करता है पर स्थिर है, अलग की एक सीमा के redox प्रतिक्रियाओं में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान की है प्रोटीन. पूर्ण रासायनिक समझ विद्युत नियंत्रण अंय तकनीकों है कि अतिरिक्त संरचनात्मक और यंत्रवत अंतर्दृष्टि जोड़ सकते है के साथ संयुक्त होना चाहिए । यहां हम एक तकनीक, प्रोटीन फिल्म अवरक्त electrochemistry, जो redox प्रोटीन के अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी नमूना के साथ प्रोटीन फिल्म electrochemistry को जोड़ती है प्रदर्शित करता है । तकनीक एक बहु प्रतिबिंब तनु कुल चिंतनशील ज्यामिति जांच एक redox एक उच्च सतह क्षेत्र कार्बन काले इलेक्ट्रोड पर मैटीरियल प्रोटीन का उपयोग करता है । एक प्रवाह सेल में इस इलेक्ट्रोड का निगमन समाधान पीएच या घुला हुआ सांद्रता माप के दौरान बदला जा करने के लिए अनुमति देता है. यह redox एंजाइमों को संबोधित करने में विशेष रूप से शक्तिशाली है, जहां तेजी से उत्प्रेरक कारोबार लगातार और इलेक्ट्रोड में लंबे समय से रहते थे स्पेक्ट्रोस्कोपी अवलोकन की अनुमति पर नियंत्रण कर सकते हैं उत्प्रेरक तंत्र में मध्यवर्ती प्रजातियों । हम कारोबार (एच2 ऑक्सीकरण) और गैर कारोबार की स्थिति के तहत ई. कोलाई hydrogenase 1 पर प्रयोगों के साथ तकनीक का प्रदर्शन ।

Introduction

प्रोटीन समारोह के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण चुनौती के विकास में शामिल है सीटू तरीकों कि प्रोटीन के प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति उनके शारीरिक भूमिकाओं बाहर ले जाने, या तो vivo में या अलग प्रोटीन नमूने का उपयोग कर । इस नियंत्रण के एकीकरण या प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और संयुक्त तकनीक है कि दोनों जेट का मूल्यांकन करने की अनुमति के उपयोग में प्रक्रियाओं को ट्रिगर की आवश्यकता है, और प्रोटीन समारोह के दौरान व्यक्तिगत रासायनिक कदम मापा जा करने के लिए, एक साथ । redox प्रोटीन के मामले में यह अक्सर विद्युत तकनीक है, जो ठीक लागू की क्षमता को नियंत्रित करने के लिए समानता है, लेकिन कोई सीधे रासायनिक जानकारी प्रदान स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि रासायनिक विशेष के प्रति संवेदनशील है के साथ प्रोटीन फंक्शन से जुड़े बदलाव । 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry युग्मित विद्युत और स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों की एक श्रृंखला के लिए एक सामांय शब्द है कि स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों और विद्युत नियंत्रण के स्तर की एक किस्म शामिल है । कई प्रोटीन कृत्रिम, घुलनशील इलेक्ट्रॉन दाताओं और स्वीकार करने वालों के साथ इलेक्ट्रॉनों विनिमय कर सकते हैं और इस अध्ययन में शोषण किया गया है जो छोटे अणुओं का उपयोग करने के लिए मध्यस्थता इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण, यूवी के साथ युग्मन सहित दिखाई,4,5 , , 7 चुंबकीय परिपत्र dichroism8 और अवरक्त5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies । मामलों की एक सीमित संख्या में यह संभव साबित कर दिया है करने के लिए मध्यस्थ का दोहन, प्रसार नियंत्रित इलेक्ट्रॉन विनिमय प्रोटीन और इलेक्ट्रोड के बीच. 15 , 16

उत्प्रेरक redox एंजाइमों द्वारा किए गए प्रतिक्रियाओं के लिए, समाधान electrochemistry एक स्पष्ट नुकसान मौजूद दृष्टिकोण । समाधान में redox मध्यस्थों के माध्यम से प्रसार-नियंत्रित इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण दर सीमित बनने की संभावना है. एंजाइम के बारे में काइनेटिक और यंत्रवत जानकारी खो दिया जा सकता है, या प्रयोगात्मक पद्धति से उत्पन्न प्रसार कलाकृतियों से deconvolute करने के लिए कम मुश्किल हो. प्रत्यक्ष, मध्यस्थ विद्युत नियंत्रण इसलिए redox प्रोटीन और एंजाइमों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । प्रोटीन फिल्म electrochemistry की तकनीक (PFE) इलेक्ट्रोड-मैटीरियल redox प्रोटीन को रोजगार, इस तरह से है कि इलेक्ट्रॉनों के लिए सीधे स्थानांतरित कर रहे है या प्रोटीन के भीतर redox cofactors से इलेक्ट्रोड के रूप में संभावितों की एक श्रृंखला में ध्रुवीकरण है । 17 , 18 , 19 PFE ऑक्सीकरण या कमी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए विशेष मूल्य के है catalyzed redox एंजाइमों द्वारा, के रूप में चेहरे की इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण एक बहुत ही उच्च दर से प्राप्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, निकल-लौह की electrocatalytic टर्नओवर दर ([नाईफ]) hydrogenase से Allochromatium vinosum सीए १,०००-१०,००० एस− 1 के लिए एच2 ऑक्सीकरण के रूप में PFE द्वारा मापा गया था । 20 catalysis को चालू करने के लिए एक ट्रिगर के रूप में इलेक्ट्रोड संभावित कार्य करता है ' या ' बंद ', और एंजाइम गतिविधि पर electrocatalytic वर्तमान रिपोर्ट । PFE इसलिए जटिल एंजाइमों की प्रतिक्रियाशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है कि क्षमता पर अच्छी तरह से निर्भर करते हैं, जैसे डि-आयरन सक्रिय साइट की प्रतिक्रियाओं के रूप में [FeFe]-hydrogenases के साथ सह और हे2,21 या संभावित प्रेरित hydrogenases,22 कार्बन मोनोऑक्साइड डिहाइड्रोजनेज,23 और अंय जटिल redox एंजाइमों की निष्क्रियता प्रतिक्रियाओं । 24

PFE द्वारा afforded प्रत्यक्ष विद्युत नियंत्रण के साथ स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक के संयोजन के लिए प्रमुख बाधा redox एंजाइमों की कम सतह कवरेज से उठता है, 1-2 के आदेश पर pmol सेमी-2 [नाईफ] hydrogenase से ए. vinosumके लिए, 20 के सापेक्ष सीटू भूतल विज्ञान अध्ययन में थोक धातु इलेक्ट्रोड पर छोटे अणु adsorbates की. यह स्पेक्ट्रोस्कोपी माप की संवेदनशीलता के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है । कई spectroelectrochemical तरीकों विभिन्न इलेक्ट्रोड की एक सीमा पर अध्ययन मैटीरियल redox प्रोटीन के लिए सूचित किया गया है: पारदर्शी धातु ऑक्साइड इलेक्ट्रोड पर यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी; 25 , 26 , 27 प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी पर गोल्ड इलेक्ट्रोड; 28 , 29 सतह बढ़ाया अवरक्त अवशोषण (SEIRA) गोल्ड इलेक्ट्रोड पर स्पेक्ट्रोस्कोपी; 30 , 31 , ३२ , ३३ और सतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक, रजत इलेक्ट्रोड पर प्रमुख । ३४ , ३५

यहां हम आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ युग्मन PFE के लिए एक विधि का वर्णन, एक प्रोटीन फिल्म अवरक्त electrochemistry (PFIRE) के रूप में जाना जाता तकनीक में । ३६ PFIRE विधि अध्ययन redox एंजाइमों एक उच्च सतह क्षेत्र कार्बन काम इलेक्ट्रोड एक तनु कुल चिंतनशील ir (एटीआर-IR) ज्यामिति के साथ संयोजन के रूप में पर मैटीरियल, कार्बन सतहों पर प्रोटीन की एक सीमा के सोखना की आसानी से शोषण । IR स्पेक्ट्रोस्कोपी redox एंजाइमों और कई छोटे अणुओं के रूप में प्रोटीन के अध्ययन में उपयोगी है, लाइगैंडों और cofactors नैदानिक absorbances कि जेट, बाध्यकारी, निषेध और redox राज्य का आकलन किया जा सकता है । उदाहरणों में लौह-सल्फर केन्द्रों,३७ के अध्ययन के लिए flavoproteins,३८,३९,४० छोटे अणु बाध्यकारी षयवस्तु केन्द्रों आदिका बंधन शामिल है. ४१ एटीआर-IR ज्यामिति एक अनुकूलित तीन इलेक्ट्रोड (spectro) विद्युत सेल४२ के निर्माण की अनुमति देता है और इसलिए उत्कृष्ट विद्युत नियंत्रण प्रदान करता है । समाधान प्रतिरोध और संभावित बहाव एक संदर्भ इलेक्ट्रोड काम इलेक्ट्रोड के पास रखने के द्वारा कम कर रहे हैं. उच्च सतह क्षेत्र काउंटर इलेक्ट्रोड उपयोग किया जाता है कि उच्च electrocatalytic काम इलेक्ट्रोड पर तेजी से एंजाइम कारोबार द्वारा उत्पादित धाराओं के साथ संगत कर रहे हैं । spectroelectrochemical सेल के माध्यम से समाधान के प्रवाह सब्सट्रेट, अवरोधकों और पीएच की एकाग्रता पर सतही नियंत्रण की अनुमति देता है । ३६ , ४३ , ४४ PFIRE विधि इसलिए आईआर स्पेक्ट्रा निरंतर एंजाइम electrocatalysis के दौरान सीटू में दर्ज किया जा करने की अनुमति देता है. ३६ , ४४ PFIRE भी उत्प्रेरक वर्तमान,४३ PFE के विपरीत में रासायनिक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है, जहां यह गैर से जानकारी निकालने के लिए मुश्किल हो सकता है redox एंजाइमों में उत्प्रेरक प्रक्रियाओं । ४५ , ४६

हम [नाईफ] hydrogenases द्वारा electrocatalytic एच2 ऑक्सीकरण के अध्ययन के लिए PFIRE विधि का प्रदर्शन किया है, जो आंतरिक सहयोग और CN लाइगैंडों एक द्विधात्विक सक्रिय साइट पर Fe के लिए समंवित होते हैं । ३६ , ४३ , ४४ [नाईफ] hydrogenases इसलिए PFIRE द्वारा अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं । PFIRE विधि प्रजातियों कि स्थिर राज्य के कारोबार के दौरान मौजूद है के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और इसलिए प्रयोगात्मक नियंत्रण के बिना hydrogenases के आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी पर साहित्य के धन के अलावा महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कारोबार खत्म । ४७ , ४८ डायर और सह-कार्यकर्ताओं ने नाईफ hydrogenases,४९,५०,५१ का अध्ययन करने के लिए या तो एक छोटे नकारात्मक संभावित कदम (द्वारा उपयोग केमाध्यम से लागू करने के लिए एक प्रकाश ट्रिगर का उपयोग करते हुए समय-समाधान आईआर तरीकों को नियोजित किया है समाधान मध्यस्थों की और एक ' पिंजरा ' इलेक्ट्रॉन स्रोत) या photolyse एक बाध्य hydride । हालांकि PFIRE विधि नहीं कर सकते, वर्तमान में, इन माप से मेल करने के लिए समय समाधान प्रदान करते हैं,४० यह दोनों पुन: प्रारंभात्मक और oxidative उत्प्रेरक प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति है, अच्छी तरह से परिभाषित क्षमता और बड़े पैमाने पर परिवहन से मुक्त की एक सीमा पर पहुंचा सीमाओं.

PFIRE विधि redox प्रोटीन, जो भी एक एटीआर-IR ज्यामिति का उपयोग करें और इलेक्ट्रोड सतह पर roughened अणुओं की IR अवशोषण को बढ़ाने के लिए एक नेनो-adsorbed धातु इलेक्ट्रोड को रोजगार के SEIRA अध्ययन से अलग है । 30 SEIRA झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत मूल्यवान तकनीक है, विशेष रूप से adsorbed में या करनेवाला झिल्ली आर्किटेक्चर के भीतर,३२ लेकिन एक धातु इलेक्ट्रोड के लिए की जरूरत सब्सट्रेट और अवरोधक गुंजाइश जेट की वजह से सीमित कर सकते हैं इलेक्ट्रोड के छोटे अणुओं के प्रति समर्थन जैसे co, CN-,2 आदि । प्रोटॉन कमी और स्वयं इकट्ठे monolayer desorption धातु पर समस्याग्रस्त किया जा सकता है बहुत नकारात्मक क्षमता पर सतहों,1,५२ हालांकि असुरक्षित धातु इलेक्ट्रोड पर एंजाइम electrocatalysis बताया गया है । ५३ , ५४ SEIRA के सापेक्ष PFIRE का एक नुकसान देशी या करनेवाला झिल्ली आर्किटेक्चर में झिल्ली प्रोटीन को शामिल करने के सापेक्ष कठिनाई है । हालांकि, कार्बन इलेक्ट्रोड के सापेक्ष रासायनिक निष्क्रियता छोटे अणु सक्रियकरण प्रतिक्रियाओं प्रतिस्पर्धा करने के लिए बनाता है PFIRE एंजाइम electrocatalysis का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक, विशेष रूप से कम क्षमता जैविक redox के लिए प्रासंगिक डोमेन में ऐसे hydrogenases द्वारा प्रोटॉन कमी के रूप में प्रक्रियाओं । 1 , ४३

इस लेख का उद्देश्य इलेक्ट्रोड मैटीरियल redox प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक के रूप में PFIRE विधि शुरू करना है, जिसका उपयोग नाईफ hydrogenase 1 (Hyd1) से एक उदाहरण के रूप में ई कोलाई के लिए होता है । नमूना तैयारी के विचार, अच्छा सब्सट्रेट प्रवाह के लिए आवश्यकता है, और डेटा हैंडलिंग पर चर्चा कर रहे हैं. PFIRE एक मोटे तौर पर लागू तकनीक है, अच्छी तरह से किसी भी redox प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूल (विशेषता आईआर absorbances के साथ) कि कार्बन इलेक्ट्रोड पर adsorbed जा सकता है, या तो सीधे या सतह संशोधन का उपयोग, इस तरह कि यह के साथ इलेक्ट्रॉनों विनिमय कर सकते हैं इलेक्ट्रोड.

Protocol

1. एक Anaerobic, सूखी Glovebox और सामांय प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अंदर एक स्विचेज स्पेक्ट्रोमीटर के आंतरिक नमूना डिब्बे पुनः बनाना

  1. एक बाहरी पारा कैडमियम telluride (MCT) डिटेक्टर और एटीआर गौण से सुसज्जित एक वाणिज्यिक स्विचेज स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें । सूखी हवा या dinitrogen के साथ स्पेक्ट्रोमीटर के शरीर को शुद्ध करना, या वैकल्पिक रूप से एक खाली ऑप्टिकल बेंच के साथ एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें ।
  2. स्पेक्ट्रोमीटर को एक स्थिर, कंपन-मुक्त तालिका पर एक anaerobic (< 1 पीपीएम O2), शुष्क (ओस बिंदु <-७५ ° c) glovebox के रूप में समान ऊंचाई पर रखें । glovebox में स्पेक्ट्रोमीटर की ir बीम को डायवर्ट करें, एक ir पारदर्शी विंडो के माध्यम से, जो फ़ोकस की गई बीम को समायोजित करने के लिए काफी बड़ी है ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि glovebox और स्पेक्ट्रोमीटर के बीच की रिक्ति भी पर्ज या खाली है, विशेष रूप से यदि कोई hygroscopic विंडो सामग्री, जैसे NaCl या एसएमआर उदाहरण के लिए, उपयोग किया जाता है ।
  3. glovebox के अंदर स्पेक्ट्रोमीटर के आंतरिक नमूना डिब्बे की प्रतिकृति ।
    1. glovebox के अंदर बीम एक बंद अक्ष ellipsoidal दर्पण पर प्रत्यक्ष, आदर्श के रूप में एक ही फोकल लंबाई के साथ स्पेक्ट्रोमीटर के आंतरिक दर्पण ध्यान केंद्रित ।
      नोट: यह दो अतिरिक्त विमान इस ध्यान केंद्रित दर्पण से पहले रखा दर्पण उपयोगी है, ताकि दोनों ऊंचाई और IR बीम की दिशा glovebox अंदर समायोजित करने की अनुमति देने के लिए; यह स्पेक्ट्रोमीटर के प्रारंभिक स्थान में किसी भी अशुद्धि भरपाई करेगा ।
    2. प्लेस एक बाहरी MCT डिटेक्टर, एक उपयुक्त ऑप्टिक ध्यान केंद्रित (जैसे एक छोटे फोकल लंबाई ZnSe लेंस, या बंद के रूप में धुरी अणुवृत्त दर्पण, एक छोटी फोकल लंबाई के साथ) के साथ पूरा glovebox अंदर, जैसे आंतरिक नमूने के आयामों को दोहराने के लिए तैनात स्पेक्ट्रोमीटर के डिब्बे ।
    3. focusing दर्पण और MCT डिटेक्टर के बीच लगभग equidistant होने के लिए IR बीम का ' ध्यान ' समायोजित करें ।
  4. एक्सटर्नल MCT डिटेक्टर के देवर को लिक्विड नाइट्रोजन के साथ ठंडा कर लीजिये.
  5. glovebox नमूना डिब्बे में एटीआर गौण माउंट । इनपुट और आउटपुट प्रकाशिकी और एटीआर गौण MCT डिटेक्टर के लिए अधिकतम प्रवाह को प्राप्त करने के लिए ध्यान केंद्रित संरेखित करें । यदि आवश्यक हो, एक एपर्चर या अन्य उपयुक्त क्षीणन (जैसे एक तार ग्रिड के रूप में) का उपयोग करने के लिए डिटेक्टर संकेत के संतृप्ति को रोकने.
    नोट: यहां प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, एक पांच प्रतिबिंब सभी चिंतनशील प्रकाशिकी और एक हटाने योग्य trapezoidal Si आंतरिक प्रतिबिंब तत्व (गुस्सा) के साथ सहायक एटीआर का प्रयोग किया जाता है (क्रिस्टल GmbH, आयाम ca 5 × 8 × 1 मिमी3, चेहरा कोण ३९.५ °) । गुस्सा एक हटाने योग्य polyether ईथर कीटोंन (तिरछी नज़र) से machined baseplate में बढ़ रहा है ।
  6. एक glovebox का प्रयोग करें उपयुक्त feedthroughs के साथ recreated नमूना डिब्बे घर के लिए एक बाह्य घर potentiostat (गैस तंग BNC कनेक्शन इस प्रयोजन के लिए उपयोगी होते हैं) के लिए कनेक्शन की अनुमति, गैस का उपयोग, और केबल (ओं) MCT से संकेत हस्तांतरण करने के लिए डिटेक्टर. यह डिटेक्टर केबल पर किसी भी परिरक्षण बनाए रखने के लिए शोर या माप के लिए हस्तक्षेप शुरू करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
  7. प्लेस एक सिकुड़नेवाला पंप, प्रवाह ६० मिलीलीटर से अधिक की दर में सक्षम/glovebox के अंदर मिनट । स्पेक्ट्रोमीटर, एटीआर गौण, सिकुड़नेवाला पम्प और potentiostat सेटअप का एक योजनाबद्ध दृश्य चित्रा 1में दिखाया गया है ।
  8. एक spectroelectrochemical कक्ष का निर्माण करें, जैसे कि चित्रा 2में योजनाबद्ध रूप से दिखाया गया है, कि एटीआर गौण पर जवानों. सेल एक उच्च सतह क्षेत्र काउंटर इलेक्ट्रोड (पीटी तार या धुंध), काम इलेक्ट्रोड (कार्बन रॉड) और एक लघु संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए एक कनेक्शन शामिल होना चाहिए. सेल के माध्यम से सेल के माध्यम से समाधान के तेजी से प्रवाह के लिए प्रवेश और आउटलेट के रूप में कम से कम दो बंदरगाहों शामिल होना चाहिए ।
    नोट: एक लघु संतृप्त calomel संदर्भ इलेक्ट्रोड इस प्रयोजन के लिए आदर्श है । ३६

2. कार्बन काले कणों की तैयारी ई. कोलाई Hydrogenase 1 के साथ संशोधित

  1. एक ' गीला ' anaerobic glovebox में, मिश्रण 20 उच्च सतह क्षेत्र कार्बन काले कणों की मिलीग्राम (> 1, 000 एम3/g) के साथ 1 मिलीलीटर ultrahigh शुद्धता पानी (प्रतिरोधकता > 18 MΩ सेमी) एक microcentrifuge ट्यूब में । कम के लिए कम शक्ति sonication (< 100 W) द्वारा कणों को तितर-बितर, या जब तक फैलाव एक समान है और 1 घंटे के भीतर तलछट नहीं है, लगभग 20 मिलीग्राम/एमएल की एक लोडिंग के साथ एक कार्बन काले फैलाव देने के लिए ।
  2. ई. कोलाई hydrogenase 1 के एक aliquot ले लो (Hyd1, लगभग ५० µ एल, एक प्रकाशित प्रक्रिया के अनुसार तैयार५५) के एक एकाग्रता में ~ 7 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल और यह एक कम ईओण ताकत बफर में विनिमय isoelectric बिंदु के पास एक पीएच पर (के लिए उदाहरण पोटेशियम फॉस्फेट, 15 मिमी, पीएच ५.८, कोई अतिरिक्त नमक). सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, एक एंजाइम तैयारी है कि जितना संभव हो सक्रिय का उपयोग करें । एकाग्रता और कमजोर पड़ने से बफर एक्सचेंज प्रदर्शन, एक केंद्रापसारक फिल्टर डिवाइस में एक उपयुक्त आणविक वजन cutoff के साथ (५० केडीए के लिए अच्छी तरह से काम करता है के लिए Hyd1).
    1. फ़िल्टर डिवाइस के लिए Hyd1 जोड़ें ।
    2. एक्सचेंज बफर के लगभग ४५० µ एल के साथ पतला ।
    3. अपरिवर्तनीय वर्षा को रोकने के लिए हल्के केंद्रापसारक (< ~ २७०० × g) का उपयोग करके ५० µ l की मात्रा पर ध्यान दें ।
    4. दोहराएँ चरण -8 और बफर एक्सचेंज पूरा होने तक 2.2.3 (आम तौर पर ~ 5 चक्र के भीतर).
  3. मिश्रण एक 5 µ एल की मात्रा 20 मिलीग्राम/एमएल कार्बन काले फैलाव (२.१ में तैयार) के साथ ५० µ एल aliquot के बफर-विमर्श Hyd1 । एक रेफ्रिजरेटर में एंजाइम कण मिश्रण स्टोर (0 डिग्री सेल्सियस) रात भर में adsorb के लिए एंजाइम की अनुमति । यह आवश्यक हो सकता है मिश्रण मिलाने के लिए कणों को फैलाया रहना सुनिश्चित करने के लिए कभी कभार ।
  4. Hyd1-कम ईओण ताकत बफर (पोटेशियम फॉस्फेट, 15 मिमी, पीएच ५.८, कोई अतिरिक्त नमक) के साथ लगातार अवसादन और फिर से एक microcentrifuge में फैलाव चक्र (~ २,७०० × g)) के साथ संशोधित कणों धो लें । गैर-adsorbed एंजाइम को निकालने के लिए 3-5 बार इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    नोट: पहले धोने supernatant वस्तुतः बेरंग होना चाहिए, एंजाइम के अच्छे सोखना का संकेत है ।
  5. ~ 5 µ एल के एक अंतिम मात्रा के कणों ध्यान केंद्रित, के लिए एक अंतिम लोड देने ~ 20 मिलीग्राम/
    नोट: Hyd1-संशोधित कणों को दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है अगर वे हाइड्रेटेड रहना; यह सबसे अच्छा ultrahigh शुद्धता पानी के ~ ५० µ एल के साथ पतला कणों भंडारण द्वारा हासिल की है ।

3. ई. कोलाई Hydrogenase 1 पर PFIRE माप के लिए तैयारी

  1. कम चालित sonication (< १०० w), में पहले H2तो4 (< ९०% w/w) के लिए ~ 15 मिनट, और उसके बाद िनॉ3 (७०% w/) में 1 hr तक Si गुस्सा साफ़ करें । यह सफाई प्रक्रिया एक हाइड्रोफिलिक गुस्सा सतह के लिए नेतृत्व करना चाहिए । यदि आगे सफाई की आवश्यकता है गुस्सा पिरांहा समाधान में रखा जा सकता है (एच2हे2के 1:3 अनुपात: एच2तो4) किसी भी शेष कार्बनिक सामग्री ऑक्सीकरण करने के लिए ।
    नोट: कठोर अंलीय सफाई तरीकों सभी क्रोध सामग्री के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । पिरांहा समाधान उच्च संक्षारक और एक मजबूत ऑक्सीडेंट है, सतहों पिरांहा समाधान और देखभाल के उपयोग से पहले काफी साफ किया जाना चाहिए तैयारी और पिरांहा समाधान के उपयोग की प्रक्रिया के अमबर प्रकृति के कारण के दौरान लिया जाना चाहिए-हमेशा एच2O जोड़ें 2 धीरे से एच2तो4 और तैयारी, उपयोग और निपटान के लिए उपयुक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं को देखें ।
  2. ultrahigh शुद्धता पानी में साफ गुस्सा कुल्ला, और सूखी नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत सूखी । संक्रमण से बचने के लिए साफ चिमटी का उपयोग कर सभी चश्मे हैंडलिंग बाहर ले ।
  3. एटीआर गौण विद्युत ग्रेड सिलिकॉन सीलेंट की एक पतली पट्टी का उपयोग कर baseplate में गुस्सा सील । ध्यान रखना गुस्सा के किनारों को सीलेंट को सीमित करने के लिए । सीलेंट को पूरी तरह से सूखने दें ।
  4. स्पेक्ट्रोमीटर glovebox के लिए एटीआर गौण baseplate हस्तांतरण और यह एटीआर गौण पर माउंट । स्पेक्ट्रोमीटर और १०२४ औसत interferograms (माप समय ~ 3-5 मिनट) के मानक रैपिड स्कैन मोड का उपयोग कर, 4सेमी -1 संकल्प पर ४०००-१,०००सेमी -1 के बीच एक संदर्भ (पृष्ठभूमि) स्पेक्ट्रम को मापने. प्रयोग में बाद में अवशोषित स्पेक्ट्रा की गणना की अनुमति देने के लिए एक इनपुट के रूप में इस स्पेक्ट्रम का प्रयोग करें ।
    नोट: छोटे Hyd1 सक्रिय साइट यह शोर अनुपात के लिए उच्च संकेत के साथ स्पेक्ट्रा इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है के लिए उम्मीद अवशोषक के कारण.
  5. एटीआर गौण baseplate ' गीला ' glovebox जो पूर्व तैयार Hyd1-संशोधित कण फैलाव (खंड 2) शामिल है स्थानांतरण । ड्रॉप-गुस्सा के बड़े चेहरे पर कण फैलाव के एक 1 µ l aliquot कास्ट, और उंहें समान रूप से सतह भर में फैल गया । नोट: कणों को गुस्सा पर पूरी तरह से शुष्क हो जाने की अनुमति नहीं है ।
  6. इस तरह के रूप में है कि ईंधन की कोशिकाओं में गैस प्रसार परत सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया कार्बन कागज का एक टुकड़ा काट, एक आकार ~ ०.१ (गुस्सा की सतह आयामों से छोटे मिमी (अर्थात सीए ८.२ × ४.९ mm2) । कार्बन कागज की सतह क्षेत्र के लिए काफी बड़ी को छोड़-कास्ट Hyd1 संशोधित कणों को कवर किया जाना चाहिए, लेकिन इतना बड़ा नहीं के रूप में सिलिकॉन को गुस्सा सुरक्षित इस्तेमाल सीलेंट ओवरलैप । पानी में कार्बन कागज सोख, और धीरे यह कण फिल्म के शीर्ष पर जगह है । कार्बन कागज पूरे कण फिल्म भर में एक अच्छा बिजली कनेक्शन प्रदान करेगा ।
    नोट: यह पहले से कार्बन पेपर के कई टुकड़े तैयार करने के लिए फायदेमंद है, और उन्हें ' गीला ' anaerobic glovebox के अंदर ultrahigh शुद्धता पानी में भिगो पूर्व की दुकान.
  7. spectroelectrochemical सेल माउंट (१.७ में वर्णित है और इस गुस्सा पर चित्रा 2) में योजनाबद्ध ढंग से दिखाया गया है, यह शिकंजा के साथ baseplate में सुरक्षित । जोड़ें ~ २०० प्रयोगात्मक बफर के µ एल एंजाइम हाइड्रेटेड रखने के लिए । एक मिश्रित बफ़र सिस्टम, एक व्यापक पीएच रेंज पर बफर करने में सक्षम, नाईफ hydrogenases पर अध्ययन के लिए उपयोगी है:५६ सोडियम एसीटेट, 2-[N'-morpholino] एतान-sulfonic एसिड (एमईएस), एन'-[2-hydroxyethyl] पिपेराजीन-n' -[2-एतानि-sulfonic अम्ल] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] मिथाइल-3-एमिनो-प्रोपेन-sulfonic एसिड (नल), और 2-[N'-cyclohexylamino] एतान-sulfonic एसिड (केएस), 15 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक घटक के साथ और इलेक्ट्रोलाइट का समर्थन के रूप में ०.१ मीटर NaCl युक्त, पीएच के साथ ध्यान केंद्रित NaOH और एचसीएल का उपयोग कर पीएच 6 के लिए समायोजित ।
    नोट: काम इलेक्ट्रोड कनेक्शन थोड़ा कार्बन पेपर (चित्रा 2) के लिए अच्छा इलेक्ट्रॉनिक कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए spectroelectrochemical सेल शीर्ष (~ ०.१ मिमी) के विमान के नीचे फैला होना चाहिए ।
  8. समाधान प्रवेश और spectroelectrochemical सेल के आउटलेट एक प्रवाह सिकुड़नेवाला पंप टयूबिंग युक्त प्रणाली और प्रयोगात्मक बफर की एक शीशी से कनेक्ट करें । इकट्ठे सेल ' सूखी ' स्पेक्ट्रोमीटर युक्त glovebox के लिए स्थानांतरण ।
  9. एटीआर गौण पर spectroelectrochemical सेल विधानसभा माउंट । कार्य, काउंटर और संदर्भ इलेक्ट्रोड potentiostat करने के लिए कनेक्ट करें । पंप करने के लिए सिकुड़नेवाला पंप टयूबिंग कनेक्ट ।
  10. ४,०००-१,००० cm-1की एक वर्णक्रमीय सीमा से अधिक 4 सेमी-1 संकल्प पर १०२४ औसत interferograms के साथ एक अवशोषक स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड, एक संदर्भ के रूप में ३.४ में एकत्र स्पेक्ट्रम का उपयोग/ इस बिंदु पर स्पेक्ट्रम महत्वपूर्ण शामिल होना चाहिए (> 100 मो । डी.) में द्वितीय बैंड के बीच ~ १,५४० cm-1 और Hyd1 के सक्रिय साइट बैंड वर्णक्रमीय क्षेत्र १,८५० में स्पष्ट किया जाना चाहिए-२,१५० सेमी-1, मोटे तौर पर ऑक्सीकरण, निष्क्रिय राज्यों में (चित्रा 3 ).

4. ई. कोलाई Hydrogenase 1 के सक्रियकरण और Spectroelectrochemical सेल परीक्षण

  1. Hyd1-संशोधित कण फिल्म के लिए एक कम करने की क्षमता (− ०.८ V vs SCE) लागू करें । H2 और प्रवाह बफ़र के साथ प्रायोगिक बफ़र धीरे spectroelectrochemical कक्ष के माध्यम से संतृप्त । पूरी तरह से Hyd1 को सक्रिय करने के लिए नमूना रात भर छोड़ दें ।
    नोट: यह anaerobic एच2, एन2 आदिका उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए सभी anaerobic गैसों एक ओ2 फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए ।
  2. सक्रियण के बाद नमूने का एक अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड. सक्रिय साइट के νCO और vCN बैंड अब कम, ' सक्रिय ' राज्यों का वितरण दिखाना चाहिए । यह सबसे आसानी से एक अंतर स्पेक्ट्रम के उपयोग के माध्यम से मनाया जाता है, ३.१० (चित्रा 4) में दर्ज स्पेक्ट्रम के सापेक्ष.
  3. spectroelectrochemical सेल के इलेक्ट्रिकल कनेक्शन का टेस्ट कराएं । ऐसा करने के लिए, N2 गैस के साथ प्रयोगात्मक बफर संतृप्त । ऑक्सीकरण का एक अनुक्रम लागू करें (0 वी बनाम SCE) और कम करने (− ०.८ वी बनाम SCE) संभावितों ( ca 30 मिनट की अवधि के) Hyd1-संशोधित कण फिल्म के लिए, और प्रत्येक पर एक अवशोषक स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड । Hyd1 तेजी से ऑक्सीकरण और कम हो जाना चाहिए, और अगर कण फिल्म अच्छी तरह से नमूना का १००% जुड़ा हुआ है लागू की गई क्षमता का जवाब देना चाहिए ।
  4. प्रयोगात्मक बफ़र की एक उपयुक्त प्रवाह दर सेट करें । ऐसा करने के लिए, नमूने को कम करने की क्षमता (− ०.८ V vs SCE) लागू करें, और H2के साथ प्रायोगिक बफ़र को संतृप्त करें । रिकॉर्ड के बीच चक्रीय voltammograms की एक श्रृंखला-०.७०७-०.०३९ V vs SCE 10 एमवी की दर से/धीरे-voltammograms के बीच एच2संतृप्त बफर के प्रवाह की दर में वृद्धि जब तक उत्प्रेरक waveshape जैसा दिखता है कि एक planar घूर्णन पर डिस्क इलेक्ट्रोड५५ और अधिकतम वर्तमान प्रवाह दर (चित्र 5) के स्वतंत्र है ।
    नोट: पानी में एच2 की घुलनशीलता सीमा २९३ K और 1 बार में ~ ०.८ mM है ।
  5. के रूप में नमूना अब PFIRE माप के लिए तैयार है, क्षमता की एक सीमा पर स्पेक्ट्रा इकट्ठा, समाधान की स्थिति की एक श्रृंखला के तहत (पीएच, तापमान, एच2 एकाग्रता आदि). potentiostat सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सभी विद्युत डेटा रिकॉर्ड करें क्योंकि स्पेक्ट्रोस्कोपी और विद्युत डेटा को सहसंबंधित करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है, खासकर जब electrocatalytic द्वारा एच2 ऑक्सीकरण जैसे Hyd1 प्रक्रियाओं का अध्ययन करना ।

5. स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा हैंडलिंग

  1. इस बात की पुष्टि करें कि प्रयोग के अंत में 0 v और − ०.८ v vs SCE पर स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करके माप के दौरान सक्रिय साइट को स्थाई रूप से परिवर्तित नहीं किया गया है । ये ४.३ में दर्ज स्पेक्ट्रा के समरूप होना चाहिए, और माप के दौरान सक्रिय साइट का कोई नुकसान नहीं होना चाहिए (चित्र 6) ।
  2. स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर से एक उपयुक्त प्रारूप में (. csv, ASCII, ' matlab ', Jcamp आदि) जैसे मूल या matlab सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रसंस्करण के लिए पूर्ण अवशोषक स्पेक्ट्रा निर्यात.
  3. आधारभूत डेटा सही है, जो चित्र 7में सचित्र प्रक्रिया का उपयोग कर रहा है ।
    1. उच्च घुमावदार पानी की पृष्ठभूमि के खिलाफ छोटे (< 1 मो. घ.) सक्रिय साइट बैंड की पहचान करने के क्रम में १,८००-२,१५० सेमी-1, रेंज में प्रत्येक अवशोषक स्पेक्ट्रम के दूसरे व्युत्पंन ले ।
    2. मूल अवशोषक स्पेक्ट्रम पर आधारभूत मार्कर अंक प्लेस, और प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रम के लिए ' स्नैप ' करने के लिए अंक निर्धारित किया है ।
    3. एक दुओं घन पट्टी समारोह या एक बहुपद समारोह का उपयोग कर अंक के माध्यम से एक आधार रेखा फिट । इस आधार रेखा फ़ंक्शन को प्रायोगिक डेटा से घटाना ।

Representative Results

चित्रा 1 स्पेक्ट्रोमीटर, glovebox, एटीआर गौण, potentiostat और PFIRE माप के लिए इस्तेमाल किया गैस प्रवाह प्रणाली की प्रयोगात्मक व्यवस्था का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है. चित्रा 2 spectroelectrochemical सेल के एक प्रतिनिधि ड्राइंग से पता चलता है.

चित्रा 3 ड्रॉप-कास्ट Hyd1-संशोधित कणों के अवशोषक स्पेक्ट्रा को दिखाता है, प्रायोगिक बफर के साथ (एक मिश्रित बफर सिस्टम, ३.७ में वर्णित, पीएच ६.०) spectroelectrochemical सेल के माध्यम से बह रहा है । Hyd1 की सतह कवरेज के उदाहरण में विशेष रूप से उच्च है चित्रा 3में दिखाया गया है, एक के बीच द्वितीय बैंड तीव्रता के साथ ~ २३५ मो. डी. और कम ' थोक ' के रूप में ओ-H खींच क्षेत्र की भयावहता का सबूत (~ ३,०००-३,६०० cm-1) पर बैंड के सापेक्ष ~ १,६४० cm-1, जो Hyd1 के छुटकारे I बैंड का एक कनवल्शनफ़िल्टर्स है और पानी h-O-h बेंड है । अतिरिक्त बैंड प्रोटीन के कारण सी-एच खींच क्षेत्र में देखा जा सकता है (ca २९०० cm-1) । ब्रॉड २,१०० सेमी के आसपास केंद्रित बैंड-1 कम ऊर्जा libration बैंड का एक सेट है, जो एच2हे अणुओं के कारण तरल पानी में हाइड्रोजन बंधन नेटवर्क के rotations प्रतिबंधित कर रहे है के साथ एच-ओ-एच झुकने कंपन का एक संयोजन बैंड है । νसह बैंड के ऑक्सीकरण, निष्क्रिय, सक्रिय साइट के Ni-B राज्य १,९४३ सेमी-1पर स्पष्ट रूप से स्पष्ट है, यहां तक कि आधारभूत सुधार के बिना, और νCN सुविधाओं के बीच स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे है 2050-2100 सेमी-1 . उच्च Hyd1 कवरेज पर, कार्बन ब्लैक फिल्म की सूक्ष्मदर्शी संरचना के बहुत५७ एंजाइम द्वारा अवरुद्ध हो जाता है और इसलिए ' थोक ' पानी एकाग्रता PFIRE माप के दौरान कम है ।

चित्रा 3 में स्पेक्ट्रा पता चलता है कि, सक्रियण से पहले, Hyd1 फिल्मों में ऑक्सीकरण, निष्क्रिय राज्यों में Hyd1 होते हैं । एक एच2 वातावरण के तहत SCE बनाम पर रात भर सक्रियण, कम, उत्प्रेरक सक्रिय राज्यों के रूप में चित्रा 4 जो एक सक्रिय (कम) ऋण के रूप में तैयार (ऑक्सीकरण) अंतर स्पेक्ट्रम से पता चलता है में प्रदर्शन के गठन की ओर जाता है च्या Hyd1. Hyd1 के अंतर स्पेक्ट्रा सबसे स्पष्ट रूप से νCO क्षेत्र का उपयोग कर व्याख्या की जा सकती है । सक्रिय साइट की प्रत्येक अद्वितीय स्थिति दो CN बैंड की तुलना में केवल एक सह बैंड है और इसलिए νCN क्षेत्र आंतरिक रूप से अधिक जटिल है, कई अतिव्यापी बैंड के साथ । चित्रा 4 में अंतर स्पेक्ट्रम से पता चलता है कि सक्रियण हानि की ओर जाता है (नकारात्मक अवशोषण बैंड) ऑक्सीकरण, निष्क्रिय नी-बी और नी-एसआई (सबसे ऑक्सीकरण ' सक्रिय राज्य) की एक छोटी राशि है कि के रूप में तैयार Hyd1 फिल्म में मौजूद था । इन Hyd1 के ' सक्रिय ' राज्यों द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं; ni-C, ni-r और ni-l. ध्यान दें कि दोनों एनआई-r और ni-l राज्यों के दो रूप हैं, के रूप में दो νसह बैंड चित्रा 4में इन प्रजातियों के लिए मनाया द्वारा सबूत. मल्टीपल नी-आर और नी-एल राज्यों के प्रेक्षण अन्य नाईफ hydrogenases के साथ समझौते में है । ४८ , ५८ , ५९

PFIRE विधि का एक महत्वपूर्ण सत्यापन है कि चक्रीय voltammograms spectroelectrochemical प्रवाह सेल के अंदर Hyd1 की दर्ज की एक waveshapes घूर्णन डिस्क इलेक्ट्रोड पर दर्ज उन लोगों के लिए इसी तरह उत्प्रेरक planar दिखाओ । ५५ अभ्यास में इसका मतलब यह है कि spectroelectrochemical कोशिका में सब्सट्रेट (एच2) और उत्पाद (एच+) के लिए मैटीरियल Hyd1 से PFIRE मापन के दौरान उपयोग की जाने वाली प्रवाह दरों में दक्ष है । उत्प्रेरक waveshape पर प्रवाह दर का प्रभाव चित्रा 5में दिखाया गया है, जो एक एच2 वायुमंडल (1 बार) के तहत दर्ज की voltammograms से पता चलता है के रूप में spectroelectrochemical सेल के माध्यम से समाधान प्रवाह दर बढ़ जाती है । सभी मामलों में Hyd1 द्वारा एच2 ऑक्सीकरण के लिए अधिक संभावना (लाल छायांकित आयत) समान है, लेकिन oxidative निष्क्रियता की हद तक (हिस्टैरिसीस के दौरान वर्तमान के बीच oxidative और प्रतिआगमनात्मक राज्यभर में सीए के ऊपर संभावितों पर 0 वी बनाम SCE) और अधिकतम एच2 ऑक्सीकरण वर्तमान समाधान प्रवाह दर पर निर्भर हैं । ५२ मिलीलीटर/मिनट (लाइट ग्रे voltammogram) से ऊपर प्रवाह दर पर उत्प्रेरक waveshape आगे प्रवाह दर बढ़ जाती है के प्रति असंवेदनशील है ।

चित्रा 6 प्रारंभिक सक्रियकरण और anaerobic पुनः ऑक्सीकरण पर 0 वी बनाम SCE के बाद νसह बैंड के सापेक्ष तीव्रता की तुलना करता है (एक एआर वायुमंडल के तहत, के रूप में ४.३ में वर्णित) और के बाद anaerobic oxidative निष्क्रियण के तहत निरंतर प्रयोगों के ४८ hr के बाद 0 V vs SCE पर एक Ar वातावरण (जैसा कि ५.१ में वर्णित है) । माप के दौरान सक्रिय साइट बैंड तीव्रता का कोई नुकसान नहीं मनाया जाता है, और सभी Hyd1 नमूना लागू संभावितों के लिए प्रतिक्रिया करता है ।

चित्र 7 इस कार्य में उपयोग की गई आधारभूत सुधार प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है । सक्रिय साइट क्षेत्र में Hyd1 नमूना का निरपेक्ष स्पेक्ट्रम (चित्रा 7) पानी के कारण महत्वपूर्ण वक्रता होता है । वास्तव में, आवश्यकता के रूप में पानी का उपयोग करने के लिए एक विलायक जीवन विज्ञान में आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए एक समस्या है । निरपेक्ष स्पेक्ट्रम के दूसरे व्युत्पंन (चित्रा 7बी), Savitsky के साथ मूल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना-Golay एक 9 बिंदु खिड़की पर चिकनी, घुमावदार पृष्ठभूमि के खिलाफ Hyd1 सक्रिय साइट के तेज बैंड की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अनुमानित चोटी एक दूसरे व्युत्पंन स्पेक्ट्रम का उपयोग कर पदों की पहचान आधारभूत लंगर अंक निरपेक्ष स्पेक्ट्रम है कि सक्रिय साइट बैंड से मुक्त कर रहे है के क्षेत्रों में रखा जाएगा ( चित्रा 7में हलकों की अनुमति देता है) । एक घन पट्टी समारोह तो इन लंगर अंक के माध्यम से फिट है एक आधारभूत समारोह है कि फिर निरपेक्ष स्पेक्ट्रम से घटाई जा सकता है बनाने के लिए एक आधारभूत ही Hyd1 सक्रिय साइट से उत्पंन चोटियों युक्त स्पेक्ट्रम सही (चित्रा 7 ) ।

चित्र 8 , Hyd1 पर एक PFIRE मापन के परिणाम दिखाता है, जो संभावितों की श्रेणी में गैर-टर्नओवर (Ar वायुमंडल) और टर्नओवर (H2 वातावरण) की स्थिति के अंतर्गत होता है. ३६ वर्तमान-समय अंश (चित्र 8a) प्रत्येक लागू की गई क्षमता पर उत्प्रेरक वर्तमान पर रिपोर्ट और गैर-टर्नओवर स्थितियों (Ar वातावरण) के अंतर्गत शूंय वर्तमान के करीब पर रहते हैं । आंशिक spectroelectrochemical redox अनुमापन में चित्रा 8बी इसलिए सक्रिय साइट के संतुलन redox व्यवहार पर रिपोर्ट, उत्प्रेरक कारोबार के अभाव में प्रत्येक संभावित पर उंमीद राज्यों के वितरण दिखा । चित्रा 8में स्पेक्ट्रासी कारोबार की स्थिति के तहत दर्ज किया गया (एक एच2 वातावरण के तहत) और इसलिए सक्रिय साइट Hyd1 द्वारा उत्प्रेरक एच2 ऑक्सीकरण के दौरान मौजूद राज्यों के स्थिर राज्य वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह स्थिर राज्य की स्थिति को प्राप्त किया गया है तथ्य यह है कि उत्प्रेरक एच2 ऑक्सीकरण वर्तमान (चित्रा 8, एच2) समय के एक समारोह के रूप में लगातार रहता है द्वारा की पुष्टि की है − ०.१९९ v और − ०.०७४ v बनाम वह; monotonic में वर्तमान में क्षय + ०.३५६ वी बनाम वह अच्छी तरह से जाना जाता है anaerobic oxidative Hyd1 की निष्क्रियता के कारण है । ५५ सक्रिय साइट राज्यों का वितरण सभी संभावितों पर Ar और H2 के अंतर्गत स्पष्ट रूप से भिन्न है जहाँ Hyd1 catalysis (चित्रा ८बी, स्पेक्ट्रा में − ०.१९९, − ०.०७४ और + ०.३५६ वी बनाम वह) करता है. Ar और H2 के अंतर्गत दर्ज स्पेक्ट्रा लगभग समान हैं − ०.५९४ V बनाम वह, तथापि, और यह प्रयोगात्मक निरंतरता का एक महत्वपूर्ण परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है; Hyd1 कम नहीं है H+ pH ६.० पर एक महत्वपूर्ण दर पर (वर्तमान चित्र 8मेंa दोनों Ar और H2 के अंतर्गत शूंय के करीब है), और स्पेक्ट्रा − ०.५९४ V पर इसलिए एक ही होने की उंमीद कर रहे हैं ।

चित्रा 9 anaerobic oxidative के गठन के माध्यम से Hyd1 की निष्क्रियता को दर्शाता है नी-बी से ni-B के दौरान एच2 ऑक्सीकरण पर + ०.३५६ V.३६ स्पेक्ट्रा ग्रे समय अंतराल के दौरान दर्ज किए गए वर्तमान समय ट्रेस पर ध्यान दिया चित्रा 9में । पर − ०.०७४ V Hyd1 oxidative निष्क्रियता से गुजरना नहीं करता है, और सक्रिय साइट राज्यों के वितरण पूरे संभावित चरण में स्थिर रहता है । यह चित्र 9biमें स्पेक्ट्रा द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जो − ०.०७४ संभावित चरण की शुरुआत में निरपेक्ष आधारभूत-सही स्पेक्ट्रम की रिपोर्ट करता है, और चित्रा 9बीद्वितीय जो बाद में दर्ज किया गया था संभावित चरण के दौरान समय और एक अंतर स्पेक्ट्रम के रूप में रिपोर्ट की गई है चित्रा 9बीमैंके सापेक्ष । चित्रा 9बीiii और बीiv में स्पेक्ट्रा भी अंतर स्पेक्ट्रा के सापेक्ष आंकड़ा 9bके रूप में सूचित कर रहे हैं मैं, और उच्च क्षमता के दौरान ni-b करने के लिए ni-SI के क्रमिक रूपांतरण दिखाने निष्क्रियता, वर्तमान में monotonic कमी के अनुरूप + ०.३५६ में दिखाया गया है चित्रा 9में वी ।

स्पेक्ट्रा समाधान की एक सीमा पर दर्ज पीएच Hyd1 उत्प्रेरक चक्र के दौरान प्रोटॉन स्थानांतरण चरणों में अंतर्दृष्टि दे । ४३ चित्र 10 एक दिखाता है PFIRE स्पेक्ट्रा पीएच ३.० और पीएच ९.० में एक ही Hyd1 फिल्म पर दर्ज की, प्रयोगात्मक बफर विनिमय करने के लिए spectroelectrochemical सेल में समाधान प्रवाह का उपयोग कर । नी-सी और नी-एल राज्यों के सापेक्ष सांद्रता इन दो स्पेक्ट्रा में स्पष्ट रूप से भिन्न हैं । गैर के तहत लागू की क्षमता अलग-कारोबार की स्थिति एनआईसी और Ni-L राज्यों के संभावित निर्भरता पीएच मूल्यों की एक श्रेणी में तेजी से निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 10बी), और दोनों राज्यों में एक व्यापक पीएच रेंज पर isopotential हो पाया जाता है । (ध् यान दें कि पीक absorbances चित्रा 10बी में स्पष्टता के लिए केवल नी-सी और नी-एल राज्यों को दिखाने के लिए, Hyd1 के पूर्ण redox titrations Hidalgo एट अलद्वारा सूचित किया गया है.) ३६ ni-c और ni-l की सांद्रता का एक ph अनुमापन तब निकाला जा सकता है, जो संभावितों पर पीक अवशोषक ले रहा है, जहां कुल ni-C और Ni-l एकाग्रता प्रत्येक पीएच (चित्रा 10C) में अपनी अधिकतम पर है । इस तरह, और EPR डेटा के साथ संयोजन के रूप में, ni-C और ni-L राज्यों के बीच एक पीएच संतुलन की पहचान की गई थी । ४३

Figure 1
चित्र 1: योजनाबद्ध IR स्पेक्ट्रोमीटर, anaerobic glovebox, एटीआर गौण, MCT डिटेक्टर, गैस प्रवाह प्रणाली और potentiostat माप के लिए इस्तेमाल की व्यवस्था की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: spectroelectrochemical कोशिका के योजनाबद्ध आरेख PFIRE माप के लिए इस्तेमाल किया, इलेक्ट्रोड और समाधान प्रवेश की व्यवस्था दिखा/आउटलेट कनेक्शन. सेल और baseplate polyether ईथर कीटोंन (तिरछी) से machined कर रहे हैं, एक कार्बन काम इलेक्ट्रोड कनेक्शन के लिए पेंच छेद के साथ, पीटी वायर काउंटर इलेक्ट्रोड, calomel संदर्भ इलेक्ट्रोड संतृप्त, और समाधान प्रवेश और आउटलेट. संतृप्त calomel संदर्भ इलेक्ट्रोड निर्माण के रूप में पहले की रिपोर्ट है. ३६ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Hyd1-संशोधित कार्बन काले कणों के अवशोषण स्पेक्ट्रम, गुस्सा पर जमा और बफर के साथ reहाइड्रेटेड । के बीच की स्थिति मैं बैंड, द्वितीय बैंड के बीच, और Hyd1 सक्रिय साइट क्षेत्र, सी के कारण अतिरिक्त सुविधाओं के साथ दिखाया जाता है-ज कंपन और विलायक पानी खींच । इनसेट सक्रिय साइट क्षेत्र के एक बढ़ाया दृश्य दिखाता है, vCO और vCN लेबल बैंड के साथ । ' के रूप में तैयार कणों ऑक्सीकरण, निष्क्रिय नी बी राज्य में मुख्य रूप से Hyd1 होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Hyd1 के सक्रियण पर − ०.८ V बनाम SCE एक एच2 वातावरण के तहत, एक कम ऋण ऑक्सीकरण अंतर स्पेक्ट्रम के रूप में प्रस्तुत किया । कम संभावित सक्रियण ऑक्सीकरण, निष्क्रिय ni-B (और नी-एसआई की एक छोटी सी एकाग्रता) में धर्मांतरित करने के लिए और अधिक कम, सक्रिय राज्यों ni-C, ni-r and ni-l ध्यान दें कि Hyd1 दो अलग उप-राज्यों नी-l और नी-r है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : उत्प्रेरक चक्रीय voltammograms के waveshape पर समाधान प्रवाह दर का प्रभाव spectroelectrochemical कक्ष में दर्ज किया गया । Voltammograms एच2-संतृप्त बफर के प्रवाह दर में वृद्धि पर दर्ज किए गए संकेत के रूप में । 20 मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर (लाल) voltammogram आगे स्कैन पर 0 वी बनाम वह के ऊपर महत्वपूर्ण निष्क्रियता से पता चलता है. ५२ मिलीलीटर से ऊपर प्रवाह की दर/निष्क्रियता की हद तक काफी कम है और वर्तमान सभी संभावितों पर प्रवाह की दर से स्वतंत्र है । अंय पैरामीटर: 1 बार एच2, 10 एमवी/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : आधार रेखा के सक्रिय साइट νसह क्षेत्र में ऑक्सीकरण, निष्क्रिय Ni-B राज्य के vs SCE पर 0. निरंतर PFIRE माप के ४८ घंटे के दौरान सक्रिय साइट तीव्रता का कोई औसत दर्जे का नुकसान है, और इसलिए Hyd1 कार्बन काले कणों पर मजबूती से adsorbed है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: डेटा हैंडलिंग के लिए उपयोग की जाने वाली आधारभूत सुधार कार्यविधियों का विवरण. आधारभूत लंगर अंक सक्रिय साइट क्षेत्र () में निरपेक्ष अवशोषक स्पेक्ट्रम पर रखा जाता है, देखभाल के लिए किसी भी νसह और νCN एक दूसरे व्युत्पंन विश्लेषण (बी) से पहचान चोटियों से बचने के ले । परिणामी आधारभूत सुधारित स्पेक्ट्रम (c) में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: गैर-टर्नओवर (Ar) और टर्नओवर (H2) शर्तों के अंतर्गत Hyd1 पर PFIRE मापन (a) Ar-संतृप्त (धूसर) और H2-संतृप्त (black) बफ़र में spectroelectrochemical कक्ष में Hyd1 का वर्तमान-समय अंश; (), () PFIRE स्पेक्ट्रा को एआर (बी) और एच2 (सी) के अंतर्गत प्रत्येक संभावित पर νसह क्षेत्र दिखा । वी बनाम में उद्धृत संभावित । Hidalgo एट अल से अनुमति के साथ reproduced । ३५ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: नी-एसआई से नी-ब के गठन के जरिए Hyd1 की Anaerobic निष्क्रियता । () एक एच2 वातावरण के तहत वर्तमान समय ट्रेस, एक स्थिर electrocatalytic वर्तमान में दिखा रहा है − ०.०७४ v और धीमी anaerobic निष्क्रियता (वर्तमान में monotonic कमी) पर + ०.३५६ वी बनाम वह । (b) स्पेक्ट्रा में चिह्नित धूसर छायांकित क्षेत्रों के दौरान (a) दर्ज किया गया । स्पेक्ट्रम बीमैं एक आधारभूत सही − ०.०७४ V संभावित चरण की शुरुआत में दर्ज की गई स्पेक्ट्रम है । स्पेक्ट्रम bii, − ०.०७४ v चरण के दौरान बाद में दर्ज किया गया, bi के सापेक्ष अंतर स्पेक्ट्रम के रूप में रिपोर्ट की जाती है और यह पता चलता है कि सक्रिय साइट राज्यों के वितरण में कोई परिवर्तन नहीं होता है, जो क्षमता की स्थिरता के अनुरूप होता है − ०.०७४ v. स्पेक्ट्रा बीiii और बीiv भी अंतर स्पेक्ट्रा बीमैं के सापेक्ष के रूप में रिपोर्ट कर रहे है और नी-एसआई के लिए ni-SI के लिए anaerobic निष्क्रियता पर + ०.३५६ वी बनाम वह में क्रमिक रूपांतरण दिखाओ । Hidalgo एट अल से अनुमति के साथ reproduced । ३५ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : स्पेक्ट्रा समाधान की एक सीमा पर दर्ज पीएच Hyd1 उत्प्रेरक चक्र के दौरान प्रोटॉन हस्तांतरण कदम में अंतर्दृष्टि दे । () IR स्पेक्ट्रा Hyd1 के νसह क्षेत्र दिखा रहा है, पीएच ३.० में दर्ज (-५४ एमवी बनाम वह) और पीएच ९.० (-३३४ एमवी बनाम वह) । (b) Spectroelectrochemical titrations को उस क्षमता का निर्धारण करने के लिए किया जाता है जिस पर नी-C और ni-L सांद्रता समाधान pH मानों की श्रेणी में अधिकतम पर होती है । केवल नी-सी और नी-एल सांद्रता को स्पष्टता के लिए दिखाया गया है, Hyd1 के एक पूर्ण spectroelectrochemical अनुमापन के लिए Hidalgo एट अल. ३६ () ni-c और ni-L के सापेक्ष एकाग्रता की pH निर्भरता, जैसा कि (b) में दर्शाए गए प्रयोगों की श्रृंखला से निर्धारित होता है । स्पेक्ट्रा 20 डिग्री सेल्सियस पर दर्ज किया गया । मर्फी एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित । ४२ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

PFIRE इलेक्ट्रोड-मैटीरियल redox प्रोटीन्स को एड्रेस करने के लिए मोटे तौर पर लागू आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है । विशेष रूप से, redox एंजाइमों की electrocatalytic प्रतिक्रियाओं तेजी से कारोबार की स्थिति के तहत जांच की जा सकती है । PFIRE विधि PFE है, जो कोई प्रत्यक्ष संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है की तकनीक द्वारा प्रदान की प्रत्यक्ष विद्युत नियंत्रण पर बनाता है, और यह एक कार्बन इलेक्ट्रोड पर IR स्पेक्ट्रोस्कोपी को जोड़ों । PFIRE दृष्टिकोण इस प्रकार electrochemistry अकेले से उपलब्ध जानकारी के लिए रासायनिक अंतर्दृष्टि कहते है और उच्च redox प्रोटीन और छोटे अणु बाध्यकारी और सक्रियकरण में शामिल एंजाइमों के अध्ययन के लिए अनुकूल है । इसके अलावा, PFIRE उत्प्रेरक कारोबार के अभाव में प्रोटीन में संभावित निर्भर संरचनात्मक परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । ऐसी गैर-टर्नओवर इलेक्ट्रॉन अंतरण घटनाएँ प्रायः PFE के ' मानक ' आवेदनों का उपयोग कर पता लगाने में कठिन होती हैं, हालाँकि PFE के विस्तार का रूपान्तर-रूपांतरित एसी voltammetry को बड़ी सफलता के साथ उपयोग में लिया गया है. ४५ , ४६

PFIRE विधि सिद्धांत रूप में, किसी भी redox प्रोटीन है कि PFE का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है के अध्ययन के लिए उपयुक्त है । इसलिए, PFE के साथ के रूप में, प्रोटीन सोखना एक सफल PFIRE प्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । इस प्रोटोकॉल में हम एक मामले का अध्ययन के रूप में ई. कोलाई Hyd1 का उपयोग कर PFIRE तकनीक के एक आवेदन का वर्णन. ३६ , ४३ हालांकि, हमने cytoplasmic रेगुलेटरी hydrogenase से आर eutropha,४४ और कार्बन ब्लैक पर फ्लेविन mononucleotide adsorbed करने के लिए PFIRE तकनीक को भी लागू किया है । ४० इन सभी मामलों में, सरल शारीरिक सोखना को संशोधित उच्च सतह क्षेत्र कार्बन ब्लैक (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है) प्रोटीन की सतह कवरेज प्रदान करता है जो उच्च सिग्नल से शोर अनुपात के साथ अच्छी गुणवत्ता वाली IR स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त उच्च है । मामलों में जहां सोखना के इस तरह के उच्च स्तर प्राप्त नहीं किया जा सकता है यह कार्बन कणों की सतह को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, उदाहरण के लिए इलेक्ट्रोड सतह के लिए प्रोटीन के आबंध लगाव की अनुमति देने के लिए. ६० , ६१ , ६२ PFIRE मापन के लिए एक glovebox का उपयोग केवल सख्ती से आवश्यक है जब नमूने है कि anaerobically संभाला जाना चाहिए का अध्ययन । हालांकि अभ्यास में बेहद निरंतर और कम (< ८० ° c ओस बिंदु) glovebox वायुमंडल द्वारा प्रदान की गई जल वाष्प के स्तर को उच्च संकेत-से-शोर स्तर देते हैं जो बहुत छोटे absorbances की निकासी की अनुमति देता है । कई मामलों में ४४ एक anaerobic वातावरण, glovebox द्वारा प्रदान की गई है कि जैसे, विद्युत माप के लिए भी वांछनीय है (PFIRE तकनीक का अभिंन अंग) क्रम में काम इलेक्ट्रोड पर हे2 कमी के कारण वर्तमान से बचने के लिए.

IR थोक पानी के कारण absorbances, प्रयोगात्मक बफ़र्स और कार्बन कणों जिस पर नमूना adsorbed सभी प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रा के लिए महत्वपूर्ण योगदान है और ब्याज की बैंड ओवरलैप सकता है, विशेष रूप से के बीच मैं, द्वितीय और तृतीय क्षेत्रों में स्पेक्ट्रम. ६३ के बीच क्षेत्र भी ऐसी flavins या nicotinamide cofactors के रूप में कार्बनिक प्रजातियों से जानकारी शामिल है, साथ ही सब्सट्रेट और कई ऑक्सीकरण और कमी प्रतिक्रियाओं के उत्पादों । नाईफ hydrogenases के मामले में, νCO और सक्रिय साइट के νCN बैंड स्पेक्ट्रम के एक अपेक्षाकृत स्पष्ट क्षेत्र में गिरावट और इसलिए PFIRE तकनीक बहुत अच्छी तरह से इन एंजाइमों के अध्ययन के लिए अनुकूल है । अंय मामलों में, तथापि, अंतर स्पेक्ट्रा isotopic लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ युग्मित करने के लिए मैटीरियल प्रोटीन के कारण परिवर्तन को अलग करने की जरूरत हो सकती है । इसी तरह के दृष्टिकोण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए, प्रोटॉन परिवर्तन, संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर Michaelis-मेनटेन परिसरों का अध्ययन करने के लिए. ६४ , ६५ , ६६ PFIRE नहीं है, इसलिए, hydrogenases के अध्ययन के लिए सीमित है, लेकिन किसी भी redox प्रोटीन है कि शामिल करने के लिए लागू किया जा सकता है (या जिनके सब्सट्रेट, उत्पादों या अवरोधों होते हैं) नैदानिक आईआर सक्रिय कंपन के साथ समूह; कार्बन मोनोऑक्साइड dehydrogeanses,६७ nitrogenases,६८,14 flavoproteins,४० और formate dehydrogenases, उदाहरण के लिए ।

संबंधित तकनीक, SEIRA, एक biomimetic वातावरण में झिल्ली से जुड़े प्रोटीन के अध्ययन के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है । ३२ SEIRA ir स्पेक्ट्रोस्कोपी का एक अनुकूलन है कि यह भी एक एटीआर-ir विंयास का उपयोग करता है, और एक सतह वृद्धि प्रभाव का उपयोग करता है कि करीब स्थित अणुओं के आईआर अवशोषित प्रवर्धक (कुछ एनएम के भीतर) एटीआर चश्मे की सतह (गुस्सा) । SEIRA इसलिए adsorbed प्रोटीन और झिल्ली वास्तुकला के भीतर घटित वर्णक्रमीय परिवर्तन के प्रति अति सुंदर रूप से संवेदनशील है और समाधान में मौजूद विलायक और सब्सट्रेट/अवरोधकों से संकेतों प्रतिस्पर्धा से अपेक्षाकृत मुक्त है । यह PFIRE तकनीक के विपरीत कुछ हद तक यहां वर्णित है जो गुस्सा (~ 1 µm) की सतह से ऊपर एक काफी अधिक पैठ गहराई पर निर्भर करता है, जिसका अर्थ है कि PFIRE अधिक सब्सट्रेट, उत्पाद या अवरोधकों के लिए संवेदनशील है समाधान में मौजूद । इस वृद्धि की संवेदनशीलता को ' थोक ' विलायक लाभप्रद हो सकता है; यदि सब्सट्रेट या उत्पाद IR द्वारा सीधे देखा जा सकता है, PFIRE स्पेक्ट्रा रिपोर्ट लंबे समय से सक्रिय प्रजातियों और electrocatalysis के दौरान जुड़े उत्पाद गठन के दोनों स्थिर राज्य कैनेटीक्स पर । ६९ सब्सट्रेट और उत्पाद के स्थिर राज्य सांद्रता का पालन करने की क्षमता इस तरह के कार्बन मोनोऑक्साइड डिहाइड्रोजनेज के रूप में एंजाइमों के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो जाएगा (जो सह के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण catalyzes2, एक मजबूत आईआर अवशोषक) या formate डिहाइड्रोजनेज (जो प्रारूप के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण के लिए2सह catalyzes) ।

वर्तमान में, PFIRE स्थिर करने के लिए सीमित है एंजाइम electrocatalysis के कारण macroscopic कार्बन इलेक्ट्रोड के लिए ' ध्यान केंद्रित ' में डेटा संग्रह और एटीआर-आईआर ज्यामिति के लिए एक गुस्सा की सतह पर एंजाइम का इस्तेमाल किया । नाईफ hydrogenases के इस संबंध PFIRE अध्ययन में डायर और सह कार्यकर्ताओं के काम के पूरक हैं,४९,५० जो प्रकाश का उपयोग-ट्रिगर क्षणिक अवशोषण आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी उप कारोबार कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए. spectroelectrochemical कक्ष,४० को miniaturize करने के लिए कार्य चल रहा है और microseconds के आदेश पर microelectrodes समय संकल्प के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए । यह ca १००-५०० s-1करने के लिए कारोबार आवृत्तियों के साथ एंजाइमों के लिए उप कारोबार कैनेटीक्स के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा, और दोनों reडक्टर और oxidative प्रक्रियाओं के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा ।

कुल मिलाकर, PFIRE एक स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि स्थिर राज्य की स्थितियों में redox एंजाइमों के electrocatalytic प्रतिक्रियाओं के रासायनिक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है । PFIRE दृष्टिकोण एकाधिक रासायनिक और विद्युत titrations एक ही एंजाइम नमूना पर किया जा करने के लिए अनुमति देता है, उच्च सतह क्षेत्र इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल किया प्रोटीन की एक मजबूत सोखना प्रदान करते हैं और एटीआर-आईआर ज्यामिति सतही समाधान विनिमय की अनुमति देता है. एंजाइम समारोह के दौरान सीटू में इस तरह के संरचनात्मक जानकारी एकत्र करने की क्षमता व्यापक bioelectrochemistry समुदाय के लिए एक अमूल्य उपकरण है ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा नहीं वित्तीय हित की घोषणा ।

Acknowledgments

K.A.V. और P.A.A. का काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (EnergyBioCatalysis-ईआरसी-२०१०-StG-२५८६००), इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद आईबी उत्प्रेरक पुरस्कार EP/N013514/1, और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान द्वारा समर्थित था परिषद् (bb/L009722/1 और bb/N006321/ R.H. Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de कोस्टा रिका, और लिंकन कॉलेज, ऑक्सफोर्ड द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक श्री चार्ली जोंस, श्री चार्ली इवांस और यांत्रिक कार्यशाला (रसायन शास्त्र विभाग) के डिजाइन और इस काम में प्रयुक्त spectroelectrochemical कोशिकाओं के निर्माण में सहायता के लिए कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

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Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

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